CN113151441A - 一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用,其中,所述检测试剂盒针对CYP2D6C100T、ADRB1G1165C两个基因的多态性和CYP2D6有效拷贝数设计特异性扩增引物和测序引物,所述试剂盒包括如下组分:扩增反应液、CYP2D6C100T测序引物、ADRB1G1165C测序引物、CYP2D6有效拷贝数测序引物和阳性对照。本发明采用非对称多重PCR一管扩增CYP2D6(C100T)、ADRB1(G1165C)、CYP2D6有效拷贝数,产生大量的生物素标记的单链DNA,在单链扩增过程中CYP2D7‑PNA阻断探针会阻断生物素标记探针与假基因CYP2D7的结合,避免假基因对测序结果的干扰,生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合,洗涤后加入测序引物和测序原料,进行焦磷酸测序,减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤,简化了测序流程和时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用,属于药物基因组检测领域。
背景技术
在全球畅销的前200种药品中,治疗高血压的药物占17种。然而,治疗高血压病的药物在临床上出现的个体反应差异十分普遍,接受药物治疗的患者约有20%-50%血压未得到良好控制,其主要原因也是由于与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异。药物疗效和不良反应的个体差异是目前药物治疗过程中的普遍现象。遗传药理学和药物基因组学的研究进展表明药物代谢酶和受体(药物作用靶点)的遗传变异是造成个体药物反应差异的主要原因。细胞色素氧化酶CYP2D6发生基因突变,在相同剂量条件下,其所介导代谢的β受体阻滞剂在突变型纯合子中的血药浓度比野生型纯合子高2~3倍,如不根据基因型调整剂量,突变型纯合子患者可能发生严重的毒副反应;相反,如果β受体发生功能性突变,在突变型纯合子个体中依然使用β受体阻滞药,往往会导致治疗失败。因此,根据个体与药物治疗相关的代谢酶和受体的遗传变异制定不同的治疗方案,实现药物治疗个体化不仅是当今遗传药理学和临床药物治疗学的发展方向,而且具有十分重要的社会意义和经济意义。
目前,对于基因多态性检测的方法有很多种,如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中,测序法能够直接检测突变位点的位置和类型,但该方法操作步骤繁琐,检测周期长,且扩增产物容易产生污染;芯片法涉及基因特异扩增、杂交、检测等多个步骤,可进行高通量分析,但其成本较高,检测步骤复杂且对样本数量有一定的要求;高分辨率熔解曲线法步骤简单,不需要做扩增后处理,但其不含特异性荧光探针,特异性偏低,且对仪器设备的要求较高;等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增,操作方法简单,无需扩增后处理,但其引物设计难以最优化,检测条件要求严格,实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。taqman荧光探针法操作方法简单,无需扩增后处理,但其试验成本高,对于多个基因的扩增通量不高。因此,需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。
CYP2D6参与了抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药、癌症治疗药物的代谢。但是CYP2D6由于CYP2D7P和2D8P假基因的存在,通过基因重组现象,CYP2D6会与CYP2D7,CYP2D8等假基因发生遗传物质的交换形成杂交型等位基因(Hybrid allele)。鉴于CYP2D6*10是亚洲人群中最常见的功能下降等位基因,重复CYP2D6*10的存在将是影响CYP2D6在药物代谢中能力的关键因素。CYP2D6*36-*10是东亚人群中很常见串联排列,CYP2D6*36-*10中具有活性的表型只有*10。目前CYP2D6*10的等位基因频率可能被高估,根据近期研究,等位基因频率的CYP2D6*10(21.6%)、CYP2D6*36-10*(34.1%)和CYP2D6*36(3.6%)合计为59.3%。目前市面上的主流方法多只对CYP2D6的C100T位点进行了分型,未对串联和拷贝数情况进行检测。
CN106868172A公开了一种焦磷酸测序法快速检测CYP2D6基因拷贝数的试剂盒及其应用。该发明在5号外显子进行扩增,将CYP2D8作为对照,来检测CYP2D6的拷贝数。本发明的CYP2D6的拷贝数检测位于CYP2D6基因9号外显子,旨在检测有效拷贝数,由于CYP2D6*5和CYP2D6*36在9号外显子均为缺失,CYP2D6*5和CYP2D6*36两种无功能性表型不能进行扩增。结合C100T位点的检测可以综合得到拷贝数和多态性信息。
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物,PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为50~100∶1。在PCR反应的最初10~15个循环中,其扩增产物主要是双链DNA,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后,非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。常规焦磷酸测序前处理操作较为复杂和耗时,因此,设计开发一款结合不对称PCR技术的可以快速检测的焦磷酸检测试剂盒是十分必要的。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明的目的是以非对称多重PCR扩增和优化焦磷酸测序技术为基础,获得一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用。
为实现上述发明目的之一,本发明采用的一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒的技术方案如下:
本发明的检测试剂盒针对CYP2D6(C100T)、ADRB1(G1165C)两个基因的多态性和CYP2D6有效拷贝数设计特异性扩增引物和测序引物,所述试剂盒包括如下组分:扩增反应液、CYP2D6(C100T)测序引物、ADRB1(G1165C)测序引物、CYP2D6有效拷贝数测序引物和阳性对照。
优选地,所述设计特异性引物,如下表所示:
引物名称 | SEQ ID | 序列(5’~3’) | 修饰 |
CYP2D6(C100T)前引物 | 1 | acctgatgcaccggcg | |
CYP2D6(C100T)后引物 | 2 | tggaagtccacatgcagcag | 5`Biotin |
ADRB1(G1165C)前引物 | 3 | aactcggccttcaacccc | |
ADRB1(G1165C)后引物 | 4 | gctcgtccaggctcgagtc | 5`Biotin |
CYP2D6有效拷贝前引物 | 5 | ttcagcttctcggtgccca | 5`Biotin |
CYP2D6有效拷贝后引物 | 6 | gggcacagcacaaagctcat | |
CYP2D6(C100T)测序引物 | 7 | tgggctgcacgctac | |
ADRB1(G1165C)测序引物 | 8 | caaccttgctgcatg | |
CYP2D6有效拷贝测序引物 | 9 | atagggggatggs | |
CYP2D7-PNA探针 | 10 | caaccttgctgcatg |
即,所述CYP2D6(C100T)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2所示;所述ADRB1(G1165C)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:4所示。所述CYP2D6有效拷贝数的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:5~SEQ ID NO:6所示;所述CYP2D7-PNA探针阻滞引物序列如序列表SEQ ID NO:10。
优选的,所述的CYP2D6(C100T)测序引物、ADRB1(G1165C)测序引物、CYP2D6有效拷贝数测序引物分别如序列表SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:9所示。
优选的,所述的扩增反应液包括CYP2D6(C100T)、ADRB1(G1165C)、CYP2D6有效拷贝数特异性扩增引物和阻滞探针,还包括PCR Buffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶、海藻糖、无核酸酶水。
更优选的,反应液各组分浓度分别为:CYP2D6(C100T)后引物(1.2uM),CYP2D6(C100T)后引物(0.02uM),CYP2D7-PNA探针(0.3uM),CYP2D6有效拷贝前引物(1.2uM),CYP2D6有效拷贝后引物(0.03uM),ADRB1(G1165C)前引物(1.2uM),ADRB1(G1165C)后引物(0.02uM),,PCR Buffer(1.5×),dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U),BSA(0.05mg/ml),海藻糖(0.2%),dUTP(0.5mM)、UDG酶(1U)和无核酸酶水(将体系补充至20μL);
优选的,所述的阳性对照,包括浓度为20ng/ul的CYP2D6*1/*10、ADRB1(1165G/C)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型,对未知样本的型别判定提供参考,同时对反应液的有效性进行质控。
本发明的另一个目的是公开一种采用上述试剂盒的β受体阻断剂用药相关的基因多态性检测方法,所述检测方法采用焦磷酸测序同时检测对CYP2D6(C100T)、ADRB1(G1165C)两个基因的多态性和CYP2D6有效拷贝数。所述焦磷酸测序的待测基因采用非对称多重PCR方式扩增获得。
具体的,所述检测方法包括以下步骤:
a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA,采用非对称多重PCR扩增进行扩增;
b.将反应产物进行焦磷酸测序;
c.确定CYP2D6(C100T)位点、ADRB1(G1165C)位点和CYP2D6有效拷贝数位点的基因型。
优选的,所述的反应体积为25ul,扩增条件为:酶处理37℃3min;预变性95℃,5min;40个循环,95℃15s,60℃25s,72℃25s;最后延伸72℃4min。
不仅如此,本发明还公开了一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及方法的应用,所述检测试剂盒同时对CYP2D6(C100T)、ADRB1(G1165C)、CYP2D6有效拷贝数进行检测,以判断样本源的代谢类型,从基因层面指导β受体阻断剂的用药。
与现有技术相比,本发明采用非对称多重PCR一管扩增CYP2D6(C100T)、ADRB1(G1165C)、CYP2D6有效拷贝数,产生大量的生物素标记的单链DNA,在单链扩增过程中CYP2D7-PNA阻断探针会阻断生物素标记探针与假基因CYP2D7的结合,避免假基因对测序结果的干扰,生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合,洗涤后加入测序引物和测序原料,进行焦磷酸测序,减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤,简化了测序流程和时间,结果判读便捷、明确,能从基因层面指导β受体阻断剂的用药,为临床个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
图1是本发明提供的CYP2D6有效拷贝数的引物设计原理图;
图2是本发明提供的CYP2D6(C100T)焦磷酸检测结果示例图;
图3是本发明提供的CYP2D6有效拷贝数焦磷酸检测结果示例图;
图4是本发明提供的ADRB1(G1165C)焦磷酸检测结果示例图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明,均为市场购买得到。
1、试剂盒的制备
本发明的试剂盒针对CYP2D6(C100T)、ADRB1(G1165C)、CYP2D6有效拷贝数设计了特异性扩增引物和测序引物,用于焦磷酸PCR检测。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准。引物序列如下表所示:
引物名称 | SEQ ID | 序列(5’~3’) | 修饰 |
CYP2D6(C100T)前引物 | 1 | ACCTGATGCACCGGCG | |
CYP2D6(C100T)后引物 | 2 | TGGAAGTCCACATGCAGCAG | 5`Biotin |
ADRB1(G1165C)前引物 | 3 | AACTCGGCCTTCAACCCC | |
ADRB1(G1165C)后引物 | 4 | GCTCGTCCAGGCTCGAGTC | 5`Biotin |
CYP2D6有效拷贝前引物 | 5 | TTCAGCTTCTCGGTGCCCA | 5`Biotin |
CYP2D6有效拷贝后引物 | 6 | GGGCACAGCACAAAGCTCAT | |
CYP2D6(C100T)测序引物 | 7 | TGGGCTGCACGCTAC | |
ADRB1(G1165C)测序引物 | 8 | CAACCTTGCTGCATG | |
CYP2D6有效拷贝测序引物 | 9 | ATAGGGGGATGGS | |
CYP2D7-PNA探针 | 10 | CAACCTTGCTGCATG |
CYP2D6的拷贝数检测检测片段位于CYP2D6基因9号外显子,通过与CYP2D6、CYP2D8相同但与CYP2D7不同得序列,同时将CYP2D6与CYP2D8基因相关片段进行扩增,而后将PCR扩增产物用于焦磷酸测序。由于CYP2D8只存在着1个拷贝,因此可以将CYP2D8基因与CYP2D6基因所测序列中同一位置处不同碱基的峰高比值作比较。得到9号外显子的拷贝数。由于CYP2D6*5和CYP2D6*36在9号外显子均为缺失,CYP2D6*5和CYP2D6*36两种无功能性表型不能进行扩增,不显示拷贝数。引物设计原理见图1。
CYP2D6有效拷贝数和CYP2D6(C100T)多态性的综合判断,更加准确的判定CYP2D6的代谢表型。
本实施例的检测试剂盒包括如下组分:
本实施例的检测试剂盒扩增反应液单人份配置体系如下:
成分 | 体积(ul) |
水(自制) | 10.4 |
10×PCR buffer | 3.25 |
dNTPS(25mM) | 0.3 |
CYP2D6(C100T)后引物(20μM) | 1.5 |
CYP2D6(C100T)前引物(10μM) | 0.05 |
ADRB1(G1165C)后引物(20μM) | 1.5 |
ADRB1(G1165C)前引物(10μM) | 0.05 |
CYP2D6有效拷贝数前引物(20μM) | 1.5 |
CYP2D6有效拷贝数后引物(10μM) | 0.075 |
CYP2D7-PNA探针(20μM) | 0.375 |
BSA(5mg/ml) | 0.25 |
海藻糖(20%) | 0.25 |
HS Taq(5U/μL) | 0.25 |
UNG酶(5U/μL) | 0.25 |
以上引物探针购自生工、dNTP(25mM)购自诺唯赞、10×PCR buffer、HS Taq(5U/μL)购自TAKARA、UNG酶(5U/μL)Thermo Fisher。
2、焦磷酸检测
本发明中采用的仪器如下:PCR扩增仪:ABI 2720PCR仪;
焦磷酸测序仪:武汉菲思特生物科技有限公司。
(1)试剂准备(试剂准备室)
提前将试剂取出,室温融化,并将各组分涡旋振荡15秒,将试剂盒各组分低速离心15秒待用。
确定反应数N,N=待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按20μL/管分装至PCR反应管中。
(2)加样检测(样本制备间)
将样本DNA、阳性对照和空白对照按5μL加样量加入到PCR反应管中,盖紧管盖,低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底,然后立即进行PCR扩增反应。所加入的待测样本DNA应大于20copies。
(3)PCR扩增(扩增间)
采用PCR仪进行PCR扩增,PCR反应体系为25μL,扩增条件:
(4)焦磷酸测序
1)在PCR反应管中加入结合液(含微珠)40μL,再向其中加入PCR产物20μL,置于台式振荡器上,1100rpm振荡10min,使微珠和生物素充分结合;
2)7,000×g离心1min,弃上清;
3)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液,7000g离心1min,弃上清;
4)向EP管中加入退火缓冲液20μL混匀,分装到3个新的测序管;
5)将测序引物溶解成10uM,测序管中分别加入1ul 3个待测位点的测序引物、3uL测序酶和3uL测序底物;
6)取一个dNTP排管,自圆滑一端向平端依次加入20μldATPαS、20μl dTTP、20μldGTP、20μl dCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面,使得碱基平铺在排管底部;
7)根据仪器使用说明进行测序。测序结果如图2~图4所示。
(5)结果判读
1)有效性判定:
本试剂盒空白对照品的不通过,阳性对照品的检出结果为CYP2D6*1/*10+*36、ADRB1(1165G/C)GC型。
2)结果判定标准
a.CYP2D6(C100T)的DNA测序峰值图中,
C的频率≧90%,T的频率≦10%,即为CC型;
20%≦C的频率≦80%,20%≦T的频率≦80%,即为CT型,依据百分比确定C:T比例;
T的频率≧90%,C的频率≦10%,即为TT型;
b.ADRB1(G1165C)的DNA测序峰值图中,
G的频率≧90%,C的频率≦10%,即为ADRB1 1165GG型;
40%≦G的频率≦60%,40%≦C的频率≦60%,即为ADRB1 1165GC型;
C的频率≧90%,G的频率≦10%,即为ADRB1 1165CC型;
c.CYP2D6有效拷贝数的DNA测序峰值图中,
C的频率≧90%,G的频率≦10%,即认为CYP2D6有效拷贝数为0拷贝;
60%≦C的频率≦70%,30%≦G的频率≦40%,即认为CYP2D6有效拷贝数1拷贝;
45%≦C的频率≦55%,45%≦G的频率≦65%,即认为CYP2D6有效拷贝数2拷贝;
25%≦C的频率≦35%,55%≦G的频率≦65%,即认为CYP2D6有效拷贝数3拷贝;
30%≦C的频率≦40%,60%≦G的频率≦70%,即认为CYP2D6有效拷贝数4拷贝;
3、CYP2D6有效拷贝数和CYP2D6(C100T)多态性的综合判断
4、基因检测结果与代谢活性的相关性
通过检测结果可以判断样本源的代谢类型,从而进一步指导相应代谢途径的药物的用药剂量。
最后有必要在此说明的是:以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司
<120> 一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒及其方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> CYP2D6(C100T前引物Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(16)
<400> 1
acctgatgca ccggcg 16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> CYP2D6(C100T后引物Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 2
tggaagtcca catgcagcag 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> ADRB1(G1165C前引物Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(18)
<400> 3
aactcggcct tcaacccc 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> ADRB1(G1165C后引物Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(19)
<400> 4
gctcgtccag gctcgagtc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> CYP2D6有效拷贝前引物(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(19)
<400> 5
ttcagcttct cggtgccca 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> CYP2D6有效拷贝后引物(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 6
gggcacagca caaagctcat 20
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> CYP2D6(C100T测序引物Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 7
tgggctgcac gctac 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> ADRB1(G1165C测序引物Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 8
caaccttgct gcatg 15
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213> CYP2D6有效拷贝测序引物(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(13)
<400> 9
atagggggat ggs 13
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> CYP2D7-PNA探针(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 10
caaccttgct gcatg 15
Claims (10)
1.一种用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒针对CYP2D6 C100T、ADRB1 G1165C两个基因的多态性和CYP2D6有效拷贝数设计特异性扩增引物和测序引物,所述试剂盒包括如下组分:扩增反应液、CYP2D6C100T测序引物、ADRB1 G1165C测序引物、CYP2D6有效拷贝数测序引物和阳性对照。
2.根据权利要求1所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒,其特征在于,所述扩增反应液包括:CYP2D6 C100T的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2所示;所述ADRB1 G1165C的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:4所示;所述CYP2D6有效拷贝数的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:5~SEQ ID NO:6所示。
3.根据权利要求1所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒,其特征在于,所述扩增反应液还包括:所述CYP2D7-PNA探针阻滞引物序列如序列表SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求1所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒,其特征在于,所述CYP2D6 C100T测序引物、ADRB1 G1165C测序引物、CYP2D6有效拷贝数测序引物分别如序列表SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:9所示。
5.根据权利要求1所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒,其特征在于,所述阳性对照包括浓度为20ng/ul的CYP2D6*1/*10、ADRB1 1165G/C杂合型基因组DNA。
6.根据权利要求1所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒,其特征在于,所述扩增反应液还包括PCR Buffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶和海藻糖。
7.根据权利要求1所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒,其特征在于,所述反应液各组分浓度分别为:CYP2D6 C100T后引物1.2uM,CYP2D6 C100T后引物0.02uM,CYP2D7-PNA探针0.3uM,CYP2D6有效拷贝前引物1.2uM,CYP2D6有效拷贝后引物0.03uM,ADRB1 G1165C前引物1.2uM,ADRB1 G1165C后引物0.02uM,PCR Buffer1.5×,dNTPS0.3 mM、HS-Taq酶1U,BSA0.05mg/ml,海藻糖0.2%,dUTP0.5mM、UDG酶1U。
8.一种采用根据权利要求1~7任一所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述检测方法采用焦磷酸测序同时检测对CYP2D6C100T、ADRB1G1165C两个基因的多态性和CYP2D6有效拷贝数。
9.根据权利要求8所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测方法,其特征在于,所述焦磷酸测序的待测基因采用非对称多重PCR方式扩增获得。
10.一种采用根据权利要求1~7任一所述的用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒的应用,其特征在于,所述用于β受体拮抗剂用药的基因检测试剂盒同时检测CYP2D6C100T、ADRB1 G1165C两个基因的多态性和CYP2D6有效拷贝数,以判断样本源的代谢类型。
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