JP3947103B2 - 肝細胞毒性に対する素因を検出する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、薬剤誘発性肝細胞毒性に対する素因を診断する方法であって、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１）遺伝子における多型を判定することを含む方法に関する。
【０００２】
ＵＧＴ１は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）遺伝子スーパーファミリーの一員である。ＵＧＴ酵素は、生体内生物質および生体異物性物質の水溶性を高めるために、糖ヌクレオチドのグルクロノシル基を疎水性低分子（アグリコン）に付加する反応を触媒する。ＵＧＴ酵素は、多くの薬剤の代謝に関与する。この酵素スーパーファミリーに関する総説としては、Parmacogenetics (1997) 7, 255〜269を参照されたい。国際特許出願国際公開公報第９２／１２９８７号には、少なくとも９種類のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼのイソ酵素が存在することが記載されている。
【０００３】
Ritterら、J.Clin.Invest.(1992), 90, 150〜155;Aomooら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1993), 197, 1239〜1244; Moghrabiら、Am.J.Hum.Genet.(1993), 53, 722〜729; Labruneら、Hum Genet.(1994), 94, 693〜697、およびSeppenら、J.Clin.Invest.(1994),268,2385〜2391によれば、これらの酵素の一つであって、ＵＧＴ１遺伝子座にコードされているヒト・ビリルビン・グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子は、遺伝子欠損症と関連がある。
【０００４】
多型という用語は、特定のＤＮＡ配列中のある位置で異なったヌクレオチドが存在しうるという観察結果に関連している。遺伝子の多型は、ゲノム全体のどこにでも生じる。遺伝子の多型は、その遺伝子がコードするタンパク質の構造が変化することによって、または、その遺伝子の発現量に影響を与えることによって、遺伝子の機能に影響を与えることがある。
【０００５】
個体間における遺伝子変異または多型が、個体間に見られる生物学的な差異の大きな原因である。また、遺伝子変異は、薬剤に対して個体が示す反応に違いをもたらす。
【０００６】
インビトロ実験によって、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子とＵＧＴ１Ａ７遺伝子における変異が、これらの遺伝子がコードする酵素の特異的な基質に対する酵素活性に影響を与えることが示されている。
【０００７】
ヒトＵＧＴ１Ａ６（血漿フェノール）ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼにおける遺伝子多型と、その薬理学的意味が、Ciottiら、Pharmacogenetics (1997), 7, 485〜495に記載されている。クロニーングされ、単離されたＵＧＴ１Ａ６＊２対立遺伝子変異体（Ｔｈｒ１８１ＡｌａおよびＡｒｇ１８４Ｓｅｒという変異を含む）をＣＯＳ細胞で発現させたところ、pH ６．４で、基質である４−ニトロフェノール、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、３−エチルフェノール、４−エチルフェノール、４−ヒドロキシクマリン、ブチルヒドロキシアニソールおよびブチルヒドロキシトルエンを、野生型イソ酵素の僅か２７〜７５％の速度で代謝した。１−ナフトール、３−ヨードフェノール、７−ヒドロキシクマリン、および７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンは、正常なレベルで代謝された。３−Ｏ−メチル−ドーパ、およびメチルサリチル酸は、野生型イソ酵素の４１〜７４％の速度で代謝され、また、β−受容体遮断薬は、野生型イソ酵素の２８〜６９％の速度で代謝された。
【０００８】
Guillemeteら、Parmacogenetics (2000) 10, 629〜644は、クロニーングされ、単離された３種類のＵＧＴ１Ａ７対立遺伝子変異体をＨＥＫ細胞で発現させると、３−、７−、および９−ヒドロキシ−ベンゾ−（ａ）−ピレンに対して、野生型酵素に較べて異なった触媒活性を示すことを明らかにしている。ＵＧＴ１Ａ７＊３（Ｌｙｓ１２９Ｌｙｓ１３１Ａｒｇ２０８）は、野生型ＵＧＴ１Ａ７＊１（Ａｓｎ１２９Ａｒｇ１３１Ｔｒｐ２０８）と較べて５．８倍低いＶｍａｘ値を示したのに対し、ＵＧＴ１Ａ７＊２（Ｌｙｓ１２９Ｌｙｓ１３１Ｔｒｐ２０８）およびＵＧＴ１Ａ７＊４（Ａｓｎ１２９Ａｒｇ１３１Ａｒｇ２０８）は、ＵＧＴ１Ａ７＊１に較べて２．６倍および２．８倍低いＶｍａｘ値を示した。上記の結果は、ＵＧＴ１遺伝子における遺伝的変異をクロニーングし、培養細胞の中で発現させると、対応する遺伝子産物の酵素活性が、特定の基質に対して影響しうることを示してはいるが、ヒト個体において、このような変異が、これら基質の代謝に重大な影響を及ぼすとの証拠を示してはいない。
【０００９】
今では、ＵＧＴ１Ａ６およびＵＧＴ１Ａ７を含むＵＧＴ１遺伝子複合体における特定の遺伝子変異が、これら酵素によって代謝される薬物に対する各患者の反応に影響することが分かっている。
【００１０】
薬理遺伝学は、多型に関する知識を用いて、遺伝子変異が、薬物応答に関する個体間の違い、すなわち、薬物代謝に個人差があることから屡々生じる違いにおいて果たす役割を研究する方法である。薬理遺伝学は、特定の薬剤による治療に最も適した患者を同定するために役立つ。この方法を薬学研究において用いて、薬剤選択プロセスに役立てることもできる。多型は、疾患の遺伝的要素を解明するためにヒトゲノムのマッピングに利用される。薬理遺伝学の詳細、および多型検出法のその他の利用法については、Linderら、(1997), Clinical Chemistry, 43, 254; Marshall (1997), Nature Biotechnology, 15, 1249；国際特許出願国際公開公報第９７／４０４６２号、スペクトラ・バイオメディカル社（Spectra Biomedical)；およびSchaferら、(1998), Nature Biotechnology, 16, 33に記載されている。
【００１１】
有害事象または異常事象など、一定の臨床上の特徴と結びついた特定の変異または多型は、集団内での頻度が低い可能性が高いため、このような変異を同定する上では、低頻度ＳＮＰが特に有用である（例えば、「シスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）遺伝子座における連鎖不平衡、および、ＣＢＳ遺伝子座における遺伝子変異と血漿中のホモシステイン量との関係（Linkage disequilibrium at the cystathionine beta synthase (CBS) locus and the association between genetic variation at the CBS locus and plasma level of homocysteine)」(De Stefanoら、Ann.Hum.Genet.(1998) 62, 481〜90）、「フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子座における変異は、血漿中のｖＷＦ：Ａｇ量に関係する：ｖＷＦ遺伝子プロモーターにおける３つの新規一塩基多型の同定（Variation at the von Willebrand factor (vWF) gene locus is associated with plasma vWF: Ag levels: identification of three novel single nucleotide polymorphisms in the vWF gene promoter)」(Keightleyら、Blood (1999) 93, 4277〜83）などを参照されたい）。
【００１２】
薬学的に有効な薬剤を人間に投与すると、稀な場合に肝細胞毒性に至ることが分かっている。典型的な例は、トルカポン（tolcapone）の治験に参加していたパーキンソン病（ＰＤ）患者の一部で肝臓トランスアミナーゼ活性の可逆的で無症候性の上昇が見られたことである。これらの実験は、稀な場合に、トルカポンが肝臓トランスアミナーゼ活性の可逆的で無症候性の上昇を誘発しうることを示している。このため、肝細胞毒性の指標となる、このような肝臓の異常の発生と、一定の遺伝的素因との間に相関関係があるか否かを確認したいとの要求があった。今では、トルカポン（タスマール：ＴＡＳＭＡＲ）の代謝および薬理に関与する遺伝子の変異が、一定の個体における代謝活性に異常をもたらし、この薬剤またはその代謝産物の蓄積が毒性レベルにまで達する結果となることが知られている。
【００１３】
臨床試験によって、薬剤治療に対する患者の応答が、しばしば不均一になることが示されている。したがって、薬剤の設計および治療に対する改良法に対する需要もある。
【００１４】
このため、本発明は、素因となる遺伝子型を同定するための遺伝子診断ツールを提供する。該ツールは、人間からの試料中に含まれているＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１）遺伝子における少なくとも一個の一塩基多型を判定することによって、薬学的に有効な化合物を人間に投与することによって生じる肝細胞毒性反応に対する素因を検出することからなる方法であって、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１遺伝子のエキソン５における９０８位のヌクレオチドを判定すること、および、ＵＧＴ１における多型を参照することによって当人の状態を判定することを含む方法を提供する。または、あるいは、これに加えて、本方法は、配列番号２に記載された、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子のエキソン１における５２８位のその人の核酸の配列を決定すること、もしくは、配列番号３に記載された、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１における１９７位のその人間の核酸の配列を決定すること、および、ＵＧＴ１における多型を参照することによってその人の状態を判定することを含む。
【００１５】
人のＵＧＴ１遺伝子が、代謝活性に異常をもたらすような変異を含んでいる場合には、その人は肝毒反応に対する素因を有する。
【００１６】
配列番号１は、GenBankアクセッション番号Ｍ８４１２４を表し、ＵＧＴ１のエキソン５を提示するものである。
【００１７】
【表１】
【００１８】
本発明は、ＵＧＴ１遺伝子座における新規の一塩基多型（ＳＮＰ）を発見したことに基づく。すなわち、
配列番号１の９０８位。この位置における多型は、ＵＧＴ１遺伝子座のエキソン５において、ヌクレオチドＧがＣに置換されることからなり、
配列番号２の５２８位。この位置における多型は、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子のエキソン１において、ヌクレオチドＡがＧに置換されることからなり、
配列番号３の１９７位。この位置における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１において、ヌクレオチドＣがＧに置換されることからなる。
【００１９】
本明細書において、ＵＧＴ１遺伝子は、すべてのＵＧＴ１Ａイソ酵素のエキソンをコードする配列、エキソン配列の間に介在するイントロン配列、および、すべてのＵＧＴ１Ａイソ酵素をコードするＵＧＴ１遺伝子のプロモーター因子などを含む、３′末端ならびに５′末端にある非翻訳領域（３′ＵＴＲおよび５′ＵＴＲ）を含むものとする。
【００２０】
配列番号２は、GenBankアクセッション番号Ｍ８４１３０を表し、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１を提示するものである。
【００２１】
【表２】
【００２２】
配列番号３は、GenBankアクセッション番号Ｕ３９５７０を表し、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１を提示するものである。
【００２３】
【表３】
【００２４】
さらに、本発明は、人間のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１）遺伝子座における一個以上の一塩基多型を判定することによって、薬学的に有効な化合物を人間に投与した後の肝細胞毒性に対する素因を検出する方法であって、さらに、以下の位置における多型を判定する方法に関する。
配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における２３２位、
配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における７５４位、
配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における７６５位、
配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における５５１位、
配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における５５５位、
配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における５５６位、または、
配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における７８６位。
【００２５】
配列番号２のＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における２３２位での多型は、この位置におけるヌクレオチドＴがＧによって置換されることからなる（その結果、対応するタンパク質の７位のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）からアラニン（Ａｌａ）に換わる）。
【００２６】
配列番号２の７５４位における多型は、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＡがＧに置換されることからなる（その結果、対応するタンパク質の１８１位のアミノ酸がスレオニン（Ｔｈｒ）からアラニンに換わる）。
【００２７】
配列番号２の７６５位における多型は、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＡがＣに置換されることからなる（対応するタンパク質の１８４位のアミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ）からセリンに換わる）。
【００２８】
配列番号３の５５１位における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＴがＧに置換されることからなり、その結果、対応するタンパク質の１２９位のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）からリジン（Ｌｙｓ）に換わる。
【００２９】
配列番号３の５５５位における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＣがＡに置換されることからなる。その結果、サイレント変異となる（配列番号３の５５６位のヌクレオチドがＧからなる場合）か、または、対応するタンパク質の１３１位のアミノ酸がアルギニンからリジンに換わる（配列番号３の５５６位のヌクレオチドがＡからなる場合）。
【００３０】
配列番号３の５５６位における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＧが置換されることからなり、その結果、５５５位のヌクレオチドがＣの場合には、対応するタンパク質の１３１位のアミノ酸がアルギニンからグルタミン（Ｇｌｎ）に換わり、５５５位のヌクレオチドがＡの場合には、１３１位のアミノ酸がアルギニンからリジンに換わる。
【００３１】
配列番号３の７８６位における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＴがＣに置換されることからなる（その結果、対応するタンパク質の２０８位のアミノ酸がトリプトファン（Ｔｒｐ）からアルギニンに換わる）。
【００３２】
このように、本発明は、少なくとも一つの一塩基多型を判定することによって、薬学的に有効な化合物を人間に投与した後の肝細胞毒性に対する素因を検出する方法であって、ＵＧＴ１遺伝子座のエキソン５の９０８位における一塩基多型が、ＣまたはＧが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子座のエキソン１の５２８位における一塩基多型が、ＧまたはＡが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の１９７位における一塩基多型が、ＧまたはＣが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子座のエキソン１の２３２位における一塩基多型が、ＧまたはＴが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子座のエキソン１の７５４位における一塩基多型が、ＡまたはＧが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子座のエキソン１の７６５位における一塩基多型が、ＡまたはＣが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の５５１位における一塩基多型が、ＧまたはＴが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の５５５位における一塩基多型が、ＡまたはＣが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の５５６位における一塩基多型が、ＡまたはＣが存在することからなり、また、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の７８６位における一塩基多型が、ＣまたはＴが存在することからなる方法に関する。
【００３３】
肝細胞毒性反応を惹き起こす薬学的有効化合物は数多く知られている。そのような化合物の例には、エンタカポン（entacapone）、ニテカポン（nitecapone）、またはトルカポン（tolcapone）などのニトロカテコール系誘導体がある。これら薬剤の主要な代謝経路はグルクロン酸抱合である。
【００３４】
グルクロン酸抱合は、薬剤などの異物性物質の多くを除去する重要な経路である。ＵＧＴ１酵素は、多くの薬剤を含む多くの内在基質および外来基質のグルクロン酸抱合を触媒することが知られている。人間の被験者における薬理動態学的実験によって、人体からのトルカポン排出の主要な経路はグルクロン酸抱合であることが示されている（Jorgaら、Br.J.Clin.Pharmacol.(1999), 4, 513〜20）。薬剤排出経路における欠陥は、有害効果をもたらすことがある。本発明は、その中には、薬剤など、多くの基質のグルクロン酸抱合活性に影響を与えるものがあることが、インビトロ実験において知られている遺伝子変異であって、薬剤による治療を受けた人間の患者に有害効果を生じさせることと有意に関連する遺伝子変異の例を初めて示すものである。これらの結果から、本明細書に記載の方法は、ＵＧＴ１酵素によって代謝される薬剤の有害作用に対する素因を予測することに応用することができると結論づけることができる。
【００３５】
ＵＧＴによる薬剤のグルクロン酸抱合は、哺乳動物の解毒系における主要な第ＩＩ相抱合反応である（Burchellら、Life Sci.(1995), 57, 1819〜31）。ＵＧＴにおける多型は、基質の結合に顕著に影響することがあり、臨床的な症候群として表れる（内生する基質が影響を受ける場合）か、薬剤に対する反応の変化、および／または有害事象として表れる（薬剤が影響を受ける場合）ことがある。したがって、一般的に、ＵＧＴ１遺伝子における遺伝子配列の多型生を同定することが重要である。多型配列を含む核酸はスクリーニング測定に利用することができ、また、個体の遺伝子型同定に利用することもできる。遺伝子判定情報を用いて、各人のＵＧＴ１基質の代謝速度、薬剤と薬剤の相互作用の可能性、および有害／副作用や、環境的または職業上毒物に曝されることから生じる病気を予測することができる。これらの核酸を用いて、薬物代謝についての動物の細胞モデルおよびインビトロモデルを確立することができる。以下に同定された多型はすべて、個人のＵＧＴ１基質の代謝速度、薬剤と薬剤の相互作用の可能性、有害／副作用、および、環境的または職業上毒物に曝されることから生じる病気と関連づけることができる。
【００３６】
【表４】
【００３７】
表１のＳＮＰ位置は、常に、公開データベースにおける特定のアクセッション番号と、本明細書に示した対応配列番号をもつ配列中の位置を表している。遺伝子型同定のためのプライマー配列は、方法の項に示してある。塩基置換に関しては、野生型対立遺伝子を最初に記載している。アミノ酸置換についても同様である。配列番号１〜３は上記してある。配列番号４〜８は以下の通りである。
【００３８】
配列番号４は、GenBankアクセッション番号Ｕ３９５５０を表し、ＵＧＴ１Ａ１０のエキソン１を提示するものである。
【００３９】
【表５】
【００４０】
配列番号５は、GenBankアクセッション番号Ｕ４２６０４を表し、ＵＧＴ１Ａ８のエキソン１を提示するものである。
【００４１】
【表６】
【００４２】
配列番号６は、GenBankアクセッション番号ＡＦ０５６１８８を表し、ＵＧＴ１Ａ９のエキソン１を提示するものである。
【００４３】
【表７】
【００４４】
配列番号７は、GenBankアクセッション番号Ｍ８４１２２を表し、ＵＧＴ１Ａのイントロンを提示するものである。
【００４５】
【表８】
【００４６】
配列番号８は、GenBankアクセッション番号Ｍ８４１２３を表し、ＵＧＴ１Ａのエキソン４を提示するものである。
【００４７】
【表９】
【００４８】
本発明に係る方法は、例えば、対立遺伝子特異的増幅法（すなわち、商標ＡＲＭＳ−対立遺伝子特異的増幅法；ＡＲＭＳとは、増幅不応変異法（amplification refractory mutation system）のことである）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）、オリゴヌクレオチドライゲーション測定法（ＯＬＡ）、および制限酵素断片長多型法（ＲＦＬＰ）など、単一塩基の変異を検出するための適当な方法を用いて行なうことができる。
【００４９】
人間の体質は、配列番号１に記載された位置によるところの、エキソン５の９０８位における対立遺伝子変異、および、必要があれば、多型を示す１個以上の別の位置における対立遺伝子変異を参照することによって判定することができる。
【００５０】
該多型をもつ核酸の試験用試料は、便宜的には、血液、気管支肺胞洗浄液、痰、尿、もしくはその他の体液、または個体から採取した組織などの試料である。試験用試料は、試験用試料中の核酸配列に相当する核酸配列と同等であると理解すべきである。すなわち、試験用核酸中のすべての領域、または一部の領域は、対立遺伝子変異を分析する前に、まず、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）など、適当な技術を用いて増幅することができると考えられる。
【００５１】
本発明の多型位置の一つ以上に変異ヌクレオチドが存在するか否かを検出するために使用できる分析手法が数多くあることは、当業者に明らかなことである。一般的に、対立遺伝子変異を検出するには、変異を区別する技術、選択的には増幅反応法、さらに選択的にはシグナル発生系が必要である。国際特許出願国際公開公報第００／０６７６８号は、増幅法および変異検出技術をいくつか列挙しており、そのうちのいくつかはＰＣＲを利用したものである。これらを、いくつかのシグナル発生系と組み合わせて用いることができ、その選択法も国際公開公報第００／０６７６８号に列挙されている。対立遺伝子変異を検出する最新の方法の多くが、Nollauら、Clin.Chem.43, 1114〜1120, 1997や、例えば、U.Landegren編「変異検出のための実験プロトコール（Laboratory Protocols for Mutation Detection）」、オクスフォード大学出版（Oxford University Press)、1996、および、NewtonとGraham著「ＰＣＲ」第２版、BIOS Scientific Publishers Limited, 1997などの一般的な教科書において概説されている。
【００５２】
また、本発明は、その配列の中に、ＵＧＴ１のエキソン５の９０８位における多型（配列番号１）、エキソン１の７５４位における多型（配列番号２）、またはエキソン１の７６５位における多型を含む、診断用核酸に関する。
【００５３】
「診断用核酸」という用語は、ヒトＵＧＴ１遺伝子の一部または全部に相当する、長さ１７ヌクレオチド以上の塩基配列を意味する。診断用核酸は、好ましくは、多型を発現する、ヒトＵＧＴ１遺伝子の一部である。長さ１７〜１００ヌクレオチドが好ましい。
【００５４】
さらに、本発明は、ＵＧＴ１遺伝子における多型を検出するための診断用プライマーであって、その配列内に上記の多型を含む核酸にハイブリダイズすることができるプライマーとして使用することができる対立遺伝子特異的プライマーに関する。
【００５５】
対立遺伝子特異的プライマーは、通常、定常プライマー（constant primer）とともに、ＰＣＲ反応などの増幅反応に使用され、例えば、商標ＡＲＭＳ測定法に用いられるような、特定の配列位置における一個のアレルを選択的に増幅することによって、対立遺伝子を区別できるようにする。対立遺伝子特異的プライマーの長さは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、最も好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００５６】
好ましくは、対立遺伝子特異的プライマーは、検出しようとする対立遺伝子と正確に対応したプライマーであるが、その派生配列であって、３′末端側の約６〜８個のヌクレオチドが、検出しようとする対立遺伝子に一致し、残りのヌクレオチドのうち８個、６個、４個、２個または１個など、１０個までが、プライマーの性質に重大な影響を与えることなく変化している配列も考えられる。しばしば、示差的プライマー結合、および、正しい対立遺伝子識別プライマーのみからの選択的伸長反応を最適化するために、（３′末端に対して）−２および／または−３位にあるヌクレオチドをミスマッチさせる。
【００５７】
このような診断用対立遺伝子特異的プライマーの適当な例は以下の通りである。
【００５８】
【表１０】
【００５９】
適当な合成方法を用いて、プライマーを製造する。このような方法の例は、例えば、分子生物学の方法シリーズ（Methods in Molecular Biology Series)第20巻、Sudhir Agrawal編「オリゴヌクレオチドおよび類似化合物のためのプロトコール；合成法と特性（Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties)」ヒューマナ社（Humana）ISBN: 0-89603-247-7; 1993; 第1版。必要であれば、プライマーを標識して検出を容易にすることができる。
【００６０】
さらに、本発明は、ＵＧＴ１遺伝子における多型を検出するための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブであって、上で定義したような多型をその配列中に含む診断用核酸にハイブリダイズすることができるプローブに関する。
【００６１】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの長さは、好ましくは、１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは、約１７〜３５ヌクレオチド、最も好ましくは、約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００６２】
このようなプローブの設計法は、当業者には自明である。通常、このようなプローブは、遺伝子において対応する野生型または変異遺伝子座に完全に相補的な塩基配列を含んでいる。しかし、必要であれば、オリゴヌクレオチドプローブの識別力に不当に影響しない限り、一つ以上のミスマッチを導入することも可能である。本発明のプローブは、検出を容易にするために標識を一つ以上持っていてもよい。
【００６３】
さらに、本発明は、ＵＧＴ１遺伝子における多型を検出するための一つ以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーまたは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む診断用キットに関する。
【００６４】
診断用キットは、適当な包装と、本発明の方法において使用するための説明書を含むことができる。このようなキットは、さらに、一つ以上の適当な緩衝液、例えば、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼを一種類以上含むこともできる。また、このようなキットは、コンパニオン／定常プライマー、および／または対照用プライマーまたはプローブを含むこともできる。コンパニオン／定常プライマーとは、ＰＣＲを行なうために使用されるプライマーペアの一部のプライマーである。このようなプライマーは、大抵、鋳型鎖に正確に相補する。
【００６５】
さらに、本発明は、トルカポンのような薬学的に有効な化合物と、本発明の方法に従って、診断として一塩基多型を検査される人にその薬剤を投与するための指示説明書が入った医薬梱包物に関する。
【００６６】
さらに、本発明は、ＵＧＴ１のエキソン５の９０８位における多型に関する配列情報を保存していあるコンピュータで読み出し可能な媒体に関する。
【００６７】
さらに、本発明は、配列同定を行なう方法であって、例えば、エキソン５の９０８位における多型部位をもつ核酸配列、またはその相補鎖、もしくは、その断片であって２０塩基以上のものを提供するステップ、および、該核酸配列を、一つ以上の別の核酸配列またはポリペプチド配列と比較して、その同一性を確認するステップを含む方法に関する。
【００６８】
別段の定義ない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解されている意味と同じ意味をもつ。
【００６９】
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであり、本発明と見なされる範囲を制限するためのものではない。
【００７０】
【実施例】
トルカポンによって誘発される肝細胞毒性の解析
患者の選択
本実験のプロトコールとインフォームド・コンセント書類は、承認を得るため、それぞれの国の地域倫理委員会に提出された。すべての患者が、彼らの血液試料を遺伝子型同定に用いるためのインフォームド・コンセントを書面で提出した。患者の気持ちが変わったときには、一ヶ月後まではこの同意を撤回することができた。
【００７１】
試料のすべてに新しく別個の番号を割り当て、サンプル収集してから一ヶ月後に、新しい番号と当初の番号の間のリンクを削除した。これは、患者の秘密保持を確保するための追加的な措置であったが、結果的に、患者の名前、または最初の臨床試験で用いられた番号からは遺伝子型情報を得ることができなくなった。約１５年間で、すべての血液およびＤＮＡの試料は破壊されることになっている。
【００７２】
まず、以前臨床試験でトルカポンを投与された６４５人の患者が、今回の遡及的遺伝子解析に含まれていると考えられた。これには、正常値の上限（ＵＬＮ）の１．５倍以上の肝臓酵素量を示した患者２１５人と、正常な肝臓酵素量を示した患者４３０人が含まれていた。肝臓のトランスアミナーゼ（ＥＬＴ）が上昇している患者はそれぞれ、性別および年齢が適合するよう、２人以上の対照患者と組み合わせた（対象となった患者の大多数は白人であったため、人種による適合は必要ではなかった）。病気の重症度は、最初の試験における試験対象患者基準によって、既に調整されていた。２１５人のＥＬＴ患者のうち、１３５人のＥＬＴ患者が実験に参加し、３１人は、彼らの研究者が、実験を行なうための倫理委員会の承認を得られなかったため参加しなかった。また、４９人の患者は、追跡調査できなかったか、死亡した。全部で４０９人の患者が、この薬理遺伝学的解析に参加した。さまざまな治験地点や国にわたる患者の分布を表２に示す。
【００７３】
【表１１】
【００７４】
試料調製
一個の血液試料（９ml）をＥＤＴＡチューブに採集した。これらを凍結して、−２０℃〜−７０℃で保存してから、スイスのバーゼルにあるロシュ中央試料事務所（Roche Central Sample Office: CSO）に送り、そこで３本のチューブに分割し、患者の匿名性を確保するため、バーコード標識に新しい別個のコード番号を割り当てた。２本の血液試料（１mlと４ml）は、カリフォルニア州アラメダにあるロシュ・モレキュラー・システムズ社（Roche Molecular Systems: RMS）のロシュ・サンプル貯蔵施設（ＲＳＲ）に送られた。残りの４mlの等量液は、スイスのバーゼルにあるＣＳＯにおいて−８０℃で保存した。ＲＳＲにおいて試料に対して行われた処置はすべて、ＧＣＰガイドラインを用い、確立された標準的な操作手順に従って行なった。
【００７５】
シリカゲルによる抽出法（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ血液キット、カリフォルニア州バレンシア（Valencia, CA））を用いて、４００μlの全血からＤＮＡを抽出した。対照は、１０mM Ｔｒｉｓ pH ８．０，１mM ＥＤＴＡ （ＴＥ）緩衝液、および、ＤＮＡの収量が分かっている血液ユニットからの全血を含んでいた。
【００７６】
試料は、８個の異なった一塩基多型（ＳＮＰｓ）について、Newtonら、Nucleic Acids Res.(1989), 17(7), 2503〜16に記載された方法である、ＰＣＲプライマーと増幅しようとする鋳型との間の３′末端側ミスマッチに依存する増幅不応変異システム（ＡＲＭＳ）を用いて遺伝子同定した。
【００７７】
増幅不応変異システム（ARMS、Nucleic Acids Res.(1989), 17(7), 2503〜16）と、ポリメラーゼ連鎖反応のキネティック・サーマル・サイクラー（kinetic thermal cycler: KTC）方式を用いて、ＤＮＡにおける点突然変異の解析結果を変換した。この方法では、蛍光プローブを使用することなく、一本のチューブにおける一塩基多型（ＳＮＰ）を区別することが可能になる（Higuchiら、Biotechnology (1993), 11, 1026〜1030）。
【００７８】
ＫＴＣ方式では、ＤＮＡインターカレート色素と、蛍光検出用ＣＣＤカメラが付属したサーマル・サイクラー（ＰＥ−バイオシステムズ社（PE-Biosystems）のGeneAmp 5700配列検出装置）を用いて、二本鎖増幅産物の生成を監視する。アニーリングと変性の各周期毎にＰＣＲ増幅用プレートの各ウェルの蛍光を測定する。相対的蛍光度が、ＰＥ−バイオシステムズ社から購入したＳＤＳソフトウエアを用いて０．５という閾値に達したときのサイクルをＣｔと定義した。
【００７９】
増幅反応は、アレル特異的になるよう設計されていたため、多型が存在すると増幅反応は陽性となり、多型が存在しなければ増幅反応は陰性となった。各２アレル多型については、増幅用プレートの一つのウェルをアレル１に特異的になるよう設定し、別のウェルをアレル２に特異的になるよう設定した。検出しようとする多型のそれぞれについて、３種類のプライマー−２つはアレル特異的プライマー、および１つは共通プライマー（表３）−を設計した。アレル１のための反応液には、アレル１特異的プライマーと共通プライマーが含まれており、アレル２の反応液には、アレル２特異的プライマーと共通プライマーが含まれていた。
【００８０】
【表１２】
【００８１】
増幅条件は以下の通りである。１０mM Ｔｒｉｓ pH ８．０、４０mM ＫＣｌ、２mM ＭｇＣｌ2、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰを各々５０μm、ＴＴＰを２５μm、ｄＵＴＰを７５μm、４％ ＤＭＳＯ、０．２Ｘ ＳｙＢｒグリーン（オレゴン州ユージーン（Eugene, OR）にあるモレキュラー・プローブ社（Molecular Probe））、２％ グリセロール、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ、２単位）、ストッフェル・ゴールド（Stoffel Gold）・ＤＮＡポリメラーゼ（１５単位、参考として、Nature (1996), 381, 445〜6を参照されたい）、および、各ウェルにつき８５μl容量にしたプライマー。各測定に使用されるプライマー濃度を表２に示す。そして、３０ngのＤＮＡを１５μlの容量にして、各ウェルに加えた。
【００８２】
前に存在していた増幅産物が混入する可能性を下げるため、このアッセイ法は、増幅産物にｄＵＴＰを取り込ませる手順を含み、前に存在していたＵを含む産物をＵＮＧによって分解させるためのインキュベートのステップを含んでいた（Longoら、Gene (1990), 93, 125〜128）。
【００８３】
分注用ロボット（コネチカット州メリデン（Meriden, CT）にあるパッカード・マルチプローブＩＩ（Packard Multiprobe II））を用いて、実験管理データベースによって作成されたバーコード標識によって識別される９６−ウェルの増幅用プレートの中で増幅用反応液を調製した。ロボットによって行なわれる処理のパラメータは、クロスコンタミネーションの可能性が最小になるよう設定された。８１の試料の各プレート毎に、５個の試料を２回反復して行い、反復した結果を解析して、それらが合致するか判定した。
【００８４】
サーマル・サイクリングの条件は、以下の通りである。以前に混入したＰＣＲ産物をＵＮＧ分解するために５０℃で５分間、ストッフェル・ゴールド・ポリメラーゼを活性化するために９５℃で１２分間、９５℃での変性と表２に示したアニーリング温度でのアニーリングを５５回繰り返した後、６０℃〜９５℃まで１分間に１℃ずつ増加させる解離ステップを行う。増幅反応は、PE-Biosystems GeneAmp 5700配列検出装置（ＳＤＳ）（カリフォルニア州フォスターシティー（Foster City,CA））で行なった。解離曲線の最初の導関数は、ＳＤＳソフトウエアによって作成され、所定の反応における蛍光が、非特異的プライマーのダイマーによるのではなく、十分に明確な解離ピークをもつ特異的産物を増幅したためであることを確認するために必要とされる試験を行なった。産物の区別は、K.M.Ririeら、Anal.Biochem.(1997), 245, 154〜160の方法に従って、ＰＣＲ過程でのＤＮＡ融解カーブを解析して行なった。
【００８５】
各増幅反応のＣｔを測定し、アレル１とアレル２のＣｔの違い（ΔＣｔ）を測定結果として用いた。−３．０〜３．０までのΔＣｔをもつ試料をヘテロ接合（Ａ１／Ａ２）と見なした。−３．０よりも小さなΔＣｔをもつ試料をＡ１についてホモ接合（Ａ１／Ａ１）とみなし、３．０よりも大きなΔＣｔをもつ試料をＡ２についてホモ接合（Ａ２／Ａ２）とみなした。ほとんどの場合、この３つの遺伝子型グループ間におけるＣｔ値の違いは十分に明確であり、３．０に近いＣｔ値をもつ試料は矛盾する試料として再試験した。
【００８６】
各測定を、１４の細胞株のＤＮＡからなるパネル上で行い、各測定プレート（Ａ１／Ａ１、Ａ１／Ａ２、およびＡ２／Ａ２）上で対照として用いるのに適した遺伝子型をもつ細胞株を同定した。細胞株ＤＮＡは、カリフォルニア州アラメダにあるロシュ・モレキュラー・システムズ社（ＲＭＳ）の人類遺伝学部門（Human Genetics Department）から入手し、Ｑｉａｇｅｎ抽出用キット（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ血液キット、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出したものである。ＤＮＡ配列決定法によって、細胞株ＤＮＡの遺伝子型を確認した。３種類の細胞株ＤＮＡ（Ａ１／Ａ１、Ａ１／Ａ２、およびＡ２／Ａ２）を、臨床試験用試料のそれぞれのプレートで対照として使用し、プレート間の変動を判定するために用いた。さらに、各測定毎に、２つの細胞株からのＤＮＡを４回反復して測定し、プレート内での測定値の変動を判定した。対照の細胞株について得られたＣｔ値を解析して、臨床試験用試料で得られたΔＣｔ値に対するカットオフ値を決定した。
【００８７】
各ウェル毎のＣｔ値を含むデータファイルをＳＤＳソフトウエアによって作成し、実験管理用データベースに入力した。別個のコード番号で識別される最終遺伝型を含むデータファイルをデータベースから抽出して、統計解析を行うために、この別個のコード番号でも識別される臨床データを対応させた。
【００８８】
この他の一塩基多型（ＳＮＰｓ）の発見については、ＡＢＩキャピラリーシークエンサーとＢｉｇＤｙｅ化学法（ＡＢＩ）を用いた二本鎖ＤＮＡ配列決定法によって、遺伝子型同定を行なった。すべてのエキソンを増幅するために使用したプライマーを下記に示すが、これらは、配列決定用プライマーとしても使用された。公開されているゲノム配列をプライマー設計用の参考として利用した。これらのプライマーペアのセットによってすべての多型を標的とした。
【００８９】
【表１３】
【００９０】
プライマーＵＧＴ１Ａ６−Ｆ１は、配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における３〜２２位に対応し、プライマーＵＧＴ１Ａ６−Ｒ１は、相補鎖に対応し、配列番号２に記載された位置によるところの、５７１〜５９０位にハイブリダイズする。プライマーＵＧＴ１Ａ６−Ｆ２は、配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における３８１〜４００位を表している。プライマーＵＧＴ１Ａ６−Ｒ２は、相補鎖に対応し、配列番号２に記載された位置によるところの、９０１〜９２１位にハイブリダイズする。
【００９１】
プライマーＵＧＴ１Ａ７−Ｆ１は、配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における７８〜９８位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ７−Ｒ１は、相補鎖に対応し、配列番号３に記載された位置によるところの、６９６〜７１５位にハイブリダイズする。プライマーＵＧＴ１Ａ７−Ｆ２は、配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における４５９〜４７８位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ７−Ｒ２は、相補鎖に対応し、配列番号３に記載された位置によるところの、１１９０〜１２１２位にハイブリダイズする。
【００９２】
プライマーＵＧＴ１Ａ８−Ｆは、配列番号５に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ８のエキソン１における１〜２０位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ８−Ｒは、配列番号５に記載された位置によるところの、４７９〜５００位にハイブリダイズする。
【００９３】
プライマーＵＧＴ１Ａ９−Ｆは、配列番号６に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ９のエキソン１における１〜１８位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ９−Ｒは、配列番号６に記載された位置によるところの、２５７〜２７７位にハイブリダイズする。
【００９４】
プライマーＵＧＴ１Ａ１０−Ｆは、配列番号４に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における５９６〜６１５位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ１０−Ｒは、配列番号４に記載された位置によるところの、１１７７〜１１９４位にハイブリダイズする。
【００９５】
プライマーＵＧＴ１Ａｉｎ−Ｆは、配列番号７に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａのイントロンにおける１０〜３１位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａｉｎ−Ｒは、配列番号７に記載された位置によるところの、４７５〜４９６位にハイブリダイズする。
【００９６】
プライマーＵＧＴ１ｅｘ４−Ｆは、配列番号８に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａのエキソン４における２９１〜３１０位に対応する。プライマーＵＧＴ１ｅｘ４−Ｒは、配列番号８に記載された位置によるところの、７６１〜７８４位にハイブリダイズする。
【００９７】
プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−１−Ｆは、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１のエキソン５における６３〜８２位に対応する。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−１−Ｒは、配列番号１に記載された位置によるところの、６８４〜７０３位にハイブリダイズする。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−２−Ｆは、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１のエキソン５における４６１〜４８０位に対応する。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−２−Ｒは、配列番号１に記載された位置によるところの、１０８２〜１１０１位にハイブリダイズする。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−３−Ｆは、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１のエキソン５における９５９〜９７６位に対応する。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−３−Ｒは、配列番号１に記載された位置によるところの、１２６１〜１２８０位にハイブリダイズする。
【００９８】
４０ngのゲノムＤＮＡを、５０μlの反応液において、自動ＰＣＲ装置を用いてＰＣＲ増幅した。反応条件は以下の通り多様であった。ＵＧＴ１Ａ６−断片を増幅するための条件は以下の通りであった。１０mM Ｔｒｉｓ pH ８．３、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2、０．２mM各ｄＮＴＰ、０．４μM各プライマー、および１．５ Ｕベーリンガー（Boehringer）Ｔａｑポリメラーゼ。温度周期プロトコールは、まず、９５℃で１５分間、その後、９４℃で１分間、５７℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５回繰り返し、最後に７２℃で１０分間という伸長ステップからなる。ＵＧＴ１Ａ７−１断片は、１．５mM ＭｇＣｌ2、０．２mM各ｄＮＴＰ、０．４μM各プライマー、および１．５ ＵベーリンガーＴａｑポリメラーゼを添加したＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ緩衝液を用いて増幅した。温度周期プロトコールは、アニーリング温度を６１℃とした以外は、ＵＧＴ１Ａ６−断片のときと同じであった。ＵＧＴ１Ａ７−２断片については、ＰＣＲ条件は以下の通りである。１５０mM Ｔｒｉｓ pH ８．５、１５mM （ＮＨ4）2ＳＯ4、３．５mM ＭｇＣｌ2、０．２mM各ｄＮＴＰ、０．４μM各プライマー、および１．５ Ｕ ＱｉａｇｅｎホットスタートＴａｑポリメラーゼ。温度周期は、タッチダウンＰＣＲプロトコールを用いて行なった。最初に９５℃で１０分間増幅させた後、９５℃で１分間、６２℃で３０秒間（各周期毎に０．５℃ずつ下げる）、７２℃で１分間を５回繰り返し、９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間という伸長ステップを行なった。ＰＣＲ増幅した後、バイオロボット９６００（Biorobot 9600）上でＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて断片を精製した。サイクルシークエンシングは、ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅターミネーター化学法を用いて、製造者の指示に以下の変更を加えて、自動ＰＣＲ装置上で行なった。２．５〜５ng／１００塩基対のＰＣＲ産物を２μlのＢｉｇＤｙｅターミネーターミックスと混合し、オリゴヌクレオチドプライマーの濃度を１０pmolとし、必要があれば、５％ＤＭＳＯを反応液に加え、最終反応溶液量を１０μlとした。シークエンシング反応は、９３℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、および５８℃で１２０秒間の周期を２８回繰り返し行い、その後、エタノール／ＮａＯＡｃ沈殿を行なった。エタノールを除去した後、ＳｐｅｅｄＶａｃを２分間使用して、試料を乾燥させ、４５μlの超純水（メルク社（ＭＥＲＣＫ）、ＨＰＬＣ級）に再懸濁した。２．５mlをＰＯＰ５を、ポリマーとして用いたＡＢＩ３７００キャピラリーシークエンサーで泳動した。配列決定した後、ポリフレッド（Polyphred）ソフトウエアを用いて多型解析を行なった（ワシントン大学（University of Washington）より許可）。
【００９９】
遺伝子マーカーの選択と発見
トルカポンについて知られている薬理学、および、対応および関連する遺伝子産物の活性に影響を与えうる遺伝子多型に関する文献に基づいて遺伝子マーカーを選択した。トルカポン除去の主要な代謝経路は、ＵＧＴ１酵素によるグルクロン酸抱合である。
【０１００】
ＵＧＴ１酵素における多型に加えて、トルカポン代謝（図１）に関与する以下の酵素をコードする遺伝子における遺伝子多型も選択した。Lachmanら、Pharmacogenetics (1996), 6, 243〜250に記載されたカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ２、参考には、Vatsisら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1991), 88, 6333〜6337;Bandmannら、Lancet (1997), 350, 1136〜1139); Ozawaら、Chem.Biol.Interact.(1998), 109, 237〜248に記載された肝臓スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ１Ａ１）、およびチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ３Ａ４、Rebbeckら、J.Natl.Cancer Inst.(1998), 50, 1225〜1229）。酸化的ストレス応答に関与するマンガン・スーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD、Shimoda-Matsubayashiら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1996), 226, 561〜565）に関する遺伝子型も調査した。
【０１０１】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ６（ＵＧＴ１Ａ６）はグルクロン酸抱合によってトルカポンを代謝する可能性があるため、これを選択した。アレルＴｈｒ１８１ＡｌａおよびＡｒｇ１８４Ｓｅｒは、レボドパや他の基質に対して活性の低下を示すと記載されている（Ciottiら、Pharmacogenetics (1997), 7, 485〜495）。ＵＧＴ１Ａ遺伝子における既知の遺伝子多型は、この遺伝子クラスターの１２の遺伝子の一種類のメンバーにしか影響を与えない（図２）。したがって、共通の調節領域である可能性のある領域、すなわち遺伝子の３′末端における遺伝子変異が１２のＵＧＴ１Ａ遺伝子のいずれの発現にも効果があるかもしれないと考えた。さらに、ＵＧＴ１Ａ７がトルカポンの除去に関与するかもしれないと考えた。新しい遺伝子多型を同定するために、さまざまな人種の個体から得られた４７個の異なるＤＮＡ試料において、ＵＧＴ１の共通エキソン２〜５および３′非翻訳領域、ならびに、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９およびＵＧＴ１Ａ１０遺伝子のエキソン１の配列を決定した。３００〜７００塩基対の断片を、バイオロボット９６００（Biorobot 9600）上で、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いてカラム精製し、ＡＢＩ３７００キャピラリーシークエンサー上でＤｙｅターミネーター化学法を用いて、両鎖のシークエンシングを行なった。シークエンシング用プライマーとしてのＰＣＲ増幅用プライマーは、上で詳しく述べた。Ｇ／Ｃ変異が同定されたので、ＵＧＴ１Ａ−３′＿９０８と名付けたが、これは以下の頻度で生じた。ＣＣ：０．６３；ＧＣ：０．３３；ＧＧ：０．０４。数字の９０８は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１２４をもつＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。さらに、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９およびＵＧＴ１Ａ１０遺伝子において、以下の多型が同定されている。
【０１０２】
ＵＧＴ１Ａ６ｅｘｏｎ１＿３１８およびＵＧＴ１Ａ６ｅｘｏｎ１＿５２８。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１３０のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０３】
ＵＧＴ１Ａ７ｅｘｏｎ１＿１９７、ＵＧＴ１Ａ７ｅｘｏｎ１＿８２４、ＵＧＴ１Ａ７ｅｘｏｎ１＿９２０、およびＵＧＴ１Ａ７ｅｘｏｎ１＿９９２。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｕ３９５７０のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０４】
ＵＧＴ１Ａ８ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿２４５。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｕ４２６０４のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０５】
ＵＧＴ１Ａ９ｅｘｏｎ１＿２１４。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号ＡＦ０５６１８８のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０６】
ＵＧＴ１Ａ１０ｅｘｏｎ１＿９５９。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｕ３９５５０のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０７】
ＵＧＴ１Ａｉｎｔｒｏｎ＿１１７およびＵＧＴ１Ａｉｎｔｒｏｎ＿３７９。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１２２のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０８】
ＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ４＿４７３。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１２３のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０９】
ＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ５＿４２３、ＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ５＿７８０、ＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ５＿９０８（上記詳述）、およびＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ５＿１０１２。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１２４のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１１０】
患者の試料を２つのグループに分けた。グループ１は、トルカポンによる治療を受けているうちに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ値（ＡＳＴ：ＳＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ値（ＡＬＴ：ＳＧＰＴ）、またはビリルビン値が、研究者のＵＬＮの１．５倍以上になった症例患者からの試料を含んでいた。グループ２は、トルカポンによる治療を受けているときに測定したところ、ＳＧＯＴ値、ＳＧＰＴ値、およびビリルビン値が１×ＵＬＮよりも低い対照患者から採取した試料を含んでいた。
【０１１１】
各遺伝子型について、以下の解析を行なった。
ａ）全遺伝子型の解析：患者を以下の３つのカテゴリによって分類した。ホモ接合１／１（アレル１が２コピー、アレル２のコピーなし）、ヘテロ接合１／２（アレル１が１コピー、アレル２が１コピー）、またはホモ接合２／２（アレル１のコピーなし、アレル２の２コピー）。解析を行なって、これらのグループのそれぞれにおける症例患者の比率に違いがあるか否かを測定し、対照患者の比率と比較した。コクラン−マンテル−ヘンゼル（Cochran-Maentel-Hanszel：ＣＭＨ）検定を、２×３の表で表示されたデータに適用した（２つの列は肝機能異常の有無を示しており、３つの行は、遺伝子型の３つのカテゴリを示す）。
【０１１２】
ｂ）アレルの解析：症例患者におけるアレル１または２の出現と、対照患者におけるそれぞれのアレルの出現とを比較した。どちらのアレルについても、２×２の表（２つの列は肝機能異常の有無を示しており、２つの行は、それぞれのアレルの有無を示す）を用いてＣＭＨ検定を適用したところ、症例−対照のオッズ比と９５％信頼区間を計算した。１．０よりも大きいオッズ比は、１．０を含まない信頼区間とともに、アレルの存在と肝機能異常の発生との間に正の関係があることを示していた。
【０１１３】
ｃ）アレル計の解析：この解析は、肝機能異常をもつ患者におけるアレルの分布と、異常のない患者の分布とを比較するために行なった。肝機能異常をもつ患者の間におけるアレル１のコピー総数を、これらの症例患者におけるアレル２のコピー総数と比較した。２×２の表（２つの列は肝機能異常の有無を示しており、２つの行は、２つのアレルの合計を示す）を用いて、データにＣＭＨ検定を適用した。ここでも、症例−対照のオッズ比と９５％信頼区間が得られた。
【０１１４】
結果
全部で４０９人のトルカポン治療を受けた患者のうち、１３５人では、肝酵素が上限値の１．５倍以上に上昇しており、２７４人は対照と一致したが、ＵＧＴ１遺伝子など、トルカポンの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子から得られるさまざまな遺伝子マーカーについて遺伝子型を同定した。顕著な関連をもたらした遺伝子マーカーの解析結果を表４〜１３に示す。肝臓トランスアミナーゼの増加に対して有意な連関を示すマーカーはすべて、ＵＧＴ１遺伝子におけるＳＮＰに対応した。
【０１１５】
【表１４】
【０１１６】
トルカポン除去の主要な代謝経路はグルクロン酸抱合である。最近の遡及解析から得られた結果は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子における３種類の遺伝子多型と肝機能異常との間には有意な関連性があることを示した。これらの発見は、トルカポン除去が正常に行われないと、肝細胞毒性の原因になるとの仮説を裏付けている。ラットの培養肝細胞におけるインビトロ実験によって、グルクロン酸抱合および酸化を阻害すると、トルカポンの細胞毒性が強まることを示した。さらに、ＵＧＴ１Ａ６ Ａｌａ１８１／Ｓｅｒ１８４変異体は、Ｔｈｒ１８１／Ａｒｇ１８４変異体に較べて、インビトロにおける活性が低下することが示された（Ciottiら、Pharmacogenetics (1997), 7, 485〜495）。このことは、Ａｌａ１８１が存在していて、Ｓｅｒ１８４が存在しないことが、肝異常のリスクが徐徐に高まることと関係しているとする最近の知見にも合致する。ＵＧＴ１遺伝子の３′ＵＴＲに位置する多型（図２）は、トルカポンの代謝に関与するすべてのＵＧＴ１Ａ遺伝子の発現に影響する可能性がある。または、この多型は、ＵＧＴ１Ａタンパク質の構造、またはこの遺伝子の発現のいずれかに影響する別の変異と連鎖不平衡になっている可能性がある。
【０１１７】
その他の調査したマーカーとは、顕著な関連が見られなかった。これらの結果は、調べた遺伝子の中に別の多型が分布している可能性を排除するものではない。
【０１１８】
これらの関連から得られたオッズ比が比較的低いのは、薬剤に誘導される肝細胞毒性が多因子的な性質を持つからである。本研究全体を通じて、トルカポンによって治療を行なうと肝臓酵素増加が起きるのは、同時投薬などの外部からの影響、および／または異なった個体におけるいくつかの遺伝的因子の組み合わせなど、多数の因子によってもたらされる結果であることが明らかになった。
【表１５】
【図面の簡単な説明】
以下の図によって、本発明をさらに具体的に説明する。
【図１】 肝臓におけるトルカポンの主要代謝経路を示す。トルカポンは、チトクロームＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）によって酸化され、ニトロ基が、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）によって還元・アセチル化される。フェノール性水酸基は、スルホトランスフェラーゼ（ＳＴ）によって硫酸化されるか、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）によってメチル化されうる。肝臓における主要な解毒反応である水酸基のグルクロン酸抱合は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）によって触媒される。その後、さらに、グルクロン酸、硫酸、および酢酸による酸化または抱合によって、主要な代謝産物を修飾する。
【図２】 ＵＧＴ１Ａ遺伝子の構造を表す。ＵＧＴ１Ａ遺伝子は、５００kbよりも長い範囲に広がり、少なくとも１２個のプロモーターと、共通エキソンとともにスプライスされ、１２の異なったＵＧＴ１Ａ酵素を生じさせる１２個の第１エキソンからなる。ＵＧＴ１Ａ６転写物の構造を下記に示す。矢印は、本研究で用いられた多型マーカーの相対的位置を示す。ＵＧＴ−３′＿９０８は、配列番号１に記載された位置によるところの、エキソン５の９０８位における多型を表す。３′ＵＴＲ（非翻訳領域）におけるこの多型は、９個の機能的ＵＧＴ１Ａ酵素すべての発現に影響する可能性がある。エキソン１Ａ６におけるその他２つの多型は、ＵＧＴ１Ａ６のタンパク質構造に影響する。
本発明は、薬剤誘発性肝細胞毒性に対する素因を診断する方法であって、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１）遺伝子における多型を判定することを含む方法に関する。
【０００２】
ＵＧＴ１は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）遺伝子スーパーファミリーの一員である。ＵＧＴ酵素は、生体内生物質および生体異物性物質の水溶性を高めるために、糖ヌクレオチドのグルクロノシル基を疎水性低分子（アグリコン）に付加する反応を触媒する。ＵＧＴ酵素は、多くの薬剤の代謝に関与する。この酵素スーパーファミリーに関する総説としては、Parmacogenetics (1997) 7, 255〜269を参照されたい。国際特許出願国際公開公報第９２／１２９８７号には、少なくとも９種類のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼのイソ酵素が存在することが記載されている。
【０００３】
Ritterら、J.Clin.Invest.(1992), 90, 150〜155;Aomooら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1993), 197, 1239〜1244; Moghrabiら、Am.J.Hum.Genet.(1993), 53, 722〜729; Labruneら、Hum Genet.(1994), 94, 693〜697、およびSeppenら、J.Clin.Invest.(1994),268,2385〜2391によれば、これらの酵素の一つであって、ＵＧＴ１遺伝子座にコードされているヒト・ビリルビン・グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子は、遺伝子欠損症と関連がある。
【０００４】
多型という用語は、特定のＤＮＡ配列中のある位置で異なったヌクレオチドが存在しうるという観察結果に関連している。遺伝子の多型は、ゲノム全体のどこにでも生じる。遺伝子の多型は、その遺伝子がコードするタンパク質の構造が変化することによって、または、その遺伝子の発現量に影響を与えることによって、遺伝子の機能に影響を与えることがある。
【０００５】
個体間における遺伝子変異または多型が、個体間に見られる生物学的な差異の大きな原因である。また、遺伝子変異は、薬剤に対して個体が示す反応に違いをもたらす。
【０００６】
インビトロ実験によって、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子とＵＧＴ１Ａ７遺伝子における変異が、これらの遺伝子がコードする酵素の特異的な基質に対する酵素活性に影響を与えることが示されている。
【０００７】
ヒトＵＧＴ１Ａ６（血漿フェノール）ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼにおける遺伝子多型と、その薬理学的意味が、Ciottiら、Pharmacogenetics (1997), 7, 485〜495に記載されている。クロニーングされ、単離されたＵＧＴ１Ａ６＊２対立遺伝子変異体（Ｔｈｒ１８１ＡｌａおよびＡｒｇ１８４Ｓｅｒという変異を含む）をＣＯＳ細胞で発現させたところ、pH ６．４で、基質である４−ニトロフェノール、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、３−エチルフェノール、４−エチルフェノール、４−ヒドロキシクマリン、ブチルヒドロキシアニソールおよびブチルヒドロキシトルエンを、野生型イソ酵素の僅か２７〜７５％の速度で代謝した。１−ナフトール、３−ヨードフェノール、７−ヒドロキシクマリン、および７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンは、正常なレベルで代謝された。３−Ｏ−メチル−ドーパ、およびメチルサリチル酸は、野生型イソ酵素の４１〜７４％の速度で代謝され、また、β−受容体遮断薬は、野生型イソ酵素の２８〜６９％の速度で代謝された。
【０００８】
Guillemeteら、Parmacogenetics (2000) 10, 629〜644は、クロニーングされ、単離された３種類のＵＧＴ１Ａ７対立遺伝子変異体をＨＥＫ細胞で発現させると、３−、７−、および９−ヒドロキシ−ベンゾ−（ａ）−ピレンに対して、野生型酵素に較べて異なった触媒活性を示すことを明らかにしている。ＵＧＴ１Ａ７＊３（Ｌｙｓ１２９Ｌｙｓ１３１Ａｒｇ２０８）は、野生型ＵＧＴ１Ａ７＊１（Ａｓｎ１２９Ａｒｇ１３１Ｔｒｐ２０８）と較べて５．８倍低いＶｍａｘ値を示したのに対し、ＵＧＴ１Ａ７＊２（Ｌｙｓ１２９Ｌｙｓ１３１Ｔｒｐ２０８）およびＵＧＴ１Ａ７＊４（Ａｓｎ１２９Ａｒｇ１３１Ａｒｇ２０８）は、ＵＧＴ１Ａ７＊１に較べて２．６倍および２．８倍低いＶｍａｘ値を示した。上記の結果は、ＵＧＴ１遺伝子における遺伝的変異をクロニーングし、培養細胞の中で発現させると、対応する遺伝子産物の酵素活性が、特定の基質に対して影響しうることを示してはいるが、ヒト個体において、このような変異が、これら基質の代謝に重大な影響を及ぼすとの証拠を示してはいない。
【０００９】
今では、ＵＧＴ１Ａ６およびＵＧＴ１Ａ７を含むＵＧＴ１遺伝子複合体における特定の遺伝子変異が、これら酵素によって代謝される薬物に対する各患者の反応に影響することが分かっている。
【００１０】
薬理遺伝学は、多型に関する知識を用いて、遺伝子変異が、薬物応答に関する個体間の違い、すなわち、薬物代謝に個人差があることから屡々生じる違いにおいて果たす役割を研究する方法である。薬理遺伝学は、特定の薬剤による治療に最も適した患者を同定するために役立つ。この方法を薬学研究において用いて、薬剤選択プロセスに役立てることもできる。多型は、疾患の遺伝的要素を解明するためにヒトゲノムのマッピングに利用される。薬理遺伝学の詳細、および多型検出法のその他の利用法については、Linderら、(1997), Clinical Chemistry, 43, 254; Marshall (1997), Nature Biotechnology, 15, 1249；国際特許出願国際公開公報第９７／４０４６２号、スペクトラ・バイオメディカル社（Spectra Biomedical)；およびSchaferら、(1998), Nature Biotechnology, 16, 33に記載されている。
【００１１】
有害事象または異常事象など、一定の臨床上の特徴と結びついた特定の変異または多型は、集団内での頻度が低い可能性が高いため、このような変異を同定する上では、低頻度ＳＮＰが特に有用である（例えば、「シスタチオニンβシンターゼ（ＣＢＳ）遺伝子座における連鎖不平衡、および、ＣＢＳ遺伝子座における遺伝子変異と血漿中のホモシステイン量との関係（Linkage disequilibrium at the cystathionine beta synthase (CBS) locus and the association between genetic variation at the CBS locus and plasma level of homocysteine)」(De Stefanoら、Ann.Hum.Genet.(1998) 62, 481〜90）、「フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子座における変異は、血漿中のｖＷＦ：Ａｇ量に関係する：ｖＷＦ遺伝子プロモーターにおける３つの新規一塩基多型の同定（Variation at the von Willebrand factor (vWF) gene locus is associated with plasma vWF: Ag levels: identification of three novel single nucleotide polymorphisms in the vWF gene promoter)」(Keightleyら、Blood (1999) 93, 4277〜83）などを参照されたい）。
【００１２】
薬学的に有効な薬剤を人間に投与すると、稀な場合に肝細胞毒性に至ることが分かっている。典型的な例は、トルカポン（tolcapone）の治験に参加していたパーキンソン病（ＰＤ）患者の一部で肝臓トランスアミナーゼ活性の可逆的で無症候性の上昇が見られたことである。これらの実験は、稀な場合に、トルカポンが肝臓トランスアミナーゼ活性の可逆的で無症候性の上昇を誘発しうることを示している。このため、肝細胞毒性の指標となる、このような肝臓の異常の発生と、一定の遺伝的素因との間に相関関係があるか否かを確認したいとの要求があった。今では、トルカポン（タスマール：ＴＡＳＭＡＲ）の代謝および薬理に関与する遺伝子の変異が、一定の個体における代謝活性に異常をもたらし、この薬剤またはその代謝産物の蓄積が毒性レベルにまで達する結果となることが知られている。
【００１３】
臨床試験によって、薬剤治療に対する患者の応答が、しばしば不均一になることが示されている。したがって、薬剤の設計および治療に対する改良法に対する需要もある。
【００１４】
このため、本発明は、素因となる遺伝子型を同定するための遺伝子診断ツールを提供する。該ツールは、人間からの試料中に含まれているＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１）遺伝子における少なくとも一個の一塩基多型を判定することによって、薬学的に有効な化合物を人間に投与することによって生じる肝細胞毒性反応に対する素因を検出することからなる方法であって、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１遺伝子のエキソン５における９０８位のヌクレオチドを判定すること、および、ＵＧＴ１における多型を参照することによって当人の状態を判定することを含む方法を提供する。または、あるいは、これに加えて、本方法は、配列番号２に記載された、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子のエキソン１における５２８位のその人の核酸の配列を決定すること、もしくは、配列番号３に記載された、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１における１９７位のその人間の核酸の配列を決定すること、および、ＵＧＴ１における多型を参照することによってその人の状態を判定することを含む。
【００１５】
人のＵＧＴ１遺伝子が、代謝活性に異常をもたらすような変異を含んでいる場合には、その人は肝毒反応に対する素因を有する。
【００１６】
配列番号１は、GenBankアクセッション番号Ｍ８４１２４を表し、ＵＧＴ１のエキソン５を提示するものである。
【００１７】
【表１】
本発明は、ＵＧＴ１遺伝子座における新規の一塩基多型（ＳＮＰ）を発見したことに基づく。すなわち、
配列番号１の９０８位。この位置における多型は、ＵＧＴ１遺伝子座のエキソン５において、ヌクレオチドＧがＣに置換されることからなり、
配列番号２の５２８位。この位置における多型は、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子のエキソン１において、ヌクレオチドＡがＧに置換されることからなり、
配列番号３の１９７位。この位置における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１において、ヌクレオチドＣがＧに置換されることからなる。
【００１９】
本明細書において、ＵＧＴ１遺伝子は、すべてのＵＧＴ１Ａイソ酵素のエキソンをコードする配列、エキソン配列の間に介在するイントロン配列、および、すべてのＵＧＴ１Ａイソ酵素をコードするＵＧＴ１遺伝子のプロモーター因子などを含む、３′末端ならびに５′末端にある非翻訳領域（３′ＵＴＲおよび５′ＵＴＲ）を含むものとする。
【００２０】
配列番号２は、GenBankアクセッション番号Ｍ８４１３０を表し、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１を提示するものである。
【００２１】
【表２】
配列番号３は、GenBankアクセッション番号Ｕ３９５７０を表し、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１を提示するものである。
【００２３】
【表３】
さらに、本発明は、人間のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１）遺伝子座における一個以上の一塩基多型を判定することによって、薬学的に有効な化合物を人間に投与した後の肝細胞毒性に対する素因を検出する方法であって、さらに、以下の位置における多型を判定する方法に関する。
配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における２３２位、
配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における７５４位、
配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における７６５位、
配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における５５１位、
配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における５５５位、
配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における５５６位、または、
配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における７８６位。
【００２５】
配列番号２のＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における２３２位での多型は、この位置におけるヌクレオチドＴがＧによって置換されることからなる（その結果、対応するタンパク質の７位のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）からアラニン（Ａｌａ）に換わる）。
【００２６】
配列番号２の７５４位における多型は、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＡがＧに置換されることからなる（その結果、対応するタンパク質の１８１位のアミノ酸がスレオニン（Ｔｈｒ）からアラニンに換わる）。
【００２７】
配列番号２の７６５位における多型は、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＡがＣに置換されることからなる（対応するタンパク質の１８４位のアミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ）からセリンに換わる）。
【００２８】
配列番号３の５５１位における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＴがＧに置換されることからなり、その結果、対応するタンパク質の１２９位のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）からリジン（Ｌｙｓ）に換わる。
【００２９】
配列番号３の５５５位における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＣがＡに置換されることからなる。その結果、サイレント変異となる（配列番号３の５５６位のヌクレオチドがＧからなる場合）か、または、対応するタンパク質の１３１位のアミノ酸がアルギニンからリジンに換わる（配列番号３の５５６位のヌクレオチドがＡからなる場合）。
【００３０】
配列番号３の５５６位における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＧが置換されることからなり、その結果、５５５位のヌクレオチドがＣの場合には、対応するタンパク質の１３１位のアミノ酸がアルギニンからグルタミン（Ｇｌｎ）に換わり、５５５位のヌクレオチドがＡの場合には、１３１位のアミノ酸がアルギニンからリジンに換わる。
【００３１】
配列番号３の７８６位における多型は、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子のエキソン１のこの位置におけるヌクレオチドＴがＣに置換されることからなる（その結果、対応するタンパク質の２０８位のアミノ酸がトリプトファン（Ｔｒｐ）からアルギニンに換わる）。
【００３２】
このように、本発明は、少なくとも一つの一塩基多型を判定することによって、薬学的に有効な化合物を人間に投与した後の肝細胞毒性に対する素因を検出する方法であって、ＵＧＴ１遺伝子座のエキソン５の９０８位における一塩基多型が、ＣまたはＧが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子座のエキソン１の５２８位における一塩基多型が、ＧまたはＡが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の１９７位における一塩基多型が、ＧまたはＣが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子座のエキソン１の２３２位における一塩基多型が、ＧまたはＴが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子座のエキソン１の７５４位における一塩基多型が、ＡまたはＧが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ６遺伝子座のエキソン１の７６５位における一塩基多型が、ＡまたはＣが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の５５１位における一塩基多型が、ＧまたはＴが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の５５５位における一塩基多型が、ＡまたはＣが存在することからなり、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の５５６位における一塩基多型が、ＡまたはＣが存在することからなり、また、ＵＧＴ１Ａ７遺伝子座のエキソン１の７８６位における一塩基多型が、ＣまたはＴが存在することからなる方法に関する。
【００３３】
肝細胞毒性反応を惹き起こす薬学的有効化合物は数多く知られている。そのような化合物の例には、エンタカポン（entacapone）、ニテカポン（nitecapone）、またはトルカポン（tolcapone）などのニトロカテコール系誘導体がある。これら薬剤の主要な代謝経路はグルクロン酸抱合である。
【００３４】
グルクロン酸抱合は、薬剤などの異物性物質の多くを除去する重要な経路である。ＵＧＴ１酵素は、多くの薬剤を含む多くの内在基質および外来基質のグルクロン酸抱合を触媒することが知られている。人間の被験者における薬理動態学的実験によって、人体からのトルカポン排出の主要な経路はグルクロン酸抱合であることが示されている（Jorgaら、Br.J.Clin.Pharmacol.(1999), 4, 513〜20）。薬剤排出経路における欠陥は、有害効果をもたらすことがある。本発明は、その中には、薬剤など、多くの基質のグルクロン酸抱合活性に影響を与えるものがあることが、インビトロ実験において知られている遺伝子変異であって、薬剤による治療を受けた人間の患者に有害効果を生じさせることと有意に関連する遺伝子変異の例を初めて示すものである。これらの結果から、本明細書に記載の方法は、ＵＧＴ１酵素によって代謝される薬剤の有害作用に対する素因を予測することに応用することができると結論づけることができる。
【００３５】
ＵＧＴによる薬剤のグルクロン酸抱合は、哺乳動物の解毒系における主要な第ＩＩ相抱合反応である（Burchellら、Life Sci.(1995), 57, 1819〜31）。ＵＧＴにおける多型は、基質の結合に顕著に影響することがあり、臨床的な症候群として表れる（内生する基質が影響を受ける場合）か、薬剤に対する反応の変化、および／または有害事象として表れる（薬剤が影響を受ける場合）ことがある。したがって、一般的に、ＵＧＴ１遺伝子における遺伝子配列の多型生を同定することが重要である。多型配列を含む核酸はスクリーニング測定に利用することができ、また、個体の遺伝子型同定に利用することもできる。遺伝子判定情報を用いて、各人のＵＧＴ１基質の代謝速度、薬剤と薬剤の相互作用の可能性、および有害／副作用や、環境的または職業上毒物に曝されることから生じる病気を予測することができる。これらの核酸を用いて、薬物代謝についての動物の細胞モデルおよびインビトロモデルを確立することができる。以下に同定された多型はすべて、個人のＵＧＴ１基質の代謝速度、薬剤と薬剤の相互作用の可能性、有害／副作用、および、環境的または職業上毒物に曝されることから生じる病気と関連づけることができる。
【００３６】
【表４】
表１のＳＮＰ位置は、常に、公開データベースにおける特定のアクセッション番号と、本明細書に示した対応配列番号をもつ配列中の位置を表している。遺伝子型同定のためのプライマー配列は、方法の項に示してある。塩基置換に関しては、野生型対立遺伝子を最初に記載している。アミノ酸置換についても同様である。配列番号１〜３は上記してある。配列番号４〜８は以下の通りである。
【００３８】
配列番号４は、GenBankアクセッション番号Ｕ３９５５０を表し、ＵＧＴ１Ａ１０のエキソン１を提示するものである。
【００３９】
【表５】
配列番号５は、GenBankアクセッション番号Ｕ４２６０４を表し、ＵＧＴ１Ａ８のエキソン１を提示するものである。
【００４１】
【表６】
配列番号６は、GenBankアクセッション番号ＡＦ０５６１８８を表し、ＵＧＴ１Ａ９のエキソン１を提示するものである。
【００４３】
【表７】
配列番号７は、GenBankアクセッション番号Ｍ８４１２２を表し、ＵＧＴ１Ａのイントロンを提示するものである。
【００４５】
【表８】
配列番号８は、GenBankアクセッション番号Ｍ８４１２３を表し、ＵＧＴ１Ａのエキソン４を提示するものである。
【００４７】
【表９】
本発明に係る方法は、例えば、対立遺伝子特異的増幅法（すなわち、商標ＡＲＭＳ−対立遺伝子特異的増幅法；ＡＲＭＳとは、増幅不応変異法（amplification refractory mutation system）のことである）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＡＳＨ）、オリゴヌクレオチドライゲーション測定法（ＯＬＡ）、および制限酵素断片長多型法（ＲＦＬＰ）など、単一塩基の変異を検出するための適当な方法を用いて行なうことができる。
【００４９】
人間の体質は、配列番号１に記載された位置によるところの、エキソン５の９０８位における対立遺伝子変異、および、必要があれば、多型を示す１個以上の別の位置における対立遺伝子変異を参照することによって判定することができる。
【００５０】
該多型をもつ核酸の試験用試料は、便宜的には、血液、気管支肺胞洗浄液、痰、尿、もしくはその他の体液、または個体から採取した組織などの試料である。試験用試料は、試験用試料中の核酸配列に相当する核酸配列と同等であると理解すべきである。すなわち、試験用核酸中のすべての領域、または一部の領域は、対立遺伝子変異を分析する前に、まず、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）など、適当な技術を用いて増幅することができると考えられる。
【００５１】
本発明の多型位置の一つ以上に変異ヌクレオチドが存在するか否かを検出するために使用できる分析手法が数多くあることは、当業者に明らかなことである。一般的に、対立遺伝子変異を検出するには、変異を区別する技術、選択的には増幅反応法、さらに選択的にはシグナル発生系が必要である。国際特許出願国際公開公報第００／０６７６８号は、増幅法および変異検出技術をいくつか列挙しており、そのうちのいくつかはＰＣＲを利用したものである。これらを、いくつかのシグナル発生系と組み合わせて用いることができ、その選択法も国際公開公報第００／０６７６８号に列挙されている。対立遺伝子変異を検出する最新の方法の多くが、Nollauら、Clin.Chem.43, 1114〜1120, 1997や、例えば、U.Landegren編「変異検出のための実験プロトコール（Laboratory Protocols for Mutation Detection）」、オクスフォード大学出版（Oxford University Press)、1996、および、NewtonとGraham著「ＰＣＲ」第２版、BIOS Scientific Publishers Limited, 1997などの一般的な教科書において概説されている。
【００５２】
また、本発明は、その配列の中に、ＵＧＴ１のエキソン５の９０８位における多型（配列番号１）、エキソン１の７５４位における多型（配列番号２）、またはエキソン１の７６５位における多型を含む、診断用核酸に関する。
【００５３】
「診断用核酸」という用語は、ヒトＵＧＴ１遺伝子の一部または全部に相当する、長さ１７ヌクレオチド以上の塩基配列を意味する。診断用核酸は、好ましくは、多型を発現する、ヒトＵＧＴ１遺伝子の一部である。長さ１７〜１００ヌクレオチドが好ましい。
【００５４】
さらに、本発明は、ＵＧＴ１遺伝子における多型を検出するための診断用プライマーであって、その配列内に上記の多型を含む核酸にハイブリダイズすることができるプライマーとして使用することができる対立遺伝子特異的プライマーに関する。
【００５５】
対立遺伝子特異的プライマーは、通常、定常プライマー（constant primer）とともに、ＰＣＲ反応などの増幅反応に使用され、例えば、商標ＡＲＭＳ測定法に用いられるような、特定の配列位置における一個のアレルを選択的に増幅することによって、対立遺伝子を区別できるようにする。対立遺伝子特異的プライマーの長さは、好ましくは１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、最も好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００５６】
好ましくは、対立遺伝子特異的プライマーは、検出しようとする対立遺伝子と正確に対応したプライマーであるが、その派生配列であって、３′末端側の約６〜８個のヌクレオチドが、検出しようとする対立遺伝子に一致し、残りのヌクレオチドのうち８個、６個、４個、２個または１個など、１０個までが、プライマーの性質に重大な影響を与えることなく変化している配列も考えられる。しばしば、示差的プライマー結合、および、正しい対立遺伝子識別プライマーのみからの選択的伸長反応を最適化するために、（３′末端に対して）−２および／または−３位にあるヌクレオチドをミスマッチさせる。
【００５７】
このような診断用対立遺伝子特異的プライマーの適当な例は以下の通りである。
【００５８】
【表１０】
適当な合成方法を用いて、プライマーを製造する。このような方法の例は、例えば、分子生物学の方法シリーズ（Methods in Molecular Biology Series)第20巻、Sudhir Agrawal編「オリゴヌクレオチドおよび類似化合物のためのプロトコール；合成法と特性（Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties)」ヒューマナ社（Humana）ISBN: 0-89603-247-7; 1993; 第1版。必要であれば、プライマーを標識して検出を容易にすることができる。
【００６０】
さらに、本発明は、ＵＧＴ１遺伝子における多型を検出するための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブであって、上で定義したような多型をその配列中に含む診断用核酸にハイブリダイズすることができるプローブに関する。
【００６１】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの長さは、好ましくは、１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは、約１７〜３５ヌクレオチド、最も好ましくは、約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００６２】
このようなプローブの設計法は、当業者には自明である。通常、このようなプローブは、遺伝子において対応する野生型または変異遺伝子座に完全に相補的な塩基配列を含んでいる。しかし、必要であれば、オリゴヌクレオチドプローブの識別力に不当に影響しない限り、一つ以上のミスマッチを導入することも可能である。本発明のプローブは、検出を容易にするために標識を一つ以上持っていてもよい。
【００６３】
さらに、本発明は、ＵＧＴ１遺伝子における多型を検出するための一つ以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーまたは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む診断用キットに関する。
【００６４】
診断用キットは、適当な包装と、本発明の方法において使用するための説明書を含むことができる。このようなキットは、さらに、一つ以上の適当な緩衝液、例えば、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼを一種類以上含むこともできる。また、このようなキットは、コンパニオン／定常プライマー、および／または対照用プライマーまたはプローブを含むこともできる。コンパニオン／定常プライマーとは、ＰＣＲを行なうために使用されるプライマーペアの一部のプライマーである。このようなプライマーは、大抵、鋳型鎖に正確に相補する。
【００６５】
さらに、本発明は、トルカポンのような薬学的に有効な化合物と、本発明の方法に従って、診断として一塩基多型を検査される人にその薬剤を投与するための指示説明書が入った医薬梱包物に関する。
【００６６】
さらに、本発明は、ＵＧＴ１のエキソン５の９０８位における多型に関する配列情報を保存していあるコンピュータで読み出し可能な媒体に関する。
【００６７】
さらに、本発明は、配列同定を行なう方法であって、例えば、エキソン５の９０８位における多型部位をもつ核酸配列、またはその相補鎖、もしくは、その断片であって２０塩基以上のものを提供するステップ、および、該核酸配列を、一つ以上の別の核酸配列またはポリペプチド配列と比較して、その同一性を確認するステップを含む方法に関する。
【００６８】
別段の定義ない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解されている意味と同じ意味をもつ。
【００６９】
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであり、本発明と見なされる範囲を制限するためのものではない。
【００７０】
【実施例】
トルカポンによって誘発される肝細胞毒性の解析
患者の選択
本実験のプロトコールとインフォームド・コンセント書類は、承認を得るため、それぞれの国の地域倫理委員会に提出された。すべての患者が、彼らの血液試料を遺伝子型同定に用いるためのインフォームド・コンセントを書面で提出した。患者の気持ちが変わったときには、一ヶ月後まではこの同意を撤回することができた。
【００７１】
試料のすべてに新しく別個の番号を割り当て、サンプル収集してから一ヶ月後に、新しい番号と当初の番号の間のリンクを削除した。これは、患者の秘密保持を確保するための追加的な措置であったが、結果的に、患者の名前、または最初の臨床試験で用いられた番号からは遺伝子型情報を得ることができなくなった。約１５年間で、すべての血液およびＤＮＡの試料は破壊されることになっている。
【００７２】
まず、以前臨床試験でトルカポンを投与された６４５人の患者が、今回の遡及的遺伝子解析に含まれていると考えられた。これには、正常値の上限（ＵＬＮ）の１．５倍以上の肝臓酵素量を示した患者２１５人と、正常な肝臓酵素量を示した患者４３０人が含まれていた。肝臓のトランスアミナーゼ（ＥＬＴ）が上昇している患者はそれぞれ、性別および年齢が適合するよう、２人以上の対照患者と組み合わせた（対象となった患者の大多数は白人であったため、人種による適合は必要ではなかった）。病気の重症度は、最初の試験における試験対象患者基準によって、既に調整されていた。２１５人のＥＬＴ患者のうち、１３５人のＥＬＴ患者が実験に参加し、３１人は、彼らの研究者が、実験を行なうための倫理委員会の承認を得られなかったため参加しなかった。また、４９人の患者は、追跡調査できなかったか、死亡した。全部で４０９人の患者が、この薬理遺伝学的解析に参加した。さまざまな治験地点や国にわたる患者の分布を表２に示す。
【００７３】
【表１１】
試料調製
一個の血液試料（９ml）をＥＤＴＡチューブに採集した。これらを凍結して、−２０℃〜−７０℃で保存してから、スイスのバーゼルにあるロシュ中央試料事務所（Roche Central Sample Office: CSO）に送り、そこで３本のチューブに分割し、患者の匿名性を確保するため、バーコード標識に新しい別個のコード番号を割り当てた。２本の血液試料（１mlと４ml）は、カリフォルニア州アラメダにあるロシュ・モレキュラー・システムズ社（Roche Molecular Systems: RMS）のロシュ・サンプル貯蔵施設（ＲＳＲ）に送られた。残りの４mlの等量液は、スイスのバーゼルにあるＣＳＯにおいて−８０℃で保存した。ＲＳＲにおいて試料に対して行われた処置はすべて、ＧＣＰガイドラインを用い、確立された標準的な操作手順に従って行なった。
【００７５】
シリカゲルによる抽出法（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ血液キット、カリフォルニア州バレンシア（Valencia, CA））を用いて、４００μlの全血からＤＮＡを抽出した。対照は、１０mM Ｔｒｉｓ pH ８．０，１mM ＥＤＴＡ （ＴＥ）緩衝液、および、ＤＮＡの収量が分かっている血液ユニットからの全血を含んでいた。
【００７６】
試料は、８個の異なった一塩基多型（ＳＮＰｓ）について、Newtonら、Nucleic Acids Res.(1989), 17(7), 2503〜16に記載された方法である、ＰＣＲプライマーと増幅しようとする鋳型との間の３′末端側ミスマッチに依存する増幅不応変異システム（ＡＲＭＳ）を用いて遺伝子同定した。
【００７７】
増幅不応変異システム（ARMS、Nucleic Acids Res.(1989), 17(7), 2503〜16）と、ポリメラーゼ連鎖反応のキネティック・サーマル・サイクラー（kinetic thermal cycler: KTC）方式を用いて、ＤＮＡにおける点突然変異の解析結果を変換した。この方法では、蛍光プローブを使用することなく、一本のチューブにおける一塩基多型（ＳＮＰ）を区別することが可能になる（Higuchiら、Biotechnology (1993), 11, 1026〜1030）。
【００７８】
ＫＴＣ方式では、ＤＮＡインターカレート色素と、蛍光検出用ＣＣＤカメラが付属したサーマル・サイクラー（ＰＥ−バイオシステムズ社（PE-Biosystems）のGeneAmp 5700配列検出装置）を用いて、二本鎖増幅産物の生成を監視する。アニーリングと変性の各周期毎にＰＣＲ増幅用プレートの各ウェルの蛍光を測定する。相対的蛍光度が、ＰＥ−バイオシステムズ社から購入したＳＤＳソフトウエアを用いて０．５という閾値に達したときのサイクルをＣｔと定義した。
【００７９】
増幅反応は、アレル特異的になるよう設計されていたため、多型が存在すると増幅反応は陽性となり、多型が存在しなければ増幅反応は陰性となった。各２アレル多型については、増幅用プレートの一つのウェルをアレル１に特異的になるよう設定し、別のウェルをアレル２に特異的になるよう設定した。検出しようとする多型のそれぞれについて、３種類のプライマー−２つはアレル特異的プライマー、および１つは共通プライマー（表３）−を設計した。アレル１のための反応液には、アレル１特異的プライマーと共通プライマーが含まれており、アレル２の反応液には、アレル２特異的プライマーと共通プライマーが含まれていた。
【００８０】
【表１２】
増幅条件は以下の通りである。１０mM Ｔｒｉｓ pH ８．０、４０mM ＫＣｌ、２mM ＭｇＣｌ2、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰを各々５０μm、ＴＴＰを２５μm、ｄＵＴＰを７５μm、４％ ＤＭＳＯ、０．２Ｘ ＳｙＢｒグリーン（オレゴン州ユージーン（Eugene, OR）にあるモレキュラー・プローブ社（Molecular Probe））、２％ グリセロール、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ、２単位）、ストッフェル・ゴールド（Stoffel Gold）・ＤＮＡポリメラーゼ（１５単位、参考として、Nature (1996), 381, 445〜6を参照されたい）、および、各ウェルにつき８５μl容量にしたプライマー。各測定に使用されるプライマー濃度を表２に示す。そして、３０ngのＤＮＡを１５μlの容量にして、各ウェルに加えた。
【００８２】
前に存在していた増幅産物が混入する可能性を下げるため、このアッセイ法は、増幅産物にｄＵＴＰを取り込ませる手順を含み、前に存在していたＵを含む産物をＵＮＧによって分解させるためのインキュベートのステップを含んでいた（Longoら、Gene (1990), 93, 125〜128）。
【００８３】
分注用ロボット（コネチカット州メリデン（Meriden, CT）にあるパッカード・マルチプローブＩＩ（Packard Multiprobe II））を用いて、実験管理データベースによって作成されたバーコード標識によって識別される９６−ウェルの増幅用プレートの中で増幅用反応液を調製した。ロボットによって行なわれる処理のパラメータは、クロスコンタミネーションの可能性が最小になるよう設定された。８１の試料の各プレート毎に、５個の試料を２回反復して行い、反復した結果を解析して、それらが合致するか判定した。
【００８４】
サーマル・サイクリングの条件は、以下の通りである。以前に混入したＰＣＲ産物をＵＮＧ分解するために５０℃で５分間、ストッフェル・ゴールド・ポリメラーゼを活性化するために９５℃で１２分間、９５℃での変性と表２に示したアニーリング温度でのアニーリングを５５回繰り返した後、６０℃〜９５℃まで１分間に１℃ずつ増加させる解離ステップを行う。増幅反応は、PE-Biosystems GeneAmp 5700配列検出装置（ＳＤＳ）（カリフォルニア州フォスターシティー（Foster City,CA））で行なった。解離曲線の最初の導関数は、ＳＤＳソフトウエアによって作成され、所定の反応における蛍光が、非特異的プライマーのダイマーによるのではなく、十分に明確な解離ピークをもつ特異的産物を増幅したためであることを確認するために必要とされる試験を行なった。産物の区別は、K.M.Ririeら、Anal.Biochem.(1997), 245, 154〜160の方法に従って、ＰＣＲ過程でのＤＮＡ融解カーブを解析して行なった。
【００８５】
各増幅反応のＣｔを測定し、アレル１とアレル２のＣｔの違い（ΔＣｔ）を測定結果として用いた。−３．０〜３．０までのΔＣｔをもつ試料をヘテロ接合（Ａ１／Ａ２）と見なした。−３．０よりも小さなΔＣｔをもつ試料をＡ１についてホモ接合（Ａ１／Ａ１）とみなし、３．０よりも大きなΔＣｔをもつ試料をＡ２についてホモ接合（Ａ２／Ａ２）とみなした。ほとんどの場合、この３つの遺伝子型グループ間におけるＣｔ値の違いは十分に明確であり、３．０に近いＣｔ値をもつ試料は矛盾する試料として再試験した。
【００８６】
各測定を、１４の細胞株のＤＮＡからなるパネル上で行い、各測定プレート（Ａ１／Ａ１、Ａ１／Ａ２、およびＡ２／Ａ２）上で対照として用いるのに適した遺伝子型をもつ細胞株を同定した。細胞株ＤＮＡは、カリフォルニア州アラメダにあるロシュ・モレキュラー・システムズ社（ＲＭＳ）の人類遺伝学部門（Human Genetics Department）から入手し、Ｑｉａｇｅｎ抽出用キット（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ血液キット、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出したものである。ＤＮＡ配列決定法によって、細胞株ＤＮＡの遺伝子型を確認した。３種類の細胞株ＤＮＡ（Ａ１／Ａ１、Ａ１／Ａ２、およびＡ２／Ａ２）を、臨床試験用試料のそれぞれのプレートで対照として使用し、プレート間の変動を判定するために用いた。さらに、各測定毎に、２つの細胞株からのＤＮＡを４回反復して測定し、プレート内での測定値の変動を判定した。対照の細胞株について得られたＣｔ値を解析して、臨床試験用試料で得られたΔＣｔ値に対するカットオフ値を決定した。
【００８７】
各ウェル毎のＣｔ値を含むデータファイルをＳＤＳソフトウエアによって作成し、実験管理用データベースに入力した。別個のコード番号で識別される最終遺伝型を含むデータファイルをデータベースから抽出して、統計解析を行うために、この別個のコード番号でも識別される臨床データを対応させた。
【００８８】
この他の一塩基多型（ＳＮＰｓ）の発見については、ＡＢＩキャピラリーシークエンサーとＢｉｇＤｙｅ化学法（ＡＢＩ）を用いた二本鎖ＤＮＡ配列決定法によって、遺伝子型同定を行なった。すべてのエキソンを増幅するために使用したプライマーを下記に示すが、これらは、配列決定用プライマーとしても使用された。公開されているゲノム配列をプライマー設計用の参考として利用した。これらのプライマーペアのセットによってすべての多型を標的とした。
【００８９】
【表１３】
プライマーＵＧＴ１Ａ６−Ｆ１は、配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における３〜２２位に対応し、プライマーＵＧＴ１Ａ６−Ｒ１は、相補鎖に対応し、配列番号２に記載された位置によるところの、５７１〜５９０位にハイブリダイズする。プライマーＵＧＴ１Ａ６−Ｆ２は、配列番号２に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ６のエキソン１における３８１〜４００位を表している。プライマーＵＧＴ１Ａ６−Ｒ２は、相補鎖に対応し、配列番号２に記載された位置によるところの、９０１〜９２１位にハイブリダイズする。
【００９１】
プライマーＵＧＴ１Ａ７−Ｆ１は、配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における７８〜９８位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ７−Ｒ１は、相補鎖に対応し、配列番号３に記載された位置によるところの、６９６〜７１５位にハイブリダイズする。プライマーＵＧＴ１Ａ７−Ｆ２は、配列番号３に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における４５９〜４７８位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ７−Ｒ２は、相補鎖に対応し、配列番号３に記載された位置によるところの、１１９０〜１２１２位にハイブリダイズする。
【００９２】
プライマーＵＧＴ１Ａ８−Ｆは、配列番号５に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ８のエキソン１における１〜２０位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ８−Ｒは、配列番号５に記載された位置によるところの、４７９〜５００位にハイブリダイズする。
【００９３】
プライマーＵＧＴ１Ａ９−Ｆは、配列番号６に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ９のエキソン１における１〜１８位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ９−Ｒは、配列番号６に記載された位置によるところの、２５７〜２７７位にハイブリダイズする。
【００９４】
プライマーＵＧＴ１Ａ１０−Ｆは、配列番号４に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａ７のエキソン１における５９６〜６１５位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａ１０−Ｒは、配列番号４に記載された位置によるところの、１１７７〜１１９４位にハイブリダイズする。
【００９５】
プライマーＵＧＴ１Ａｉｎ−Ｆは、配列番号７に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａのイントロンにおける１０〜３１位に対応する。プライマーＵＧＴ１Ａｉｎ−Ｒは、配列番号７に記載された位置によるところの、４７５〜４９６位にハイブリダイズする。
【００９６】
プライマーＵＧＴ１ｅｘ４−Ｆは、配列番号８に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１Ａのエキソン４における２９１〜３１０位に対応する。プライマーＵＧＴ１ｅｘ４−Ｒは、配列番号８に記載された位置によるところの、７６１〜７８４位にハイブリダイズする。
【００９７】
プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−１−Ｆは、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１のエキソン５における６３〜８２位に対応する。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−１−Ｒは、配列番号１に記載された位置によるところの、６８４〜７０３位にハイブリダイズする。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−２−Ｆは、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１のエキソン５における４６１〜４８０位に対応する。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−２−Ｒは、配列番号１に記載された位置によるところの、１０８２〜１１０１位にハイブリダイズする。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−３−Ｆは、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１のエキソン５における９５９〜９７６位に対応する。プライマーＵＧＴ１ｅｘ５−３−Ｒは、配列番号１に記載された位置によるところの、１２６１〜１２８０位にハイブリダイズする。
【００９８】
４０ngのゲノムＤＮＡを、５０μlの反応液において、自動ＰＣＲ装置を用いてＰＣＲ増幅した。反応条件は以下の通り多様であった。ＵＧＴ１Ａ６−断片を増幅するための条件は以下の通りであった。１０mM Ｔｒｉｓ pH ８．３、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ2、０．２mM各ｄＮＴＰ、０．４μM各プライマー、および１．５ Ｕベーリンガー（Boehringer）Ｔａｑポリメラーゼ。温度周期プロトコールは、まず、９５℃で１５分間、その後、９４℃で１分間、５７℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５回繰り返し、最後に７２℃で１０分間という伸長ステップからなる。ＵＧＴ１Ａ７−１断片は、１．５mM ＭｇＣｌ2、０．２mM各ｄＮＴＰ、０．４μM各プライマー、および１．５ ＵベーリンガーＴａｑポリメラーゼを添加したＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ緩衝液を用いて増幅した。温度周期プロトコールは、アニーリング温度を６１℃とした以外は、ＵＧＴ１Ａ６−断片のときと同じであった。ＵＧＴ１Ａ７−２断片については、ＰＣＲ条件は以下の通りである。１５０mM Ｔｒｉｓ pH ８．５、１５mM （ＮＨ4）2ＳＯ4、３．５mM ＭｇＣｌ2、０．２mM各ｄＮＴＰ、０．４μM各プライマー、および１．５ Ｕ ＱｉａｇｅｎホットスタートＴａｑポリメラーゼ。温度周期は、タッチダウンＰＣＲプロトコールを用いて行なった。最初に９５℃で１０分間増幅させた後、９５℃で１分間、６２℃で３０秒間（各周期毎に０．５℃ずつ下げる）、７２℃で１分間を５回繰り返し、９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間という伸長ステップを行なった。ＰＣＲ増幅した後、バイオロボット９６００（Biorobot 9600）上でＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて断片を精製した。サイクルシークエンシングは、ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅターミネーター化学法を用いて、製造者の指示に以下の変更を加えて、自動ＰＣＲ装置上で行なった。２．５〜５ng／１００塩基対のＰＣＲ産物を２μlのＢｉｇＤｙｅターミネーターミックスと混合し、オリゴヌクレオチドプライマーの濃度を１０pmolとし、必要があれば、５％ＤＭＳＯを反応液に加え、最終反応溶液量を１０μlとした。シークエンシング反応は、９３℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、および５８℃で１２０秒間の周期を２８回繰り返し行い、その後、エタノール／ＮａＯＡｃ沈殿を行なった。エタノールを除去した後、ＳｐｅｅｄＶａｃを２分間使用して、試料を乾燥させ、４５μlの超純水（メルク社（ＭＥＲＣＫ）、ＨＰＬＣ級）に再懸濁した。２．５mlをＰＯＰ５を、ポリマーとして用いたＡＢＩ３７００キャピラリーシークエンサーで泳動した。配列決定した後、ポリフレッド（Polyphred）ソフトウエアを用いて多型解析を行なった（ワシントン大学（University of Washington）より許可）。
【００９９】
遺伝子マーカーの選択と発見
トルカポンについて知られている薬理学、および、対応および関連する遺伝子産物の活性に影響を与えうる遺伝子多型に関する文献に基づいて遺伝子マーカーを選択した。トルカポン除去の主要な代謝経路は、ＵＧＴ１酵素によるグルクロン酸抱合である。
【０１００】
ＵＧＴ１酵素における多型に加えて、トルカポン代謝（図１）に関与する以下の酵素をコードする遺伝子における遺伝子多型も選択した。Lachmanら、Pharmacogenetics (1996), 6, 243〜250に記載されたカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ２、参考には、Vatsisら、Proc.Natl.Acad.Sci.(1991), 88, 6333〜6337;Bandmannら、Lancet (1997), 350, 1136〜1139); Ozawaら、Chem.Biol.Interact.(1998), 109, 237〜248に記載された肝臓スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ１Ａ１）、およびチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ３Ａ４、Rebbeckら、J.Natl.Cancer Inst.(1998), 50, 1225〜1229）。酸化的ストレス応答に関与するマンガン・スーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD、Shimoda-Matsubayashiら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1996), 226, 561〜565）に関する遺伝子型も調査した。
【０１０１】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ６（ＵＧＴ１Ａ６）はグルクロン酸抱合によってトルカポンを代謝する可能性があるため、これを選択した。アレルＴｈｒ１８１ＡｌａおよびＡｒｇ１８４Ｓｅｒは、レボドパや他の基質に対して活性の低下を示すと記載されている（Ciottiら、Pharmacogenetics (1997), 7, 485〜495）。ＵＧＴ１Ａ遺伝子における既知の遺伝子多型は、この遺伝子クラスターの１２の遺伝子の一種類のメンバーにしか影響を与えない（図２）。したがって、共通の調節領域である可能性のある領域、すなわち遺伝子の３′末端における遺伝子変異が１２のＵＧＴ１Ａ遺伝子のいずれの発現にも効果があるかもしれないと考えた。さらに、ＵＧＴ１Ａ７がトルカポンの除去に関与するかもしれないと考えた。新しい遺伝子多型を同定するために、さまざまな人種の個体から得られた４７個の異なるＤＮＡ試料において、ＵＧＴ１の共通エキソン２〜５および３′非翻訳領域、ならびに、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９およびＵＧＴ１Ａ１０遺伝子のエキソン１の配列を決定した。３００〜７００塩基対の断片を、バイオロボット９６００（Biorobot 9600）上で、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いてカラム精製し、ＡＢＩ３７００キャピラリーシークエンサー上でＤｙｅターミネーター化学法を用いて、両鎖のシークエンシングを行なった。シークエンシング用プライマーとしてのＰＣＲ増幅用プライマーは、上で詳しく述べた。Ｇ／Ｃ変異が同定されたので、ＵＧＴ１Ａ−３′＿９０８と名付けたが、これは以下の頻度で生じた。ＣＣ：０．６３；ＧＣ：０．３３；ＧＧ：０．０４。数字の９０８は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１２４をもつＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。さらに、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９およびＵＧＴ１Ａ１０遺伝子において、以下の多型が同定されている。
【０１０２】
ＵＧＴ１Ａ６ｅｘｏｎ１＿３１８およびＵＧＴ１Ａ６ｅｘｏｎ１＿５２８。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１３０のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０３】
ＵＧＴ１Ａ７ｅｘｏｎ１＿１９７、ＵＧＴ１Ａ７ｅｘｏｎ１＿８２４、ＵＧＴ１Ａ７ｅｘｏｎ１＿９２０、およびＵＧＴ１Ａ７ｅｘｏｎ１＿９９２。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｕ３９５７０のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０４】
ＵＧＴ１Ａ８ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿２４５。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｕ４２６０４のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０５】
ＵＧＴ１Ａ９ｅｘｏｎ１＿２１４。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号ＡＦ０５６１８８のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０６】
ＵＧＴ１Ａ１０ｅｘｏｎ１＿９５９。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｕ３９５５０のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０７】
ＵＧＴ１Ａｉｎｔｒｏｎ＿１１７およびＵＧＴ１Ａｉｎｔｒｏｎ＿３７９。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１２２のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０８】
ＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ４＿４７３。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１２３のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１０９】
ＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ５＿４２３、ＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ５＿７８０、ＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ５＿９０８（上記詳述）、およびＵＧＴ１Ａｅｘｏｎ５＿１０１２。数字は、公開データベースのGenBankアクセッション番号Ｍ８４１２４のＤＮＡ配列に対応するＳＮＰの位置を意味する。
【０１１０】
患者の試料を２つのグループに分けた。グループ１は、トルカポンによる治療を受けているうちに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ値（ＡＳＴ：ＳＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ値（ＡＬＴ：ＳＧＰＴ）、またはビリルビン値が、研究者のＵＬＮの１．５倍以上になった症例患者からの試料を含んでいた。グループ２は、トルカポンによる治療を受けているときに測定したところ、ＳＧＯＴ値、ＳＧＰＴ値、およびビリルビン値が１×ＵＬＮよりも低い対照患者から採取した試料を含んでいた。
【０１１１】
各遺伝子型について、以下の解析を行なった。
ａ）全遺伝子型の解析：患者を以下の３つのカテゴリによって分類した。ホモ接合１／１（アレル１が２コピー、アレル２のコピーなし）、ヘテロ接合１／２（アレル１が１コピー、アレル２が１コピー）、またはホモ接合２／２（アレル１のコピーなし、アレル２の２コピー）。解析を行なって、これらのグループのそれぞれにおける症例患者の比率に違いがあるか否かを測定し、対照患者の比率と比較した。コクラン−マンテル−ヘンゼル（Cochran-Maentel-Hanszel：ＣＭＨ）検定を、２×３の表で表示されたデータに適用した（２つの列は肝機能異常の有無を示しており、３つの行は、遺伝子型の３つのカテゴリを示す）。
【０１１２】
ｂ）アレルの解析：症例患者におけるアレル１または２の出現と、対照患者におけるそれぞれのアレルの出現とを比較した。どちらのアレルについても、２×２の表（２つの列は肝機能異常の有無を示しており、２つの行は、それぞれのアレルの有無を示す）を用いてＣＭＨ検定を適用したところ、症例−対照のオッズ比と９５％信頼区間を計算した。１．０よりも大きいオッズ比は、１．０を含まない信頼区間とともに、アレルの存在と肝機能異常の発生との間に正の関係があることを示していた。
【０１１３】
ｃ）アレル計の解析：この解析は、肝機能異常をもつ患者におけるアレルの分布と、異常のない患者の分布とを比較するために行なった。肝機能異常をもつ患者の間におけるアレル１のコピー総数を、これらの症例患者におけるアレル２のコピー総数と比較した。２×２の表（２つの列は肝機能異常の有無を示しており、２つの行は、２つのアレルの合計を示す）を用いて、データにＣＭＨ検定を適用した。ここでも、症例−対照のオッズ比と９５％信頼区間が得られた。
【０１１４】
結果
全部で４０９人のトルカポン治療を受けた患者のうち、１３５人では、肝酵素が上限値の１．５倍以上に上昇しており、２７４人は対照と一致したが、ＵＧＴ１遺伝子など、トルカポンの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子から得られるさまざまな遺伝子マーカーについて遺伝子型を同定した。顕著な関連をもたらした遺伝子マーカーの解析結果を表４〜１３に示す。肝臓トランスアミナーゼの増加に対して有意な連関を示すマーカーはすべて、ＵＧＴ１遺伝子におけるＳＮＰに対応した。
【０１１５】
【表１４】
トルカポン除去の主要な代謝経路はグルクロン酸抱合である。最近の遡及解析から得られた結果は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子における３種類の遺伝子多型と肝機能異常との間には有意な関連性があることを示した。これらの発見は、トルカポン除去が正常に行われないと、肝細胞毒性の原因になるとの仮説を裏付けている。ラットの培養肝細胞におけるインビトロ実験によって、グルクロン酸抱合および酸化を阻害すると、トルカポンの細胞毒性が強まることを示した。さらに、ＵＧＴ１Ａ６ Ａｌａ１８１／Ｓｅｒ１８４変異体は、Ｔｈｒ１８１／Ａｒｇ１８４変異体に較べて、インビトロにおける活性が低下することが示された（Ciottiら、Pharmacogenetics (1997), 7, 485〜495）。このことは、Ａｌａ１８１が存在していて、Ｓｅｒ１８４が存在しないことが、肝異常のリスクが徐徐に高まることと関係しているとする最近の知見にも合致する。ＵＧＴ１遺伝子の３′ＵＴＲに位置する多型（図２）は、トルカポンの代謝に関与するすべてのＵＧＴ１Ａ遺伝子の発現に影響する可能性がある。または、この多型は、ＵＧＴ１Ａタンパク質の構造、またはこの遺伝子の発現のいずれかに影響する別の変異と連鎖不平衡になっている可能性がある。
【０１１７】
その他の調査したマーカーとは、顕著な関連が見られなかった。これらの結果は、調べた遺伝子の中に別の多型が分布している可能性を排除するものではない。
【０１１８】
これらの関連から得られたオッズ比が比較的低いのは、薬剤に誘導される肝細胞毒性が多因子的な性質を持つからである。本研究全体を通じて、トルカポンによって治療を行なうと肝臓酵素増加が起きるのは、同時投薬などの外部からの影響、および／または異なった個体におけるいくつかの遺伝的因子の組み合わせなど、多数の因子によってもたらされる結果であることが明らかになった。
【表１５】
【図面の簡単な説明】
以下の図によって、本発明をさらに具体的に説明する。
【図１】 肝臓におけるトルカポンの主要代謝経路を示す。トルカポンは、チトクロームＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）によって酸化され、ニトロ基が、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）によって還元・アセチル化される。フェノール性水酸基は、スルホトランスフェラーゼ（ＳＴ）によって硫酸化されるか、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）によってメチル化されうる。肝臓における主要な解毒反応である水酸基のグルクロン酸抱合は、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）によって触媒される。その後、さらに、グルクロン酸、硫酸、および酢酸による酸化または抱合によって、主要な代謝産物を修飾する。
【図２】 ＵＧＴ１Ａ遺伝子の構造を表す。ＵＧＴ１Ａ遺伝子は、５００kbよりも長い範囲に広がり、少なくとも１２個のプロモーターと、共通エキソンとともにスプライスされ、１２の異なったＵＧＴ１Ａ酵素を生じさせる１２個の第１エキソンからなる。ＵＧＴ１Ａ６転写物の構造を下記に示す。矢印は、本研究で用いられた多型マーカーの相対的位置を示す。ＵＧＴ−３′＿９０８は、配列番号１に記載された位置によるところの、エキソン５の９０８位における多型を表す。３′ＵＴＲ（非翻訳領域）におけるこの多型は、９個の機能的ＵＧＴ１Ａ酵素すべての発現に影響する可能性がある。エキソン１Ａ６におけるその他２つの多型は、ＵＧＴ１Ａ６のタンパク質構造に影響する。
Claims (12)
- 人間の試料中のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１）遺伝子における一塩基多型の判定に基づいて、薬学的に有効な化合物の投与によって生じるヒトの肝細胞毒性反応に対する素因を検出する方法であって、
配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１遺伝子のエキソン５における９０８位のヌクレオチドを判定することを含む方法。 - 人間からの試料中に含まれているＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１）遺伝子における少なくとも一個の一塩基多型の判定に基づいて、薬学的に有効な化合物の投与によって生じるヒトの肝細胞毒性反応に対する素因を検出する方法であって、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＧＴ１遺伝子のエキソン５における９０８位のヌクレオチドを判定することを含む方法。
- 請求項１又は２記載の方法であって、ＵＧＴ１遺伝子座のエキソン５の９０８位における一塩基多型が、ＣまたはＧが存在することからなる方法。
- 配列を決定する前に、多型を含む領域を増幅する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 多型を含む領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する、請求項４記載の方法。
- 配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＴＧ１のエキソン５における９０８位の多型を検出するための、１７〜１００ヌクレオチドの診断用核酸であって、以下の多型含有配列、すなわち、
ＵＧＴ１のエキソン５における９０８位にＣをもつ、配列番号１記載の塩基配列、
ＵＧＴ１のエキソン５における９０８位にＧをもつ、配列番号１記載の塩基配列、または、
その相補鎖、もしくは、その断片であって、上記多型の一つを含む断片を含む診断用核酸。 - ＵＧＴ１のエキソン５における９０８位にＣをもつ、配列番号１記載の塩基配列の一部からなる、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＴＧ１のエキソン５における９０８位の多型を検出するための、１７〜１００ヌクレオチドの診断用核酸。
- ＵＧＴ１のエキソン５における９０８位にＧをもつ、配列番号１記載の塩基配列の一部からなる、配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＴＧ１のエキソン５における９０８位の多型を検出するための、１７〜１００ヌクレオチドの診断用核酸。
- 配列番号１に記載された位置によるところの、ＵＴＧ１のエキソン５における９０８位の多型を検出するための、１７〜１００ヌクレオチドの診断用核酸のセットであって、以下の多型含有配列、すなわち、
ＵＧＴ１のエキソン５における９０８位にＣをもつ、配列番号１記載の塩基配列、
ＵＧＴ１のエキソン５における９０８位にＧをもつ、配列番号１記載の塩基配列、または、
その相補鎖、もしくは、その断片であって、上記多型の一つを含む断片を含む診断用核酸のセット。 - 配列番号１に記載された位置によるところのＵＧＴ１遺伝子のエキソン５における９０８位の多型を検出するための診断用核酸プライマーであって、該プライマーは対立遺伝子特異的プライマーであり、請求項３記載の多型をもつ核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、配列番号１記載の塩基配列の一部からなる１７〜５０ヌクレオチドの診断用核酸プライマー。
- 配列番号１に記載された位置によるところのＵＧＴ１遺伝子のエキソン５における９０８位の多型を検出するための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブであって、請求項３記載の多型の一つをもつ核酸に特異的にハイブリダイズすることができ、配列番号１記載の塩基配列の一部からなる、１７〜５０ヌクレオチドの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ。
- 請求項１０記載の診断用プライマーを一種類以上、および／または、請求項１１記載の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを一種類以上含む診断用キット。
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