DE10207971A1

DE10207971A1 - Verfahren zur Identifizierung Nebenwirkungs-relevanter Markerprofile

Info

Publication number: DE10207971A1
Application number: DE10207971A
Authority: DE
Inventors: Norbert Dahmen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-02-25
Filing date: 2002-02-25
Publication date: 2003-09-11
Also published as: AU2003210352A1; WO2003070978A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines nebenwirkungsrelevanten, genetischen Marker-Profils, bei dem man DOLLAR A (a) eine Patienten-Gruppe identifiziert, die Nebenwirkungen bei Einnahme einer oder mehrerer bestimmter pharmazeutischer Zusammensetzungen erlitten haben; DOLLAR A (b) die Gegenwart und/oder Häufigkeit einer Vielzahl von Marker-Sequenzen in der Patienten-Gruppe mit der Gegenwart und/oder Häufigkeit derselben Sequenzen in einer Kontroll-Gruppe durch genetische Analyse vergleicht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung Nebenwirkungs-relevanter genetischer Marker-Profile, sowie deren Verwendung zur Verbesserung klinischer und vorklinischer Versuche zur Zulassung von Arzneimitteln.
Pharmazeutische Wirkstoffe entfalten ihre Wirkungen üblicherweise, indem sie mit bestimmten Zielstrukturen des zu behandelnden Subjekts, in der Regel mit Proteinen, beispielsweise Rezeptoren, Hormonen oder Zytokinen, interagieren. So kann eine entsprechende Interaktion die Bindung des Wirkstoffes an einen Rezeptor umfassen, wodurch der Rezeptor für die Bindung durch den natürlichen Liganden blockiert wird.
Die Zielstrukturen werden auch als "Targets" bezeichnet und die Auffindung einer Interaktion zwischen einem Wirkstoff und einem "Target" ist Gegenstand der präklinischen pharmakologischen Forschung, die von allen Pharmafirmen und insbesondere von Biotechnologiefirmen systematisch betrieben wird.
Im Gegensatz dazu wird die Analyse der Nebenwirkungen eines Wirkstoffes in der vorklinischen Entwicklung vollständig unberücksichtigt gelassen. Selbst während der klinischen Erprobungsphase wird lediglich auf das Auftreten unerwünschter Ereignisse geachtet. Eine systematische Erforschung der Nebenwirkungen findet jedoch nicht statt. So kommt es immer wieder vor, dass in einer späten klinischen Erprobungsphase oder sogar erst nach der Zulassung eines Arzneimittels festgestellt wird, dass ein bestimmter pharmakologischer Wirkstoff Nebenwirkungen aufweist, die zuvor nicht erwartet worden waren. Besondere Probleme ergeben sich ferner aus der Tatsache, dass viele Wirkstoffe nur bei bestimmten Patienten zum Teil schwerwiegende und sogar Lebensbedrohende Nebenwirkungen entfalten.
Jüngstes und aktuelles Beispiel hierfür ist das Medikament Lipobay der Firma Bayer, bei dem erst Jahre nach der allgemeinen Anwendung, Fälle von tödlichem Muskelzerfall auftraten, die in einem möglichen kausalen Zusammenhang mit dem Präparat stehen. Ein weiteres Beispiel für Nebenwirkungen ist das Auftreten von Krampfanfällen bei ca. 1/1000 der Patienten, die mit dem Antidepressivum Bupropion ("Zyban") behandelt werden (Dunner et al., J Clin Psychiatry 1998 Jul; 59(7): 366-73).
Auch die Nebenwirkungen basieren auf einer Interaktion des pharmazeutischen Wirkstoffes mit einer Zielstruktur des Patienten. Bislang existiert jedoch kein Diagnoseverfahren, mittels dessen Patienten auf ein entsprechendes Nebenwirkungs-Risiko hin untersucht werden könnten. Tatsächlich sind die Ursachen solcher Nebenwirkungen, also die Art der Interaktion des Wirkstoffs mit Nebenwirkungs relevanten Zielstrukturen, in den meisten Fällen völlig ungeklärt.
Auch im akademischen Bereich findet sich keine etablierte Nebenwirkungsforschung als eigene Forschungsrichtung, was unter anderem dadurch begründet sein kann, dass die medizinischen Abteilungen nach Organsystemen ausgerichtet sind (Kardiologie, Neurologie etc.), die Nebenwirkungen sich jedoch dieser Einteilung entziehen. Psychiatrische Medikamente können beispielsweise kardiologische Nebenwirkungen auslösen (etwa Herzrhythmusstörungen).
Es wäre somit vorteilhaft, wenn man die für Nebenwirkungen relevanten Genvarianten gleichzeitig mit oder noch vor der klinischen Erforschung eines Wirkstoffs ermitteln könnte.
Umgangssprachlich werden Genvarianten, deren Träger eine signifikant erhöhte Gefahr haben, eine bestimmte Erkrankung zu erleiden, als Krankheitsgene bezeichnet. In den letzten Jahren konnten zahlreiche dieser Krankheitsgene durch Analyse des menschlichen Genoms identifiziert werden. Im Stand der Technik wurden dabei zwei grundsätzlich verschiedene Verfahren eingesetzt, um entsprechende Krankheitsgene zu finden, die genetische Assoziationsstudie (Cardon LR and Bell JI., Nat Rev Genet 2001 Feb; 2 (2): 91-9; Cox NJ and Bell GI, Diabetes. 1989 Aug; 38 (8): 947-50) und die genetische Kopplungsanalyse (Baron M., Mol Psychiatry., 2001 Mar; 6 (2): 143-9).
Zur Durchführung einer Assoziationsstudie benötigt man eine große Anzahl von Patienten sowie eine große Anzahl von geeigneten Kontroll-Personen. Üblicherweise werden Studien mit Gruppen einer Größe von etwas weniger als 100 bis mehrere 100 Personen durchgeführt. Als erster Schritt der Assoziationsstudie werden dann beide Gruppen (Patienten und Kontrollen) auf Gegenwart oder Abwesenheit von einer beschränkten Anzahl festgelegter Genvarianten hin untersucht. Kommen bestimmte Genvarianten in einer der Gruppe überzufällig häufig vor, so wird die Hypothese aufgestellt, dass die entsprechende Variante entweder direkt für den Ausbruch der Krankheit verantwortlich ist, das Krankheitsgen somit gefunden wäre, oder aber, dass in der Nähe der untersuchten Genvariante eine andere Variante zu finden ist, die für die Ausprägung des Merkmals mindestens mitverantwortlich ist. In diesem letzten Fall wäre somit ein Hinweis gefunden worden, auf welchem Chromosom, in welchem Abschnitt, etc. ein Krankheitsgen voraussichtlich zu finden sein wird.
Genetische Kopplungsanalysen werden nach einem anderen Prinzip durchgeführt. Benötigt werden Familien, von denen ein Teil der Mitglieder erkrankt ist, ein anderer Teil nicht. Durch genetische Analyse wird ermittelt, inwieweit bestimmte DNS-Sequenzvarianten, üblicherweise hochpolymorphe Marker-Sequenzen oder in Ausnahmefällen auch andere Genvarianten, zusammen mit der Krankheit bei den innerhalb der Familie auftretenden Neu- und Umverteilungen des genetischen Materials mitwandern, bzw. "gekoppelt" sind. Hochpolymorphe genetische Marker sind DNS-Sequenzen, die in vielen Sequenz-Varianten auftreten und daher einen Rückschluß darauf erlauben, von welcher Seite sie vererbt wurden.
Wird eine ausreichend große Anzahl genetischer Marker aller Chromosomen systematisch für eine Kopplungsanalyse eingesetzt, so liefert diese eine Aussage darüber, mit welchem chromosomalem Abschnitt ein bestimmtes Krankheitsgen zusammen vererbt wird. Ein besonderer Vorteil der Kopplungsanalyse besteht somit darin, dass Ergebnisse erhalten werden, ohne dass zuvor Hypothesen erstellt werden mussten. Ein Nachteil besteht darin, dass die Krankheitsgene anschließend durch weitere Analyse identifiziert werden müssen. In günstigen Fällen läßt sich bereits das Analyseergebnis diagnostisch verwerten. so wurde die Huntington Diagnostik vor der Entdeckung des Huntington-Gens jahrelang auf dieser Grundlage durchgeführt.
Als hochpolymorpher Marker besonders geeignet ist die sogenannte Satelliten-DNS, eine Fraktion eukaryotischer DNS, die bei Dichtegradienten-Zentrifugation als Satelliten-Bande von der DNS- Hauptbande abgetrennt wird. Satelliten-DNS besteht häufig aus polymorphen, sich vielmals wiederholenden, kurzen DNS-Sequenzen, deren Dichte aufgrund des hohen AT-Gehaltes von der Dichte der restlichen DNS abweicht.
Das Human-Genom-Projekt hat zur Identifizierung von einer Vielzahl von entsprechenden polymorphen Mikrosatelliten und anderen Arten genetischer Marker geführt, welche die Lokalisierung von bestimmten Genorten erheblich erleichtern. Im Stand der Technik sind über 12 000 polymorphe Mikrosatelliten bekannt (Bowock et al., Report of the DNA Committee, Human Gene Mapping 1995, A Compendium, Johns Hopkins University Press, Baltimore, 1454-1468, 1996). Neben den auf Mikrosatelliten basierenden Markern werden zunehmend auch andere Marker entwickelt, die zwar weniger polymorph, und somit genetisch weniger "informativ" sind, dafür aber unmittelbar Gensequenzen betreffen und daher auch Kandidaten für genetische Funktionsanalysen sind. Die zahlenmäßig wichtigsten Vertreter sind hier die "single nucleotide polymorphisms" (SNPs). Mitte 2001 wurde die Zahl der bekannten SNPs auf einige Hunderttausend geschätzt (Faruqi AF et al., MC Genomics. 2001; 2(1): 4) und in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information, USA (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov/) fanden sich 8/2001 knapp 300.000 diesbezügliche Einträge.
Zur besseren Lokalisierung eines Krankheitsgens müssen häufig eine Kopplungsanalyse und eine Assoziationsstudie nacheinander durchgeführt werden (Jorde et al., Am. J. Hum. Genet., 54: 884-898, 1994; Lander und Schork Science, 265: 2037-2048, 1994; Jorde, L. B., am. J. Hum. Genet., 56: 11-14, 1995; und Weeks und Lathrop, Trans Genet., 11: 513.519, 1995).
Durch verschiedene genetische Studien konnten so mehr als 400 Erkrankungen identifiziert werden, die nach Mendelschen Regeln vererbt werden (Cooper und Schmidtke, Knn. Med., 24: 29-41, 1992; Gottesmann und Collins, Nat. Genet., 7: 246-249, 1994; und McKusick, V. A. Mendelian Inheritance in Man: A Catalog of Human Genes and Genetic Disease, Johns Hopkins University Press, Baltimore, 1994).
Zur Verbesserung dieser Studien wurde in den letzten Jahren im Stand der Technik versucht, die Vorteile der Assoziationsstudie mit denen der Kopplungsanalyse zu verbinden. Das Hauptproblem bei der Ausweitung der Assoziationsstudien zu einem Genom-weitem, also alle Chromosomen umfassenden, Hypothesenfreiem Screening liegt darin, dass der molekulargenetische Aufwand extrem hoch ist. Eine mittelgroße Kopplungsanalyse umfasst beispielsweise 200 Familienmitglieder, die mit insgesamt 400 genetischen Markern untersucht werden, so dass 80 000 genetische Einzelanalysen gemacht werden müssen. Selbst bei teilautomatisierter DNS-Analytik ist dies ein sehr großer Aufwand. Eine mittlere Assoziationsstudie mit 2 mal 200 Teilnehmern müsste auf einer Genom-weiten Basis ca. 5000 genetische Marker verwenden, so dass 2 Millionen Einzelanalysen durchgeführt und ausgewertet werden müssten. Ein derartiger Aufwand wird bisher als nicht wirtschaftlich und damit unter praktischen Gesichtspunkten für kaum realisierbar gehalten.
Zur Verringerung des experimentellen Aufwands wurde daher im Stand der Technik vorgeschlagen, DNS-Proben verschiedener Personen zu vermischen (DNS-Pooling) und als Mischung zu analysieren. Bei diesem Vorgehen werden somit keine Daten über eine einzelne Person erhalten, sondern lediglich die Häufigkeit einzelner Varianten innerhalb einer Gruppe als Ergebnis der Analyse der Gemeinschaftsprobe erhalten. Voraussetzung dafür ist, dass die Probe von jedem Studienteilnehmer gleiche DNS-Mengen gleicher Qualität enthält. Ein entsprechender Ansatz wird beispielsweise in der Veröffentlichung Barcellos et al. (Am. J. Hum. Genet., 61: 734-747, 1997) offenbart, wobei vorgeschlagen wurde, das Verfahren zur Analyse affektiver Störungen (Depressionen) und zur Analyse der Multiplen Sklerose einzusetzen.
Barcellos et al. (a. a. O.) benutzten ein Verfahren zur Durchführung genetischer Assoziationsstudien, bei dem Mikrosatellit- Marker in vermischten DNS-Proben und mittels PCR amplifiziert werden, um ein Genom-Screening zur Identifizierung bestimmter Genort durchzuführen. In diesem Zusammenhang wird darauf hingewiesen, dass die PCR-Amplifikation bei Mikrosatelliten-Sequenzen dazu neigt, Artefakte aufgrund von "Stottern" und differentieller Amplifikation zu erzeugen. Sogenannte "Stotter"-Banden sind Amplifikationsprodukte, die ein bis zwei Einheiten kürzer als das vollständige Amplifikationsprodukt sind, da die Polymerase auf der sich wiederholenden Sequenz "verrutscht". Ein weiteres Problem besteht in der differentiellen oder vorzugsweisen Amplifikation, und bezeichnet die Tatsache, dass die DNS-Polymerase bestimmte Sequenzen besser amplifiziert als andere.
Im Stand der Technik wurden jedoch bereits Verfahren beschrieben, durch die durch Stottern und vorzugsweise Amplifikation erzeugten Probleme durch Verwendung spefizischer Software ausgeräumt werden konnten (Barcellos et al., a. a. O.; und Daniels et al., Am. J. Hum. Genet. 62, 1189-1197, 1998).
Quantitatives DNS-Pooling wurde ferner zur Verbesserung der Kopplungsanalyse bei autosomal dominanten Erkrankungen eingesetzt (Damji et al., Hum. Genet., 102: 207-212, 1998). Auch für Assoziationsstudien wurden bereits DNS-Pooling verwendet, beispielsweise zur Bestimmung der Gesamt-Allel-Unterschiede in Mikrosatelliten (vgl. Collins et al., Human Genet. 2000 Feb; 106 (2): 218-26).
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem besteht somit darin, dass Nebenwirkungen eines pharmazeutischen Wirkstoffes im Stand der Technik weder vorhersagbar noch analysierbar sind. Daher ist es bisher auch unmöglich, diese Nebenwirkungen gezielt zu vermeiden.
Dieses Problem wurde nunmehr durch Verfahren zur Gewinnung eines Nebenwirkungs relevanten, genetischen Marker-Profils gelöst, bei dem man

a) eine Patienten-Gruppe identifiziert, die Nebenwirkungen bei Einnahme einer oder mehrerer bestimmter pharmazeutischer Zusammensetzungen erlitten haben;
b) die Gegenwart und/oder Häufigkeit einer Vielzahl von Marker-Sequenzen in der Patienten-Gruppe mit der Gegenwart und/oder Häufigkeit derselben Sequenzen in einer Kontroll-Gruppe durch genetische Analyse vergleicht.

Erfindungsgemäß wurde somit überraschenderweise festgestellt, dass eine völlig neue Kombination der Analyse-Verfahren, die für die Identifizierung von Krankheitsgenen entwickelt wurden, in besonderem Maße für die Identifizierung solcher Genvarianten geeignet ist, die eine Prädisposition für bestimmte Nebenwirkungen anzeigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit erstmals die Bestimmung eines genetischen Markerprofils, welches mit dem genetischen Profil einzelner Patienten oder von Personen einer vorklinischen oder klinischen Studiengruppe verglichen werden kann, um auszuschließen, dass diese Personen bei Einnahme eines Arzneimittels bestimmte Nebenwirkungen erleiden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine beliebige Gruppe von Personen, die bei Einnahme einer oder mehrerer bestimmter pharmazeutischer Zusammensetzungen eine Nebenwirkung erlitten haben als Patienten-Gruppe bezeichnet. Die Gruppe kann eine beliebige Größe umfassen, vorzugsweise umfasst die Gruppe jedoch mindestens 50 Personen, wobei eine Größe von mindestens 100 Personen besonders bevorzugt ist.
Die Gruppe der Kontroll-Personen setzt sich entweder aus Personen zusammen, die bei Einnahme derselben pharmazeutischen Zusammensetzungen keine Nebenwirkungen erlitten haben oder aus einer beliebigen Personen-Gruppe. Insbesondere wenn die Nebenwirkung relativ selten ist, können beliebige Personen als Kontroll-Gruppe gewählt werden. Die Kontroll-Gruppe umfasst vorzugsweise mindestens 50 Personen, wobei eine Größe von mindestens 100 Personen besonders bevorzugt ist.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Kontroll-Gruppe so ausgewählt, dass sie der Patienten-Gruppe genetisch ähnlich ist. Genetische Ähnlichkeit kann durch familiäre Zugehörigkeit, Zugehörigkeit zu ethnischen Gruppen oder Geschlechtszugehörigkeit erreicht werden. Alternativ dazu können Kontroll- und Patienten-Gruppe aus größeren Populationen durch Molekular-genetische Analysen gezielt aufgrund ihrer Ähnlichkeit ausgewählt werden.
Sowohl für die Bestimmung der Gegenwart und/oder Häufigkeit der Vielzahl von Marker-Sequenzen als auch für die Bestimmung der genetischen Ähnlichkeit zwischen Kontroll- und Patienten-Gruppe kann eine genetische Analyse unter Verwendung von mindestens 500, 3000, 5000 oder vorzugsweise mindestens 6000 Marker-Sequenzen durchgeführt werden. Erfindungsgemäß ist es besonders bevorzugt, dass die Marker-Sequenzen gleichmäßig auf allen Chromosomen verteilt sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine beliebige DNS-Sequenz als Marker-Sequenz bezeichnet, wenn sie eindeutig einer chromosomalen Position zugeordnet werden kann. Bevorzugt für die erfindungsgemäße Analyse sind solche Markersequenzen, die aufgrund bekannter Sequenz-Unterschiede zwischen verschiedenen Personen geeignet sind, eine Analyse der genetischen Ähnlichkeit der verschiedenen Personen zu ermöglichen. Üblicherweise handelt es sich bei den Marker-Sequenzen um hochpolymorphe Sequenzen. Liegen bei verschiedenen Personen an einem Genort Sequenzunterschiede vor, so bezeichnet man diese als Polymorphismen. Polymorphe Sequenzen sind somit Abschnitte auf der DNA, die sich von Individuum zu Individuum unterscheiden; als hochpolymorph werden Sequenzen bezeichnet, bei denen eine größere Anzahl von Varianten gefunden wurde. Entsprechende DNSSequenzen, beispielsweise sogenannte Mikrosatelliten oder SNPs, sind beim Menschen in großer Vielzahl bekannt (vgl. McKusick, a. a. O.).
Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich, wenn die genetische Analyse mit mindestens 5000, vorzugsweise etwa 6000 Marker-Sequenzen durchgeführt wird, die gleichmäßig auf allen Chromosomen verteilt sind. Diese Ausführungsform weist den besonderen Vorteil auf, dass das Verfahren ein extrem genaues Marker-Profil liefert; Nebenwirkungs relevante also ohne weiteren Aufwand identifiziert werden kann.
Als Marker-Sequenzen weden beispielsweise die aus der Genomforschung bekannten Mikrosatelliten eingesetzt. Diese können ferner teilweise oder vollständig durch andere Marker, z. B. SNPs, ersetzt werden.
Die genetische Analyse kann durch irgendein bekanntes Verfahren zur Ermittlung von Sequenz-Unterschieden, bzw. -Identität durchgeführt werden. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass die Analyse durch Sequenzierung, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder RFLP-Kartierung durchgeführt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die genetische Analyse an DNS-Proben durchgeführt, die durch Vermischen der Proben mehrerer Personen erhalten wurden. Vorzugsweise werden dabei die DNS-Proben von mindestens 10 oder mindestens 50 Personen miteinander vermischt, wobei die Vermischung von DNS-Proben von mindestens 100 Personen besonders bevorzugt ist. Dieses Vorgehen hat den besonderen Vorteil, dass der experimentelle Aufwand bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens um Größenordnungen reduziert wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung der Gegenwart und/oder Häufigkeit der Marker-Sequenzen der Kontroll-Gruppe mittels einer Datenbank, die unabhängig von dem konkreten Nebenwirkungs relevanten Marker-Profil erzeugt wurde. Dieses Vorgehen hat den besonderen Vorteil, dass eine einmal erzeugte größere Datenbank als Grundlage für die Bestimmung der Gegenwart und/oder Häufigkeit der Marker-Sequenzen für eine Vielzahl von Verfahren zur Gewinnung eines Nebenwirkungs relevanten, genetischen Marker-Profils verwendet werden kann.
Diese Kontroll-Datenbank sollte natürlich die Ergebnisse einer genetischen Analyse von einer Vielzahl von Personen enthalten. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass für die Erstellung der Datenbank mindestens 100, vorzugsweise mindestens 300 Personen genetisch analysiert wurden. Die genetische Analyse kann dabei nach einem der oben beschriebenen Verfahren erfolgen. Vorzugsweise wird die Datenbank durch genetische Analyse von mindestens 100 Personen erzeugt, bei denen Gegenwart und/oder Häufigkeit von mindestens 500, mindestens 3000, mindestens 5000 oder vorzugsweise mindestens 6000 hochpolymorphen Marker-Sequenzen, die gleichmäßig auf alle Chromosomen verteilt sind, erzeugt.
Nach Erstellung der Datenbank werden die Daten einer Gruppe für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung einer Nebenwirkungs relevanten, genetischen Marker-Profils zusammengestellt. Vorzugsweise wird die Gruppe aus den in der Datenbank vorhandenen Datensätzen anhand der genetischen Ähnlichkeit zwischen Kontroll- und Patienten-Gruppe ausgewählt. Die genetische Ähnlichkeit kann dabei wiederum durch Übereinstimmung von Gegenwart und/oder Häufigkeit einer Anzahl von Marker-Sequenzen zwischen Kontroll- und Patienten-Gruppe bestimmt werden. Durch n polymorphe genetische Marker wird ein n-dimensionaler Raum aufgespannt. Kontrollen und Patienten werden so ausgesucht, daß sie iin übereinstimmenden Bereichen dieses "genetischen Raumes" lokalisiert sind. Durch diese Art der Analyse (in der Regel validierter) ausgesuchter Marker läßt sich eine Aussage zum allgemeinen genetischen Hintergrund (der Ethnizität) treffen. Diese Information kann anschließend dazu benutzt werden, Kontroll-Personen und Patienten besonders genau zuzuordnen bzw. zu "matchen".
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dazu verwendet werden, beliebige, Nebenwirkungs relevante, genetische Marker-Profile für beliebige pharmazeutische Zusammensetzungen zu erstellen. Beispiele für genomisch untersuchbare Nebenwirkungen sind Blutbildungsstörungen, z. B. Agranulozytose nach Einnahme von Clozapin ("Leponex"), Leberzerstörung nach Anwendung bestimmter Inhalationsnarkotika oder Krampfanfälle nach Einnahme des schon erwähnten Buprion ("Zyban"). Andere Beispiele sind epidermale Nekrolysen, Ausschläge, Schwindel, Übelkeit, Parästhesien, Hautjucken, schmerzhafte Zustände, z. B. im Abdomen, Verdauungsstörungen, Stevens-Johnson-Symdrom. Kreislaufversagen, weitere Leukopenien, Neuropathien, Geschmacksstörungen, Störungen des Sehvermögens, weitere Konvulsionen, Verwirrung/Delirien, Ataxien, Urticaria, Herzrhythmusstörungen, Sepsis, Erbrechen, Allergien, Veränderungen des Schmerzempfindens, Darmentzündungen, Luftnot, Fieberschütteln, Muskelschmerzen und andere Muskelstörungen, Bronchospasmus, Anämien, Schleimhautentzündungen, vermehrtes Schwitzen, erhöhte Leberenzyme oder andere Blutwerte, Thrombozytopenie, Gerinnungsstörungen/Blutungen, Synkopen, Ödeme u. a.
Das Marker-Profil ergibt sich in dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Vergleich der Gegenwart und/oder Häufigkeit der Marker- Sequenzen in Patienten- und Kontroll-Gruppe, wobei eine oder mehrere Nebenwirkungs relevante Genvarianten dadurch identifiziert werden, dass sie zusammen mit einer oder mehreren bestimmten Marker-Sequenzen auftreten. Mit anderen Worten ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Feststellung, dass eine Nebenwirkungs relevante Genvariante, also ein Gen, das darauf eine Prädisposition des Trägers für bestimmte Nebenwirkungen bei Einnahme bestimmter Arzneimittel aufweist, zusammen mit einer bestimmten Marker-Sequenz vererbt wird und daher die Marker- Sequenz selbst die Nebenwirkungs relevante Genvariante ist oder sich in deren chromosomalen Umfeld findet. Die nebenwirkungsrelevante Genvariante kann daher durch Sequenzierung des unmittelbaren Umfelds der Marker-Sequenz identifiziert werden. Es kann auch Fälle geben, in denen die Marker-Sequenz lediglich Teil eines Stoffwechselweges ist oder sich in chromosomalem Umfeld eines Stoffwechselweges befindet. In diesem Fall ermöglicht das Marker-Profil die Identifizierung von Stoffwechselwegen, die eine weitere Bestimmung des Genproduktes der Nebenwirkungs relevanten Genvariante ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Gewinnung eines Genproduktes einer Nebenwirkungs relevanten Genvariante, bei dem die DNS-Sequenz des für das Produkt kodierenden Gens mittels eines der erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und das Produkt anschließend durch rekombinante Expression der DNS- Sequenz oder durch chemische Synthese erzeugt und isoliert wird. Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren bekannt, mittels derer Proteine erhalten werden können, sobald die für das Protein kodierende DNS-Sequenz identifiziert wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit nicht nur die Identifizierung der Nebenwirkungs relevanten Genvariante, sondern auch die Gewinnung des zugehörigen Genproduktes. Dies weist den besonderen Vorteil auf, dass die Interaktion des Wirkstoffes mit dem Genprodukt der Nebenwirkungs relevanten Genvariante näher analysiert werden kann.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Screeningverfahren für pharmakologische Wirkstoffe bzw. Entwicklungssubstanzen mit dem Genprodukt der nebenwirkungs-relevanten Genvariante. Festgestellte Interaktion z. B. Bindung der Entwicklungssubstanz an das Genprodukt der nebenwirkungs-relevanten Genvariante zeigt das Potential der Entwicklungssubstanz an, die bestimmte Nebenwirkung hervorrufen, oder aber zu modulieren. Die Substanz wird dann entweder von der medizinischen Entwicklung ausgeschlossen oder aber in Richtung der Beeinflussung der Nebenwirkung oder eines verwandten Symptombildes gezielt weiterentwickelt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht daher erstmals im frühen präklinischen Stadium das Potential von Substanzen für die Auslösung von Nebenwirkugen zu erkennen.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines Nebenwirkungs relevanten, genetischen Marker-Profils, bei dem man

a) eine Patienten-Gruppe identifiziert, die Nebenwirkungen bei Einnahme einer oder mehrerer bestimmter pharmazeutischer Zusammensetzungen erlitten haben;

b) die Gegenwart und/oder Häufigkeit einer Vielzahl von Marker-Sequenzen in der Patienten-Gruppe mit der Gegenwart und/oder Häufigkeit derselben Sequenzen in einer Kontroll-Gruppe durch genetische Analyse vergleicht.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Patienten-Gruppe mindestens 50, vorzugsweise mindestens 100 Personen umfaßt und die Kontroll-Gruppe mindestens 50, vorzugsweise mindestens 100 Personen umfaßt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Kontroll- Gruppe bei Einnahme derselben pharmazeutischen Zusammensetzungen keine Nebenwirkungen erlitten haben.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Kontroll-Gruppe so gewählt wird, dass sie der Patienten- Gruppe genetisch weitgehend ähnlich ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die genetische Ähnlichkeit zwischen Kontroll- und Patienten- Gruppe durch moleuklar-genetische Analysen bestimmt wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die genetische Analyse mit mindestens 500 oder mindestens 1000, vorzugsweise mindestens 3000 Marker-Sequenzen durchgeführt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem die genetische Analyse mit mindestens 5000, vorzugsweise 6000 Marker-Sequenzen durchgeführt wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Marker-Sequenzen gleichmäßig auf allen Chromosomen verteilt sind.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem als Marker-Sequenzen hochpolymorphe Sequenzen oder SNPs verwendet werden.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem die genetische Analyse mit mindestens 5000 hochpolymorphen Marker-Sequenzen durchgeführt wird, die gleichmäßig auf allen Chromosomen verteilt sind.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die genetische Analyse durch Sequenzierung, Polymerase-Ketten- Reaktion (PCR), oder RFLP-Kartierung durchgeführt wird.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem man die genetische Analyse an DNS-Proben durchführt, die durch Vermischen der Proben mehrerer Personen erhalten wurden.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem man für die genetische Analyse DNS-Proben von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 50 oder 100 Personen miteinander vermischt.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem die Gegenwart und/oder Häufigkeit der Marker-Sequenzen der Kontroll-Gruppe mittels einer Datenbank erfolgt, die unabhängig von dem konkreten Nebenwirkungs relevanten Marker-Profil erzeugt wurde.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem die Datenbank durch genetische Analyse einer Vielzahl von Personen erzeugt wurde.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem die Datenbank durch Analyse von mindestens 100, vorzugsweise mindestens 300 Personen erzeugt wurde.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, bei dem die Datenbank durch genetische Analyse von mindestens 100 Personen erzeugt wurde, wobei die genetische Analyse die Bestimmung der Gegenwart und/oder Häufigkeit von mindestens 3000, mindestens 5000 oder vorzugsweise mindestens 6000 hochpolymorphen Marker-Sequenzen, die gleichmäßig auf alle Chromosomen verteilt sind, umfaßt.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem eine Kontroll-Gruppe aus den in der Datenbank vorhandenen Datensätzen anhand der genetischen Ähnlichkeit zwischen Kontroll- und Patienten-Gruppe ausgewählt wird.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, bei dem die genetische Ähnlichkeit der Gruppen durch Übereinstimmung von Gegenwart und/oder Häufigkeit einer Anzahl von Marker-Sequenzen in den Gruppen bestimmt wird.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, bei dem bei dem ein Nebenwirkungs-relevantes genetisches Marker-Profil für pharmazeutischen Zusammensetzungen erstellt wird.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, bei dem ein Nebenwirkungs-relevantes genetisches Marker-Profil für eine Nebenwirkung erstellt wird, die aus der Gruppe bestehend aus Blutbildungsstörungen, Agranulozytose nach Einnahme von Clozapin ("Leponex"), Leberzerstörung nach Anwendung von Inhalationsnarkotika, Krampfanfälle nach Einnahme von Buprion ("Zyban"), epidermale Nekrolysen, Ausschläge, Schwindel, Übelkeit, Parästhesien, Hautjucken, schmerzhafte Zustände, z. B. im Abdomen, Verdauungsstörungen, Stevens-Johnson-Symdrom. Kreislaufversagen, weitere Leukopenien, Neuropathien, Geschmacksstörungen, Störungen des Sehvermögens, weitere Konvulsionen, Verwirrung/Delirien, Ataxien, Urticaria, Herzrhythmusstörungen, Sepsis, Erbrechen, Allergien, Veränderungen des Schmerzempfindens, Darmentzündungen, Luftnot, Fieberschütteln, Muskelschmerzen und andere Muskelstörungen, Bronchospasmus, Anämien, Schleimhautentzündungen, vermehrtes Schwitzen, erhöhte Leberenzyme oder andere Blutwerte, Thrombozytopenie, Gerinnungsstörungen/Blutungen, Synkopen und Ödeme ausgewählt wurde.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, bei dem der Vergleich der Gegenwart und/oder Häufigkeit der Marker-Sequenzen zwischen Patienten- und Kontroll-Gruppe ergibt, dass eine oder mehrere Nebenwirkungs relevante Genvarianten zusammen mit bestimmten Marker-Sequenzen vererbt werden.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, bei dem man eine Marker-Sequenz als Nebenwirkungs relevante Genvariante identifiziert.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, bei dem man das Genprodukt der Nebenwirkungs relevanten Genvariante durch Sequenzierung oder andere geeignete Verfahren bestimmt.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, bei dem man die Nebenwirkungs relevante Genvariante in genetischer Nähe zu einer Marker-Sequenz identifiziert.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem man die Nebenwirkungsrelevante Genvariante durch Sequenzierung des chromosomalen Umfelds identifiziert.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, bei dem das Marker-Profil Stoffwechselwege anzeigt, die eine Identifizierung des Genproduktes der Nebenwirkungs relevanten Genvariante ermöglichen.

28. Verfahren zur Gewinnung eines Genproduktes einer Nebenwirkungs relevanten Genvariante, bei dem man die DNS-Sequenz des für das Produkt kodierenden Gens mittels eines der in einem der Ansprüche 1 bis 27 genannten Verfahrens identifiziert und das Produkt anschließend durch rekombinante Expression der DNS-Sequenz oder durch chemische Synthese erzeugt und isoliert.

29. Screening-Verfahren für pharmakologische Wirkstoffe, das ein Verfahren zur Gewinnung eines Nebenwirkungs relevanten genetischen Marker-Profils gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 umfaßt, wobei Wirkstoffe für die weitere medizinische Verwendung ausgeschlossen werden, wenn Nebenwirkungen aufgrund der Interaktion zwischen Wirkstoff und Genprodukt der Nebenwirkungs relevanten Genvariante zu erwarten sind oder gezielt zur Modulation der Nebenwirkung oder eines verwandten Symptoms weiterentwickelt werden.