EP1658380A2 - Verfahren zur bestimmung von haarzyklus-markern - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von haarzyklus-markern

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Publication number
EP1658380A2
EP1658380A2 EP04764414A EP04764414A EP1658380A2 EP 1658380 A2 EP1658380 A2 EP 1658380A2 EP 04764414 A EP04764414 A EP 04764414A EP 04764414 A EP04764414 A EP 04764414A EP 1658380 A2 EP1658380 A2 EP 1658380A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
proteins
hair
mrna molecules
column
fragments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04764414A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Olaf HOLTKÖTTER
Dirk Petersohn
Kordula Schlotmann
Melanie Giesen
Daniela Kessler-Becker
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1658380A2 publication Critical patent/EP1658380A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining hair cycle markers in vitro, test kits and biochips for determining hair cycle markers and the use of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules as hair cycle markers; furthermore a test method for the detection of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active ingredients for influencing the hair cycle as well as a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active ingredients for influencing the hair cycle and a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation for influencing the hair cycle.
  • Hair follicles go through a cycle of three stages: anagen (growth phase), catagen (regression phase) and telogen (resting phase).
  • growth phase growth phase
  • catagen progression phase
  • telogen resting phase
  • androgenic alopecia is characterized by a shorter anagen phase combined with a reduction in the size of the hair follicle (e.g. Paus and Cotsarelis (1999), New Eng. J. Med., 341: 491-497).
  • the hair follicle is assigned to a stage of the hair cycle essentially based on the microscopic-morphological analysis of the hair.
  • the molecular mechanisms that play a role in the progression through the hair cycle are only poorly understood. Consequently, there are no molecular markers that are characteristic of a particular stage of the hair follicle, just as there are no sufficiently large number of molecular targets that influence the condition of the hair follicle can.
  • a number of different markers of human hairy skin could be identified in the applicant's DE 102 60931.4, these are primarily characteristic of the anagen hair follicles, which make up the largest proportion of hairy skin.
  • transcriptome i.e. the entirety of all transcribed genes, of the hair follicle has not been described in various stages of the cell cycle.
  • Transcriptome analyzes of the skin using various methods, including SAGE TM analysis, are state of the art. However, isolated keratinocytes (in vitro) or epidermal explants are used, which - as explained above - do not represent models representative of the complex process in the skin.
  • DE-A-101 00 127.4-41 From DE-A-101 00 127.4-41 by the applicant it is known to subject skin cells to a SAGE TM analysis in order to characterize the total transcriptome of the skin.
  • DE-A-101 00 121.5-41 by the applicant discloses the determination of markers of stressed or aged skin on the basis of a comparative SAGE TM analysis between stressed or aged skin and undressed or young skin.
  • information on specific markers of the hair cycle cannot be found in these publications. From J Invest Dermatol 2002 Jul; 119 (1): 3-13; "A serial analysis of gene expression in sun-damaged human skin"; Urschitz J.
  • the object of the present invention is to identify as large a part of the genes as are important for the hair cycle.
  • the hair cycle is to be determined by means of the identified genes and methods for finding active substances for influencing the hair cycle are to be provided.
  • This first object is achieved according to the invention by a method (1) for identifying the genes which are important for the hair cycle (hair cycle markers) in humans, characterized in that a) a first mixture of expressed, ie transcribed and in anagenous human hair follicles optionally also translated genetically coded factors, i.e. proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from hairy human skin, preferably from hairy scalp, b) a second mixture of expressed, ie transcribed and optionally in human hair follicles also translates genetically coded factors, i.e.
  • a first mixture of expressed, ie transcribed and in anagenous human hair follicles optionally also translated genetically coded factors, i.e. proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from hairy human skin, preferably from hairy scalp
  • a second mixture of expressed, ie transcribed and optionally in human hair follicles also translates genetically coded
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to understand the complex process of the hair cycle and the causal relationships of the changes in the hair follicle. Only with this knowledge can new concepts for cosmetic hair products be developed that have an effect on the broad spectrum of gene expression in the hair follicle.
  • SAGE TM analysis carried out as part of the method according to the invention shows for the first time in a very comprehensive manner which genes are expressed differently in anagen and catagen hair follicles.
  • transcriptome The entirety of all mRNA molecules that are synthesized by a cell or a tissue at a specific point in time is referred to as a "transcriptome”.
  • SAGE TM serial analysis of gene expression
  • This technique simultaneously allows the identification and quantification of those expressed in hair follicles
  • the comparison of the transcriptome of anagen hair follicles with the transcriptome of catagen hair follicles allows the identification of relevant genes of the hair cycle, which can be genes that are particularly strongly expressed in anagen hair follicles or genes that are characterized in that they are compared to catagen hair follicles are only slightly expressed.
  • the SAGE method is based on two principles: First, only a short nucleotide sequence from the 3 ' region of the mRNA is required to identify the gene. A sequence of nine base pairs enables differentiation of 262,144 (4 9 ) transcripts. That is more than the number of all genes present in the genome. Secondly, the concatenation of the short sequences enables efficient automated analysis using sequencing. One advantage of this technique that should not be underestimated is the determination of the reading direction of the genes. If two opposite transcripts of a gene are started in the reading direction, this can only be determined with the SAGE technique. Typically, double-stranded cDNA is synthesized with biotinylated primers from polyA-RNA.
  • the cDNA is digested with a 4bp recognizing restriction enzyme (anchoring enzyme), which statistically cut every 256bp.
  • the 3 'end of the cDNA is isolated by binding to streptavidin beads.
  • the sample is divided into two halves and the cDNA end is ligated with a linker (1 or 2), which has a recognition site for a type III restriction enzyme (tagging enzyme). This cuts up to 20bp offset from the asymmetrical detection point. This creates a short sequence (tag) bound to the linker, which is unique for each gene.
  • the linkers! -Tags after filling the protruding ends with the Linker2-7ags ligated (Linkerditag).
  • the ligation products are amplified with linker-specific primers (1 or 2). Then the linker that is no longer used is released by a further enzymatic digestion with the anchoring enzyme.
  • the isolated ditags are lined up (concatemere), cloned into a vector and transfected into cells. The concatemers are amplified from the cells via PCR and finally sequenced.
  • Another promising method is micro-array or chip technology.
  • entire gene libraries are brought together on one chip.
  • the genes on the chip are hybridized with fluorescence-labeled cDNA, which was generated from the mRNA of the tissue sample to be examined.
  • fluorescence-labeled cDNA was generated from the mRNA of the tissue sample to be examined.
  • a very advantageous analysis method is the combination of the SAGE and the M / ⁇ O / 4rray technique.
  • the SAGE method provides new or known genes for the hair cycle can be significant. These are projected onto a chip that can now be used to measure samples from individual candidates.
  • Human hair follicles from healthy female donors were used for SAGE TM analysis.
  • the follicles were isolated from pieces of tissue taken from the donor's ear and sorted according to their morphology according to catagen and anagen hair follicles.
  • the catagen and anagen hair follicles of a total of five donors were combined. The same number of catagen and anagen follicles from a donor was used and the total number of follicles from the individual donors was adjusted to each other.
  • SAGE TM analysis was carried out as in Veiculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487.
  • One SAGE TM bank was analyzed for catagen and one for anagen hair follicles.
  • both SAGE TM banks were normalized to the average number of days. The two banks were compared to identify genes with hair cycle specific regulation.
  • Table 1 lists markers for which differential expression depending on the stage of the hair cycle has already been described. They serve as positive controls for the experiment. Specified are: • the relative expression frequency in anagen hair follicles in column 1, • the relative expression frequency in catagen hair follicles in column 2, • the quotient of the determined relative expression frequency in anagen hair follicles and the determined relative expression frequency in catagen hair follicles in column 3, • the significance of the values mentioned in column 3 in column 4, • the UniGene Accession Number in column 5, • the Swissprot Accession number in column 6 and • the name of the gene from which the corresponding tag originates in column 7
  • the quotient in column 3 indicates the strength of the differential expression, i.e. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in anagen hair follicles than in catagen hair follicles, or vice versa.
  • mice whose vitamin D receptor has been inactivated are characterized by hair loss. It could be shown that after stimulation of the anagen stage by shaving, mice with an inactive vitamin D receptor cannot initiate the hair cycle (Kong et al. (2002), J Invest Dermatol, 118: 631-
  • Thrombospondin-1 has been shown to play a role in inducing hair follicle involution and in vascular breakdown during the catagen phase (Yano et al. (2003), J Invest Dermatol, 120: 14-9). While no expression of thrombospondin can be detected in the early to middle anagen phase, a strong expression during the catagen phase is shown, in accordance with the expression data found here.
  • the role of neurotrophin-5 for human hair follicles has not been described so far, but there are studies on the family member neurotrophin-3 in murine hair follicles. Maximum expression of the neurotrophin was observed in the catagenic stage (Botchkarev et al. (1998), Am J Pathol, 153: 785-99). A corresponding expression pattern was found here for neurotrophin-5.
  • Tables 2 to 6 contain a detailed list of the genes determined with the aid of the method according to the invention and differentially expressed in anagen hair follicles and in catagen hair follicles, stating • the current sequence ID (cf. sequence listing) in column 1, • the tag sequence used in column 2, • the relative expression frequency in anagen hair follicles in column 3, • the relative expression frequency in catagen hair follicles in column 4, • the quotient of the determined relative expression frequency in anagen hair follicles and the determined relative expression frequency in catagen hair follicles in column 5, • the Significance of the values in column 5 in column 6, • the UniGene Accession Number in column 7, • the Swissprot Accession Number in column 8 and • a brief description of the gene or gene product in column 9
  • the quotient in column 5 indicates the strength of the differential expression, ie by which factor the respective gene is more strongly expressed in anagen hair follicles than in catagen hair follicles, or vice versa
  • Table 2 lists all genes that are expressed at least 5-fold differentially in anagen hair follicles compared to catagen hair follicles with a p-value of p ⁇ 0.01 (significance> 2.0).
  • Table 3 lists all genes that are at least 2-fold differentially expressed in anagen hair follicles compared to catagen hair follicles with a p-value of p ⁇ 0.01 (significance> 2.0).
  • Table 4 lists all genes that are expressed at least 1.3 times differentially in anagen hair follicles compared to catagen hair follicles with a p-value of p ⁇ 0.01 (significance> 2.0).
  • Table 5 lists all genes which are expressed at least 5-fold differently in anagen hair follicles compared to catagen hair follicles with a p-value of p ⁇ 0.05 (significance> 1, 3).
  • Table 6 lists all genes that are at least 2-fold differentially expressed in anagen hair follicles compared to catagen hair follicles with a p-value of p ⁇ 0.05 (significance> 1, 3).
  • the clear difference in expression of the ribosomal RNAs is particularly striking here. Small differences in expression in ribosomal RNAs have so far been described as typical artifacts of SAGE TM. In the present
  • Attractin is a protein from the agouti / melanocortin
  • the gene product plays a role in determining the
  • mice Hair color of mice (Gunn et al. (1999), Nature, 398: 152-6; Barsh et al. (2002),
  • Adenosyltransferase an enzyme of vitamin B12 metabolism.
  • a vitamin B12 Adenosyltransferase, an enzyme of vitamin B12 metabolism.
  • Dopachrome tautomerase an enzyme in melanin biosynthesis, is also induced in catagenic hair follicles. All of the above genes are relevant for hair follicle biology, especially for pigmentation, but so far not in
  • angiopoietin-like protein CDT6 can be found in the catagenic hair follicles, a protein for which a regulatory
  • Hair follicle is coupled to the hair cycle (see above Thrombospondin-1).
  • the 14-3-3 family of proteins regulate a variety of enzymes, including those of primary metabolism and of the cell cycle. Furthermore, they have a chaperone function, they can activate the transcription of inducible genes and regulate signal transduction and apoptosis processes.
  • a role in the differentiation of keratinocytes has been described in particular for the protein 14-3-3 sigma (stratifin) (Dellambra et al. (1995), J Cell Sei 108: 3569-79). A specific regulation of the members of this protein family in the different hair follicle stages is therefore extremely likely.
  • the keratin 6A and the aeidie hair keratin are also found in catagen hair follicles.
  • Table 7 contains a detailed list of the genes determined with the aid of the method according to the invention and differentially expressed in anagen hair follicles and in catagen hair follicles, stating • the current sequence ID (see sequence listing) in column 1, • the tag sequence used in column 2 , • the relative expression frequency in anagen hair follicles in column 3, • the relative expression frequency in catagen hair follicles in column 4, • the ratio of the determined relative expression frequency in anagen hair follicles and the determined relative expression frequency in catagen hair follicles to each other in column 5, • the significance of the values mentioned in column 5 in column 6, • the GO number in column 7, • a brief description of the gene or gene product in column 8 and • the Swissprot Accession Number in column 9
  • the quotient in column 5 indicates the strength of the differential expression, i. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in anagen hair follicles than in catagen hair follicles, or vice versa.
  • the dipeptidyl peptidases of the DPP-IV family are proline-specific proteases, the main function of which appears to be the regulation of various pathological and physiological processes (Aleski and Malik
  • Type IV collagen is a typical part of the follicle matrix, and one Increased expression of this protein is expected in the growth phase of the follicle.
  • the "synaptosome” cluster is also induced in the anagen hair follicles.
  • This cluster contains the SNARE proteins VAMP-2 [5: 0] and VAMP-3 [4: 0], which have a general role in secretion.
  • VAMP-2 [5: 0] and VAMP-3 [4: 0] have a general role in secretion.
  • This observation is supported by the general induction of genes that play a role in exocytosis. This induction of exocytosis genes is probably related to the process of pigmentation of the hair. Pigmentation requires the transfer of melanin-synthesizing organelles, so-called melanosomes, from melanocytes to keratinocytes in the hair follicle.
  • Poly-N-acetyllactosamine structures are found in both N- and O-linked glycans of mammalian glycoproteins. These glycans presumably interact with selectins and other glycan-binding proteins (Zhou (2003), Curr Protein Pept Sei, 4: 1-9).
  • clustering is made possible by comparing the SAGE data with the data from available domain and motif databases, for example PROSITE and Pfam [http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml; http://www.expasy.ch/prosite/].
  • Table 8 contains a detailed list of the genes determined with the aid of the method according to the invention and differentially expressed in anagen hair follicles and in catagen hair follicles, stating • the current sequence ID (cf. sequence listing) in column 1, • the tag sequence used in column 2, • the relative expression frequency in anagen hair follicles in column 3, • the relative expression frequency in catagen hair follicles in column 4, • the ratio of the determined relative expression frequency in anagen hair follicles and the determined relative expression frequency in catagen hair follicles to each other in column 5, • the significance of the values mentioned in column 5 in column 6, • a brief description of the motif or gene or gene product in column 7 and • the Swissprot Accession Number in column 8
  • the quotient in column 5 indicates the strength of the differential expression, i. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in anagen hair follicles than in catagen hair follicles, or vice versa.
  • the significance of the differential expression of different genes can be increased by lexical analysis.
  • matching keywords in the description texts become the different Genes such as those found in the database annotations were searched for.
  • Table 9 contains a detailed list of the genes determined with the aid of the method according to the invention and differentially expressed in anagen hair follicles and in catagen hair follicles, stating • the current sequence ID (see sequence listing) in column 1, • the tag sequence used in column 2 , • the relative expression frequency in anagen hair follicles in column 3, • the relative expression frequency in catagen hair follicles in column 4, • the ratio of the determined relative expression frequency in anagen hair follicles and the determined relative expression frequency in catagen hair follicles to each other in column 5, • the significance of the values in column 5 in column 6, • the search word in column 7, • a short description of the gene or gene product in column 8 and • the Swissprot Accession Number in column 9
  • the quotient in column 5 indicates the strength of the differential expression, i. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in anagen hair follicles than in catagen hair follicles, or vice versa.
  • Autophagy is a process in which cells envelop macroscopic cell components, such as organelles, in autophagosomes and then digest them in the lysosome. Autophagy mainly occurs when there is a lack of cells; Excessive autophagy is considered a mechanism of non-apoptotic programmed cell death. Furthermore, clusters are repressed in catagen hair follicles, which are formed on the basis of the keywords “dsc2” and “desmocollin”.
  • the second object underlying the present invention is achieved according to the invention by a method (2) for determining the hair cycle in humans, in particular women, in vitro, which is characterized in that a) a mixture of proteins, mRNA molecules or fragments of Proteins or mRNA molecules from hairy human skin or from human hair follicles, b) the mixture obtained for the presence and possibly the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules examined by means of serial analysis gene expression (SAGE) are identified as being differentially expressed in anagen and catagenic human hair follicles, c) comparing the test results from b) with the expression patterns identified by means of serial analysis of gene expression (SAGE) and d) the growing or healthy mixture examined in b) Allocates hair when it's predominant Contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are more strongly expressed in anagen hair follicles than in catagen hair follicles, or which the mixture examined in
  • the mixture in step a) of the method according to the invention for determining the hair cycle can be obtained from whole skin samples, hairy skin equivalents, isolated hair follicles, hair follicle equivalents or cells of hairy skin.
  • step b) of the method for determining the hair cycle it may be sufficient to examine the mixture obtained for the presence of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which can be determined by means of serial analysis of gene expression (SAGE) identified as differentially expressed in anagen and catagen hair follicles if these are expressed exclusively in anagen or only in catagen hair follicles.
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • step d) of the method for determining the hair cycle the mixture examined in b) is assigned to growing or healthy hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are more strongly expressed in anagen hair follicles than in catagens, that is, the mixture either contains more different compounds typically expressed in anagen hair follicles than those typically expressed in catagen hair follicles (qualitative differentiation), or contains more copies of compounds typically expressed in anagen hair follicles than typically in catagenes Hair follicles are present (quantitative differentiation). For the assignment to hair in regression or sick hair is used in a complementary manner.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention for determining the hair cycle is characterized in that in step b) the mixture obtained is examined for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are defined in Table 9 in column 9 by their Swissprot Accession Number and in step d) assigns the mixture examined in b) to growing or healthy hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed more strongly in anagen hair follicles than in catagen, or which assigns the mixture examined in b) to regression or diseased hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are present in catagen hair follicles are expressed more than in anagen.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the hair cycle is characterized in that in step b) the mixture obtained is examined for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Table 8 in column 8 by their Swissprot Accession Number and in step d) assigns the mixture examined in b) to growing or healthy hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules contains which are expressed more strongly in anagen hair follicles than in catagen, or which assigns the mixture examined in b) to regression or diseased hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are in catagen Hair follicles are expressed more than in anagen.
  • step b) the mixture obtained is examined for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are defined in Table 7 in column 9 by their Swissprot Accession Number and in step d) assigns the mixture examined in b) to growing or healthy hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are more strongly expressed in anagen hair follicles than in catagen, or that in b ) Examines the mixture under regression or diseased hair if it contains ' predominantly proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed more strongly in catagenic hair follicles than in anagenic ones.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the hair cycle is characterized in that in step b) the mixture obtained is examined for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Table 6 in column 7 by their UniGene Accession Number, in column 8 by their Swissprot Accession Number, or in column 9 by their short description of the gene or gene product and in step d) that examined in b) Mixes growing or healthy hair if it contains predominantly proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed in anagen hair follicles at least twice as strongly as in catagen, or the mixture examined in b) is in regression or sick hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins contains n or mRNA molecules that are expressed in catagenic hair follicles at least twice as strongly as in anagenic ones.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the hair cycle is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are defined in Table 5 in column 7 by their UniGene accession number, in column 8 by their Swissprot accession number, or in column 9 by their short description of the gene or gene product and in Step d) assigns the mixture examined in b) to growing or healthy hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 5 times as strongly in anagen hair follicles as in catagen, or assigns the mixture examined in b) to regression or diseased hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed at least 5 times as strongly in catagen hair follicles as in anagen.
  • step b) the mixture obtained is examined for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules , which are defined in Table 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, in column 8 by their Swissprot Accession Number, or in column 9 by their short description of the gene or gene product and in step d) that in b) Allocated mixture assigned to growing or healthy hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed at least 1.3 times as strongly in anagen hair follicles as in catagen, or that in b) investigated mixture assigned to regression or diseased hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments contains proteins or mRNA molecules that are expressed in catagen hair follicles at least 1.3 times as strongly as in anagen.
  • step b) the mixture obtained is examined for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are listed in table 3 in column 7 by their UniGene Accession Number, in column 8 are defined by their Swissprot Accession Number, or in column 9 by their short description of the gene or gene product and in step d) assigns the mixture examined in b) to growing or healthy hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or includes fragments of proteins or mRNA molecules which are in anagen 'hair follicles at least 2 times as strongly expressed, as in catagen, or examined in b) mixture assigns in regression befindlichem or diseased hair when it predominantly proteins, mRNA molecules or contains fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed at least twice as strongly in catagenic hair follicles as in anagenic ones.
  • step b) the mixture obtained is checked for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules examined, which are defined in Table 2 in column 7 by their UniGene Accession Number, in column 8 by their Swissprot Accession Number, or in column 9 by their short description of the gene or gene product and in step d) that in b ) investigates the mixture of growing or healthy hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed at least 5 times as strongly in anagen hair follicles as in catagen, or that was examined in b) Mixture in regression or diseased hair if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments contains proteins or mRNA molecules which are expressed at least 5 times as strongly in catagen hair follicles as in anagen.
  • the hair cycle can also be described in that several markers (expression products of the genes which are important for anagen or catagen hair follicles) are quantified, which must then be active in a characteristic ratio to one another in order to represent growing or healthy hair, or in one of them different characteristic ratios must be active in order to represent regression or diseased hair.
  • the present invention therefore furthermore relates to a method (3) for determining the hair cycle in humans, in particular women, in vitro, which is characterized in that a) a mixture of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA -Molecules from hairy human skin or from human hair follicles, b) quantified in the mixture obtained at least two of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are identified by method (1) as important for the hair cycle, c) the expression ratios of the at least two proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules to one another are determined and the expression quotient is formed, d) the expression ratios from c) are compared with the expression ratios which are typically found in anagen for the molecules quantified in b) or present in catagen hair follicles, especially with the Expression ratios that result from Tables 2 to 6, column 5, and e) assign the mixture obtained in a) to growing or healthy hair, if the expression ratio
  • the mixture is obtained in step a) by means of microdialysis.
  • microdialysis The technique of microdialysis is described, for example, in “Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735-8; and in “Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies ", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; and also described on the Internet at http://www.microdialysis.se/techniqu.htm, to which reference is hereby made in full.
  • microdialysis When using microdialysis, a probe is typically inserted into the skin and the probe is slowly rinsed with a suitable carrier solution. After the acute reactions have subsided after the puncture, the microdialysis provides proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which occur in the extracellular space and which can then be isolated and analyzed in vitro, for example by fractionation of the carrier liquid. Microdialysis is less invasive than taking a full skin sample; however, it is disadvantageously limited to the extraction of compounds occurring in the extracellular space.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that in step b) in method (2) the examination for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins or protein fragments; or in method (3) the quantification of at least two proteins or protein fragments is carried out by means of a method which is selected from one- or two-dimensional gel electrophoresis affinity chromatography protein-protein complexation in solution iv. Mass spectrometry, especially matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) and especially v. Use of protein chips, or by means of suitable combinations of these methods.
  • MALDI matrix assisted laser desorption ionization
  • 2D gel electrophoresis is described, for example, in L.D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System or in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; both in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; or in 2-D electrophoresis manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (order no. 80-6429-60).
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that in step b) in method (2) the examination for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the mRNA molecules or mRNA molecule fragments; or in method (3) the quantification of at least two mRNA molecules or mRNA molecule fragments is carried out by means of a method which is selected from i. Northern Blots, ii. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), iii. RNase protection experiments, iv. Dot blots, v. cDNA sequencing, vi. Clone hybridization, vii. Differential display, viii. Subtractive hybridization, ix. cDNA fragment fingerprinting, x.
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • iii. RNase protection experiments iv. Dot blots, v. cDNA sequencing, vi. Clone hybridization, vii. Differential display, viii. Sub
  • TOGA Total Gene Expression Analysis
  • xi Serial analysis of gene expression
  • xii Massively Parallel Signature Sequencing
  • MPSS ® Massively Parallel Signature Sequencing
  • the MPSS ® process is US Patent No. 6,013,445 described in, which are hereby fully comprehensive cover.
  • a further preferred embodiment of the processes according to the invention is characterized in that in step b) the presence and optionally the amount of from 1 to about 5000, preferably from 1 to about 1000, in particular from about 10 to about 500, preferably from about 10 to about 250, particularly preferably about 10 to about 100 and very particularly preferably about 10 to about 50 of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are listed in Table 8 in column 8 by their Swissprot Accession Number, in the tables 7 and 9 in column 9 by their Swissprot Accession Number and in Tables 2 to 6 in column 7 by their UniGene Accession Number, in column 8 by their Swissprot Accession Number, or in column 9 by their short description of the Gene or gene product can be defined.
  • the present invention further provides a test kit for determining the hair cycle in humans in vitro, comprising means for carrying out the method according to the invention for determining the hair cycle in humans.
  • Another object of the present invention is a biochip for determining the hair cycle in humans in vitro, comprising i. a firm, d. H. rigid or flexible beams and ii. on this immobilized probes, which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are listed in Table 8 in column 8 by their Swissprot Accession Number, in Tables 7 and 9 in column 9 by their Swissprot accession number and in Tables 2 to 6 in column 7 by their UniGene accession number, in column 8 by their Swissprot accession number, or in column 9 by their short description of the gene or Gene product to be defined.
  • a BioChip is a miniaturized functional element with molecules immobilized on a surface, in particular biomolecules, which can serve as specific interaction partners.
  • the structure of these functional elements often has rows and columns; one then speaks of chip "arrays". Since thousands of biological or biochemical functional elements can be arranged on a chip, they usually have to be manufactured using microtechnical methods.
  • the following are particularly suitable as biological and biochemical functional elements: DNA, RNA, PNA (in the case of nucleic acids and their chemical derivatives, for example, single strands, triplex structures or combinations thereof), saccharides, peptides, proteins (for example antibodies) , Antigens, receptors) and derivatives of combinatorial chemistry (e.g. organic molecules).
  • BioChips have a 2D base area for coating with biologically or biochemically functional materials.
  • the base surfaces can also be formed, for example, by walls of one or more capillaries or by channels.
  • the DNA chip technology which is particularly preferred in the context of the present invention is based on the ability of nucleic acids to enter into complementary base pairings.
  • This technical principle known as hybridization, has been used in Southern blot and Northern blot analysis for years used. Compared to these conventional methods, in which only a few genes are analyzed, DNA chip technology allows a few hundred to several tens of thousands of genes to be examined in parallel.
  • a DNA chip essentially consists of a carrier material (eg glass or plastic) on which single-stranded, gene-specific probes are immobilized in a high density at a defined location (spot). The technique of probe application and the chemistry of probe immobilization are considered problematic.
  • E. M. Southern (EM Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 and EM Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) describes the preparation of oligonucleotide arrangements by direct synthesis on a glass surface, which was derivatized with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and then with a glycol.
  • DNA molecules already present can also be bound to surfaces of support material.
  • the probe is preferably applied by means of a piezocontrolled nanodispenser, which, like an inkjet printer, applies contact solutions with a volume of 100 picoliters to the surface of the carrier material without contact.
  • the probes are immobilized e.g. as described in EP-A-0 965 647:
  • the generation of DNA probes takes place here by means of PCR using a sequence-specific primer pair, a primer being modified at the 5 'end and carrying a linker with a free amino group. This ensures that a defined strand of the PCR products can be bound to a glass surface which has been treated with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then with 1,4-phenyldiisothiocyanate.
  • the gene-specific PCR products should ideally have a defined nucleic acid sequence with a length of 200-400 bp and contain non-redundant sequences.
  • mRNA is isolated from two cell populations to be compared.
  • the isolated mRNAs are converted into cDNA by means of reverse transcription using, for example, fluorescence-labeled nucleotides.
  • the samples to be compared are marked with, for example, red or green fluorescent nucleotides.
  • the cDNAs are then hybridized with the gene probes immobilized on the DNA chip and the bound fluorescence is then quantified.
  • a key success factor for using DNA chip technology to analyze gene expression in hair follicles is the composition of the gene-specific probes on the DNA chip.
  • the relevant genes of the hair cycle identified in the SAGE TM analysis are used.
  • RNA chip Since the use of a DNA chip to analyze the relevant genes of the hair cycle sometimes requires extremely small amounts of mRNA to be examined, it may become necessary to analyze the mRNA prior to analysis using so-called linear amplification (Zhao et al. (2002) , BMC Genomics, 3:31).
  • the mRNA of a sample is first rewritten into cDNA.
  • the amplified RNA is obtained from this double-stranded cDNA by in vitro transcription.
  • the analysis chips mentioned in DE-A-100 28 257.1-52 and in DE-A-101 02 063.5-52 are particularly preferred for the production of small (up to about 500 probes) biochips.
  • These analysis chips have an electrically addressable structure which allows the samples to be electrofocused. This advantageously makes it possible to focus and immobilize samples regardless of their viscosity with the aid of electrodes at defined points on a grid of points (arrays). Due to the focusing ability, the local concentration of the samples is increased and thus a higher specificity.
  • the biochip according to the invention preferably comprises 1 to approximately 5000, preferably 1 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 500, preferably approximately 10 to approximately 250, particularly preferably approximately 10 to approximately 100 and very particularly preferably approximately 10 to approximately 50 different probes.
  • the probes which differ from one another, can each be present in duplicate on the chip.
  • the biochip according to the invention preferably comprises nucleic acid probes, in particular RNA or PNA probes, particularly preferably DNA probes.
  • the nucleic acid probes preferably have a length of approximately 10 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 800, preferably approximately 100 to approximately 600, particularly preferably approximately 200 to approximately 400 nucleotides.
  • a DNA chip is particularly preferred which has probes selected from the probes listed in Tables 2 and 5, the probes listed in Table 3 (without mitochondrial and ribsomal tags and the overrepresented groups "DNA helicase activity”, “DPPIV activity” and “Melanin biosynthesis from tyrosine” from Table F.
  • the biochip according to the invention comprises peptide or protein probes, in particular antibodies.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are listed in Table 8 in column 8 by their Swissprot Accession Number, in Tables 7 and 9 in column 9 by their Swissprot-Accession-Number and in Tables 2 to 6 in column 7 by their UniGene-Accession-Number, in column 8 by their Swissprot-Accession-Number, or in column 9 by their short description of the gene or gene product Hair cycle markers in humans.
  • Another object of the present invention is a test method for detecting the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active ingredients for influencing the hair cycle, in particular against diseases or impairments of the hair and their growth, in vitro, characterized in that a) the hair status by a method according to the invention for Determination of the hair cycle, or by means of a test kit according to the invention for determining the hair cycle, or by means of a biochip according to the invention, b) applying an active ingredient against diseases or impairments of the hair and its growth to the hairy skin one or more times, c) again the hair status by a method according to the invention for determining the hair cycle, or by means of a test kit according to the invention for determining the hair cycle, or by means of of a biochip according to the invention is determined, and d) the effectiveness of the active ingredient is determined by comparing the results from a) and c).
  • test method according to the invention can be carried out with whole skin samples, hairy skin equivalents, isolated hair follicles, hair follicle equivalents or cells with hairy skin.
  • Another object of the present invention is a test kit for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the hair and their growth, comprising means for carrying out the test method according to the invention.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are listed in Table 8 in column 8 by their Swissprot Accession Number, in Tables 7 and 9 in column 9 by their Swissprot-Accession-Number and in Tables 2 to 6 in column 7 by their UniGene-Accession-Number, in column 8 by their Swissprot-Accession-Number, or in column 9 by their short description of the gene or gene product Proof of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the hair and their growth.
  • Another object of the present invention is a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against diseases or impairments of the hair and their growth in vitro, which is characterized in that a. determines the hair status by a method according to the invention for determining the hair cycle, or by means of a test kit according to the invention for determining the hair cycle, or by means of a biochip according to the invention, b) applying a potential active ingredient against diseases or impairments of the hair and its growth to the hairy one or more times Applies skin, c) determines the hair status by a method according to the invention for determining the hair cycle, or by means of a test kit according to the invention for determining the hair cycle, or by means of a biochip according to the invention, and d) active ingredients by comparing the results from a) and c ) certainly.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are listed in Table 8 in column 8 by their Swissprot Accession Number, in Tables 7 and 9 in column 9 by their Swissprot-Accession-Number and in Tables 2 to 6 in column 7 by their UniGene-Accession-Number, in column 8 by their Swissprot-Accession-Number, or in column 9 by their short description of the gene or gene product Identification of cosmetic or pharmaceutical active ingredients against diseases or impairments of the hair and its growth.
  • Another object of the present invention is a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation against diseases or impairments of the hair and its growth, characterized in that a) active ingredients with the help of the screening method according to the invention, or the use for the identification of cosmetic or active pharmaceutical ingredients against diseases or impairments of the hair and their growth and b) active ingredients found to be effective are mixed with cosmetically and pharmacologically suitable and compatible carriers.
  • neurotrophin 4 AnagekatageriQuotienfeignifikan UniGene Swissproi Tag ID 7.98 5.01 1.59 0.37 Hs. 2062 P11473 vitamin D receptor 1.00 2.00 -2.00 0.60 Hs. 87409 P07996 thrombospondin 1 1.00 3.01 - 3.01 0.43 Hs. 26690 P34130 neurotrophin 5 (neurotrophin 4

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Haarzyklus-Markern in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung von Haarzyklus-Markern sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Haarzyklus-Marker; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Beeinflussung des Haarzyklus sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Beeinflussung des Haarzyklus und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Beeinflussung des Haarzyklus.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Haarzyklus-Markern
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Haarzyklus- Markern in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung von Haarzyklus-Markern sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Haarzyklus-Marker; ferner ein Testverfahren- zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Beeinflussung des Haarzyklus sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Beeinflussung des Haarzyklus und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Beeinflussung des Haarzyklus.
Haare besitzen neben ihrer eigentlichen biologischen Aufgabe eine nicht zu unterschätzende psychosoziale Funktion. Der unerwünschte Haarverlust oder übermäßiges Haarwachstum kann zu einer massiven Beeinträchtigung des Selbstbewußtseins der betroffenen Person führen (Paschier et al. (1988), Int. J. Dermatol 27: 441-446).
Mit Ausnahme seltener kongenitaler Haarerkrankungen, die durch Mutationen in Keratinen oder anderen Strukturproteinen verursacht sind, beruhen übermäßiger Haarverlust und übermäßiges Haarwachstum auf einem gestörten Haarzyklus. Haarfollikel durchlaufen einen Zyklus aus drei Stadien: Anagen (Wachstumsphase), Katagen (Regressionsphase) und Telogen (Ruhephase). Die Androgene Alopezie ist beispielsweise geprägt durch eine kürzer werdende Anagenphase, verbunden mit einer Verkleinerung des Haarfollikels (z.B. Paus und Cotsarelis (1999), New Eng. J. Med., 341 :491-497).
Die Zuordnung des Haarfollikels zu einem Stadium des Haarzyklus erfolgt im Wesentlichen aufgrund der mikroskopisch-morphologischen Analyse des Haares. Die molekularen Mechanismen, die bei der Progression durch den Haarzyklus eine Rolle spielen, sind dabei nur lückenhaft verstanden. Konsequenterweise existieren molekulare Marker, die für ein bestimmtes Stadium des Haarfollikels charakteristisch sind, genauso wenig, wie eine genügend große Anzahl molekularer Targets, über die der Zustand des Haarfollikels beeinflusst werden kann. Zwar konnten im Rahmen der DE 102 60931.4 der Anmelderin eine Vielzahl verschiedener Marker der humanen behaarten Haut identifiziert werden, diese sind aber in erster Linie für die anagenen Haarfollikel, die den größten Anteil der behaarten Haut ausmachen, charakteristisch.
Die ungenügende Anzahl an Markern, die charakteristisch für ein bestimmtes Stadium des Haares sind, führt zu Defiziten bei der allgemeinen Beschreibung der Wachstumsphasen des Haares in vivo, bei kultivierten Haarfollikeln in vitro (Philpott-Modell; Philpott M et al. (1990). Human Hair Growth in vitro; J Cell Sei 97:463-471 , 1990) sowie bei rekonstruierten Haarfollikelmodellen. Besonders in letzteren Systemen ist eine morphologische Einteilung in Stadien des Haarzyklus nicht mehr problemlos möglich. Die Beurteilung in vitro kultivierter Haarfollikel erfolgt durch die mikroskopische Messung der Längenwachstums mit Hilfe eines Messokkulars einschließlich fotografischen Dokumentation und durch die histologische Bewertung aufwendiger Vertikalschnitte. Diese Form der Analyse ist sehr zeitaufwendig und verlangt eine große Anzahl an Haarfollikeln, um die individuellen Schwankungen zu erfassen. Für die Beurteilung rekonstruierter Haarfollikelmodelle ist eine Charakterisierung über molekulare Marker des entsprechenden Stadiums von essentieller Bedeutung.
Als Marker für die Wachstumsphasen von Haarfollikeln dienen, neben dem Verhältnis von Proliferation zu Apoptose in den Follikeln, der DNA-/Protein- und Keratinsynthese und dem ATP-Gehalt, bislang nur einzelne Marker, beispielsweise Matrixproteine wie Kollagen Typ IV, Fibronektin und Laminin (Couchman JR et al (1985), Dev Biol 108:290-298), Wachstumsfaktoren wie Transforming Growth Factor TGF-ß1 und TGF-ß2 (Foitzik et al. (2000), FASEB J. 14:752-760; Tsutomu S et al. (2002), J Invest Dermatol 118: 993-997) sowie Fibroblast Growth Factor FGF-7 (Hebert JM et al. (1994), Cell 78: 1017-1025). Als problematisch erweist sich dabei jedoch, dass eine Vielzahl dieser Marker aus Untersuchungen des synchronisierten Haarzyklus der Maus resultieren und nicht ohne weiteres auf Zyklus des menschlichen Haares übertragbar sind. Außerdem führt das geringe Verständnis der molekularen Mechanismen, die beim Durchlaufen des Haarzyklus bedeutsam sind, zu einer unzureichenden Anzahl von Targets, die für eine kosmetische oder pharmakologische Einflussnahme auf den Haarfollikel zur Verfügung stehen. So ist für die Androgene Alopezie lediglich das Enzym 5α-Reduktase (Typ II) als Target validiert. Eine Inhibition dieses Enzyms, beispielsweise durch den Wirkstoff Finasterid, führt zu einer verringerten Konzentration an Dihydrotestosteron in der Haut und im Serum und damit zu einer Inhibition der Androgen-abhängigen Miniaturisierung der Haarfollikel. Nachteil des Wirkstoffes sind sicherlich die mit seiner Verwendung verbundenen Nebenwirkungen; insbesondere schwangere Frauen sollen Finasterid nicht nutzen. Außerdem darf der Wirkstoff nicht in kosmetischen Formulierungen verwendet werden.
Erschwert wird die Analyse molekularer Marker in Haarfollikeln einerseits durch die Tatsache, dass aus den Follikeln nur geringe Mengen an mRNA gewonnen werden können, andererseits dadurch, dass in den Zellen der Haarfollikel mRNA- Moleküle in Konzentrationen zwischen einigen wenigen und mehreren hundert Kopien vorkommen. Die schwach exprimierten Gene sind bisherigen Analysetechniken nicht oder nur sehr schwer zugänglich gewesen, können aber durchaus eine entscheidende Rolle im Haarfollikel spielen.
Bis heute ist das Transkriptom, also die Gesamtheit aller transkribierten Gene, der Haarfollikel in verschiedenen Stadien des Zellzyklus nicht beschrieben worden.
Transkriptom-Analysen der Haut mittels verschiedener Verfahren, einschließlich der SAGE™-Analyse, sind Stand der Technik. Allerdings werden hierbei isolierte Keratinozyten (in vitro) oder Epidermis-Explantate verwendet, die - wie oben erläutert - keine für das komplexe Geschehen in der Haut repräsentativen Modelle darstellen.
Aus der DE-A-101 00 127.4-41 der Anmelderin ist bekannt, Hautzellen einer SAGE™-Analyse zu unterwerfen, um das Gesamttranskriptom der Haut zu charakterisieren. Die DE-A-101 00 121.5-41 der Anmelderin offenbart die Ermittlung von Markern gestreßter bzw. gealterter Haut auf der Basis einer vergleichenden SAGE™-Analyse zwischen gestreßter bzw. gealterter Haut und ungestreßter bzw. junger Haut. Informationen über spezifische Marker des Haarzyklus sind diesen Schriften aber nicht zu entnehmen. Aus J Invest Dermatol 2002 Jul;119(1):3-13; „A serial analysis of gene expression in sun-damaged human skin"; Urschitz J. et al.; ist bekannt, Marker sonnengeschädigter Haut mittels einer vergleichenden SAGE™-Analyse von Vollhautexplantanten zu bestimmen, die vor der Ohrmuschel (sonnengeschädigt) bzw. hinter der Ohrmuschel (geschützt vor Sonnenstrahlung) entnommen wurden. Aus dieser Publikation lassen sich gleichfalls keinerlei Kenntnisse über spezifische Marker des Haarzyklus gewinnen.
Es besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise aller, für den Haarzyklus wichtigen Gene.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen möglichst großen Teil der für den Haarzyklus bedeutsamen Gene zu identifizieren. Außerdem sollen mittels der identifizierten Gene der Haarzyklus bestimmt und Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen zur Beeinflussung des Haarzyklus bereitgestellt werden.
Diese erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (1) zur Identifizierung der für den Haarzyklus bedeutsamen Gene (Haarzyklus-Marker) bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein erstes Gemisch von in anagenen menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut, vorzugsweise aus behaarter Kopfhaut, gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in katagenen menschlichen Haarfollikeln exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut, vorzugsweise aus behaarter Kopfhaut, gewinnt und c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in anagenen und katagenen menschlichen Haarfollikeln unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es vorteilhafterweise möglich, den komplexen Prozess des Haarzyklus und die kausalen Zusammenhänge der Veränderungen am Haarfollikel zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische Haar-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite Spektrum der Genexpression im Haarfollikel ausüben. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführte SAGE™-Analyse zeigt erstmals in einer sehr umfassenden Weise, welche Gene in anagenen und katagenen Haarfollikeln unterschiedlich exprimiert werden.
Die Gesamtheit aller mRNA-Moleküle, die von einer Zelle oder einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt synthetisiert werden, bezeichnet man als "Transkriptom". Zur Erfassung des Transkriptoms humaner Haarfollikel wurde die Technik der „Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGE™) (Veiculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487) eingesetzt. Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung der in Haarfollikeln exprimierten Gene. Der Vergleich des Transkriptoms von anagenen Haarfollikeln mit dem Transkriptom von katagenen Haarfollikeln erlaubt die Identifikation relevanter Gene des Haarzyklus. Dies können Gene sein, die in anagenen Haarfollikeln besonders stark exprimiert werden oder auch Gene, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln nur gering exprimiert werden.
Die Analyse der Genexpression ist zwar auch mit der Quantifizierung spezifischer mRNA-Moleküle möglich (z.B. Northern-Blot, RNase-Schutzexperimente). Mit diesen Techniken können jedoch nur eine relativ begrenzte Anzahl an Genen gemessen werden. Theoretisch könnten die Techniken MPSS (Massive Parallel Signiture Sequencing) oder Techniken, die auf Differential display beruhen, die SAGE™ -Analyse ersetzen. Praktisch ist die SAGE™-Technik jedoch schneller und zuverlässiger als Alternativmethoden und somit zu bevorzugen.
Die SAGE-Methode basiert auf zwei Prinzipen: Zum einen ist nur eine kurze Nukleotidsequenz aus der 3'-Region der mRNA für die Identifikation des Gens erforderlich. Eine Sequenz von neun Basenpaaren ermöglicht die Unterscheidung von 262.144 (49) Transkripten. Das ist mehr als die Anzahl aller im Genom vorhandenen Gene. Zum zweiten erlaubt die Aneinanderreihung der kurzen Sequenzen eine effiziente automatisierte Analyse mittels Sequenzierung. Ein nicht zu unterschätzender Vorteil dieser Technik ist die Bestimmung der Leserichtung der Gene. Werden zwei in der Ableserichtung entgegengesetzte Transkripte eines Gens gestartet, so läßt sich dies nur mit der SAGE-Technik feststellen. Typischerweise wird mit biotinylierten Primern aus polyA-RNA doppelsträngige cDNA synthetisiert. Die cDNA wird mit einem 4bp erkennendem Restriktionsenzym (anchoring enzyme) verdaut, die statistisch alle 256bp schneiden. Das 3 '-Ende der cDNA wird durch Bindung an Streptavidin beads isoliert. Die Probe wird in zwei Hälften unterteilt und das cDNA-Ende mit jeweils einem Linker (1 bzw. 2) ligiert, der eine Erkennungstelle für ein TypIlS- Restriktionsenzym (tagging enzyme) besitzt. Dieses schneidet bis zu 20bp versetzt von der asymmetrischen Erkennungsstelle. Dadurch entsteht eine an dem Linker gebundene kurze Sequenz (Tag), die für jedes Gen einzigartig ist. Um größere Mengen an Material zu gewinnen, werden die Linker! -Tags nach Auffüllen der überstehenden Enden mit den Linker2-7ags ligiert (Linkerditag). Die Ligationsprodukte werden mit Linker-spezifischen Primern (1 bzw. 2) amplifiziert. Danach wird der nicht mehr gebrauchte Linker durch einen weiteren enzymatischen Verdau mit dem anchoring enzyme freigesetzt. Die isolierten Ditags werden durch Ligation aneinandergereiht (Concatemere), in einen Vektor kloniert und in Zellen transfiziert. Aus den Zellen werden die Concatemere über PCR amplifiziert und schließlich sequenziert.
Eine weitere vielversprechende Methode ist die Mikro-Array- oder Chip-Technik. Hier werden ganze Genbibliotheken auf einen Chip gebracht. Die Gene auf dem Chip werden mit Fluoreszenz-markierter cDNA, die aus der mRNA der zu untersuchenden Gewebeprobe generiert wurde, hybridisiert. Durch Vergleiche von anagenem mit katagenem Follikel-Material können alle interessanten Gene in einem Versuch anhand der Fluoreszenzunterschiede detektiert werden. Dabei ist allerdings die Kenntnis der Klone in der Genbibliothek erforderlich. Eine sehr vorteilhafte Analysemethode ist die Kombination der SAGE- und der M/αO-/4rray-Technik. Die SAGE-Methode liefert neue oder bekannte Gene, die für den Haarzyklus bedeutsam sein können. Diese werden auf einen Chip projeziert, mit dem sich nun Proben von individuellen Kandidaten messen lassen.
Für die SAGE™-Analyse wurden humane Haarfollikel gesunder weiblicher Spender verwendet. Die Follikel wurden aus Gewebestücken isoliert, die über dem Ohr der Spenderinnen entnommen wurden, und aufgrund ihrer Morphologie nach katagenen und anagenen Haarfollikeln sortiert. Um die Detektion von spenderspezifischen Varianzen möglichst gering zu halten, wurden jeweils die katagenen und anagenen Haarfollikel von insgesamt fünf Spenderinnen vereinigt. Dabei wurde die gleiche Anzahl katagener und anagener Follikel eines Spenders verwendet sowie die Gesamtzahl an Follikeln der einzelnen Spender aneinander angeglichen.
Die Durchführung der SAGE™-Analyse erfolgte wie bei Veiculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487 beschrieben. Analysiert wurde je eine SAGE™-Bank für katagene und für anagene Haarfollikel. Zur weiteren Analyse wurden beide SAGE™-Banken auf die durchschnittliche Tag-Anzahl normiert. Die beiden Banken wurden miteinander verglichen, Um Gene mit einer Haarzyklusspezifischen Regulation zu identifizieren.
Wie für zwei Banken desselben Gewebetyps erwartet, ist das Tag-Repertoire der beiden Follikel-Banken weitgehend ähnlich. Trotz der Ähnlichkeit der Gewebe und der relativ geringen Tag-Zahl zeigen 197 Tags eine differentielle Expression mit einer Signifikanz von p > 0,05. Die Bestimmung der Signifikanz erfolgte, wie bei Audic S, Claverie JM (1997), „The significance of digital gene expression profiles", Genome Res 7:986-95, beschrieben.
Tabelle 1 listet Marker auf, für die bereits eine differentielle Expression in Abhängigkeit vom Stadium des Haarzyklus beschrieben wurde. Sie dienen als Positivkontrollen für das Experiment. Angegeben sind: • die relative Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 1 , • die relative Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte 2, • der Quotient der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte 3, • die Signifikanz der in Spalte 3 genannten Werte in Spalte 4, • die UniGene-Accession-Number in Spalte 5, • die Swissprot-Accession-Number in Spalte 6 und • die Bezeichnung des Gens, aus dem der entsprechende Tag stammt, in Spalte 7
Der Quotient in Spalte 3 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Unter ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide direkt zugänglich.
Mäuse, deren Vitamin D Rezeptor inaktiviert wurde, sind durch Haarverlust gekennzeichnet. Es konnte gezeigt werden, dass nach der Stimulation des Anagenstadiums durch eine Rasur Mäuse mit inaktivem Vitamin D Rezeptor den Haarzyklus nicht iniitieren können (Kong et al. (2002), J Invest Dermatol, 118:631-
8).
Für Thrombospondin-1 konnte gezeigt werden, dass es eine Rolle in der Induktion der Haarfollikel-Involution und im Gefäßabbau während der Katagenphase spielt (Yano et al. (2003), J Invest Dermatol, 120:14-9). Während sich in der frühen bis mittleren Anagenphase keine Expression des Thrombospondins detektieren lässt, zeigt sich, in Übereinstimmung mit den hier gefundenen Expressionsdaten, eine starke Expression während der katagenen Phase. Die Rolle von Neurotrophin-5 für die humanen Haarfollikel wurde bisläng nicht beschrieben, allerdings gibt es Untersuchungen zum Familienmitglied Neurotrophin-3 in murinen Haarfollikeln. Maximale Expression des Neurotrophins wurde dabei im katagenen Stadium beobachtet (Botchkarev et al. (1998), Am J Pathol, 153:785-99). Ein entsprechendes Expressionsmuster wurde hier für das Neurotrophin-5 gefunden.
Im Zuge der SAGE™ wurde in einem ersten Schritt die Anzahl der einzelnen Tags bestimmt und, soweit das möglich war, Genen oder Einträgen der Datenbank UniGene zugeordnet. Durch den Vergleich der Tags in den unterschiedlichen SAGE™-Banken lassen sich differentiell exprimierte Gene identifizieren. Eine erste Klassifizierung erfolgt demnach über die Signifikanz der differentiellen Expression der identifizierten Gene. Es ist davon auszugehen, dass Gene, die signifikant differentiell exprimiert sind, Markergene für die Stadien des Haarzyklus sind.
Die Gene, für die eine signifikante differentielle Expression gefunden wurde, sind in den Tabellen 2 bis 6 wiedergegeben.
Die Tabellen 2 bis 6 enthalten eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten, in anagenen Haarfollikeln und in katagenen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene unter Angabe • der laufenden Sequenz-ID (vgl. Sequenzprotokoll) in Spalte 1 , • der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2, • der relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 3, • der relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte 4, • des Quotienten der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte 5, • der Signifikanz der in Spalte 5 genannten Werte in Spalte 6, • der UniGene-Accession-Number in Spalte 7, • der Swissprot-Accession-Number in Spalte 8 und • einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 9 Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in anagenen Haarfollikeln stärker exprihriiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Unter ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide direkt zugänglich.
In Tabelle 2 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p<0,01 (Signifikanz >2,0) mindestens 5-fach differentiell exprimiert werden.
In Tabelle 3 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p<0,01 (Signifikanz >2,0) mindestens 2-fach differentiell exprimiert werden.
In Tabelle 4 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p<0,01 (Signifikanz >2,0) mindestens 1 ,3-fach differentiell exprimiert werden.
In Tabelle 5 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p<0,05 (Signifikanz >1 ,3) mindestens 5-fach differentiell exprimiert werden.
In Tabelle 6 sind alle Gene aufgelistet, die in anagenen Haarfollikeln im Vergleich zu katagenen Haarfollikeln mit einem p-Value von p<0,05 (Signifikanz >1 ,3) mindestens 2-fach differentiell exprimiert werden. Auffällig ist hier insbesondere der deutliche Expressionsunterschied der ribosomalen RNAs. Geringe Expressionsunterschiede in ribosomalen RNAs sind bisher als typische Artefakte der SAGE™ beschrieben worden. Im vorliegenden
Fall sind die Expressionunterschiede aber auffällig hoch und gleichförmig. Es findet sich eine wesentlich stärkere Expression an rRNA in anagenen Haarfollikeln als in katagenen Haarfollikeln. Demnach ist bereits die Expressionsstärke ribosomaler RNA ein Markerkriterium für anagene Haarfollikel.
Außerdem finden sich einige weitere, biologisch interessante
Expressionsunterschiede. Zum einen ist die Expression von Attractiή in katagenen
Haarfollikeln gesteigert. Attractin ist ein Protein aus dem Agouti/Melanocortin-
Signaltransduktionsweg. Das Genprodukt spielt eine Rolle in der Bestimmung der
Haarfarbe von Mäusen (Gunn et al. (1999), Nature, 398:152-6; Barsh et al. (2002),
J Recept Signal Transduct Res, 22:63-77).
Desweiteren findet sich in katagenen Haarfollikeln eine Induktion der Cobalamin
Adenosyltransferase, einem Enzym des Vitamin B12-Metabolismus. Eine Vitamin
B12-Defizienz führt im Menschen zu einer Depigmentierung des Haares (Mori et al. (2001 ), J Dermatol, 28:282-5).
Die Dopachrome-Tautomerase, ein Enzym der Melanin-Biosynthese, ist ebenfalls in katagenen Haarfollikeln induziert. Alle oben genannten Gene sind relevant für die Haarfollikelbiologie, speziell für die Pigmentierung, bisher aber nicht im
Zusammenhang mit dem Haarzyklus beschrieben.
Weiterhin fällt auf, dass in den katagenen Haarfollikeln die Trankriptionsfaktoren
Fos-B und Egr1 induziert sind. Beide Transkriptionsfaktoren gehören zu der
Gruppe der sogenannten immediate-early genes und haben weitreichende regulatorische Funktionen.
Andererseits ist in den katagenen Haarfollikeln eine Repression des Angiopoietin- ähnlichen Proteins CDT6 zu finden, ein Protein, für das eine regulatorische
Funktion in der Angiogenese vermutet wird (Peek et al. (2002), J Biol Chem,
277:686-93). Eine Kontrolle der Angiogenese und damit der Blutversorgung der
Haarfollikel ist an den Haarzyklus gekoppelt (s.o. Thrombospondin-1).
Auffällig ist auch die Induktion der 14-3-3 sigma Proteins Stratifin bei gleichzeitiger
Repression des 14-3-3 tau/theta Proteins. Die Familie der 14-3-3 Proteine regulieren eine Vielzahl von Enzymen, darunter die des Primärmetabolismus und des Zelizykluses. Weiterhin haben sie eine Chaperonfunktion, sie können die Transkription induzierbarer Gene aktivieren, und regulieren Signal-Transduktions- und Apoptosevorgänge. Insbesondere für das Protein 14-3-3 sigma (Stratifin) wurde eine Rolle bei der Differenzierung von Keratinozyten beschrieben (Dellambra et al. (1995), J Cell Sei 108:3569-79) . Eine spezifische Regulation der Mitglieder dieser Proteinfamilie in den verschiedenen Haarfollikelstadien ist daher ausgesprochen wahrscheinlich.
Schließlich finden sich auch noch das Keratin 6A und das aeidie hair Keratin in katagenen Haarfollikeln repremiert.
Die Beurteilung, ob die differentielle Expression verschiedener Gene signifikant ist oder nicht, wird maßgeblich durch die Anzahl der sequenzierten Tags bestimmt. Durch eine Erhöhung der Zahl sequenzierter Tags können nicht signifikante Expressionsunterschiede statistisch signifikant werden.
Um die Relevanz subsignifikanter Expressionsunterschiede zu beurteilen, können verschiedene Methoden der Datenanalyse herangezogen werden, über die biologisches Fachwissen in die Beurteilung der Expressionsunterschiede einfließt. Eine Methode ist das Clustem der identifizierten Gene nach ihrer GO-Annotation. Die GO-Annotation ergibt sich aus den Einträgen in der Datenbank des Gene Ontology (GO)-Konsortiums, in der einzelne Genen/Proteinen nach ihrer (übergeordneten) Funktion klassifiziert werden [http://www.geneontology.org/]. Durch Verwendung dieser Verwandschaftsmerkmale bekommen auch Expressionsunterschiede eine Bedeutung, die statistisch nicht außerhalb des Konfidenzintervalls liegen.
Tabelle 7 enthält eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten, in anagenen Haarfollikeln und in katagenen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene unter Angabe • der laufenden Sequenz-ID (vgl. Sequenzprotokoll) in Spalte 1 , • der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2, • der relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 3, • der relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte 4, • des Verhältnisses der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln zueinander in Spalte 5, • der Signifikanz der in Spalte 5 genannten Werte in Spalte 6, • der GO-Nummer in Spalte 7, • einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 8 und • der Swissprot-Accession-Number in Spalte 9
Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Unter ihrer GO-Nummer sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.geneontology.org/.
Beispielsweise zeigt sich im katagenen Haarfollikel eine deutliche Induktion von
Genen des DPP-IV Clusters, einer Familie von Dipeptidylpeptidasen (Attractin
[Anagen 8 Tags: Katagen 23 Tags],DPP-9 [0:9], DPP-4 [0:2], DPP-8 [0:1]).
Die Dipeptidylpeptidasen der DPP-IV-Familie sind Prolin-spezifische Proteasen, deren hauptsächliche Funktion offensichtlich die Regulation verschiedener pathologischer und physiologischer Prozesse zu sein scheint (Aleski und Malik
(2001), Biochim Biophys Act, 1550:107-116).
Darüber hinaus findet sich eine schwache aber konsistente Induktion verschiedener DNA Reparatur-Helikasen, beispielsweise RecQ-like 5 [3:8], RecQ- like 4 [1 :2], RuvB-like [0:3] usw. Diese Induktion ist bei allen annotierten Helikasen dieses Datensatzes zu finden.
Außerdem findet sich eine deutliche Induktion des Melanin-Biosynthese Clusters, unter den u.a. die Dopachrome Tautomerase [0:7] und Silver/pMEL17 [7:17] fallen.
Im Gegensatz dazu findet sich in anagenen Haarfollikeln eine Induktion verschiedener Untereinheiten des Typ IV Kollagens (α1 [5:1], α2 [1 :0], α6 [4:0]).
Kollagen Typ IV ist ein typischer Bestandteil der Follikelmatrix, und eine gesteigerte Expression dieses Proteins ist in der Wachstumsphase des Follikels zu erwarten.
Der "Synaptosome"-Cluster ist ebenfalls in den anagenen Haarfollikeln induziert. Unter diesem Cluster finden sich die SNARE-Proteine VAMP-2 [5:0] und VAMP-3 [4:0], die eine generelle Rolle bei der Sekretion besitzen. Unterstützt wird diese Beobachtung durch die allgemeine Induktion von Genen, die eine Rolle in der Exozytose spielen. Diese Induktion von Genen der Exozytose steht wahrscheinlich im Zusammenhang mit dem Prozess der Pigmentierung des Haares. Voraussetzung der Pigmentierung ist der Transfer melanin-syhthetisierender Organellen, sogenannter Melanosomen, aus Melanozyten in Keratinozyten des Haarfollikels. Melanosomen zeigen eine große mikroskopische Ähnlichkeit zu den Synaptosomen der Nervenzellen, sekretorische Vesikel, die ein Auschüttung von Neurotransmittem ermöglichen. Die Rolle von SNARE-Proteinen für die Synaptosomen ist hinreichend dokumentiert, die Rolle dieser Proteine in Melanosomen wird zur Zeit diskutiert (Scott et al. (2002), J Cell Sei, 115:1441-51). Schließlich sind in den anagenen Haarfollikeln noch Gene der Gruppe mit N- Acetyliactoseamin Synthase-Aktivität induziert (Kette 1 [3:0], Kette 2 [8:2], Kette 3 [1 :0]). Poly-N-acetyllactosamin-Strukturen finden sich sowohl in N- als auch in O- verknüpften Glycanen der Glycoproteine aus Säugetieren. Diese Glycane interagieren vermutlich mit Selectinen und anderen Glycan-bindenden Proteinen (Zhou (2003), Curr Protein Pept Sei, 4:1-9).
Eine weitere Möglichkeit, die Relevanz subsignifikant differentiell exprimierter Gene zu steigern, ist das Clustern nach Sequenzmotiven. Ein solches Clustern wird durch den Abgleich der SAGE-Daten mit den Daten aus verfügbaren Domänen- und Motivdatenbanken, beispielsweise PROSITE und Pfam, ermöglicht [http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml; http://www.expasy.ch/prosite/].
Tabelle 8 enthält eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten, in anagenen Haarfollikeln und in katagenen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene unter Angabe • der laufenden Sequenz-ID (vgl. Sequenzprotokoll) in Spalte 1 , • der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2, • der relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 3, • der relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte 4, • des Verhältnisses der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln zueinander in Spalte 5, • der Signifikanz der in Spalte 5 genannten Werte in Spalte 6, • einer Kurzbeschreibung des Motivs oder des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 7 und • der Swissprot-Accession-Number in Spalte 8
Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Durch diesen Abgleich wird auch die Signifikanz einiger bereits beschriebener Gene weiter gesteigert. So wird der GO-Cluster mit Dipeptidylpepidase-Aktivität durch weitere Mitglieder der PF:PEPTIDASE_S9 Familie erweitert. Weiterhin findet sich in den katagenen Haarfollikeln eine deutliche Induktion von Proteinen mit einer GRAM-Domäne. Die Funktion der Domäne ist zur Zeit noch nicht bekannt (Doerks et al. (2000),Trends Biochem Sei, 25:483-485). Wie bereits als GO-Cluster beschrieben, findet sich auch in diesem Ansatz eine Repression der Typ IV Kollagen-Untereinheiten (C4-Domäne) in katagenen Haarfollikeln.
Auffällig ist eine Induktion von Proteinen mit einer Gla-Domäne in den anagenen Haarfollikeln. Dabei handelt es sich um die Proteine Matrix-Gla und Osteocalcin. Das Matrix-Gla-Protein wurde als Antagonist des BMP-2 in der Haarfollikelentwickung und im -zyklus beschrieben (Nakamura et al. (2003), FASEB J., 17:497-9).
Außerdem kann die Signifikanz der differentiellen Expression verschiedener Gene noch durch eine lexikalische Analyse gesteigert werden. In diesem Fall werden übereinstimmende Stichwörter in den Beschreibungstexten zu den verschiedenen Genen, wie sie beispielsweise in den Datenbank-Annotationen zu finden sind, gesucht.
Tabelle 9 enthält eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten, in anagenen Haarfollikeln und in katagenen Haarfollikeln differentiell exprimierten Gene unter Angabe • der laufenden Sequenz-ID (vgl. Sequenzprotokoll) in Spalte 1 , • der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2, • der relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln in Spalte 3, • der relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln in Spalte 4, • des Verhältnisses der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in anagenen Haarfollikeln und der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in katagenen Haarfollikeln zueinander in Spalte 5, • der Signifikanz der in Spalte 5 genannten Werte in Spalte 6, • des Suchwortes in Spalte 7, • einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 8 und • der Swissprot-Accession-Number in Spalte 9
Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert wird, als in katagenen Haarfollikeln, oder umgekehrt.
Aufgrund dieser Analyse findet sich in katagenen Haarfollikeln eine signifikante Induktion des Clusters mit dem Stichwort "Autophagy" (Apg4 [2:7], Apg3 [0:2], Apg10 [0:2], Apg5 [0:1]). Autophagie ist ein Prozess, bei dem Zellen makroskopische Zellbestandteile, wie beispielsweise Organellen, in Autophagosomen einhüllen und dann im Lysosom verdauen. Autophagie tritt vor allem bei Versorgungsmangel der Zellen auf; exzessive Autophagie wird als ein Mechanismus des nicht-apoptotischen programmierten Zelltodes angesehen. Weiterhin sind in katagenen Haarfollikeln Cluster reprimiert, die sich aufgrund der Stichworte "dsc2" und "desmocollin" bilden. Insbesondere für das Desmocollin-3 ist eine Lokalisation im Haarfollikel beschrieben (Kurzen et al. (1998), Differentiation, 63:295-304; Nuber et al. (1996), Eur J Cell Biol, 71 :1-13). Die ribosomalen RNAs, für die sich schon zuvor eine deutliche Repression in katagenen Haarfollikeln zeigte, sind auch in dieser Analyse in den katagenen
Haarfollikeln deutlich reprimiert.
Auffällig ist schließlich noch die Repression von Selenoproteinen in katagenen
Haarfollikeln.
Die zweite der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (2) zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut oder aus menschlichen Haarfollikeln gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in anagenen und katagenen menschlichen Haarfollikeln differentiell exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen Haarfollikeln, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in anagenen Haarfollikeln.
Erkrankungen bzw. Störungen des Haarzyklus sind beispielsweise: Pili torti (Torsionshaare, gedrehte Haare), Monilethrix (Spindelhaar), Wollhaare (Kräuselhaar), Haarschaftveränderungen mit Brüchen [Trichorrhexis nodosa, Trichorrhexis invaginata, Trichoschisis, Trichoptilosis (Haarspliß)], Haarschaftveränderungen bei Stoffwechselstörungen, Pili recurvati, Rollhaare, Veränderungen der Haarfarbe [Heterochromie, Albinismus, Poliose (erworbene herdförmige Pigmentlosigkeit der Haare), Canitis (physiologisches Ergrauen)], Hypertrichosen, Hirsutismus, Alopezien (Irreversible Alopezie.: z.B. Androgenetische Alopezie des Mannes und der Frau); Reversible Alopezie.: z.B. Symptomatische diffuse Alopezien durch Infektionen, ehem. Noxen und Arzneimittel, hormonelle Störungen, Krankheiten, etc.) sowie Alopezia areata.
Die Gewinnung des Gemisches in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus kann aus Vollhautproben, behaarten Hautäquivalenten, isolierten Haarfollikeln, Haarfollikeläquivalenten oder Zellen behaarter Haut vorgenommen werden.
Es kann in Schritt b) des Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ausreichend sein, das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zu untersuchen, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in anagenen und katagenen Haarfollikeln differentiell exprimiert identifiziert werden, wenn diese ausschließlich in anagenen oder ausschließlich in katagenen Haarfollikeln exprimiert werden. In allen anderen Fällen muß in Schritt b) auch die Menge der differentiell exprimierten Moleküle untersucht werden, d. h., die Expression muß quantifiziert werden.
In Schritt d) des Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus wird das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zugeordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen, d. h., daß das Gemisch entweder mehr unterschiedliche typischerweise in anagenen Haarfollikeln exprimierte Verbindungen enthält, als solche, die typischerweise in katagenen Haarfollikeln exprimiert werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise in anagenen Haarfollikeln exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in katagenen Haarfollikeln vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu in Regression befindlichem bzw. krankem Haar wird in komplementärer Weise verfahren.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot-Accession-Number definiert werden und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in anagenen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number definiert werden und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in anagenen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 7 in Spalte 9 durch ihre Swissprot-Accession-Number definiert werden und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es' überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in anagenen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens 1 ,3-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens 1 ,3-fach so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 3 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen ' Haarfollikeln mindestens 2-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens 2-fach so stark exprimiert werden wie in anagenen.
Eine weitere ganz besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Haarzyklus ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 2 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in anagenen. Man kann den Haarzyklus auch dadurch beschreiben, daß mehrere Marker (Expressionprodukte der für anagene oder katagene Haarfollikel bedeutsamen Gene) quantifiziert werden, die dann untereinander in einem charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um wachsendes bzw. gesundes Haar zu repräsentieren, bzw. in einem hiervon verschiedenen charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um in Regression befindliches bzw. krankes Haar zu repräsentieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren (3) zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut oder aus menschlichen Haarfollikeln gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels Verfahren (1) als für den Haarzyklus bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt und den Expressionsquotienten bildet, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in anagenen bzw. in katagenen Haarfollikeln vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den Tabellen 2 bis 6, Spalte 5 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Follikel bzw. der untersuchten behaarten Haut den Expressionsverhältnissen in anagenen Haarfollikeln entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Follikel bzw. der untersuchten behaarten Haut den Expressionsverhältnissen in katagenen Haarfollikeln entsprechen. Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren gewinnt man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispielsweise in „Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161 :12 1735-8; sowie in „Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sei., 1998, 91 , 231-244; und auch im Internet unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die im extrazellulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender Verbindungen beschränkt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente, mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese Affinitätschromatographie Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in dem Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die 2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L.D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA- Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Northern Blots, ii. Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), iii. RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. cDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA), xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE), xii. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS®) und insbesondere xiii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Das TOGA-Verfahren ist in "J. Gregor Sutcliffe et al, TOGA: An automated parsing technology for analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976-1981 (2000)" beschrieben, worauf hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird.
Das MPSS®-Verfahren ist in der US-A-6,013,445 beschrieben, worauf hiermit in vollem umfang Bezug genommen wird.
Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen eingesetzt werden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot- Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen in vitro, umfassend i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden.
Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können. Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden. Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle). Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktionellen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein.
Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics, Vol. 21 , Supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA- Chiptechnologie liefern die Bücher „DNA Microarrays: A Practical Approach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und „Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA- Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete technische Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot-Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei denen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA-Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen. Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z.B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden-Immobilisierung eingeschätzt.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden- Immobilisierung realisiert:
E.M. Southern (E.M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 und E.M. Southern et al. ( 1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Synthese an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.
Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithographischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. Natl Acad Sei USA 91 , 5022-5026).
Neben diesen auf der in stfu-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Techniken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von Trägermaterial gebunden werden.
P.O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) beschreibt die Immobilisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen. Die Veröffentlichung von L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebunden werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyl- diisothioeyanat behandelt wurde. Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenannten „Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z.B. einem Durchmesser von 250 μm, in Sondenlösungen ein und überführen anschließend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trägermaterial des DNA-Chips.
Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezogesteuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlösungen mit einem Volumen von 100 Picolitem kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z.B. wie in der EP-A-0 965 647 beschrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'- Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glasoberfläche gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspezifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäuresequenz in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisierten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei 96°C für 10 Min entfernt.
In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu vergleichenden Zellpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser Transkription unter Verwendung von z.B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z.B. rot bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschließend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert. Ein entscheidender Erfolgsfaktor für den Einsatz der DNA-Chiptechnologie zur Analyse der Genexpression der Haarfollikel ist die Zusammensetzung der genspezifischen Sonden auf dem DNA-Chip. Hier werden insbesondere die bei der SAGE™-Analyse identifizierten relevanten Gene des Haarzyklus eingesetzt. Da bei der Verwendung eines DNA-Chips zur Analyse der relevanten Gene des Haarzyklus mitunter ausgesprochen geringe mRNA-Mengen untersucht werden müssen, kann sich die Notwendigkeit ergeben, die mRNA vor der Analyse mit Hilfe der sogenannten linearen Amplifikation (Zhao et al. (2002), BMC Genomics, 3:31) anzureichern. Dabei wird die mRNA einer Probe zunächst in cDNA umgeschrieben. Die amplifizierte RNA wird aus dieser doppelsträngigen cDNA durch in vitro -Transkription gewonnen.
Für die Herstellung kleiner (bis etwa 500 Sonden umfassender) Biochips sind die in der DE-A-100 28 257.1-52 und in der DE-A-101 02 063.5-52 genannten Analysechips ganz besonders bevorzugt. Diese Analysechips weisen eine elektrisch adressierbare Struktur auf, die eine Elektrofokussierung der Proben gestattet. Hierduch wird es vorteilhafterweise ermöglicht, Proben unabhängig von ihrer Viskosität mit Hilfe von Elektroden an definierten Punkten eines Punktrasters (Arrays) zu fokussieren und zu immobilisieren. Durch die Fokussierfähigkeit erfolgt gleichzeitig eine Erhöhung der lokalen Konzentration der Proben und so eine höhere Spezifität. Während der Analyse selbst besteht die Möglichkeit das Testgut an die einzelnen Positionen des Arrays zu adressieren. So kann potentiell jede untersuchte Information mit der höchst möglichen Sensitivität aufgespürt werden. Eine Kreuzkontamination durch benachbarte Spots ist nahezu ausgeschlossen.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, bevorzugtermaßen 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein. Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist ein DNA-Chip, der Sonden aufweist, die ausgewählt sind unter den in den Tabellen 2 und 5 aufgeführten Sonden, den in Tabelle 3 aufgeführten Sonden (ohne mitochondriale und ribόsomale Tags sowie den überrepräsentierten Gruppen "DNA Helikase-Aktivität", "DPPIV- Aktivität" und "Melanin Biosynthese aus Tyrosin" aus Tabelle F.
In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden, als Haarzyklus- Marker bei Menschen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Beeinflussung des Haarzyklus insbesondere gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums, in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums einmal oder mehrmals auf die behaarte Haut aufbringt, c) erneut den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) ermittelt.
Das erfindungsgemäße Testverfahren kann mit Vollhautproben, behaarten Hautäquivalenten, isolierten Haarfollikeln, Haarfollikeläquivalenten oder Zellen behaarter Haut durchgeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden, zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a. den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums einmal oder mehrmals auf die behaarte Haut aufbringt, c) den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Tabellen:
Tabelle 1 :
AnagerkatageriQuotienfeignifikan UniGene Swissproi Tag ID 7,98 5,01 1,59 0,37 Hs.2062 P11473 vitamin D receptor 1,00 2,00 -2,00 0,60 Hs.87409 P07996 thrombospondin 1 1,00 3,01 -3,01 0,43 Hs.26690 P34130 neurotrophin 5 (neurotrophin 4
Tabelle 2:
Tabelle 3:
Tabelle 4:
Tabelle 5:
Tabelle 6:
Tabelle 7:
Tabelle 8:

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut oder aus menschlichen Haarfollikeln gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in anagenen und katagenen menschlichen Haarfollikeln differentiell exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen Haarfollikeln, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in anagenen Haarfollikeln.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 9 in Spalte 8 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes, oder in Spalte 9 durch ihre Swissprot- Accession-Number definiert werden und b) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente, von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in anagenen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 8 in Spalte 7 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes, oder in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number definiert werden und b) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in anagenen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 7 in Spalte 8 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes, oder in Spalte 9 durch ihre Swissprot- Accession-Number definiert werden und b) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln stärker exprimiert werden als in anagenen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession- Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und b) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in anagenen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession- Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und b) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in anagenen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession- Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und b) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens 1 ,3-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens 1 ,3-fach so stark exprimiert werden wie in anagenen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 3 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession- Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und b) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens 2-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens 2-fach so stark exprimiert werden wie in anagenen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man a) in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 2 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession- Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden und b) in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anagenen Haarfollikeln mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in katagenen, oder das in b) untersuchte Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in katagenen Haarfollikeln mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in anagenen.
10.Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen, in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus behaarter menschlicher Haut oder aus menschlichen Haarfollikeln gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels Verfahren (1) als für den Haarzyklus bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt und den Expressionsquotienten bildet, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in anagenen bzw. in katagenen Haarfollikeln vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den Tabellen 2 bis 6, Spalte 5 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch wachsendem bzw. gesundem Haar zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Follikel bzw. der untersuchten behaarten Haut den Expressionsverhältnissen in anagenen Haarfollikeln entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch in Regression befindlichem bzw. krankem Haar zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Follikel bzw. der untersuchten behaarten Haut den Expressionsverhältnissen in katagenen Haarfollikeln entsprechen.
11. Test-Kit zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen nach einem der Ansprüche 1 bis 10. umfassend Mittel zur Durchführung der Verfahren.
12. Biochip zur Bestimmung des Haarzyklus bei Menschen in vitro, umfassend a) einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und b) auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot-Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession-Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden.
13. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot- Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession- Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden, als Haarzyklus-Marker bei Menschen.
14. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Beeinflussung des Haarzyklus insbesondere gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums, in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums einmal oder mehrmals auf die behaarte Haut aufbringt, c) erneut den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test- Kits zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) ermittelt.
15. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums, umfassend Mittel zur Durchführung des Testverfahrens gemäß Anspruch 14.
16. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot- Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession- Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden, zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums..
17. Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums einmal oder mehrmals auf die behaarte Haut aufbringt, c) den Haarstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Haarzyklus, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
18. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in Tabelle 8 in Spalte 8 durch ihre Swissprot- Accession-Number, in den Tabellen 7 und 9 in Spalte 9 durch ihre Swissprot- Accession-Number sowie in den Tabellen 2 bis 6 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, in Spalte 8 durch ihre Swissprot-Accession- Number, oder in Spalte 9 durch ihre Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums.
19. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Erkrankungen oder Beeinträchtigungen der Haare und ihres Wachstums bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
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