DE60009530T2 - Genetische toxizitätsmarker, herstellung und verwendung - Google Patents

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    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Technikbereiche der Biotechnologie, der Medizin, der Biologie und der Biochemie. Ihre Anwendungen betreffen die Gesundheit von Menschen, Tieren und Pflanzen. Ganz besonders beschreibt die Erfindung neuartige Verfahren, die die Bestimmung des toxischen Potenzials von Testverbindungen oder die Vorhersage der Sensibilität oder der Reaktion von Patienten auf diese Verbindungen erlauben, sowie auch Werkzeuge und Kits zur Anwendung dieser Verfahren. Die Erfindung beschreibt ebenfalls Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäure-Sequenzen, die als genetische Marker der Toxizität verwendbar sind. Die Erfindung ist besonders in der pharmazeutischen Industrie zur Analyse des toxischen Profils von Molekülen von Nutzen, die in der pharmazeutischen Entwicklung und/oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen Verwendung finden werden können.
  • Toxische Probleme bilden den wesentlichen Grund für den Verzicht auf Moleküle für therapeutische Zwecke im Verlauf der präklinischen und klinischen Entwicklung. Bekanntlich gibt es bis zum heutigen Tag keinen Test, der die schnelle Diagnose der Toxizität von Molekülen beim Menschen erlaubt. Die Genehmigungsbehörden fordern jedoch, dass ein neues Kandidaten-Molekül einer Reihe an Tests auf Toxizität, Mutagenität, Carcinogenität und Teratogenität bei Tieren und vor klinischen Versuchen beim Menschen unterzogen wird. Diese Tests sind lang, teuer und nur teilweise befriedigend. Auch die Toxizität beim Tier ist weit davon entfernt, die Toxizität beim Menschen widerzuspiegeln. Andererseits erlaubt die beschränkte Anzahl an Patienten, die an den klinischen Untersuchungen beteiligt sind, keine systematische Identifizierung der toxischen Probleme, die mit einer kleinen und spezifischen Population verbunden sind. Die Einrichtung, Entwicklung und Anwendung derartiger Test würde die Identifizierung und Eliminierung möglichst der meisten toxischen Moleküle erlauben. Neue Behandlungen könnten viel früher und mit geringeren Kosten für die pharmazeutische Industrie und auch für die Gesundheitsinstitutionen und die Verbraucher in den Handel gebracht werden. Zudem könnten derartige Tests ebenfalls die Detektion bestimmter Toxizitäten erlauben, die gegenwärtig nur gemacht werden, nachdem die Verbindungen im Handel sind.
  • Die gegenwärtig verfügbaren Test erlauben nicht die hinreichende Charakterisierung , der Toxizitätsmarker und des toxischen Potenzials der Moleküle. Bestimmte Tests, die bei Bakterien (Ames-Test) oder bei Hefe (wie beispielsweise in der US Patentanmeldung 4.997.757 beschrieben) entwickelt worden sind, bestimmen das mutagene Potenzial der Verbindungen. Diese Tests können nur erfolgte Beeinträchtigungen auf DNA-Ebene nachweisen. Aber zahlreiche Moleküle üben toxischen Effekte aus, ohne deswegen mutagen zu sein und können folglich nicht von derartigen Mitteln detektiert werden. Andere Tests wie beispielweise der in der Anmeldung WO 94/17208 beschriebene Test verwenden eine bestimmte Anzahl an Promotoren von bekannten eukaryotischen Genen oder von diesen Promotoren entnommene Reaktionselemente, die in verschiedenen Stresssituationen induziert sind, um den toxischen Effekt der Moleküle zu charakterisieren. Jedoch erlauben die beschränkte Anzahl dieser genetischen Marker und der gemessene Prozess (Aktivität eines Promotors) nicht die Vorhersage des toxischen Potenzials der Verbindungen. Außerdem sind diese Tests schwierig durchzuführen, da sie die Kultivierung transformierter Zelllinien beinhalten, die ein oder mehrere genetische Konstrukte umfassen. WO 99/42606 betrifft den Einsatz bestimmter Fische (Teleostei und Teleostomi) zur Bewertung der Toxizität von Verbindungen.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt nun effiziente und schnelle Verfahren zur Bestimmung des toxischen Potenzials von Testverbindungen, sowie auch Mittel und Kits zur Durchführung derartiger Verfahren. Der Ausdruck «Toxizität» bezeichnet im Sinne der Erfindung jeglichen unerwünschten und/oder sekundären Effekt einer Verbindung auf den Stoffwechsel einer Zelle oder eines Gewebes, wie besonders ihr mutagenes, carcinogenes, teratogenes etc. Potenzial, und allgemeiner jegliche Störung des Stoffwechsels, die zu einem negativen Effekt der Verbindung auf die Zelle oder das Gewebe führen kann. Die vorliegende Erfindung beruht ganz besonders auf dem Genom und der Entwicklung genetischer Marker der Toxizität, die für eine Vorhersage des toxischen Charakters eines jeden Verbindungstyps auf jeden Zelltyp zweckdienlich sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls neue Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäure-Sequenzen, die die Bestimmung der Toxizität von Molekülen (z. B. genetische Marker der Toxizität) erlauben, insbesondere von Molekülen, die in der pharmazeutischen Entwicklung und/oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen Verwendung finden.
  • Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf dem Nachweis, dass genetische Marker zur Bewertung des toxischen Charakters von Testverbindungen gebildet und verwendet sein können. Insbesondere und vorteilhafterweise sind diese Marker verwendbar, unabhängig davon, welche toxische Verbindung getestet werden soll und mit welchem Zelltyp diese Testverbindung verwendet ist. Derartige Marker, wie auch die Träger, Kits und Verfahren der Erfindung erlauben vorteilhafterweise auf eine schnelle Art und Weise die Generierung von besonders entwickelten und zuverlässigen Toxizitätsprofilen. Außerdem erlauben diese Marker, Träger, Kits und Verfahren der Erfindung auch die Bestimmung und Zuweisung von Toxizitätsindices den Testverbindungen.
  • Insbesondere zeigt die vorliegende Erfindung, dass es genetische Ereignisse gibt, die sowohl toxischen Zuständen als auch zellulären Stoffwechselwegen, die in Abwesenheit toxischer Verbindungen induziert sind, gemeinsam sind. Derartige genetische Ereignisse können folglich induziert werden und dann als genetischer Marker der Toxizität verwendet sein. Wie es noch detailliert in der vorliegenden Beschreibung beschrieben wird, können derartige Marker außerdem selektioniert und modifiziert werden, um verbesserte Banken zu bilden, was eine prädiktivere Diagnose der Toxizität einer Verbindung erlaubt. Spezifischer zeigt die vorliegende Erfindung nun, dass genetische Marker, die in einer Zelle in einem deregulierten Zustand von zellulären Signalwegen induziert sind, insbesondere eine Zelle, wo die Lebensfähigkeit und/oder die Proliferation der Zelle dereguliert sind (zum Beispiel bei der Apoptose), in effektiver Weise zur Charakterisierung des toxischen Profils von Testverbindungen verwendet werden können. Vorteilhafterweise zeigt die Erfindung ebenfalls, dass diese Marker in Toxizitätstests unabhängig vom verwendeten Verbindungstyp und Zelltyp verwendet sein können. Die Erfindung beschreibt ebenfalls die Bildung differenzieller Nucleinsäure-Banken, die für die Deregulation zellulärer Signalwege charakteristisch sind, besonders Situationen, in denen die Lebensfähigkeit und/oder Proliferation der Zelle dereguliert sind, und weist nach, dass diese Banken zur Bewertung des toxischen Profils von Verbindungen mit einer beträchtlichen Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit verwendet sein können.
  • Die Erfindung erlaubt ebenfalls die Identifizierung und/oder Charakterisierung von Mutationen und Polymorphismen (insbesondere SNPs «Single Nucleotide Polymorphisms»), die für Profile von Probanden, besonders für das Antwortprofil auf eine Verbindung oder Behandlung, für das Empfindlichkeitsprofil auf einen toxischen Effekt, etc. charakteristisch sind. Wie auch die gebildete Banken einen Auszug von Sequenzen repräsentieren, die im Verlauf der zellulären Signalderegulationen mobilisiert sind, besonders bei Stress, der zur Apoptose führen kann. Die Erfindung zeigt, dass die Expression dieser Sequenzen auf spezifische Weise als Antwort auf bestimmte Verbindungen modifiziert ist. Mutationen oder Polymorphismen, auch als SNPs (single nucleotid polymorphisms) bezeichnet, können die Gene beeinflussen, die von diesen Sequenzen stammen. Individuen, die derartige Polymorphismen zeigen, sind folglich für gestörte Antworten auf Verbindungen empfindlich, die die Expression dieser Gene mobilisieren. Ein Aspekt der Erfindung ist folglich ebenfalls, eine geeignete Auswahl von Genen zu erlauben, die an den toxischen Phänomen beteiligt sind. Genauer, die Erfindung erlaubt im Rahmen dieser Auswahl eine ergänzende Auswahl von Genen durchzuführen, die bei der Antwort auf eine bestimmte Verbindung beteiligt sind. Die Erfindung stellt eine Grundlage für die Suche nach Polymorphismen in einer beschränkten Anzahl (10 bis 50) an Genen bereit, deren Expressionsmodifikationen mit der toxischen Wirkung auf eine bestimmte Verbindung verbunden ist, wobei diese zu jeder pharmakologischen Klasse und zu jeder chemischen Familie gehören kann.
  • Ein Gegenstand der Erfindung besteht folglich ganz besonders in der Verwendung von genetischen Markern, die für (einen) deregulierte(n) Zustand/Zustände von Signalwegen der Zelle («deregulierte(n) Zustand/Zustände») charakteristisch sind, zur Charakterisierung des toxischen Profils von Testverbindungen. Ein Gegenstand der Erfindung ist bevorzugter die Verwendung von genetischen Markern, die in einem deregulierten Zustand induziert sind, zur Charakterisierung des toxischen Profils von Testverbindungen. Bevorzugter betrifft die Erfindung die Verwendung von Nucleinsäure-Klonen, die genetischen Ereignissen (zum Beispiel transkriptionellen Ereignissen und/oder Spleißereignissen) entsprechen, die für (einen) deregulierte(n) Zustand/Zuständen als genetische Marker der Toxizität charakteristisch sind.
  • Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Analyse des toxischen Potenzials einer Testverbindung, umfassend wenigstens einen Hybridisierungsschritt von a) einer Probe an Nucleinsäuren von Zellen, die mit dieser Verbindung behandelt sind, und b) einem Präparat (zum Beispiel einer Bank) an Nucleinsäuren, die genetischen Ereignissen entsprechen, die für deregulierte Zustände charakteristisch sind, wobei das Hybridisierungsmuster das toxische Potenzial der Testverbindung anzeigt.
  • Die Erfindung besteht noch aus Kits zur Durchführung dieser Verfahren, sowie auch aus Zusammensetzungen oder Banken von Nucleinsäuren, die genetische Marker von Deregulation(en) der zellulären Signalwege umfassen oder ebenfalls aus Verfahren, die die Generierung derartiger Marker erlauben.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der beschriebenen Klone oder Nucleinsäuren zur Identifizierung von Mutationen oder Polymorphismen, besonders SNPs, die mit der Antwort von Probanden auf pharmazeutische Verbindungen korreliert sind. Die Erfindung erlaubt nämlich die Identifizierung einer Reihe an Genen, deren Expressionen als Antwort auf eine bestimmte Verbindung modifiziert sind. Diese Gene können innerhalb von Humanpopulationen Mutationen oder Polymorphismen (deren SNPs, single nucleotide polymorphisms) zeigen. Die Erfindung erlaubt die Selektion der Gene und ihre Polymorphismen zu untersuchen, für eine Segregation von Patienten in Abhängigkeit ihres Genotyps nach ihrer Fähigkeit, auf mehr oder weniger optimale Weise auf eine Verbindung zu antworten und ganz besonders die Toxizitätsrisiken zu minimieren.
  • In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung allgemeiner die Verwendung von Nucleinsäuren, die für einen bestimmten physiopathologischen Zustand charakteristische Spleißereignisse repräsentativ sind, zur Identifizierung oder Charakterisierung von SNPs, die mit besagtem Zustand korreliert sind.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung von SNPs oder anderen Mutationen oder Polymorphismen, die die Bewertung der Antwort eines Probanden auf eine bestimmte Verbindung erlauben, umfassend (i) die in vitro Identifizierung von Nucleinsäuren, die für in einer mit besagter Verbindung behandelten Zelle induzierte Spleißereignisse charakteristisch sind, und (ii) die Identifizierung von SNPs oder anderen Mutationen oder Polymorphismen in dem oder den Genen, die in (i) identifizierten Nucleinsäuren entsprechen. Die Erfindung stellt auch Verfahren und Mittel zur Selektion von Genen bereit, bei denen Polymorphismen mit einer Toxizität für eine bestimmte Verbindung verbunden sind.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Population an Nucleinsäuren, die für so identifizierte Polymorphismen oder SNPs charakteristisch sind, besonders Nucleotid-Primer zur selektiven Amplifikation der Polymorphismen oder Sonden zur selektiven Hybridisierung mit den in Betracht kommenden Polymorphismen.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Analyse (zum Beispiel Vorhersage, Bewertung oder Bestimmung) der Antwort eines Probanden auf eine Testverbindung, umfassend die Untersuchung von Polymorphismen, besonders die Analyse von zuvor definierten SNPs.
  • Die vorliegende Erfindung basiert folglich besonders auf der Definition und der Entwicklung genetischer Marker der Toxizität, die in Verfahren zur Vorhersage des toxischen Charakters einer Testverbindung, oder als Ziel zur Untersuchung der Mechanismen des Zelltods und bei der Suche oder der Entwicklung von therapeutischen Produkten zweckdienlich sind.
  • 1. Definition und Entwicklung genetischer Marker der Toxizität
  • Die Lebensfähigkeit und Differenzierung von Zellen sind durch die Balance zwischen den Phänomenen Mitose und Apoptose reguliert. Im Organismus ist die Homöostase des Gewebes ebenfalls von dieser Balance zwischen Zellproliferation und Zelltod bestimmt. Die Störungen dieses Gleichgewichts bilden die Basis von Krankheiten, die mit einer übermäßigen (neorodegenerative Krankheiten) oder einer mangelnden Apoptose (rheumatoide Polyarthritis, Krebserkrankungen) verbunden sind. Die vorliegende Erfindung beruht besonders auf der Hypothese, dass Störungen dieses Gleichgewichts ebenfalls an diesen toxischen Phänomenen beteiligt sein können und dass genetische Marker, die für diese Deregulationsereignisse der zellulären Signalwege (besonders der Lebensfähigkeit und/oder Zellproliferation) charakteristisch sind, wirksame Marker der Toxizität bilden könnten.
  • Die vorliegende Erfindung zeigt nun, dass es genetische Ereignisse gibt, die sowohl diesen deregulierten Zuständen der zellulären Signalwege als auch toxischen Zuständen, die von Verbindungen induziert sind, gemeinsam sind. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Identifizierung, Charakterisierung, Selektion und Isolierung von Nucleinsäure-Klonen bereit, die diesen genetischen Ereignissen entsprechen, und zeigt, dass sie als genetische Marker der Toxizität effektiv verwendet sein können. Die Erfindung beschreibt ebenfalls die Bildung von Banken derartiger Klone, besonders auf festen Trägern, und ihre Verwendung bei Verfahren zur Diagnose der Toxizität von Testverbindungen.
  • 2. Definitionen
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck deregulierter Zustand oder «Deregulation» jeden deregulierten Zustand oder Störung eines oder mehrerer zellulärer Signalwege und insbesondere jeden deregulierten Zustand des Zellwachstums und/oder der Zelllebensfähigkeit. Es handelt sich folglich um jede Zelle, in der ein oder mehrere zelluläre Signalwege gestört (nämlich insbesondere induziert oder reprimiert) worden sind, zum Beispiel ein Apoptosezustand, wie es noch detaillierter nachfolgend beschrieben wird.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „für einen deregulierten Zustand charakteristisches genetisches Ereignis" ganz besonders jede Modifikation der genetischen Aktivität, besonders der Expression von Genen (Steigerung oder Repression, Suppression oder Induktion, etc.), der posttranskriptionellen Regulation (besonders Spleißung), der Replikation, das Auftreten von Deletionen, etc., die für eine Deregulation charakteristisch ist, die nämlich in einer Zelle in dereguliertem Zustand induziert ist. Es ist zu verstehen, dass nicht jedes einzelne genetische Ereignis, das für eine Deregulation charakteristisch ist, für diesen Zustand notwendigerweise spezifisch ist, gerade wo bestimmte zelluläre Signalwege an mehreren zellulären Prozessen beteiligt sind. Daher fassen die Nucleinsäure-Banken der Erfindung unterschiedliche Klone zusammen und repräsentieren folglich tatsächlich genetische Signaturen, die für derartige Zustände charakteristisch sind.
  • Die Klone der Erfindung entsprechen bevorzugter transkriptionellen genetischen Ereignissen und/oder Spleißereignissen, die für Deregulation(en) charakteristisch sind. Im Kontext der Erfindung umfasst der Ausdruck „transkriptionelle Ereignisse" ganz besonders jede Expressionsaktivität von Genen, nämlich die Produktion von primären Transkripten, Prämessengern oder Messengern von den codierenden Regionen. Der Ausdruck "Spleißereignisse" bezeichnet ganz besonders jedes Spleißereignis, das mit einem deregulierten Zustand verbunden ist, nämlich das Auftreten von besonderen Spleißfuormen, das Verschwinden besonderer Spleißformen oder eventuell die quantitative Änderung von Spleißformen etc.
  • Die Erfindung beschreibt folglich die Herstellung von Nucleinsäure-Klonen, die derartigen genetischen Ereignissen entsprechen, die für Zustände charakteristisch sind, wo ein oder mehrere zelluläre Signalwege gestört sind, und ihre Verwendung als genetische Marker der Toxizität. Ein Nucleinsäure-Klon, der einem derartigen genetischen Ereignis entspricht, ist im Sinne der Erfindung jede Nucleinsäure oder jedes Nucleinsäure-Fragment, umfassend wenigstens eine Region, deren Sequenz für dieses Ereignis spezifisch ist. Daher kann es sich um jede Nucleinsäure handeln, die eine Sequenz umfasst, die für einen deregulierten Zustand charakteristische Spleißform oder Deletion oder noch für ein Gen spezifisch ist, das in dereguliertem Zustand spezifisch exprimiert oder reguliert ist. Derartige Klone sind folglich in der Lage, in einer Nucleinsäure-Testprobe mit den Spleißformen, die für den deregulierten Zustand charakteristisch sind, oder mit den Genen, die während des deregulierten Zustands bevorzugt oder spezifisch exprimiert sind, zu hybridisieren. Diese Klone erlauben daher mittels Hybridisierung die Anwesenheit genetischer Ereignisse zu zeigen, die in einer Testpopulation an Nucleinsäuren vorliegen.
  • 3. Präparation der genetischen Marker der Toxizität
  • Wie bereits oben angegeben, zeigt die vorliegende Erfindung, dass für deregulierte Zustände charakteristische genetische Marker als Marker der Toxizität verwendet sein können, und beschreibt in dieser Hinsicht die Entwicklung von Techniken, die die Generierung und Isolierung derartiger Marker erlauben.
  • Ein Gegenstand der Erfindung besteht folglich in Verfahren, die die Generierung genetischer Marker der Toxizität erlauben. Die Verfahren der Erfindung umfassen ganz besonders die Bildung von Klonen und Nucleinsäure-Banken, die für Deregulation(en) des/der zellulären Signalweges) charakteristisch sind. Diese Klone und Banken können auf verschiedene Arten generiert sein, wie es detailliert nachfolgend beschrieben wird. Zudem können die Banken der Erfindung variable Mengen an Nucleinsäure-Klonen enthalten. Außerdem sind diese Banken vorteilhafterweise auf Trägern angebracht, was den Hybridisierungsschritt und die Analyse des Hybridisierungsmusters erleichtert.
  • Das zur Herstellung der Klone und Banken verwendete Ausgangsmaterial umfasst hauptsächlich Nucleinsäure-Populationen, die von Zellen im deregulierten Zustand stammen, und Nucleinsäure-Populationen, die von Zellen im Kontrollzustand stammen. In einer ganz besonderen Anwendungsform umfasst der Herstellungsverfahren von genetischen Markern der Toxizität gemäß der Erfindung vorteilhafterweise einen Hybridisierungsschritt von einer Nucleinsäure-Probe, die von einer Zelle im deregulierten Zustand stammt, und einer Nucleinsäure-Probe, die von einer Zelle im Kontrollzustand stammt. Dieser Hybridisierungsschritt erlaubt die Generierung von Nucleinsäure-Klonen (oder Klonbanken), die für die Zelle im deregulierten Zustand verglichen mit dem Kontrollzustand charakteristisch sind.
  • Die verwendeten Nucleinsäure-Populationen sind zum Beispiel Gesamt-RNA oder Messenger-RNA von Zellen im deregulierten Zustand und Kontrollzustand, oder Nucleinsäuren, die von diesen Gesamt-RNA oder Messenger-RNA (mittels inverser Transkription, Amplifikation, Klonierung in Vektoren etc.) stammen. Diese Populationen können mit herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Techniken (inverse Transkription, Amplifikation etc.) hergestellt sein.
  • Die Wahl des oder der deregulierten Zustände, des oder der Kontrollzustände, sowie auch der Verfahren zur Herstellung und Isolierung der Marker sind entscheidend, da sie die Eignung der generierten Marker und folglich der Banken sowie auch ihre einfache Handhabung bestimmen.
  • 3.1. Ausgangsmaterial
  • Die genetischen Marker der Toxizität gemäß der Erfindung sind im Allgemeinen wie angegeben zunächst aus Nucleinsäure-Präparaten gewonnen, die von Zellen im deregulierten Zustand stammen. Es ist zu verstehen, dass diese Marker, wenn sie einmal isoliert und charakterisiert sind, mit künstlichen Verfahren wie beispielsweise PCR, künstliche Synthese (wenn die Sequenzen verfügbar sind), Amplifikation mittels Bakterienkultur, Replikation von Banken etc. reproduziert oder amplifiziert sein können wie es noch später erläutert wird.
  • Wie oben angegeben, versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter "Deregulierungszustand" jeden deregulierten Zustand des Wachstums und/oder der Lebensfähigkeit der Zelle, zum Beispiel jede Zelle, in der ein zellulärer Signalweg wenigstens gestört worden ist.
  • Gemäß einer besonderen Variante der Erfindung ist die Zelle im deregulierten Zustand eine Zelle, in der die Expression des ganzen oder eines Teils eines Gens verändert worden ist, das am Wachstum oder an der Lebensfähigkeit der Zelle beteiligt ist.
  • Gemäß einer anderen besonderen Variante der Erfindung ist die Zelle im deregulierten Zustand eine Zelle, in der die Expression des ganzen oder eines Teils eines beteiligten Onkogens oder eines Antionkogens verändert worden ist.
  • Gemäß einer anderen besonderen Variante der Erfindung ist die Zelle im deregulierten Zustand eine Zelle, in der die Expression des ganzen oder eines Teils eines an der zellulären Apoptose beteiligten Gens verändert worden ist.
  • Die zelluläre Apoptose ist ein dem Fachmann bekannter Ausdruck, der den Prozess des programmierten Zelltods bezeichnet. Die Apoptose umfasst eine Reihe an Mechanismen, Genen oder zellulären Stoffwechselwegen, die zum Tod der Zelle führen. Bestimmte die Apoptose initiierende und ausführende Systeme sind zum Beispiel die Antionkogene, die Fas und TNF-Rezeptoren, Adaptoren (besonders für "Death domain"), Mitglieder der bcl2-Familie oder noch Caspasen, die an der ontogenetischen Morphogenese, an den pathologischen Deregulationen und am Zelltod beteiligt sind.
  • Im Rahmen der Erfindung kann der Apoptosezustand jeder Zustand des Beginns, des Verlaufs oder der Beendigung der Apoptose sein, nämlich ein Apoptosezustand in jedem Stadium des voranschreitenden Prozesses des Zelltods, einschließlich sehr früher Stadien, in denen bestimmte Stoffwechselwege (oder zelluläre Signalwege) lediglich gestört (d. h. aktiviert, reprimiert, stimuliert etc.) worden sind. Die Klone der Erfindung können folglich aus jeder Zelle hergestellt sein, in der wenigstens ein zellulärer Signalweg gestört worden ist, insbesondere in der ein Apoptoseweg wenigstens initiiert worden ist. So kann es sich um Zellen handeln, in denen ein am Apoptoseprozess beteiligter Stoffwechselweg induziert oder stimuliert worden ist, selbst wenn diese Induktion oder Stimulation unter subletalen Bedingungen (d.h. nicht zum Zelltod führenden Bedingungen) erfolgt ist. In dieser Hinsicht kann es sich um Zellen in einem natürlichen Apoptosezustand (wie zum Beispiel eine Population an Zellen in Tumoren, bestimmte Nervenzellen bei pathologischen Zuständen) oder sowohl um Zellen handeln, in denen der Apoptosezustand künstlich induziert worden ist. Im letzteren Fall kann der Apoptosezustand durch verschiedene Behandlungsarten und besonders durch die Modulation der Aktivität, bevorzugt der Expression von die Apoptose initiierenden oder ausführenden Genen induziert sein.
  • In einer besonderen Form sind die genetischen Marker der Erfindung zunächst aus einer Population an Zellen hergestellt, in denen ein Apoptosezustand durch Induktion oder Repression der Aktivität, bevorzugt der Expression des ganzen oder eines Teils eines die Apoptose initiierenden oder ausführenden Gens, künstlich induziert worden ist.
  • Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung ist die Zelle in dereguliertem Zustand eine Zelle, in der die Aktivierung, bevorzugt die Expression des ganzen oder eines Teils eines anti-onkoguenen Gens (oder ein Tumor-Suppressorgen) induziert oder erhöht worden ist, zum Beispiel durch Überexpression, posttranskriptionelle Modifikationen) (Phosphorylierung, Glycosylierung etc.), deregulierte intrazelluläre Lokalisation, Assoziierung mit unterschiedlichen funktionellen Partnern etc.
  • In einer besonders bevorzugten Anwendungsform der vorliegenden Erfindung sind die für einen deregulierten Zustand charakteristischen genetischen Ereignisse durch Modifikation der Expression eines oder mehrerer die Apoptose intiierenden oder ausführenden Gene, besonders eines oder mehrerer Tumor-Suppressorgene (oder einer funktionellen Variante derartiger Gene), induziert.
  • Es kann sich insbesondere um jede Zelle handeln, in der eine Überexpression eines Antionkogens induziert worden ist. Insbesondere kann es sich um eine Zelle handeln, in die ein genetisches Konstrukt eingeführt worden ist, das die Induktion oder die Zunahme der Menge an Antionkogen in dieser Zelle erlaubt. Besondere Beispiele für antionkogene Gene (ebenfalls als Tumor-Suppressorgene bezeichnet) sind besonders p53 (Eliyahu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 8763–7; Finlay et al., Cell (1989) 57: 1083–93), Rb (Lee et al., Science (1987) 235: 1394–9), p73 (Kaghad et al., Cell (1997) 90: 809–19), TUPRO-2 (US5.849.899), NHTS (US5.892.016), p15 (Hannon et al., Nature 371 (1994) 257), p16 (Ivision et al., Nature Genet. 371 (1994) 180), etc., beschränken sich aber nicht nur auf diese Beispiele.
  • Ein typisches Beispiel gemäß der Erfindung ist der mittels Induktion oder Erhöhung der Aktivität, bevorzugt der Expression von p53, generierte deregulierte Zustand. Den Schalter zwischen Leben und Tod der Zelle betätigt p53, ein Tumor-Suppressorgen (oder antionkogenes Gen), das das Zellwachstum durch Auslösen eines Stops am Ende der G1-Phase negativ reguliert. Dieser Stop im Zellzyklus ist durch eine Repression der Expression der Gene, die in der Progression der G1-Phase zur S-Phase beteiligt sind, und durch die Induktion von spezifischen Genen gekennzeichnet. Die Aufhebung dieser Funktionen von p53 ist einer der wirksam werdenden Mechanismen bei der Entstehung zahlreicher Tumore, wo die Deletion oder Mutationen im Gen p53 beobachtet sind. Eine Überexpression von p53 kann die Apoptose in verschiedenen Zelltypen induzieren. Diese durch Virus-Infektion induzierte Überexpression, die die Expression der Wildform von p53 erlaubt, ist die Behandlungsgrundlage von Krebserkrankungen mittels Gentherapie. Die Induktion der Expression von p53 kann ebenfalls in der Physiologie beobachtet werden und ist besonders während der Zurückbildung der Milchdrüse am Ende der Laktation beschrieben worden. Eine Induktion der Apoptose durch Serumabnahme, ein Zustand, der auf eine Vielzahl an Stoffwechselwegen einwirkt, ist ebenfalls unter Beteiligung einer Stabilisierung von p53 beschrieben worden Die Induktion von p53 löst in den Zellen ein zum Zelltod führendes Programm aus, wenn die Reparatursysteme der Zelle mit DNA-Brüchen überschwemmt werden. Diese Induktion der Apoptose nimmt besonders das Fas-System und die Caspasen in Anspruch, deren Messenger so gespleißt sein müssen, dass sie als funktionsfähige Isoformen für den Zelltod exprimiert werden.
  • Außerdem ist von p53 bekannt, dass es die Expression von Genen reguliert, die an anderen verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind, wie Regulation des Zellcyclus, Angiogenese, Antwort auf oxidativen Stress, Störung von DNA oder Zellwachstum. p53 spielt zudem eine wichtige Rolle bei der Zellantwort bei DNA-Störung, bei Hypoxie, beim zellulären Redoxpotenzial oder zellulärer Adhäsion. Zudem ist gezeigt worden, dass p53 vom Zellkern bis zu den Mitochondrien wandern konnte, wo es in der Lage ist, mit dem hsp70 Protein zu Wechselwirken, wobei dieses mitochondriale Ziel den Zelltod auslösen kann. Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Signaturen nach Induktion von p53 erlauben folglich die Untersuchung der Gesamtheit dieser Signalwege und die Bereitstellung einer vollständigen und prädiktiven Antwort auf das toxische Potenzial von Verbindungen.
  • Die Erfindung beschreibt ganz besonders die Verwendung von genetischen Markern, die durch Aktivierung bevorzugt der Expression von p53 (insbesondere der Wildform von p53) induziert sind, zur Charakterisierung des toxischen Profils von Testverbindungen. Die Erfindung betrifft bevorzugter die Verwendung von Nucleinsäure-Klonen, die genetischen Ereignissen (zum Beispiel transkriptionelle Ereignisse und/oder Spleißereignisse) entsprechen, die durch Aktivierung, bevorzugt der Expression von p53 (insbesondere Wildform p53), induziert sind, als genetische Marker der Toxizität.
  • Die Erfindung beschreibt ganz besonders die Gewinnung und Verwendung von cDNA-Klonen, die qualitativen und/oder unterschiedlichen quantitativen genetischen Ereignissen von Kontrollzellen (zum Beispiel proliferierende Zellen) und von Zellen entsprechen, die sich in einem Apoptoseprozess durch Induktion der Wildform von p53 befinden.
  • Es ist zu verstehen, dass es noch andere Möglichkeiten gibt, Zellen einem Stress auszusetzen, der sie für den programmierten Zelltod empfindlich macht oder zelluläre Signalwege stört. Die Erfindung betrifft folglich ebenfalls die Verwendung anderer zellulärer Modelle, wie beispielsweise solche, die auf der induzierbaren (oder konstitutiven) Expression der gesamten oder eines Teils von Antionkogen-Genen, Promotoren, von Apoptose initiierenden oder ausführenden Genen beruhen. Von diesen Genen können vorteilhafterweise RB, das Produkt des Retinoblastom-Gens, p73, ein homologes Protein zu p53, myc oder jedes andere Protein oder Proteinfragment, das in der Lage ist, mit dem Zellwachstum oder der Zellproliferation zu interterieren, ausgewählt sein. Wie oben angegeben, kann es sich ebenfalls zum Beispiel um eine Tumorzelle oder um eine degenerierte Nervenzelle handeln.
  • Andere Ausgangsmaterialien sind zum Beispiel Proben, die Zellen enthalten, in denen die Proliferation durch onkogene Aktivierungskaskaden (wie beispielsweise der ras-Signalweg), Inaktivierung von Tumor-Suppressorgenen, Inhibition von Apoptosekaskaden, Inhibition oder Aktivierung von Kinasen vermittelten Wegen (zum Beispiel die p13-Kinase, die das Akt-Protein stimuliert), Inhibition der Genexpression mit Hilfe von RNA oder Antisense-Oligonucleotiden, etc. dereguliert ist. Ein besonderes Beispiel für Zellen sind Tumorzellen, die aus Tumorbiopsien erhalten sind (in diesem Fall sind es gemäß der Erfindung die genetischen Marker, die für die Tumorzelle im Vergleich zu einer mittels Biopsie entnommener Kontrollgewebeprobe, besonders von gesundem Gewebe, charakteristisch sind).
  • Außerdem kann der deregulierte Zustand ebenfalls durch eine oder mehrere ausgewählte toxische Verbindungen induziert sein, die auf die Zelllebensfähigkeit über Prozesse wirken, die beispielsweise die Integrität des Genoms (Genotoxizität), das Redoxpotenzial der Zelle, die von bestimmten Oberflächenrezeptoren initiierte Antwort, die Konformation der Proteine oder den energetischen Status der Zelle beeinflussen. Derartige Verbindungen können insbesondere in Kombination mit den zuvor beschriebenen Ansätzen zur Induktion, die auf den Modifikationen der Genexpression beruhen, verwendet sein.
  • Die zur Induktion eines deregulierten Zustands verwendete Zellpopulation kann unterschiedlichen Ursprungs und Natur sein, beispielsweise können es Epithel-, Leber-, Lungen-, Nerven-, Muskel-, Fibroblastenzellen, etc. sein. Es handelt sich in bevorzugter Weise um menschliche Zellen. Es kann sich um Primärkulturen oder um etablierte Zelllinien handeln, in denen die Deregulation unter oben beschriebenen Bedingungen induziert ist. Es kann sich ebenfalls um Tumorproben, die Zellen im deregulierten Zustand enthalten, oder zum Beispiel aus Serum entnommene Zellen handeln. Wie es später angegeben ist, können genetische Marker der Deregulation, die als Marker der Toxizität gemäß der Erfindung verwendbar sind, aus unterschiedlichen Zelltypen hergestellt sein.
  • Der verwendete Kontrollzustand ist im Allgemeinen eine Population an Zellen des selben Typs, wie die für den deregulierten Zustand verwendeten Zellen, selbst wenn unterschiedliche Zelltypen verwendet sein können. Der Kontrollzustand kann ein normaler ruhender, proliferativer oder sogar ein deregulierter Zustand sein, aber ein etwas weniger vorangeschrittenes Ausmaß oder Stadium als der deregulierte Referenzzustand.
  • Typischerweise ist der deregulierte Zustand ein Zustand der Induktion der Aktivierung, bevorzugt die Expression eines Tumor-Suppressorgens, wie p53 oder Rb, und der Kontrollzustand ist ein Zustand ohne Induktion dieser Aktivierung, bevorzugt Expression, oder Induktion auf sehr niederem Niveau. In einem anderen Beispiel ist der deregulierte Zustand eine Population an Krebszellen und der Kontrollzustand eine Population gleicher Zellen in gesundem Zustand. Spezifische Beispiele für Zellen sind im Versuchsteil gegeben.
  • 3.2 Herstellung der Marker und Banken
  • Wie oben angegeben, umfasst das Verfahren zur Herstellung von genetischen Markern der Toxizität gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise einen Hybridisierungsschritt von einer Nucleinsäure-Probe, die von einer Zelle im deregulierten Zustand stammt, und einer Nucleinsäure-Probe, die von einer Zelle im Kontrollzustand stammt. Dieser Hybridisierungsschritt erlaubt die Generierung von Nucleinsäure-Klonen, die für die Zelle im deregulierten Zustand verglichen mit dem Kontrollzustand charakteristisch sind.
  • Die Nucleinsäure-Populationen sind zum Beispiel Gesamt-RNA oder Messenger-RNA von Zellen im deregulierten Zustand und Kontrollzustand oder von dieser Gesamt-RNA oder Messenger-RNA abstammende Nucleinsäuren (mittels inverser Transkription, Amplifikation, Klonierung in Vektoren, etc.). Diese Nucleinsäuren können gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt sein. Zusammengefasst umfassen diese Verfahren im Allgemeinen eine Lyse von Zellen, Gewebe oder Probe und Isolierung von RNAs mittels Extraktionsverfahren. Es kann sich insbesondere um eine Behandlung mit chaotropen Mitteln wie beispielsweise Guanidinthiocyanat (das die Zellen zerstört und die RNA schützt) und anschließende RNA-Extraktion mit Lösemitteln (zum Beispiel Phenol, Chloroform) handeln. Derartige Verfahren sind dem Fachmann wohl bekannt (siehe Maniatis et al., Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162 (1987) 156), und können ohne weiteres mittels Verwendung von im Handel erhältlichen Kits angewandt sein wie zum Beispiel das Kit US73750 (Amersham) für die Gesamt-RNA. Es ist nicht erforderlich, dass die eingesetzten RNAs ganz rein sind und insbesondere stört es nicht, wenn Spuren genomischer DNA oder anderer Zellbestandteile (Proteine, etc.) in den Präparaten verbleiben, da sie die Stabilität der RNAs nicht signifikant beeinflussen. Außerdem ist es wahlweise möglich, nicht Gesamt-RNA Präparate sondern Messenger-RNA Präparate zu verwenden. Diese können entweder direkt aus einer biologischen Probe oder aus Gesamt-RNA mit Hilfe von polyT-Sequenzen gemäß herkömmlichen Verfahren isoliert sein. Die Gewinnung von Messenger-RNA kann in dieser Hinsicht mit Hilfe kommerzieller Kits durchgeführt sein, wie beispielsweise mit Kit US72700 (Amersham). Die RNAs können ebenfalls direkt aus Banken oder anderen Proben gewonnen sein, die bereits hergestellt und/oder in Sammlungen zugänglich und unter geeigneten Bedingungen aufbewahrt sind.
  • Die Hybridisierung kann unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt sein, die vom Fachmann angepasst sein können. Vorzugsweise setzt man für die Hybridisierung die Population an Nucleinsäuren, die von dem deregulierten Zustand stammen, in einem Überschuss im Vergleich zur Population an Nucleinsäuren ein, die von dem Kontrollzustand stammen.
  • Es können zwei prinzipielle Versuchsansätze durchgeführt sein, um aus dem Produkt der Hybridisierungsreaktion die Klone zu isolieren, die für die Deregulation gemäß der Erfindung charakteristisch sind. Der erste lediglich quantitative Ansatz erlaubt die Generierung eines Nucleinsäure-Präparates, das die gesamten Klone (oder einen signifikanten Teil davon) zusammenfasst, die aus einer Differenz des Expressionsniveau zwischen den beiden Zuständen resultieren. Derartige Klone (und Banken) sind gemäß den bekannten Subtraktionshybridisierungstechniken erhalten, die im Wesentlichen aus der Elimination der während des Hybridisierungsschrittes gebildeten Klone bestehen, um nur die nicht hybridisierten Klone zu erhalten, die für den deregulierten Zustand im Vergleich zum gewählten Kontrollzustand charakteristisch sind.
  • In einer bevorzugten Anwendungsform wendet man indessen ein qualitatives Verfahren an, das die Generierung eines Nucleinsäure-Präparates erlaubt, das die gesamten Klone (oder einen wichtigen Teil davon) zusammenfasst, die aus funktionellen genetischen Störungen resultieren, die für den deregulierten Zustand verglichen mit dem gewählten Kontrollzustand charakteristisch sind. Insbesondere umfasst eine derartige qualitative Bank nicht die gesamten Klone, deren Expression modifiziert ist, sondern zum Beispiel die Klone, die differenziellen Spleißungen oder Deletionen von den beiden Zuständen entsprechen. Wenn man die Rolle von alternativen Spleißungen in den Regulations- und Transformationswegen der Zelle berücksichtigt, enthalten derartige Präparate (und Banken) vorteilhafterweise Klone mit einem beträchtlichen funktionellen Wert, und sind folglich in der Lage, die an dem deregulierten Zustand beteiligten genetischen Modifikationen wiederzugeben.
  • Derartige Klone erlauben folglich die Bildung prädiktiverer Banken und die Generierung repräsentativerer genetischer Marker.
  • Die Bildung derartiger qualitativer Banken kann mittels Isolierung von Nucleinsäure-Regionen, die differenziellen Spleißungen oder Deletionen entsprechen, aus den beim Hybridisierungsschritt gebildeten Hybriden durchgeführt sein. Gemäß den angewandten Verfahren entsprechen diese Regionen entweder nicht gepaarten Regionen oder gepaarten Regionen.
  • Diese beiden Versuchsansätze sind nachfolgend detaillierter beschrieben.
  • 3.2.1. Herstellung und Verwendung von quantitativen differenziellen Banken
  • In einer ersten Anwendungsform verwendet man folglich in der vorliegenden Erfindung eine quantitative differenzielle Bank, nämlich eine Bank, umfassend Nucleinsäure-Klone, die Genen entsprechen, deren Expressionsniveau in Zellen im deregulierten Zustand verglichen mit einem Kontrollzustand modifiziert ist. Derartige Banken können zum Beispiel aus quantitativen differenziellen Analysen hervorgegangen sein und die Sequenzen zusammenfassen, deren Expression während zellulärer Deregulationsphänomene erhöht oder vermindert ist. Die Methodologien zur Etablierung dieses Banken-Typs sind dem Fachmann bekannt und können in den folgenden Kategorien zusammengefasst sein:
  • Elektronische Subtraktion der Hochdurchsatz-Sequenzierunq
  • Dieses Verfahren beruht auf der zufälligen Sequenzierung einer bestimmten Anzahl an cDNAs. Eine Suchmaschine zur Informationsrecherche kann danach verwendet sein, um eine Subtraktion der beiden analysierten Zustände vorzunehmen.
  • Serielle Analyse der Genexpression (SAGE)
  • Dieses Verfahren beruht auf der Wiedererkennung einer mit jeder cDNA assoziierten Signatur unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Oligonucleotid-Adaptern. Dieses Etikett entspricht einem Teil der cDNA-Sequenz (10 Nucleotide lang, um auf diese eindeutige Weise die entsprechende cDNA zu identifizieren). Diese Etiketten werden dann miteinander zusammengefügt, um sequenziert und dann analysiert zu werden (Velculescu und Mitarbeiter, Science, 1995, 270: 484–487). Dieser Ansatz stellt folglich eine Verkürzung gegenüber der systematischen Sequenzierung dar.
  • Nucleinsäure-Arrays
  • Diese Methode beruht auf der Anlagerung von Nucleinsäuren (Oligonucleotide, PCR-Fragmente, cDNAs) auf festen Trägern (Membranen, Glasträger, Gen-Chips) in mehr oder weniger hoher Dichte. Sonden, die von der Messenger-RNA von gesunden oder pathologischen Proben stammen, werden anschließend zur Hybridisierung verwendet, um die Messenger-RNAs zu identifizieren, die überexprimiert oder stark überexprimiert oder stark reprimiert sind.
  • Differenzielles Display
  • Diese Technik nutzt einen Oligo-dT Primer und Zufallsprimer zur Durchführung von PCR-Reaktionen mit cDNA-Populationen. Die PCR-Produkte werden dann mit Hilfe hoch auflösender Gele verglichen. Die exprimierten Fragmente des differenziellen Typs werden anschließend isoliert und ihr Vorhandensein ist mit Nothern-Blots vor der Sequenzierung bestätigt.
  • Mehrere Variationen dieser Technologie sind entwickelt worden (Prashar und Weissman, PNAS, 1996, 93: 656–663). Aufgrund der Primer und der Auswahl der Restriktionsenzyme und der eingesetzten Adapter differieren die Variationen. Wie bei der SAGE-Technik richten sie sich an das äußere Ende der 3'-cDNAs. Mehrere Kits sind ebenfalls im Handel erhältlich, um diesen Ansatz zu ermöglichen.
  • Subtraktionsklonierung
  • Diese Technik beruht auf der Eliminierung von cDNAs, die in beiden zu vergleichenden Proben vorhanden sind. So werden verschiedene Subtraktionskits, in denen die cDNA ,Tester' mit einem Überschuss an cDNA ,Driver' hybridisiert ist, angeboten (Clontech). Das Endprodukt wird aus einem Pool von Fragmenten gebildet, die mittels PCR amplifiziert sind, und stammt von cDNAs ab, die differenziell exprimiert werden, und das in einen geeigneten Vektor zur weiteren Analyse kloniert werden kann. Die RDA-Technik (Representational Difference Analysis) beruht ebenfalls auf diesem Subtraktionsprinzip (Lisitsyn und Mitarbeiter, Science, 1993, 259: 946–951).
  • Die Anwendung dieser differenziellen Analysetechniken erlaubt folglich die Generierung von Klonen und quantitativen Banken, nämlich Zusammenfassungen der gesamten Sequenzen, deren Expression bei (einem) zellulären Deregulationsphänomen(en) erhöht oder vermindert ist.
  • 3.2.2. Herstellung und Verwendung von differenziellen qualitativen Banken
  • In einer anderen Anwendungsform verwendet man in der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise eine qualitative differenzielle Bank, nämlich eine Bank, umfassend Nucleinsäure-Klone, von denen wenigstens ein Sequenz-Teil der Sequenz der differenziell gespleißten Gene in Zellen in dereguliertem Zustand entspricht. Dieser Banken-Typ fasst folglich die während des Deregulationsprozesses in differenzieller Weise gespleißten Sequenzen zusammen.
  • Die Verwendung dieses Banken-Typs ist besonders vorteilhaft. Denn die verschiedenen zellulären Stressarten, die zum Zelltod oder anderen Deregulationen führen, verwenden initiierende und ausführende Elemente von Signalwegen und regulieren die Schlüsselelemuente des Zellcyclus, darunter p53. Die Regulation des Expressionsniveau dieses Proteins erfolgt prinzipiell durch seine Stabilisierung und Zunahme der Transkription. Wenn der Fas-Rezeptor, die Mitglieder der bcl2-Familie und die Caspasen auf Transkriptionsebene reguliert sind, sind sie mehr auf Reifungsebene, Spleißebene und auf Ebene ihrer Prämessenger-RNA kontrolliert. Diese posttranskriptionelle Regulationsebene ist kritisch, da sie aus demselben Transkriptionsereignis die Entstehung einer pro- oder anti-Apoptose-Form von jedem Mitglied der in Betracht kommenden Proteinfamilien bestimmt. Diese Modifikationen der Transkription und der Spleißung sind vom Stoffwechsel und der Signalgebung der Zelle reguliert. Die Regulationsfaktoren der Transkription und der Spleißung, die in "traps" diese Schlüsselschritte der Genexpression regulieren, sind Proteine, deren Aktivität durch insbesondere Phosphorylierung entsprechend des Proliferationszustandes, der Differenzierung oder der Lebensfähigkeit der Zelle reguliert ist. Das Spleißprogramm, das während der Zellderegulationen abläuft und das die verschiedenen initiierenden und ausführenden Elemente des Zelltods mobilisiert, übersetzt folglich die Modifikationen der zellulären Signale aufgrund unterschiedlicher Stressarten. Durch Beeinflussung dieser Transkriptions- und Spleißmechanismen wirken diese Modifikationen auf die Expression zahlreicher Gene, die aber nicht auf Gene beschränkt sind, von denen eine initiierende oder ausführende Rolle bei der Deregulation beschrieben ist, sondern greifen auf verschiedenen Ebenen der Signalkaskaden ein. Ebenso mobilisieren die während der Onkogenese gestörten Kaskaden, insbesondere durch Expression von Spleißvarianten, Marker, deren Expression nicht auf Tumore beschränkt ist.
  • Um diese Phänomene und diese Komplexität zu berücksichtigen und auch eine prädiktivere Antwort auf das toxische Potenzial einer Testverbindung zu liefern, verwendet das Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise als genetische Marker der Toxizität charakteristische Spleißereignisse für deregulierte Zustände.
  • Um dies zu bewerkstelligen, verwendet die vorliegende Erfindung zum Beispiel differenzielle qualitative Nucleinsäure-Banken, die gemäß der «DATAS» Methodologie, die in der internationalen Patentanmeldung, Nr. WO 99/46403 , beschrieben ist, hergestellt sind. Insbesondere können derartige Banken hergestellt sein durch Hybridisierung von einer Population Nucleinsäuren, die von Zellen im deregulierten Zustand stammen, und der Population Nucleinsäuren, die von Zellen im Kontrollzustand stammen, und Isolieren, aus den gebildeten Hybriden, der Nucleinsäuren, die differenziellen Spleißungen entsprechen.
  • In diesem Versuchsansatz erfolgt die Hybridisierung bevorzugt in flüssiger Phase. Außerdem kann die Hybridisierung in jeder geeigneten Vorrichtung durchgeführt sein, wie beispielsweise Röhrchen (zum Beispiel Eppendorf), Platten oder jeden anderen geeigneten Träger, der üblicherweise in der Molekularbiologie Verwendung findet. Die Hybridisierung erfolgt vorteilhafterweise in Volumina zwischen 10 und 1000 μl zum Beispiel zwischen 10 und 500 μl. Es ist zu verstehen, dass die verwendete Vorrichtung und die verwendeten Volumina ohne weiteres vom Fachmann angepasst sein können. Die für die Hybridisierung eingesetzten Mengen an Nucleinsäuren sind ebenfalls dem Fachmann bekannt. Im Allgemeinen sind Mikrogramm-Mengen für Nucleinsäuren hinreichend, zum Beispiel in einer Größenordnung von 0,1 bis 100 μg. Zudem ist es möglich, die Nucleinsäuren in einem Verhältnis von Driver/Tester, variierend von 50 bis ungefähr 0,02, vorzugsweise von 40 bis 0,1, einzusetzen. Noch vorteilhafter ist es, ein Verhältnis von nahe oder größer 1, vorteilhafterweise zwischen etwa 1 und etwa 10, zu bevorzugen. Es ist sehr wohl zu verstehen, dass das Verhältnis vom Fachmann entsprechend den Verfahrensbedingungen (zur Verfügung stehende Mengen an Nucleinsäuren, physiologische Situationen, verfolgte Absicht, etc.) angepasst sein kann. Die anderen Parameter der Hybridisierung (Zeit, Temperatur, Ionenstärke) können ebenfalls vom Fachmann angepasst sein. Im großen und ganzen erfolgt die Hybridisierung nach Denaturierung von "Tester" und "Driver" (zum Beispiel durch Hitze) innerhalb von etwa 2 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37°C (eventuell Temperaturerhöhungen unterworfen) und unter Standardbedingungen der Ionenstärke (kann beispielsweise zwischen 0,1 bis 5 M NaCl variieren). Es ist bekannt, dass die Ionenstärke einer der entscheidenden Faktoren für die Stringenz einer Hybridisierung ist, besonders im Falle einer Hybridisierung auf einem festen Träger.
  • Gemäß einer bestimmten Anwendungsform der Erfindung ist die Hybridisierung in einer Phenol-Emulsion durchgeführt, zum Beispiel gemäß der PERT-Technik ("Phenol Emulsion DNA Reassociation Technique), die von Kohne D.E. et al. (Biochemistry, Vol. 16, Nr. 24, Seiten 5329–5341) beschrieben ist. Vorteilhafterweise ist die Hybridisierung in Phenol-Emulsion mit Hilfe von Thermocyclen (Temperaturerhöhungen von etwa 37°C auf etwa 60/65°C) und nicht durch Rühren gemäß der von Miller und Riblet beschriebenen Technik (NAR 23 (19A5) 2339) durchgeführt.
  • Jede andere Hybridisierungstechnik in Flüssigphase, vorzugsweise in Emulsion, kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt sein. Überdies kann die Hybridisierung ebenfalls mit einem auf einem Träger immobilisierten Partner erfolgen. Vorteilhafterweise ist der Driver immobilisiert. Dies kann besonders mit biotinylierten Primern oder mit jedem anderen dem Fachmann bekannten Immobilisierungsverfahren erfolgen.
  • Aus den durch Hybridisierung erzeugten Populationen an Nucleinsäuren können die genetischen Marker der Erfindung (die Klone, die für qualitative genomische Störungen charakteristisch sind) mit jeder dem Fachmann bekannten Techniken identifiziert werden. Im Falle von Heteroduplex RNA/DNA, zeigen sich diese Bereiche im Wesentlichen in Form von nicht gepaarten RNA-Bereichen (RNA-Schlaufen) und können durch Trennung von Heteroduplex und von einzelsträngigen Nucleinsäuren (überschüssige Nucleinsäure, die nicht reagiert hat), selektiven Verdau von doppelsträngiger RNA (Domänen, die am Heteroduplex beteiligt sind), dann Trennung von resultierender einzelsträngiger RNA und von einzelsträngiger DNA identifiziert und kloniert werden. Im Fall von Heterotriplex zeigen sich diese differenziellen Spleißbereiche im Wesentlichen in Form von doppelsträngigen DNA-Bereichen und können durch Behandlung in Gegenwart geeigneter Enzyme, wie beispielsweise ein Enzym, das den Verdau der RNA erlaubt, und dann ein Enzym, das den Verdau der einzelsträngigen DNA erlaubt, identifiziert und kloniert werden. Die so erhaltenen Nucleinsäuren werden direkt in Form von doppelsträngiger DNA erhalten und können in jeden geeigneten Vektor kloniert werden.
  • Es ist zu verstehen, dass weitere Variationen und genaue Bedingungen für die Isolierung von Nucleinsäuren, die Hybridisierungen und Gewinnung qualitativer Klone in der Anmeldung, Nr WO 99/46403 , angegeben sind.
  • Diese Methodologien erlauben die Generierung von Nucleinsäure-Klonen und Banken, die den qualitativen genetischen Markern von (einem) deregulierten Zustand/Zuständen entsprechen. Wie im Beispielteil angegeben ist, stellen diese Nucleinsäure-Präparate besonders zweckdienliche Marker zur Charakterisierung des toxischen Profils von Verbindungen dar.
  • 4. Diversität der Banken
  • Die zuvor beschriebenen Methodologien erlauben folglich die Generierung von Gruppen von Nucleinsäure-Klonen, die für deregulierte Zustände charakteristisch sind. Jede Präparationstechnik generiert zahlreiche Klone, die Banken bilden. Diese Banken können verwendet sein, beispielsweise auf Trägern angebracht oder durch Zufügen oder Wegnehmen von Klonen, Gruppierung von verschiedenen Banken, Zufügen von Kontroll-Klonen, etc. modifiziert sein.
  • Die Banken der Erfindung können zum Beispiel 10 bis 50 000 Klone, meistens 10 bis 10 000 Klone, noch bevorzugter 50 bis 5000 Klone umfassen. Die Klone sind im Allgemeinen in geordneter Weise auf einem oder mehreren Trägern angebracht, um so die Analyse der Hybridisierungsergebnisse zu erleichtern. Der Träger kann aus Glas, Nylon, Kunststoff, Fasern etc., im Grunde jeder feste Träger sein, der für die Präsentation von Nucleinsäuren geeignet ist. Die Anlagerung der Banken auf den Trägern kann mit herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Techniken durchgeführt sein und sind zum Beispiel in der Internationalen Patentanmeldung WO 99/46403 beschrieben.
  • Die verwendeten Banken können gleichzeitig Nucleinsäure-Klone, die Genen entsprechen, deren Expressionsniveau in Zellen in einem deregulierten Zustand modifiziert ist (quantitative genetische Marker), und Nucleinsäure-Klone umfassen, von denen wenigstens ein Sequenz-Teil der Sequenz von differenziell gespleißten Genen in Zellen in dereguliertem Zustand entspricht (qualitative genetische Marker). So können die genetischen Marker nach verschiedenen Ansätzen generiert und dann gemischt werden, um eine möglichst prädiktive Antwort zu erhalten.
  • In dieser Hinsicht ist ebenfalls die Verwendung von Banken möglich, die aus verschiedenen deregulierten Zuständen generierte Klone umfassen. So wie es oben angegeben ist, können die deregulierten Zustände auf verschiedene Arten induziert sein (Erhöhung der Expression des p53-Gens, Erhöhung der Expression des Rb-Gens, Verwendung unterschiedlicher Zellpopulationen, Verwendung einer Tumorzelle, etc.). Diese unterschiedlichen deregulierten Zustände induzieren nicht immer genau dieselben genetischen Ereignisse, und folglich nicht immer genau die selben Nucleinsäure-Banken gemäß der Erfindung. Selbst wenn jede dieser Banken einzeln im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet sein kann. Ist es ebenfalls möglich, sie miteinander auf demselben Träger (oder auf getrennten Trägern) zu kombinieren, um noch die Anzahl genetischer Marker der Toxizität zu erhöhen und so die Vorhersageleistung der Verfahren der Erfindung zu verbessern.
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht folglich ebenfalls in einem Nucleinsäure-Präparat, das qualitative und quantitative genetische Marker umfasst, die für (eine) zelluläre Deregulation(en) charakteristisch sind. Ein besonderer Gegenstand der Erfindung besteht in einer Bank, die für unterschiedliche deregulierte Zustände charakteristische genetische Marker umfasst. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist jeder feste Träger, auf dem wenigstens zwei Nucleinsäure-Banken angebracht worden sind, die für zwei deregulierte Zustände charakteristisch sind. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung noch ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips, der für die Diagnose des toxischen Potenzials einer Testverbindung zweckdienlich ist, umfassend die Anlagerung auf einem festen Träger eines oder mehrerer Nucleinsäure-Präparate, die für (einen) deregulierte(n) Zustand/Zustände charakteristisch sind.
  • Zudem verwendet man gemäß einer bevorzugten Anwendungsform Nucleinsäure-Banken, die durch Selektion der Klone je nach Verwendung entsprechend ihrer tatsächlichen Implikation an toxischen Phänomenen aufgereinigt sind. Die Ausgangsbanken können nämlich zum Beispiel die gesamten Klone umfassen, die für genetische Ereignisse einer deregulierten Situation charakteristisch sind. Dann erlaubt die Anwendung des Diagnoseverfahrens der Erfindung die Feststellung, dass bestimmte Klone niemals oder nur sehr selten mit den getesteten Nucleinsäure-Proben hybridisieren. Derartige Klone können eventuell aus der Bank eliminiert werden, was Generierung spezifischerer und folglich umfassenderer und prädiktiverer Banken erlaubt.
  • Ein anderer vorteilhafter Gegenstand der Erfindung besteht ebenfalls in einer Nucleinsäure-Bank, die Nucleinsäure-Klone umfasst, die einem deregulierten Zustand und einem toxischen Zustand gemeinsamen genetischen Ereignissen entsprechen.
  • Ein anderer Gegenstand besteht in einem Verfahren zur Herstellung von Banken von genetischen Markern der Toxizität, umfassend die Hybridisierung von einer Population an Nucleinsäuren, die von Zellen im deregulierten Zustand stammen, und einer Population an Nucleinsäuren, die von Zellen im Kontrollzustand stammen, die Isolierung aus dem Produkt der Hybridisierungsreaktion von Klonen, die für den deregulierten Zustand charakteristisch sind, und die Hybridisierung der erhaltenen Klone mit einer Probe an Nucleinsäuren, die von Zellen in toxischem Zustand stammen. Vorteilhafterweise umfasst das obige Verfahren außerdem einen Selektionsschritt, umfassend die Hybridisierung der Bank mit unterschiedlichen Proben an Nucleinsäuren, die von Zellen in einem von verschiedenen Verbindungen induzierten toxischen Zustand stammen, und die Identifizierung der Klone von der Bank, die am häufigsten mit besagten Proben hybridisieren.
  • Auf ganz spezifische Weise beschreibt nun die vorliegende Erfindung die Identifizierung und die Charakterisierung derartiger Klone, die als genetische Marker der Toxizität verwendbar sind.
  • In dieser Hinsicht beschreibt die Erfindung besonders die Identifizierung, die Herstellung, die Klonierung und die Charakterisierung bestimmter Klone, deren Sequenzen von den identifizierenden SEQ ID NR: 1 bis 37 dargestellt sind. Diese Klone sind als genetische Marker der Toxizität im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendbar. Diese Klone sind mit qualitativen Verfahren isoliert worden und umfassen Sequenzen, die qualitativen genetischen Störungen entsprechen, die für verschiedene zelluläre Gene beeinflussende Deregulationsereignisse charakteristisch sind, wie beispielsweise Gene, die für Proteine, Enzyme codieren, mitochondriale Gene, Transkriptionsfaktoren, pathologische Gene, auf Stress antwortende Gene, an der Signaltransduktion beteiligte Gene, etc. Derartige Klone, die sie enthaltenden Präparate und Banken, wie auch ihre Verwendungen sind besondere Gegenstände der Erfindung.
  • Vor allem ist ein besonderer Gegenstand der Erfindung ein Präparat oder eine Bank an Nucleinsäuren, die eine Vielzahl an Nucleinsäure-Klonen als genetische Marker der Toxizität umfassen, wobei besagtes Präparat oder besagte Bank wenigstens einen Klon mit der aus SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz umfasst.
  • Ein besonderer Gegenstand der Erfindung besteht ganz allgemein in jeder Nucleinsäure-Bank, die wenigstens einen Klon mit der aus SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz umfasst.
  • Ein Klon mit der Sequenz SEQ ID NR: X bezeichnet im Sinne der Erfindung (i) jeden Klon, der besagte Sequenz SEQ ID NR: X (oder eine zu dieser komplementäre Sequenz) vollständig umfasst, und gegebenenfalls zusätzliche Sequenzen an den Enden angefügt sind, wobei vorzugsweise ein Klon aus besagter vollständiger Sequenz SEQ ID NR: X (oder aus einer zu dieser komplementären Sequenz) besteht; sowie auch (ii) jeden Klon, der nur einen Teil der Sequenz SEQ ID NR: X (oder eine zu dieser komplementäre Sequenz) umfasst, eventuell an einem Ende zusätzliche Sequenzen) angefügt (besonders von der entsprechenden Gen- Sequenz oder Messenger-Sequenz stammend), wobei der Teil der Sequenz hinreichend ist, um eine spezifische Hybridisierung (zum Beispiel wenigstens 10 Basen) zu erlauben; oder noch (iii) jede andere Nucleinsequenz, die für das Gen oder ein genetisches Ereignis der Deregulation des Gens spezifisch ist, das mit der SEQ ID NR: X nachgewiesen ist, ohne notwendigerweise mit der Sequenz SEQ 1D NR: X zu überlappen. Die Sequenzen (iii) sind zum Beispiel Sequenzen von einer anderen Region des betreffenden Gens, was seinen Nachweis unter ähnlichen Bedingungen erlaubt. Die Klone (i) bis (iii) gemäß der Erfindung umfassen typischerweise zwischen 10 und 1000 Basen, meistens zwischen 20 und 500 Basen, von denen wenigstens ein Teil für das betrachtete genetische Ereignis spezifisch ist.
  • Die Präparate oder Banken der Erfindung umfassen bevorzugter wenigstens 5, vorzugsweise wenigstens 10, bevorzugter wenigstens 15, noch bevorzugter wenigstens 20 Klone mit der aus SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz. Wie oben angegeben, handelt es sich typischerweise um Banken, die zwischen 10 und 50 000 Klone, meistens zwischen 10 und 5000 Klone, insbesondere zwischen 50 und 1000 Klone umfassen, von denen wenigstens ein Teil von einem oder mehreren Klonen mit der aus SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz repräsentiert ist.
  • Die Banken und Präparate gemäß der Erfindung können auf Trägern angebracht und verwendet sein, wie es nachfolgend beschrieben ist.
  • Eine der Hauptanwendungen der Identifizierung und Klonierung dieser genetischer Marker betrifft die Bewertung des toxischen Potenzials einer Testverbindung. Diese Bewertung kann durch Hybridisieren einer Sonde erfolgen, die Messenger-RNA einer mit diesem Produkt behandelten Zellkultur repräsentiert, mit einer oder mehreren Banken von Signaturen, die für deregulierte Zustände charakteristisch sind, wie es oben beschrieben ist. Eine andere Anwendung besteht in der Identifizierung von genomischen Störungen (besonders von SNPs), die mit einer Antwort eines Probanden auf eine bestimmte Verbindung korreliert sind, zum Beispiel die Antwort auf eine Behandlung, die Empfindlichkeit auf eine Verbindung etc. Diese Anwendungen sind im nachfolgenden detaillierter beschrieben.
  • 5. Verfahren zur Analyse und Diagnose der Toxizität
  • Ein Gegenstand der Erfindung ist folglich ebenfalls ein Verfahren zur Analyse des toxischen Potenzials von Testverbindungen, das die oben beschriebenen genetischen Marker verwendet. Insbesondere erlaubt die Erfindung die Bestimmung des toxischen Potenzials jeder Verbindung durch Hybridisierung einer Nucleinsäure-Probe von Zellen, die mit dieser Verbindung behandelt sind, mit den oben definierten genetischen Markern, wobei das beobachtete Hybridisierungsmuster das toxische Potenzial der Verbindung anzeigt. Zu diesem Zweck sind die verwendeten genetischen Marker vorzugsweise in Form von Banken zusammengefasst, um eine auch möglichst prädiktive Antwort zu liefern. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht ebenfalls in der beträchtlichen Anzahl an verwendeten Markern, was die generierte Information viel prädiktiver macht. Der prädiktive Charakter der Information ist außerdem durch die Natur der verwendeten und präparierten Marker gesichert.
  • Ein besonderer Gegenstand der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Analyse des toxischen Potenzials einer Testverbindung, umfassend wenigstens einen Hybridisierungsschritt von a) einer Probe an Nucleinsäuren von mit dieser Verbindung behandelten Zellen und b) einer Bank an Nucleinsäuren, die für (einen) deregulierten Zustand/Zustände zellulärer Signalweges) charakteristischen genetischen Ereignissen entsprechen, wobei das Hybridisierungsmuster das toxische Potenzial der Testverbindung anzeigt. Insbesondere gilt, je höher die Anzahl positiv hybridisierter Klone als um so potenziell toxischer wird die Testverbindung betrachtet.
  • Die Analyse des toxischen Profils der Verbindung erfolgt meistens auf der Bank durch Vergleich des Hybridisierungsmusters einer Nucleinsäure-Probe von Zellen, die mit dieser Verbindung behandelt sind, mit derjenigen Nucleinsäure-Probe von Zellen, die nicht mit dieser Verbindung behandelt sind. Dieser Vergleich erlaubt den Nachweis einer Differenz zwischen der Anzahl hybridisierter Klone im toxischen Zustand und dem Kontrollzustand, wobei diese Differenz in der Klon-Anzahl die Zuweisung eines Toxizitätsindex der Testverbindung erlaubt.
  • Insbesondere besteht die Erfindung in einem Verfahren zur Analyse des toxischen Potenzials einer Testverbindung, umfassend wenigstens
    • – einen Hybridisierungsschritt von a) einer Probe an Nucleinsäuren von Zellen, die mit dieser Verbindung behandelt sind, und b) einer Bank an Nucleinsäuren, die genetischen Ereignissen entsprechen, die für (einen) deregulierte(n) Zustand/Zustände zellulärer Signalweges) charakteristisch sind.
    • – einen Hybridisierungsschritt von a) einer Probe an Nucleinsäuren von mit dieser Verbindung nicht behandelten Zellen und b) einer Bank an Nucleinsäuren, die genetischen Ereignissen entsprechen, die für (einen) deregulierte(n) Zustand/Zustände zellulärer Signalweges) charakteristisch sind.
    • – den Vergleich der erhaltenen Hybridisierungsmuster, die das toxische Potenzial der Testverbindung anzeigen.
  • Der Nachweis des Hybridisierungsmusters kann mit jeder dem Fachmann bekannten Technik erfolgen und besonders durch Markierung der zu testenden Nucleinsäure-Proben und Detektion der auf der Bank vorhandenen Markierung. Ebenso besteht die Erfindung ganz besonders in einem Verfahren zur Analyse des toxischen Potenzials einer Testverbindung, umfassend wenigstens die getrennte Hybridisierung von a) markierten Nucleinsonden, die RNA von nicht behandelten und mit besagter Testverbindung behandelten Zellen entsprechen, und b) einer Bank an Nucleinsäuren, die genetischen Ereignissen (besonders transkriptionellen Ereignissen und/oder Spleißereignissen) entsprechen, die für (eine) Deregulation(en) charakteristische sind, wobei das Hybridisierungsmuster das toxische Potenzial der Testverbindung anzeigt.
  • Die Markierung der Nucleinsäuren kann mit jeder dem Fachmann bekannten Technik erfolgen, wie besonders der Einsatz zum Beispiel von radioaktiven, fluoreszierenden, enzymatischen oder kolorimetrischen Markern. Im Allgemeinen ist die Markierung radioaktiv, und der Nachweis einer Hybridisierung umfasst die Detektion der auf dem Träger vorhandenen Radioaktivität. Die Markierung kann sehr wohl selbstverständlich fluoreszierend sein, und der Nachweis einer Hybridisierung umfasst in diesem Fall die Detektion der auf dem Träger emittierten Fluoreszenz.
  • Wie zuvor in den Verfahren der Erfindung angegeben, können die Nucleinsäure-Banken, die genetischen Ereignissen entsprechen, die für (einen) deregulierte(n) Zustand/Zustände charakteristisch sind, insbesondere Nucleinsäure-Banken sein, die für deregulierte Zustände des Zellwachstums und/oder der Zelllebensfähigkeit charakteristisch sind. Ganz besonders handelt es sich um Nucleinsäure-Banken, die für Zellen mit dereguliertem Zellwachstum, besonders von transformierten Zellen, insbesondere Tumorzellen, charakteristisch sind.
  • Die Nucleinsäure-Banken in den oben beschriebenen Verfahren der Erfindung sind bevorzugter Nucleinsäure-Banken, die für Störungen der Signalwege charakteristischen genetischen Ereignissen entsprechen, die durch Aktivierung vorzugsweise der Expression des ganzen oder eines Teils eines Tumor-Suppressorgens vorzugsweise von p53 induziert sind. Es handelt sich insbesondere um Banken, die für Apoptose charakteristisch sind, die von einem Tumor-Suppressorgen vorzugsweise p53 induziert ist. Die in den Beispielen angeführten Ergebnisse zeigen insbesondere, dass aufgrund der Anwendung der qualitativen differenziellen spezifischen Durchmusterungsstrategie, ein Apoptosezustand als Folge der Induktion der Expression des Proteins p53 zahlreiche Spleißmodifikationen, zudem noch Modifikationen quantitativer Art nach sich zieht, die mit einer transkriptionellen Regulation unterschiedlicher Gene verbunden sind. Die Erfindung zeigt, dass Sonden, die von mit unterschiedlichen toxischen Verbindung behandelten Zellen abstammen, mit Klonen der Banken hybridisieren, die von quantitativen und qualitativen Durchmusterungen abstammen, die einerseits mit Kontrollzellen und andererseits mit Zellen durchgeführt sind, in denen die Expression der p53 Wildform induziert ist. Dies weist darauf hin, dass transkriptionelle Ereignisse und Spleißereignisse sowohl bei toxischen Zuständen als Zuständen vorkommen, wo das p53 Protein auf verstärkte Weise in seiner Wildform exprimiert ist.
  • Übrigens zeigen die erhaltenen Ergebnisse ebenfalls, dass, wenn die behandelten Zellen vom selben Zelltyp sind wie die Zellen, in denen die Expression von p53 induziert worden ist, die Sonden, die aus Messenger-RNA von mit zunehmenden Dosen toxischer Produkte behandelten Zellen hergestellt sind, mit viel mehr Klonen innerhalb der Banken von quantitativen und qualitativen Ereignissen hybridisieren, wenn die Dosen erhöht sind und folglich die Toxizität beträchtlich ist. Dies zeigt, dass es eine Korrelation zwischen dem Toxizitätsniveau und dem Hybridisierungsmuster auf den Banken der Erfindung gibt.
  • Es ist dennoch eindeutig, dass die Anwendung der Verfahren, Kits und Banken der Erfindung nicht auf einen bestimmten Zelltyp beschränkt ist. Insbesondere ist die Anwendung nicht auf Tests von Produkten beschränkt, die mit den selben Zellen durchgeführt sind, wie diejenigen Zellen, von denen die Klone und Banken für die quantitative und qualitative Analyse stammen. Daher zeigen die angeführten Ergebnisse, dass die Klone der Erfindung vorteilhafterweise eine Diagnose der Toxizität unabhängig von der toxischen Verbindung und dem getesteten Zelltyp erlauben.
  • In einer spezifischen Anwendungsform umfasst die Nucleinsäure-Bank wenigstens einen Klon mit der aus den SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenzen, wie oben definiert.
  • In einer besonderen Anwendungsform der Verfahren der Erfindung sind die mit der Testverbindung behandelten oder nicht behandelten Zellen und die zur Bildung der Banken verwendeten Zellen unterschiedlichen Typs.
  • Ganz besonders können die mit der Testverbindung behandelten oder nicht behandelten Zellen verschiedenen Ursprungs und Typs sein. Es handelt sich bevorzugt um Säugerzellen, noch bevorzugter um menschliche Zellen. Es handelt sich um Primärkulturen oder Zelllinien. Der verwendete Zelltyp, Zellkonzentration, Dichte und physiologische Zustand (ruhend, stimuliert, etc.) können vom Anwender der Verfahren in Abhängigkeit der Testverbindungen und in Erwägung gezogenen Anwendungen ausgewählt sein. Übrigens kann es sich ebenfalls um Zellen von Organextrakten oder Tiergeweben handeln, die mit der Testverbindung behandelt oder nicht behandelt worden sind.
  • Die Testverbindung kann ebenfalls sehr verschiedenartiger Natur sein. So kann es sich um eine einzelne Verbindung oder um eine Mischung aus Substanzen handeln. Die Verbindung kann chemischer oder biologischer Art sein. Es kann sich besonders um ein Peptid, Polypeptid, Nucleinsäure, Lipid, Kohlenhydrat, um ein chemisches Molekül, pflanzliche Extrakte, kombinatorische Banken, etc. handeln. Die Test verbindung kann ebenfalls eine auf Zellen angewandte Behandlung (Bestrahlung, UV, etc.) sein. Zur Anwendung des Verfahrens der Erfindung kann die Testverbindung in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt sein, die vom Anwender ausgewählt sind. Zudem können die von behandelten Zellen stammenden Nucleinsäure-Proben zu verschiedenen Zeitpunkten nach Behandlung mit der Verbindung präpariert sein. Es können sogar gegebenenfalls Kinetiken durchgeführt sein.
  • Die Nucleinsäuren und die entsprechenden Sonden sind mit herkömmlichen Techniken hergestellt. Die Hybridisierung kann dann durchgeführt sein, ebenfalls unter Bedingungen, die vom Fachmann und Anwender angepasst sein können. In dieser Hinsicht kann die Hybridisierung unter hoch, mittel oder schwach stringenten Bedingungen, entsprechend dem erstrebten Empfindlichkeitsgrad, der Menge an verfügbarem Material, etc. durchgeführt sein. Außerdem können gemäß der vorliegenden Erfindung die Hybridisierungen von der Bank und den Sonden homologe (wenn die Bank und die Sonden aus Nucleinsäuren derselben Spezies, zum Beispiel Menschen, gebildet sind) oder heterologe Hybridisierungen sein (wenn die Bank und die Sonden aus Nucleinsäuren verschiedener Spezies gebildet sind, zum Beispiel eine Bank menschlichen Ursprungs und Sonden aus Material eines anderen Säugers hergestellt sind). Obwohl die Banken und Sonden bevorzugt aus menschlichem Material gebildet sind, ist es tatsächlich möglich, andere Quellen besonders für die Sonden (zum Beispiel murines Material) zu verwenden. Im Falle derartiger heterologer Hybridisierungen können die Hybridisierungsbedingungen vom Fachmann gemäß den herkömmlichen Techniken, besonders durch Verringerung der Hybridisierungstemperatur und/oder Erhöhung des Salzgehalts der Hybridisierungslösung, angepasst sein.
  • 6. Bestimmung eines Toxizitätsindex
  • Ein Vorteil der Verfahren der Erfindung besteht in der Möglichkeit, einen Toxizitätsindex eines bestimmten Produkts mit jedem Zelltyp zu bestimmen. Für diese Anwendung werden die Klone, die aus Zellen identifizierten Elementen entsprechen, die zur Etablierung von für die Zelllebensfähigkeit wie auch für die induzierte Deregulation spezifischen Banken gedient haben, mit einer Sonde hybridisiert, die von zu untersuchenden nicht behandelten Zellen stammt. Ihre Hybridisierung bildet das Referenzmuster der RNA-Expression, die einem deregulierten Modell und einem untersuchten zellulären Modell gemeinsam ist. Ein Vergleich der RNA-Expression des Zustandes der nicht behandelten Zelle mit denjenigen Zuständen, wo eine Behandlung mit verschiedenen Produkten in verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen Behandlungszeiten erfolgte, wird einfach durch Vergleich der Hybridisierungsmuster von jeder Sonde, die von jedem untersuchten Zustand stammt, durchgeführt. Der Toxizitätsindex eines Zustands kann ermittelt werden, indem einerseits den Klonen ein Wert 1 zugewiesen wird, die mit der nicht behandelten Sonde hybridisiert sind, und andererseits mit dem behandelten Zustand von Interesse nicht-hybridisiert sind, und indem ebenfalls den Klonen der Wert 1 zugewiesen wird, die mit der nicht behandelten Sonde nicht hybridisiert sind, aber andererseits mit der behandelten Sonde hybridisiert sind. Der Index ist nun die Summe der einzelnen Werte 1; ausgedrückt als Prozentsatz der Anzahl an Klonen, die hybridisiert sind. Dieser Index kann folglich zwischen 0 und 100 variieren. Dieses Beispiel für die Berechnung des Index ist nicht beschränkend. Andere mathematische Verfahren, Algorithmen oder Berechnungsverfahren, beispielsweise neuronale Netze, könnten ebenfalls angewandt sein.
  • Das Nutzen der Bestimmung eines derartigen Index durch Hybridisieren der Klone, die von einer qualitativen differenziellen Durchmusterung zweier Zustände desselben Zelltyps (in Proliferation und in induzierter Apoptose) stammen, mit Sonden, die von anderen Zelltypen stammen, ist mit der Möglichkeit gezeigt, einen um so wichtigeren Index für eine bestimmte Verbindung zu ermitteln, wenn die den getesteten Zellen verabreichte Dosis sehr hoch ist.
  • Der Indexwert ist natürlich abhängig von der Schwelle, wann ein Klon den Wert 1 oder 0 bekommen soll. Der Index ist um so wichtiger, wenn der Regressions- oder Induktionsfaktor, der einen in Betracht kommenden Klon darstellen soll, schwach ist. Die Stärke des Verfahrens ist dennoch durch die Tatsache bewiesen, dass eine Linearität zwischen dem berücksichtigten Faktor und dem berechneten Toxizitätsindex besteht. Diese Linearität spiegelt die Anzahl unabhängiger Ereignisse wider, die die qualitative Bank bilden, was erlaubt, sich von der zu großen Bedeutung eines bestimmten Klons mit einem sehr beträchtlichen Expressionsunterschied zwischen behandeltem oder nicht behandeltem Zustand zu lösen.
  • 7. Suche nach Polymorphismen, die mit einer Toxizität für eine bestimmte Verbindung verbunden sind:
  • Die Bestimmung des toxischen Potenzials einer Verbindung nach dem in Abschnitt 5 und in den Beispielen beschriebenen Verfahren erlaubt die Identifizierung der Sequenzen, die von Genen stammen, die bei Stress-Mechanismen oder Zelltod beteiligt sind, und deren Expression von dieser Verbindung beeinträchtigt ist.
  • Diese Gene stellen mögliche Kandidaten für die Suche nach Polymorphismen dar, die in der Lage sind, die Antwort auf eine untersuchte Verbindung zu beeinträchtigen. Diese Polymorphismen erlauben Patienten-Kandidaten für eine Verabreichung dieser Verbindung in Gruppen zu segregieren, die mehr oder weniger für eine Entwicklung einer gesteigerten Toxizität, besonders hepatischen Toxizität, empfindlich sind.
  • Zum Beispiel kann es leicht in Betracht gezogen werden, dass ein Polymorphismus, der ein Gen beeinträchtigt, dessen Expression von einer Verbindung reprimiert ist, einen Patienten für die toxische Wirkung dieser Verbindung empfindlicher macht. Ohne diesen besonderen Fall zu berücksichtigen, ist die Bedeutung der Polymorphismen für diese Auswahl der Gene, die mit Hilfe der Erfindung durchgeführt ist, durch die Bildung der Korrelationen abgeschätzt, die zwischen diesen Polymorphismen und den beobachteten Toxizitäten bei klinischen Versuchen vorhanden sind, die über die untersuchte Verbindung durchgeführt worden sind.
  • Ein Gegenstand der Erfindung ist folglich die Verwendung der beschriebenen Klone oder Nucleinsäuren zur Identifizierung von Mutationen oder Polymorphismen, besonders SNPs, die mit der Antwort von Probanden auf pharmazeutische Verbindungen korreliert sind.
  • Die Erfindung betrifft allgemeiner die Verwendung von Nucleinsäuren, die für Spleißereignisse repräsentativ sind, die für einen bestimmten physiopathologischen Zustand charakteristisch sind, zur Identifizierung oder Charakterisierung von SNPs, die mit besagtem Zustand korreliert sind.
  • Die Identifizierung kann nach verschiedenen, dem Fachmann bekannten Verfahren oder Versuchsansätzen durchgeführt sein. So kann sie durch Sequenzierung von Genen aus biologischen Proben, die von auf eine Verbindung reagierende und nicht reagierende Probanden stammen, die ausgewählten Klonen oder Nucleinsäuren entsprechen und der Suche nach Polymorphismen in besagten Genen durchgeführt sein. Die Identifizierung kann ebenfalls aus SNPs-Banken durch Suche nach SNPs, die in besagten Genen vorhanden sind, durchgeführt sein.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung von SNPs oder anderen Mutationen oder Polymorphismen, die die Bewertung einer Antwort eines Probanden auf eine bestimmte Verbindung erlauben, umfassend (i) die in vitro Identifizierung von Nucleinsäuren, die für in einer mit besagter Verbindung behandelten Zelle induzierten Spleißereignisse charakteristisch sind, und (ii) Identifizierung von SNPs oder anderen Mutationen oder Polymorphismen in dem oder den Genen, die in (i) identifizierten Nucleinsäuren entsprechen, wobei besagte SNPs oder andere Mutationen oder Polymorphismen die Bewertung der Antwort eines Probanden auf die bestimmte Verbindung erlauben. Die Erfindung stellt daher Verfahren und Mittel zur Selektion von Genen bereit, für die Polymorphismen mit einer Toxizität für eine bestimmte Verbindung verbunden sind.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Population an Nucleinsäuren, die für so identifizierte Polymorphismen oder SNPs spezifisch sind, besonders Nucleotid-Primer für die selektive Amplifikation von Polymorphismen, oder Sonden für die selektive Hybridisierung mit den in Betracht kommenden Polymorphismen.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Analyse (zum Beispiel zur Vorhersage, Bewertung oder Bestimmung) der Antwort eines Probanden auf eine Testverbindung, umfassend die Untersuchung von Polymorphismen, besonders die Analyse von oben definierten SNPs. Ein besonderes Verfahren betrifft die Untersuchung der Sensibilität oder der Antwort eines Probanden auf eine Verbindung, besonders auf die Toxizität einer Verbindung, umfassend die Analyse, aus einer DNA umfassenden biologischen Probe von besagtem Probanden, auf das Vorhandensein in der DNA des Probanden von Polymorphismen, SNPs oder anderen genomischen Störungen, die in Genen vorliegen, deren Spleißung als Antwort auf besagte Verbindung verändert ist. Wie oben angegeben, kann das Vorhandensein von Polymorphismen, SNPs oder anderen genomischen Störungen in der DNA eines Probanden mit Hilfe verschiedener, dem Fachmann bekannter Techniken wie der Sequenzierung, Ampli fikation, Hybridisierung, Trennverfahren, chromatographischer Verfahren etc. bestimmt sein. Ein bevorzugter Versuchsansatz besteht aus der Amplifikation von DNA des Probanden mit Hilfe eines für die gesuchte Störung (besonders SNP) spezifischen Primers. Ein anderer Versuchsansatz besteht aus der Verwendung einer Nucleotid-Sonde, deren Sequenz für die gesuchte Störung (besonders SNP) spezifisch ist. Es ist zu verstehen, dass die Erfindung nicht auf bestimmte Techniken beschränkt ist.
  • 8. Kits
  • Ein Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung sind Kits (oder Sets) zur Durchführung eines Analyseverfahrens, wie es beispielsweise oben beschrieben ist. Ganz besonders sind Kits ein Gegenstand der Erfindung zur Untersuchung des toxischen Potenzials einer Testverbindung, umfassend wenigstens:
    • – eine Nucleinsäure-Bank, die genetischen Ereignissen (transkriptionellen Ereignissen und Spleißereignissen) entspricht, die für (eine) Störungen) eines oder mehrerer zellulärer Signalwege, charakteristisch sind, besonders deregulierte(n) Zustand/Zustände des Zellwachstums oder der Zelllebensfähigkeit.
  • Meistens umfassen die Kits der Erfindung eine Bank an genetischen Markern, die für Deregulation(en), zum Beispiel der Apoptose, charakteristisch sind, wie beispielsweise in der Erfindung definiert, und die auf einem festen Träger angebracht sind.
  • Bevorzugter umfassen die Kits der Erfindung eine Bank an Nucleinsäuren, die für unter verschiedenen Bedingungen induzierte mehrere deregulierte Zustände charakteristisch sind.
  • Gemäß einer anderen besonderen Form umfassen die Kits der Erfindung wenigstens eine Nucleinsäure-Bank, umfassend Klone, die den Zellen in einem deregulierten Zustand und toxischen Zustand gemeinsamen genetischen Ereignissen entsprechen.
  • Gemäß einer besonderen Form betrifft die Erfindung jedes Kit, das eine Nucleinsäure-Bank umfasst, wobei die Bank wenigstens einen Klon mit der aus SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz umfasst, wie sie oben definiert ist. Die Bank ist vorteilhafterweise auf einem Träger, vorzugsweise auf einem festen Träger, insbesondere Glas, Silika, Filter, Membran, Nylon, Kunststoff, etc., angebracht.
  • In den Kits der Erfindung umfassen die Banken außerdem vorteilhafterweise Kontrollklone, die die Eichung der detektierten Signale erlauben. Diese Kontrollen können ganz besonders aus drei Materialien gebildet sein:
    • – Klone aus genomischer DNA,
    • – cDNA, die zur Herstellung von Sonden zweckdienlich ist, die mit Banken hybridisieren werden, und/oder
    • – cDNA, die der Kontrollproteine codierenden mRNA entspricht, wie zum Beispiel Haushaltsproteine (besonders Enzyme) wie beispielsweise das β-Actin und das GADPH (Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase)
  • Die von den Haushaltsenzymen bereitgestellten Kontrollen sind klassischerweise vom Fachmann bei dem «cDNA Display» Versuch verwendet. Jedoch kann bei Deregulationsphänomenen gemäß der Erfindung die mRNA-Menge dieser Enzyme variieren. Auch zum Zwecke der Standardisierung der Hybridisierungsintensität (und folglich des Signals) einer jeden Sonde schlägt die Erfindung die Verwendung eines oder mehrerer Kontrollsysteme vor. In dieser Hinsicht erlaubt die Verwendung von genomischer DNA und/oder cDNA (nicht markiert), die der Sonde (nämlich der DNA-Population der behandelten oder nicht behandelten biologischen Probe) entspricht, gemäß der Erfindung den Erhalt von Hybridisierungskontrollen, die von jeder qualitativen oder quantitativen Variation der Genexpression unabhängig sind. Dieselben cDNA-Mengen, die mit der gleichen spezifischen Aktivität nach (radioaktiven) Markierungen versehen sind, sollten im Prinzip äquivalente Signale bei Hybridisierung einerseits mit genomischer DNA und andererseits mit sich selbst generieren.
  • Die Kits der Erfindung können außerdem umfassen:
    • – Oligonucleotide zur Herstellung von Sonden und/oder
    • – ein Protokoll für die Hybridisierungsreaktion und/oder
    • – Elemente und Informationen, die die Etablierung eines Toxizitätsindex für jedes getestete Produkt erlauben, insbesondere ein Verarbeitungsprogramm des Signals.
  • Die Oligonucleotide sind vorzugsweise halb-zufälligen Typs, wie beispielsweise die Oligonucleotide mit der Formel X-Nn-AGGT, wo X eine stabilisierende Sequenz wie beispielsweise GAGAAGCGTTATG oder CCACGTACAAG(C) ist, N eine Base ist und n eine ganze Zahl zwischen einschließlich 3 und einschließlich 8 ist.
  • Die Durchführbarkeit, die Durchführung und andere Vorteile der Erfindung sind in den nachfolgenden Beispielen erläutert, die als Erläuterungen und nicht als Beschränkungen betrachtet werden sollen.
  • Legenden der Figuren
  • 1 Differenzielle Hybridisierung von Sonden, die von nicht behandelten (A), mit Ethanol behandelten (B) oder mit Cyclosporin behandelten HepG2-Zellen stammen, auf Filter, umfassend PCR-Fragmente, die Klonen entsprechen, die von der qualitativen Durchmusterung eines von p53 induzierten Apoptosesystems stammen.
  • 2 Toxizitätsindex, aus verschiedenen toxischen Verbindungen auf dem Filter für Apoptose p53 berechnet.
  • 3 Differenzielle Hybridisierung von Sonden, die von nicht behandelten (A), mit Clenbuterol behandelten (B), mit R-Propranolol behandelten (C) oder mit DL-Propranolol (D) behandelten HepG2-Zellen stammen, auf Filter, umfassend PCR-Fragmente, die Klonen entsprechen, die von der qualitativen Durchmusterung von Tumorbiopsien stammen.
  • 9. Beispiele
  • 9.1. Identifizierung von genetischen Merkern der Toxizität aus einer qualitativen Durchmusterung auf ein zelluläres Apoptosesystem.
  • Ein Beispiel für den Beitrag der differenziellen qualitativen Durchmusterung für die Identifizierung von genetischen Markern, die mit der Toxizität von Molekülen verbunden sind, ist durch die Anwendung von DATAS auf ein Modell der Apoptose- Induktion durch Induktion der Expression der p53 Wildform veranschaulicht. Dieses Zellmodell ist durch Transfektion eines für das Tumor-Suppressorgen p53 induzierbaren Expressionssystems etabliert worden. Um die qualitativen Unterschiede zu identifizieren, die mit der von p53 induzierten Apoptose spezifisch verbunden sind, ist eine qualitative Durchmusterung von Messenger-RNA aus Zellextrakten von induzierten (ml) und nicht induzierten Zellen (mNl) durchgeführt worden. Diese Messenger-RNA sind in komplementäre DNA (cl) und (cNl) mit Hilfe der reversen Transkriptase (RT) und biotynilierten Oligonucleotid-Primern umgewandelt worden. ml/cNl und cl/mNl Hybride bilden sich dann in der flüssigen Phase.
  • Die erforderlichen RNA und cDNA-Mengen (im vorliegenden Fall jeweils 200 ng) werden vereint und mit Ethanol gefällt. Die Proben werden in einem Volumen von 30 μl Hybridisierungspuffer (40 mM Hepes (pH 7,2), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA), supplementiert mit deionisiertem Formamid (80% (v/v), wieder aufgenommen. Nach 5 min Denaturierung bei 70°C werden die Proben über Nacht bei 40°C inkubiert.
  • Die Streptavidin-Kügelchen (Dynal) werden gewaschen, dann in einem Fixierungspuffer (2X = 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2M NaCl, 1 mM EDTA) äquilibriert. Die Hybridisierungsproben werden auf ein Volumen von 200 μl mit Wasser aufgefüllt, dann für 200 μl Kügelchen für eine 60 minütige Inkubation bei 30°C angepasst. Nach magnetischem Einfangen und Waschen der Kügelchen werden diese in 150 μl RNaseH-Puffer aufgenommen, dann 20 min bei 27°C inkubiert. Nach magnetischem Einfangen sind die nicht hybridisierten Regionen im Überstand wieder freigesetzt worden, der mit Dnase behandelt, dann mit Phenol/Chloroform extrahiert, dann mit Ethanol gefällt wird. Die Ethanol-Fällungen geringer Nucleinsäure-Mengen werden mit Hilfe eines kommerziellen Polymers SeeDNA (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt, was eine quantitative Wiedergewinnung von Nucleinsäuren aus sehr verdünnten Lösungen (Größenordnung ng/ml) erlaubt.
  • Die cDNA-Synthese aus Proben von RNAs aus dem RNaseH-Verdau erfolgt mit zufälligen Hexanucleotiden mit Hilfe von Superscript II Reverse Transcriptase. Die RNA wird danach mit einer Mischung aus RNaseH und RNase T1 abgebaut. Der Primer, die nicht eingebauten Nucleotide und die Enzyme werden von der cDNA mit Hilfe einer «GlassMAX Spin» Kartusche abgetrennt. Die Spleiß-Schlaufen ent sprechende cDNA wird danach einer PCR-Reaktion unterzogen unter Verwendung halb-zufälliger Oligonucleotide mit der Struktur: (FS3)N7AGGT, wo (FS3) = CCACGCTACAAG ist.
  • Die PCR-Reaktion ist mit Hilfe der Taq-Polymerase über 30 Runden durchgeführt:
    • – Erste Denaturierung. 94°C für 1 min.
    • – 94°C für 30 s
    • – 55°C für 30 s
    • – 72°C für 30 s
    • – Finale Extension: 72°C für 5 min
  • Die PCR-Produkte werden in den pGEM-T Vektor (Promega) kloniert, der ein freies T an den 3'-Enden besitzt, um die Klonierung von Fragmenten zu erleichtern, die mit Hilfe der Taq-Polymerase amplifiziert sind. Nach Transformation in die kompetenten JM109 Bakterien (Promega) werden die erhaltenen Kolonien in Platten mit 96 Vertiefungen aufbewahrt. Die mit Hilfe von T7 und Sp6 Oligonucleotiden erzeugten PCR-Produkte, die sich auf dem Klonierungsplasmid befinden und die Inserts einschließen, sind auf Nitrocellulose-Filter deponiert.
  • HepG2-Zellen werden dann individuell mit verschiedenen Testverbindungen mit unterschiedlichem toxischen Potenzial behandelt. In diesem Beispiel ist die eingesetzte Dosis mit einem Zelllebensfähigkeitstest (MTT) berechnet und entspricht einer IC80. Die Dosen der verschiedenen Verbindungen sowie die Behandlungsdauer sind in nachfolgender Tabelle zusammengefasst: Tabelle 1
    Figure 00410001
  • Markierte Sonden, die RNA entsprechen, sind aus diesen Situationen hergestellt. Hierfür dient der erste cDNA-Strang, der aus Gesamt-RNA gemäß den dem Fachmann bekannten Techniken erhalten ist, als Matrize für eine PCR-Reaktion mit Hilfe der (FS4)GN3AGGT und FS3CN3AGGT Oligonucleotide, in denen (FS4) = GAGAAGCGTTAT ist, entsprechend folgendem Programm:
    Erste Denaturierung: 95°C, 5 min
    5 Runden mit:
    Denaturierung: 94°C, 30 sec
    Paarung: 30°C, 30 sec
    Temperaturerhöhung von 30 auf 72°C in 30 sec
    Elongation: 72°C, 30 sec
    35 Runden mit:
    Denaturierung: 94°C, 30 sec
    Paarung: 57°C, 30 sec
    Elongation: 72°C, 30 sec
    Finale Elongation:
    72°C, 7 min
  • Die PCR-Produkte sind mit Hilfe des Redyprime Kits (Amersham) markiert.
  • Die Filter werden in einem Hybridisierungspuffer (Rapid Hybrid Buffer, Amersham), der Lachssperma (100 μl/ml) enthält, 30 min bei 65°C vorhybridisiert. Die PCR-Sonde wird dann auf die Membran (0,5 × 106 bis 1 × 106 cpm/ml) für die Inkubation von 2 bis 18 Stunden bei 65°C gegeben. Die Filter werden in 0,5 × SSC, 0,1% SDS Puffer 30 min bei 65°C, dann in 0,2 × SSC, 0,1% SDS Puffer gewaschen. Die Hybridisierungsmuster werden durch Messung der Radioaktivität auf Instantlmager (Packard Instruments) (1) analysiert. Die quantitative Bestimmung der einzelnen Hybridisierungsintensitäten erlaubt die Berechnung eines Index gemäß der zuvor beschriebenen Prozedur (2). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass es möglich ist, verschiedene Produkte entsprechend ihrer Fähigkeit, bei einer p53 induzierten Toxizität die Expression von differenziell gespleißten Markern zu induzieren, zu klassifizieren. So mobilisiert Diclofenac mehr Spleißereignisse, die mit denjenigen identisch sind, die bei der mit der p53 Expression verbundenen Toxizität o induziert sind, als Aspirin in den HepG2-Zellen. Die Verwendung von Banken, die in einem Referenzzustand (gesund) und einen Hauptweg der Toxizität mobilisierenden Zustand in unterschiedlicher Weise gespleißte komplementäre DNA-Sequenzen zusammenfasst, erlaubt folglich die Klassifizierung von Produkten, deren Wirkungen nicht mit klassischen Toxizitätstests wie beispielweise dem MTT-Test zu unterscheiden sind.
  • 9.2. Identifizierung genetischer Marker der Toxizität aus einer qualitativen Durchmusterung von Tumorbiopsien
  • Ein zweites Anwendungsbeispiel der Erfindung für die Identifizierung von genetischen Markern der Toxizität besteht in der Generierung von Nucleinsäure-Banken, die zwischen gesunden Geweben und Tumorgeweben differenzieren. Der Vorteil, die einerseits in den Kontrollgeweben (gesund) und andererseits in den Tumorgeweben spezifisch exprimierten Sequenzen zu identifizieren, liegt darin, dass innerhalb eines Tumors in verschiedenen Zellen, aber ebenfalls innerhalb von gleichen Zellen, die Informationen präsentiert sind, die für dereguliertes Zellwachstum und Zelltod charakteristisch sind. Im Vergleich zu einem Apoptosemodell, das durch deregulierte Expression von p53 oder jedem anderen Protein induziert ist, das eine negative Wirkung auf das Zellwachstum oder die Zelllebensfähigkeit hat, erlaubt die Verwendung von Tumoren folglich zudem auf Filtern für prädiktive toxikologische Zwecke über Sequenzen zu verfügen, deren Expression für eine übermäßige Proliferation oder Cancerogenität charakteristisch sind.
  • Tumorbiopsien aus 7 Patienten mit Schädel- oder Halskrebs sowie Biopsien aus gesunden Geweben vom Halszäpfchen derselben Patienten waren als Arbeitsmaterial verwendet, Das gleiche wie in Beispiel 9.1 beschriebene Verfahren ist angewandt worden, falls nicht eine quantitative Anpassung aufgrund der geringen Mengen an verfügbarem Material in den Biopsien menschlichen Ursprungs erfolgte.
  • Die mit der Anwendung der Erfindung bei Tumorgeweben oder normalen Geweben generierten Nucleinsäure-Fragmente sind auf Nitrocellulose-Filter verfügbar gewesen. Diese Filter sind mit denselben radioaktiven Sonden wie in Beispiel 8.1 hybridisiert worden, nämlich Sonden, die aus genetischem Material von mit verschiedenen Verbindungen mit unterschiedlichem toxischen Potenzial behandelten HepG2-Zellen generiert worden sind. Verschiedene Hybridisierungsmuster sind mit den verschiedenen Verbindungen beobachtet worden, was so den Nutzen einer Verwendung dieser Nucleinsäure-Banken für die Bewertung einer mit einer bestimmten Verbindung verbundenen Toxizität demonstriert.
  • 3 zeigt die mit Sonden erhaltenen Hybridisierungssignale, die von normalen, Clenbuterol-behandelten, mit dem inaktiven Propranolol-Enantiomer behandelten oder noch mit einer Razemat-Mischung aus aktivem und inaktivem Propranolol-Enantiomer behandelten HepG2-Zellen stammen. Die Dosen der Verbindungen sind in der vorangehenden Tabelle 1 angegeben und die Herstellung der Sonden und die für die Hybridisierung befolgten Protokolle sind mit dem Protokoll identisch, das in dem Abschnitt erwähnt ist, wo die Verwendung von Filtern beschrieben ist, die für das p53 induzierte Apoptosemodell spezifische Signaturen sammeln (Beispiel 9.1.).
  • Die in 3 dargestellten Hybridisierungssignale können quantifiziert werden und als Basis für die Bestimmung eines Toxizitätsindex für jede der Verbindungen gemäß desselben Verfahrens dienen, wie das Verfahren, das den Erhalt der in 2 angeführten Indices erlaubt. So zeigen die in 3 dargestellten Hybridisierungen, dass die Wirkungen verschiedener Verbindungen auf HepG2-Zellen, die mit klassischen Techniken, die in toxikologischen Untersuchungen wie Färbung nach MTT eingesetzt sind, nicht wahrnehmbar sind, entsprechend ihrer Fähigkeit klassifiziert werden können, Spleißereignisse auszulösen, die für vorhandene Unterschiede zwischen Zellen gesunden Gewebes und Tumorzellen spezifisch sind.
  • 9.3. Beschreibung genetischer Marker der Toxizität
  • Die Durchführung der in Beispielen 9.1 und 9.2 beschriebenen Techniken hat die Bildung und Verwendung von Klon-Banken, genetischen Markern der Toxizität erlaubt. Die Klone, die diese Banken bilden, sind analysiert und sequenziert worden und die Sequenz eines Teils von ihnen ist in der Sequenzliste der vorliegenden Patentanmeldung (SEQ ID NR: 1–37) angeführt.
  • Die Analyse dieser Klone zeigt, dass sie qualitativen genetischen Ereignissen entsprechen, die auf sehr verschiedene Gene der Zellen einwirken, was (i) die Effizienz der Verfahren der Erfindung, (ii) das Vorhandensein genetischer Marker, die im Sinne der Erfindung «universell» sind, und (iii) die Bedeutung der Diversität der Klone zum Erhalt einer prädiktiven Antwort bestätigt.
  • So erlauben die identifizierten Sequenzen mittels Hybridisierung den Nachweis von Expressionsvariationen oder Störungen von folgenden menschlichen zellulären Genen: Aldolase A (Exon 9) (SEQ ID NR: 1); S4-Untereinheit des 26S Proteasoms (SEQ ID NR: 2); Alpha-Tubulin (SEQ ID NR: 3); Glucosidase II (SEQ ID NR: 4); Lamin B Rezeptor-Homolog (SEQ ID NR: 5); EF1-alpha (SEQ ID NR: 6); Fra-1 (SEQ 1D NR: 7), Rezeptor von Tyrosin-Kinase AX1 (SEQ ID NR: 8); spleißomales SAP62 Protein (SEQ ID NR: 9); TRAF-3 (SEQ ID NR: 10); EF2 (SEQ ID NR: 11); TEF-5 (SEQ ID NR: 12); CDC25b (SEQ ID NR: 13), Interleukin-1 Rezeptor assoziierte Kinase («IRAK») (SEQ ID NR: 14); WAF-1 (SEQ ID NR: 15); c-fos (Exon 4) (SEQ ID NR: 16); ckshs1 (SEQ ID NR: 17); PL16 (SEQ ID NR: 18); NFAR-2 (SEQ ID NR: 19); Phosphatidylinositol 4-Kinase (SEQ ID NR: 20); ERF(SEQ ID NR: 21); Tyrosin-Kinase vom Rezeptor-Typ Eph (hEphB1b) (SEQ ID NR: 22); BAF60b Protein des SWI/SNF-Komplexes (SEQ ID NR: 23); EB1 (SEQ ID NR: 24); MSS1 (SEQ ID NR: 25); alpha-Rezeptor der Retinoinsäure (RARa) (SEQ ID NR: 26); Translations-Initiationsfaktor eIF4A (SEQ ID NR: 27); Kinase vom Typ STE20 (SEQ ID NR: 28); 90 kDa HSP-Protein (SEQ ID NR: 29); Lipocortin II (SEQ ID NR: 30); TPT1 Protein («translationally controlled tumor proteon») (SEQ ID NR: 31); Hsc70 (SEQ ID NR: 32); Cytokeratin 18 (SEQ ID NR: 33); 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase (SEQ ID NR: 34); mitochondriales NADH6-Gen (SEQ ID NR: 35); mitochondriales NADH Dehydrogenase 4 Gen (SEQ ID NR: 36); alpha-Untereinheit der mitochondrialen ATP-Synthase (SEQ ID NR: 37).
  • Ein besonderer Gegenstand der Erfindung besteht besonders in der Verwendung einer Nucleinsonde, die für das gesamte oder einen Teil eines Gens spezifisch ist, das für ein oben erwähntes Protein oder Faktor codiert, zur Detektion oder zur Bewertung des toxischen Potenzials einer Verbindung und zur Detektion eines toxischen Zustands in einer biologischen Probe. Vorzugsweise umfasst die Sonde wenigstens 1000 Basen, bevorzugter wenigstens 500 Basen, und umfasst eine zu einem Teil eines oben erwähnten Gens komplementäre Sequenz. Bevorzugter ist die Sonde markiert.
  • Vorteilhafterweise betrifft die Erfindung eine Gruppe von Sonden, besonders von 5 Sonden oder mehr, vorzugsweise von 10 Sonden oder mehr, wobei jede Sonde zu einem Teil eines Gens komplementär ist, das aus den zuvor erwähnten Genen ausgewählt ist. Noch bevorzugter sind die Sonden auf einem wie in der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen Träger immobilisiert.

Claims (33)

  1. Verfahren zur Untersuchung des toxischen Potenzials einer Testverbindung, umfassend wenigstens einen Hybridisierungsschritt von a) einer Probe an Nucleinsäuren von Zellen, die mit dieser Verbindung behandelt sind, und b) einer Bank an Nucleinsäuren, wobei besagte Bank Klone umfasst, die für charakteristische (Teile von) Gene(n) oder Transkripte des Apoptosezustandes spezifisch sind, und das Hybridisierungsmuster das toxische Potenzial der Testverbindung anzeigt.
  2. Verfahren zur Untersuchung des toxischen Potenzials einer Testverbindung gemäß Anspruch 1, umfassend wenigstens eine separate Hybridisierung von a) markierten Nuclein-Sonden, die RNAs von nicht behandelten Zellen und mit besagter Testverbindung behandelten Zellen entsprechen, und b) einer Bank an Nucleinsäuren, wobei besagte Bank Klone umfasst, die für charakteristische (Teile von) Gene(n) oder Transkripte des Apoptosezustandes spezifisch sind, und das Hybridisierungsmuster das toxische Potenzial der Testverbindung anzeigt.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuclein-Sonden a) Messenger-RNAs aus behandelten und nicht behandelten Zellen entsprechen.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuclein-Sonden a) cDNA oder cDNA-Fragmente sind, die aus RNAs von behandelten oder nicht behandelten Zellen hergestellt sind.
  5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuclein-Sonden a) Amplifikationsprodukte sind.
  6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuclein-Sonden a) mit radioaktiven, fluoreszierenden, enzymatischen oder kolorimetrischen Markern markiert sind.
  7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Testverbindung eine Verbindung chemischer oder biologischer Art ist.
  8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank b) Nucleinsäuren umfasst, die Genen entsprechen, deren Expressionsniveau in einem Apoptosezustand modifiziert ist.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank b) Nucleinsäuren umfasst, deren Sequenz wenigstens zum Teil der Sequenz von Genen entspricht, die beim Apoptosezustand differentiell gespleißt sind.
  10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank b) Nucleinsäuren gemäß Anspruch 8 und Nucleinsäuren gemäß Anspruch 9 umfasst.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank b) hergestellt ist mittels Hybridisierung von einer Population an Nucleinsäuren von einer Zelle im zellulären Apoptosezustand und einer Population an Nucleinsäuren aus einer Zelle im Kontrollzustand und Isolieren aus den gebildeten Hybriden der Nucleinsäuren, die differentiellen Spleißungen entsprechen.
  12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Deregulationszustand durch Modifikation der Aktivierung, bevorzugt der Expression eines die Apoptose initiierenden oder ausführenden Gens, induziert wird.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Deregulationszustand durch Induktion oder Steigerung der Aktivierung, bevorzugt der Expression eines anti-onkogenen Gens, ausgelöst wird.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das anti-onkogene Gen aus p53, Rb, p73, myc, TUPRO-2 und NHTS ausgewählt ist.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Deregulationszustand durch Modifikation der Aktivierung, bevorzugt der Expression eines Gens induziert ist, das am Zellwachstum oder an der Zelllebensfähigkeit beteiligt ist.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Deregulationszustand durch Aktivierung bevorzugt der konstitutiven oder induzierbaren Expression des ganzen oder eines Teils eines Gens induziert wird, das am Zellwachstum, an der Zelllebensfähigkeit oder an der Apoptose beteiligt ist.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank b) wenigstens einen Klon, bevorzugter wenigstens 5 Klone, mit der aus der SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz umfasst.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank b) eine Gruppe Sonden, besonders 5 Sonden oder mehr, bevorzugt 10 Sonden oder mehr, umfasst, wobei jede Sonde zu einem Teil eines Gens komplementär ist, das aus den Genen ausgewählt ist: Aldolase A; S4-Untereinheit des 26S Proteasoms; Alpha-Tubulin; Glucosidase II; Lamin B Rezeptor-Homolog; EF1-alpha; Fra-1, Rezeptor von Tyrosin-Kinase AX1; spleißomales SAP62 Protein; TRAF-3; EF2; TEF-5; CDC25b, Interleukin-1 Rezeptor assoziierte Kinase («IRAK»); WAF-1; c-fos (Exon 4); ckshs1; PL16; NFAR-2; Phosphatidylinositol 4-Kinase; ERF; Tyrosin-Kinase vom Rezeptor-Typ Eph (hEphB1b); BAF60b Protein des SWI/SNF-Komplexes; EB1; MSS1; alpha-Rezeptor der Retinoinsäure RARa); Translations-Initiationsfaktor elF4A; Kinase vom Typ STE20; 90 kDa HSP-Protein,; Lipocortin II; TPT1 Protein («translationally controlled tumor proteon»); Hsc70; Cytokeratin 18; 2-Oxoglutarat-De hydrogenase; mitochondriales NADH6-Gen; mitochondriales NADH Dehydrogenase 4 Gen; alpha-Untereinheit der mitochondrialen ATP-Synthase.
  19. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die behandelten oder nicht behandelten Zellen a) und im Deregulationszustand b) unterschiedlichen Typs sind.
  20. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die behandelten oder nicht behandelten Zellen Säugerzellen vorzugsweise Humanzellen sind.
  21. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die behandelten oder nicht behandelten Zellen Zelllinien sind.
  22. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die behandelten oder nicht behandelten Zellen Primärkulturen sind.
  23. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die behandelten oder nicht behandelten Zellen Zellextrakte von Geweben oder Organen behandelter oder nicht behandelter Tiere sind.
  24. Verfahren zur Diagnose des toxischen Potenzials einer Testverbindung gemäß Anspruch 1, umfassend wenigstens die Hybridisierung einerseits von markierten Nuclein-Sonden, die mRNAs von nicht behandelten Zellen entsprechen, und einer Bank an Nucleinsäuren, umfassend Klone, die für charakteristische (Teile von) Gene(n) oder Transkripte des Apoptosezustandes spezifisch sind, und andererseits von markierten Nuclein-Sonden, die mRNAs von mit besagter Testverbindung behandelten Zellen entsprechen, und besagter Bank an Nucleinsäuren, umfassend Klone, die für charakteristische (Teile von) Gene(n) oder Transkripte des Apoptosezustandes spezifisch sind, wobei das Hybridisierungsmuster das toxische Potenzial der Testverbindung anzeigt.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank Klone umfasst, die für charakteristische (Teile von) Gene(n) oder Transkripte der Deregulation des p53 Pfades spezifisch sind.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure-Bank eine für transformierte Zellen, besonders Tumorzellen, charakteristische Nucleinsäure-Bank ist.
  27. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank wenigstens einen Klon, bevorzugter wenigstens 5 Klone, mit der aus den SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz umfasst.
  28. Verwendung von Nucleinsäure-Klonen, die für charakteristische (Teile von) Gene(n) oder Transkripte des Apoptosezustandes spezifisch sind, als Genmarker der Toxizität von Testverbindungen.
  29. Verwendung eines Klons gemäß Anspruch 28 mit der aus den SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz.
  30. Kit zur Untersuchung des toxischen Potenzials einer Testverbindung, umfassend eine Bank an Nucleinsäuren, umfassend wenigstens 5 Klone, bevorzugter wenigstens 10 Klone, mit der aus den SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz.
  31. Kit gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Bank auf einem Träger angebracht ist.
  32. Verfahren zur Herstellung von Genmarkern der Toxizität, umfassend die Hybridisierung von einer Population an Nucleinsäuren, die von Zellen im Apoptosezustand stammen, und einer Population an Nucleinsäuren, die von Zellen im Kontrollzustand stammen, Isolieren aus dem Produkt der Hybridisierungsreaktion von Klonen, die für den Apoptose-Zustand charakteristisch sind, und Hybridisierung von Klonen, die mit einer von Zellen im Toxizitätszustand stammenden Nucleinsäure-Probe erhalten sind.
  33. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips, der für die Diagnose eines toxischen Potenzials einer Testverbindung einsetzbar ist, umfassend die Anlagerung einer oder mehrerer Nucleinsäure-Präparate auf einem Träger, umfassend wenigstens 5 Klone mit der aus den SEQ ID NR: 1 bis 37 ausgewählten Sequenz.
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