DE102010024898B4 - Genexpressionsanalysen zur Charakterisierung und Identifizierung genotoxischer Verbindungen - Google Patents

Genexpressionsanalysen zur Charakterisierung und Identifizierung genotoxischer Verbindungen Download PDF

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Abstract

Verfahren zum Testen von Verbindungen auf genotoxisches und/oder progenotoxisches Potential mit den folgenden Schritten: (a) Bereitstellen eines zellulären Systems, das mindestens zur Expression der Gene GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R und KIF1A befähigt ist, wobei das System aus der Gruppe von Einzelzellen, Zellkulturen, Geweben, Organen und Säugetieren oder einer Probe davon ausgewählt ist, (b) Inkubieren mindestens eines Teils des Systems mit zu testenden Verbindungen, und (c) Nachweisen des genotoxisches und/oder progenotoxisches Potential durch Genexpressionsanalyse, indem die Expression dieser Gene im System mit der Genexpression in einem Kontrollsystem verglichen wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen von Verbindungen auf (pro-)gentoxisches Potential, in dem ein zelluläres System, das zur Expression von 11 bestimmten Genen in der Lage ist, bereitgestellt und mit zu testenden Verbindungen inkubiert wird, wobei sich anhand eines Vergleichs der Expression dieser Gene im System mit der Genexpression in einem Kontrollsystem das (pro-)genotoxische Potential nachweisen lässt. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Verlaufskontrolle physiologischer und/oder pathologischer Zustände, die durch Deregulation von Proliferation-, Differenzierungs- und Zellteilungsprozessen sowie Schadensreparatur hervorgerufen, vermittelt und/oder verbreitet werden, wobei eine wirksame Menge mindestens einer (pro-)genotoxischen Verbindung einem Säugetier verabreicht wird und die Expression von 11 bestimmten Genen in einer biologischen Probe des Säugetiers analysiert wird. Die Erfindung betrifft ferner Arrays zum Testen von Verbindungen auf (pro-)gentoxisches Potential umfassend Nukleinsäuresonden, die unter stringenten Bedingungen an die Markergene der Tabellen Anhang 9, 10 und/oder 11 hybridisieren.
  • Abkürzungsverzeichnis1
    • Abb.
      Abbildung
      ABI
      Applied Biosystems
      Acetyl-CoA
      Coenzym A
      ACT
      Actinomycin D
      AFB1
      Aflatoxin B1
      AhR
      Arylhydrocarbonrezeptor
      ALARA-Prinzip
      As Low As Reasonably Achievable-Prinzip
      AP
      apurinisch/apyrimidinisch
      ATP
      Adenosintriphosphat
      BaP
      Benzo(a)pyren
      BER
      Basen-Exzisionsreparatur
      BH-q-Wert
      False Discovery Rate nach Benjamin und Hochberg
      BMBF
      Bundesministerium für Bildung und Forschung
      CA
      Chromosomenabberrationstest
      CAR
      konstitutiver Androstanrezeptor
      CAS-Nummer
      Chemical Abstract Services-Nummer
    • 1 Gensymbole mit den zugehörigen Gennamen sind jeweils im Text bzw. in den Datentabellen im Anhang und nicht im Abkürzungsverzeichnis aufgeführt. Abgesehen von den Gennamen sind englische Begriffe und Begriffe zu denen es keine angemessene deutsche Übersetzung gibt oder diese nicht gebräuchlich ist, in der gesamten Arbeit kursiv hervorgehoben. Gensymbole sind entsprechend der HGNC-Richtlinie (Guidelines for Human Gene Nomenclature: www.genenames.org/guidelines) für humane Gene in Großbuchstaben (z. B. MYC) und der Richtlinie für Ratten- und Mäusegene (Guidelines for Nomenclature of Genes, Genetic Markers, Alleles, and Mutations in Mouse and Rat: www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/gene) in Kleinbuchstaben, aber groß beginnend (z. B. Myc) dargestellt. Bei generellen Signalwegbeschreibungen wurden die gebräuchlichen Symbolschreibweisen (z. B. Myc) verwendet.
    • CITCO
      6-(4-Chlorophenyl)imidazo[2,1-b][1,3]thiazol-5-carbaldehyd O-(3,4-dichlorobenzyl)oxim
      Ct
      Schwellenwertzyklus (Threshold Cycle)
      CYP
      Cytochrom-P450-Monooxygenase
      DEN
      Diethylnitrosamin
      DMBA
      7,12-Diemthylbenz[a]anthracen
      DMN
      Dimethylnitrosamin
      DNA
      Desoxyribonukleinsäure
      DDT
      Dichlordiphenyltrichlorethan
      DTT
      Dithiothreitol
      ECETOC
      European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals
      ECHA
      European Chemicals Agency
      ECVAM
      European Centre for the Validation of Alternative Methods
      EEMS
      European Environmental Mutagen Society
      EMA
      European Medicines Agency
      EMSA
      Electrophoretic Mobility Shift Assay
      etc.
      et cetera (lat.: und so weiter)
      ETO
      Etoposid
      FAM
      6-Carboxy-Fluorescein
      FDA
      Food and Drug Administration
      FDR
      False Discovery Rate
      FET
      Fluoreszenz-Energietransfer
      FXR
      Farnesoid-X-Rezeptor
      GLP
      Gute Laborpraxis
      GR
      Glukokortikoidrezeptor
      GST
      Glutathion-S-Transferase
      HH
      humane Primärhepatozyten
      HPRT
      Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase
      IARC
      International Agency for Research on Cancer
      IC-TST
      5th International Congress of Turkish Society of Toxicology
      IQ
      2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]chinolin
      ITF
      Innovation Task Force
      LDA
      lineare Diskriminanzanalyse
      LNT-Modell
      Linear-No-Threshold-Modell
      LOWESS
      Locally Weighted Polynomial Regression
      LXR
      Leber-X-Rezeptor
      3-MC
      3-Methycholanthren
      MLA
      Maus-Lymphoma-Test (Mouse Lymphoma Assay)
      MMS
      Methylmethansulfonat
      NADPH
      Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
      NATB
      N-Nitrosoanatabin
      α-NF
      α-Naphthoflavon
      β-NF
      β-Naphthoflavon
      NHEJ
      Non-homologous end joining
      NOAEL
      No Observed Adverse Effect Level
      NOEL
      No Observed Effect Level
      NNK
      4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon
      NNAL
      4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol
      NNN
      N9-Nitrosonomikotin
      NRC
      National Research Council
      nt
      Nukleotide
      OATP
      Organischer Anionentransporter
      OCT
      Organischer Kationentransporter
      OECD
      Organisation for Economic Cooperation and Development
      P53
      Protein 53 kD
      PAK
      Polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoff
      PB
      Phenobarbital
      PBREM
      Phenobarbital response enhancer modules
      PCA
      Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis)
      PCR
      Polymerase-Kettenreaktion
      PhIP
      2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin
      PPAR
      Peroxisomen-proliferiende Substanzen aktivierten Rezeptoren
      PXR
      Pregnan-X-Rezeptor
      PXRRE
      PXR response element
      REACH
      Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of chemical substances)
      RIF
      Rifampicin
      ROS
      reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Species)
      RXR
      Retinoid-X-Rezeptor
      rpm
      Umdrehungen pro Minute
      SHE
      Test Syrischer Hamsterembryo-Transformationstest
      siRNA
      small interfering RNA
      SLDA
      Spärliche LDA (Sparse Linear Discriminant Analysis)
      SULT
      Sulfotransferase
      SVM
      Supportvektormaschine
      Tab.
      Tabelle
      TAMRA
      6-Carboxy-Tetramethylrhodamin
      TCDD
      2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin
      TCPOBOP
      1,4-Bis[2-(3,5-dichloropyridyloxy)]benzen
      TFT
      Trifluorothymidin
      TH-Zellen
      T-Helfer-Zellen
      tk
      Thymidinkinase
      TMB
      3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
      TSCA
      Toxic Substances Control Act
      UDP
      Uridindiphosphat
      UDPGA
      Uridindiphosphoglukuronsäure
      UGT
      UDP-Glukuronosyltransferasen
      VDR
      Vitamin-D-Rezeptor
      VP-16
      Etoposid
      v/v
      Volumenprozent
      w/o
      ohne
      XPRT
      Xanthin-Guaninphosphoribosyltransferase
      XRE
      Xenobiotic response elements
  • 1 Einleitung
  • 1.1 Toxicogenomics- eine neue Methode in der Toxikologie
  • „Toxikologie ist im Allgemeinen die Lehre von Schadwirkungen chemischer Stoffe auf Lebewesen” [1]. Diese Schadwirkungen sind gesundheitliche Folgen der Exposition mit chemischen Stoffen und hängen von der Art des Stoffes, der Dosis/Konzentration, der Einwirkungsart (Kontaktort/Aufnahmeweg) und der Einwirkungszeit ab. Die Aufgabe der Toxikologie ist es, die Art und das Ausmaß der Schadwirkungen zu erfassen, zugrunde liegende Mechanismen aufzuklären und eine Risikoabschätzung für die Exposition von Mensch und Umwelt durchzuführen. Die Ableitung von Schutz- und Vorsorgemaßnahmen sowie die Erkennung und Behandlung fällt ebenfalls in das toxikologische Aufgabenspektrum. Anwendungsgebiete der Toxikologie sind die Prüfung von neuen Arzneimitteln in der Entwicklung, Festlegung von Maßnahmen zum Arbeitsschutz im Bereich der Gewerbetoxikologie und Aufklärung schädlicher Einflüsse von Umweltchemikalien auf dem Gebiet der Ökotoxikologie. Die klassische Toxikologie bedient sich dazu tierexperimentellen Prüfungen und nutzt auch Beobachtungen am Menschen. Endpunkte solcher Untersuchungen reichen von allgemeinen Veränderungen des (Gesundheits-)zustandes, pathologischen Organveränderungen, chemisch-klinischen Parametern bis hin zur Letalität [1]. Diese Analysen geben Aufschluss über mögliche Krankheitszustände, erlauben eine Ableitung des bestehenden Risikos und geben Aufschluss über den Mechanismus der schädlichen Wirkung. Allerdings werden die komplexen zellulären Wechselwirkungen auf molekularer Ebene damit nicht erfasst. Zudem sind die Tierstudien zeit- und resourcenintensiv, wodurch die Herausforderungen der heutigen Zeit, wie zum Beispiel die Untersuchung verschiedener Lebensstadien, vielfältiger Gesundheitsauswirkungen, vieler nicht getesteter Chemikalien und chemischer Gemische, nicht (ausreichend) adressiert werden [2]. Begrenzungen solcher klassischen toxikologischen Methoden werden auch häufig für Stoffe mit Besonderheiten im Wirkungsprofil (z. B. nicht-lineare Dosis-Wirkungsbeziehungen, Spezies-abhängige Wirkunterschiede) deutlich [3–5]. Außerdem erhöhen Bedenken der ethischen Vertretbarkeit von Tierversuchen den Druck auf die Entwicklung neuer toxikologischer Untersuchungsmethoden.
  • Enorme Fortschritte innerhalb der letzten beiden Jahrzehnte im Bereich der molekularen Genetik als Konsequenz des humanen Genomprojektes sowie auf den Gebieten der Computer- und Chiptechnologie und der bioinformatischen Analysesysteme ermöglichten die Entwicklung einer Reihe von neuen Technologien [6]. Es entstand ein neuer Forschungsansatz, die „Systembiologie” oder auch „integrative Biologie”, deren Ziel die dynamische Untersuchung des Verhaltens aller Komponenten eines Systems ist und damit dem klassischen reduktionistischen Ansatz, bei dem das System in Einzelkomponenten betrachtet wird, gegenüber steht. Die so genannten „Omics”-Methoden sind eine Vorgehensweise der Systembiologie und basieren auf der Messung globaler Veränderungen in einem zellulären System oder Gewebe auf den Ebenen der Gene (Genomics), Proteine (Proteomics) oder Stoffwechselmetabolite (Metabolomics). Die gewonnenen globalen Messwerte sollen zur Ableitung von molekularen Mechanismen und Entdeckung neuer systemcharakterisierender „Biomarker” dienen. Die Omics-Methoden sind auch zu einer hoffnungsvollen neuen Subdisziplin der Toxikologie geworden ( ) [6].
  • Diese neuen Methoden sollen zu einer Verbesserung der Risikoabschätzung von Substanzen beitragen, indem durch mechanistische Erkenntnisse eine verbesserte Spezies-, in vitro- zu in vivo-Extrapolation oder Erklärung der erhöhten Anfälligkeit bestimmter Subpopulationen, ermöglicht werden kann [6]. Zu den Leitmotiven der modernen Toxizitätstestung gehören möglichst präzise Informationen für die Risikoabschätzung, wobei die Reduktion von Tierversuchen und die Minimierung des Aufwandes an Kosten und Zeit für die Substanztestung sowie die behördliche Prüfung im Vordergrund stehen sollen [6]. Fabre und seine Mitarbeiter zeigten beispielhaft die Nützlichkeit des Einsatzes von Toxicogenomics in der Entwicklung und Selektion sowie in der präklinischen Sicherheitstestung von neuen Medikamentkandidaten, um den gesamten Prozess der Medikamterforschung und -entwicklung zu verbessern [8]. Dabei steht als Hauptziel die schnelle, kostenreduzierte Entwicklung von aktiven und möglichst nebenwirkungsfreien Medikamenten im Vordergrund. Toxicogenomics soll dazu dienen, Substanzen mit negativen Eigenschaften früh herauszufiltern und nicht-invasive Marker für die Nutzung in späteren klinischen Studien zu finden [8].
  • Toxicogenomics kann man als die Untersuchung der Beziehung zwischen der Struktur und der Aktivität des Genoms und adversen biologischen Effekten von exogen zugeführten Fremdstoffen definieren [9]. Das Grundkonzept, welches hinter der Toxicogenomicsanalyse steht, ist das Entdecken der Wirkungsweise/des Wirkungsmechanismus (Englisch: MoA-mode of action) über den eine Substanz einen bestimmten adversen (bzw. toxischen) Effekt hervorruft [6]. Dabei gilt es, die molekularen Ereignisse, den Toxizitätsstoffwechsel- bzw. die Toxizitätssignalwege, welche durch einen exogenen Stressor angesprochen werden, aufzuklären. Neben der Identifizierung solcher charakteristischer molekularer Signalwege, so genannter Schlüsselereignisse, sollen aus Tier- und in vitro-Studien neue Biomarker (biologische Marker einer Exposition und genereller toxischer Effekte) und/oder Bioindikatoren (spezifische biologische Marker eines Krankheitsereignisses, die dem Targetgewebe entstammen und eine direkte Konsequenz des gestörten Toxizitätspathways sind) gewonnen werden. Auf Basis dieser Informationen können neue quantitative in vitro-Tests entwickelt und die Daten aus diesen Tests gemeinsam mit traditionellen Daten (Pharmakokinetik, Histopathologie) zur Erstellung prädiktiver quantitativer biologischer Aktivitätsbeziehungen genutzt werden [6].
  • Das Interesse an Toxicogenomics ist dabei bei Weitem nicht nur industriell geprägt, sondern auch öffentliche Institutionen sehen diese Technologie als zukunftsträchtiges Instrument. 2004 reagierte die United States Food and Drug Administration (FDA) auf den rückläufigen Trend in der Medikamententwicklung mit dem White Paper [10]. Der negative Trend äußerte sich in steigenden Kosten und erhöhter Dauer für den Entwicklungsprozess von Medikamenten sowie späten Fehlschlägen, oft in klinischen Phasen, aufgrund unzureichender Sicherheit und Effektivität. Mit dem White Paper thematisiert die FDA die Ursachen des Problems und fordert zur Integration von neuen Technologien, wie Genomics, in den Entwicklungsprozess auf. Mit einer 2005 veröffentlichten Richtlinie (FDA's Pharmacogenomics Data Submission Guidance) über die Einreichung von Pharmacogenomics-Daten versucht die FDA die Verwendung solcher Daten für die Praxis voranzutreiben [11]. Die Europäische Arzneimittelagentur EMA rief eine Innovationsprojektgruppe die ITF (Innovation Task Force) ins Leben, welche die Expertise für den Einsatz und Umgang mit neuen Technologien innerhalb der EMA erweitern soll und als regulatorische Beratung und Informationszentrum zur Verfügung steht [12]. Im Jahr 2007 wurde durch die Veröffentlichung des Reports Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy durch das National Research Council (NRC) einen weiterer Impuls zur Entwicklung und Implementierung neuer toxikologischer Technologien gegeben [2]. Außerdem wurden in den letzten Jahren einige vielversprechende Projekte ins Leben gerufen, welche Toxicogenomics und andere Omics-Technologien auf den Prüfstand stellten und deren Eignung als neue Methoden in den Bereichen der Medizin und Chemikalienbewertung evaluierten. Zu diesen Projekten/Initiativen gehörten unter anderem die EU Innovative Medicines Initiative (2008) in Europa, das BMBF-Projekt „Konditionierung und Einsatz hepatischer in vitro-Systeme zur Identifizierung von Leber-Karzinogenen mittels Toxicogenomics-Methoden” (2007) in Deutschland oder das National Toxicology Program (2004) als Beispiel für die USA.
  • Neben dem Einsatz von Toxicogenomics in der Medikamententwicklung, erhofft man sich durch die gewonnenen Daten zum Wirkmechanismus der untersuchten Substanzen einen Nutzen in der Sicherheits- und Risikobewertung von Chemikalien [13–15]. Die Rolle von Toxicogenomics in der Risikobewertung erlangte mit der Erlassung der neuen EU-Chemikalienverordnung REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals/Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung von Chemikalien) am 1. Juni 2007 einen erneuten Bedeutungsaufschwung [16]. Das Ziel von REACH ist die Verbesserung des Schutzes der menschlichen Gesundheit und Umwelt und soll durch erweiterte Sicherheitsinformationen und eine bessere Charakterisierung von Chemikalien, welche im Maßstab von über 1 Tonne pro Jahr produziert werden, erreicht werden. Schätzungen zu Folge müssen von etwa 100,000 existierenden Substanzen 30,000 bezüglich ihrer Sicherheit getestet und bei der Europäischen Agentur für chemische Stoffe (ECHA) registriert werden [16]. Neben der Anwendung von klassischen tierversuchs-basierten GLP konformen Standardtestmethoden der Toxikologie bietet REACH die Möglichkeit neue innovative Ersatzmethoden zum Tierversuch, wie z. B. Omics-Verfahren in vitro, einzusetzen [17]. Der Einsatz solcher Ersatzmethoden spielt eine sehr große Rolle, da der Tierverbrauch für REACH mit Standardtoxizitätstests auf 7,5–45 Millionen Tiere (vorwiegend Nager) geschätzt wird [17]. Eine Reduktion der Menge an Versuchstieren ist aus ethischen Gründen im Sinne des 3R-Prinzips, aber auch vom finanziellen Aspekt betrachtet, anzustreben. Das 3R-Prinzip wurde 1959 von William Russel und Rex Burch begründet [18] und ist zu einem zentralen Leitsatz der modernen Forschung geworden. 3R leitet sich von den englischen Worten Reduce, Refine und Replace ab [18]. Dies besagt, dass wenn Tierversuche nötig sind, dann sollten so wenig Tiere wie möglich (Reduce: Reduzieren von Versuchstierzahlen) unter geringster Belastung (Refine: Verfeinern der Versuche) eingesetzt werden. Unnötige Tierversuche sollen gänzlich vermieden (Replace: Ersetzen von Tierversuchen) werden [18]. Die Anwendung neuer Technologien, wie Toxicogenomics, kann nicht nur im Rahmen der Risikobewertung von Chemikalien, sondern auch in der pharmazeutischen Industrie zu einer verbesserten Umsetzung des 3R-Prinzips beitragen. Eine bessere Selektion von potentiellen Medikamentkandidaten in der Entwicklung ist gemäß des 3R-Prinzips, weil Tiere erst später zum Einsatz kommen, die Kandidaten nicht so negative Eigenschaften haben sollten (Verfeinern der Versuche) und schlechte Kandidaten gar nicht erst getestet werden (Tierzahlreduktion).
  • 1.2 Genotoxische Verbindungen und Krebsentstehung
  • 1.2.1 Grundlagen zur Genotoxizität und chemischen Kanzerogenese
  • Jedes Jahr sterben weltweit ungefähr 7,9 Millionen Menschen an Krebs, davon 211.500 in Deutschland [19]. Damit ist Krebs die zweithäufigste Todesursache. Eine der häufigsten Krebsarten ist Lungenkrebs, für den im Tabakrauch enthaltene Chemikalien als einer der Hauptrisikofaktoren angesehen werden [19]. Dass Chemikalien einen entscheidenden Beitrag zur Krebsentstehung leisten können, entdeckte man schon sehr früh anhand der Analysen von epidemiologischen Studien. Paracelsus beschrieb bereits 1567 die so genannte Wasting Disease von Bergleuten und mutmaßte einen Zusammenhang zur Exposition mit Erzen, wie z. B. Realgar (Rubinschwefel) [20]. Eine ähnliche Beobachtung machte man auch im Erzgebirge in Sachsen. Die Vielzahl an Lungenkrebsfällen stand im Verdacht durch Arsen verursacht zu sein, wenn man auch später herausfand, dass die radioaktiven Zerfallsprodukte des Radons die Hauptursache darstellen. Der erste experimentelle Beweis, dass Chemikalien Krebs auslösen können, wurde jedoch erst im 20. Jahrhundert erbracht. Der japanische Pathologe Katsusaburo Yamagiwa und sein Assistent Koichi Ichikawa waren die Ersten, die im Jahr 1915 die Entstehung maligner epithelialer Tumoren durch die Applikation von Steinkohlenteer auf die Ohren von Kaninchen hervorrufen konnten und somit den Grundstein für die experimentelle Krebsforschung legten [20].
  • Genotoxizität lässt sich als eine generelle Bezeichnung für letale, toxische und vererbbare Effekte auf karyotisches und extra-karyotisches Material in Keimzellen und somatischen Zellen definieren [21]. Eine genotoxische bzw. mutagene Verbindung muss deshalb nicht automatisch zur Krebsentstehung führen [1]. Die Tumorentwicklung verläuft in einem mehrstufigen Prozess (Stufenmodell der Kanzerogenese) und erst wenn weitere Kontroll- und Reparatursysteme der Zelle versagen, kommt es zur malignen Entartung. Jedoch stellen mutagene Veränderungen in der DNA, welche sich infolge eines irreparablen DNA-Schadens manifestieren können, den initialen Schritt in der Tumorentstehung dar ( ). Zudem sind bösartige Tumoren stets monoklonal, d. h. sie entwickeln sich aus einer einzigen entarteten Zelle. In der nächsten Phase des Stufenmodells der Kanzerogenese, der Promotionsphase, kommt es zur präferentiellen Vermehrung initiierter Zellen, da diese stärker auf bestimmte Substanzen, so genannte Tumorpromotoren, reagieren als normale Zellen. Bei ausreichend hoher Dosierung kann ein Initiator allerdings auch ohne die Wirkung eines Tumorpromotors einen Tumor erzeugen. Man bezeichnet solche Kanzerogene als „komplette Kanzerogene”. In der dritten Phase, der Progressionsphase, kommt es zur Zunahme der Malignität des Tumors. Die Progression beinhaltet ein zunehmend autonomes Wachstum des Tumors, Neubildung von Blutgefäßen und Entwicklung der Metastasierungsfähigkeit [1].
  • Der DNA-schädigenden Wirkung liegt häufig eine Alkylierung der DNA-Basen durch elektrophile Strukturen in den gentoxischen Verbindungen zugrunde [23]. zeigt potentiell reaktive Stellen in den DNA-Basen für den Angriff elektrophiler, aber auch nukleophiler Substanzen. Reaktive Zentren elektrophiler Verbindungen sind die Stickstoff- und Sauerstoffatome in den DNA-Basen oder Hydroxylgruppen des Zucker-Phosphatrückrats [1]. Dabei reagieren analog dem Prinzip der „harten und weichen Säuren und Basen”, harte Elektrophile bevorzugt mit harten Nukleophilen und weiche Elektrophile mit weichen Nukleophilen [1]. Besonders bevorzugt wird die Base Guanin von elektrophilen Spezies angegriffen [24]. Generell hängt die attackierte Position der DNA-Base von der DNA-Sequenz, der Größe und Reaktivität des Reaktionspartners sowie von elektrostatischen und sterischen Faktoren ab. Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe reagieren beispielsweise bevorzugt mit dem exozyklischen N2 von Guaninbasen, während Mykotoxine, wie Aflatoxin B1 (AFB1), bevorzugt die N7-Position angreifen. Neben den elektrophilen Angriffen gibt es auch nukleophile Verbindungen, die mit den DNA-Basen reagieren können. Zum Beispiel greifen aromatische Amine bevorzugt nukleophil die C8-Postion des Guanin an [24].
  • Die Alkylierung der Phosphatgruppen in der DNA begünstigt die hydrolytische Spaltung der Zucker-Phosphatbindung eines Nukleotids, wodurch es zur Entstehung von DNA-Strangbrüchen kommen kann [1]. Hingegen kann die Alkylierung der DNA-Basen einerseits zu einer Störung der Ausbildung der korrekten Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA-Basen und somit zur Fehlpaarung und zum Einbau fehlerhafter Nukleotide bei der nächsten Replikation führen [24]. Auf diese Weise können so genannte Transversionen entstehen [1]. Andererseits erleichtern Basenalkylierungen die Abspaltung von Basen vom Zucker-Phosphatrückrat über die Spaltung der N-glykosidischen Bindungen. Diese Stellen, an denen eine Base vom Zucker-Phosphatrückrat abgespalten wurde, werden AP(apurinische/apyrimidinische)-Läsionen genannt. Werden die AP-Läsionen unzureichend repariert, kann das zum Einbau fehlerhafter Nukleotide oder ebenfalls zu Strangbrüchen führen. Während Einzelstrangbrüche meistens gut repariert werden können, kommt es bei Doppelstrangbrüchen häufig zu Deletionen und Translokationen und somit zur Entstehung von Mutationen. Die Reparatur von Doppelstrangbrüchen ist problematisch, da die Zelle, aufgrund der Schädigung beider Stränge, keine unmodifizierte Vorlage zur Verfügung hat. Doppelstrangbrüche entstehen außerdem häufig bei der Reparatur einer weiteren Art von DNA-Schäden, den Quervernetzungen (Crosslinks). Diese werden durch die Reaktion von bifunktionellen Elektrophilen (Lost- oder Cis-Platin-Derivate) gebildet. Crosslinks können zwischen Proteinen (z. B. Histonen) und DNA, den beiden DNA-Strängen einer Helix (interstrand-crosslink) oder zwei Basen eines Stranges (intrastrand-crosslink) entstehen [1].
  • DNA-Schäden können schließlich zu einer Hemmung der Replikation und Transkription und somit der Zellteilung und Proteinsynthese führen [1]. Allerdings führen nur wenige Mutationen zu solchen schwerwiegenden Beeinträchtigungen, da die Zelle eine Reihe von Schutzmechanismen besitzt. Eine Möglichkeit ist es, den Schaden durch verschiedene Reparaturmöglichkeiten zu reparieren. Die Art der Reparatur hängt von der Art der Schädigung ab [1]. Direkte Reparaturmechanismen sind z. B. Alkylierungen, wie die O6-Methylierung am Guanosin, die durch das Enzym O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase repariert wird [251. Ein weiteres Beispiel ist das Aufspalten von UV-verursachten Pyridindimeren durch das Enzym Photolyase. Häufiger werden falsch eingebaute Basen oder Nukleotide in einer Reihe von enzymatischen Schritten einfach ausgetauscht (Basen-/Nukleotidexzisionsreparatur). Doppelstrangbrüche können über homologe Rekombinationsprozesse repariert werden, wenn bereits ein Schwesterchromatid des gebrochenen Chromosoms gebildet wurde. Entsteht der Bruch jedoch früher, gibt es nur die Möglichkeit der NHEJ-Reparatur (Non-homologous end joining), welche jedoch sehr ineffektiv ist und häufig zu Deletionen führt [25].
  • Viele Mutationen führen nicht zu Beeinträchtigungen, da nur ein kleiner Bruchteil des Genoms transkriptionell aktiv ist. Problematisch sind jedoch Mutationen in wachstumsregulierenden Genen, den so genannten Onkogenen (wachstumsfördernde Gene) oder Tumorsuppressorgenen (zellteilungskontrollierende Gene) [1]. Beide Typen von Genen nehmen in normalen Zellen wichtige Funktionen in der Regulation von Proliferations-, Differenzierungs- und Zellteilungsprozessen wahr. Außerdem sind diese Gene für die Regulation der Schadensreparatur essentiell, da für die Reparatur der Zellzyklus vorerst gestoppt werden muss, bis der Schaden repariert ist [1]. Eines der bekanntesten Gene der DNA-Schadensreparatur ist das p53-Tumorsuppressorgen [26]. Es codiert für einen Transkriptionsfaktor, welcher eine Vielzahl von protektiven Genen der Zelle kontrolliert, die bei Stresssituationen eine Rolle spielen. Zu diesen Genen gehören nicht nur solche aus der DNA-Schadensreparatur, sondern auch Gene, die Apoptose induzieren und den Zellzyklus kontrollieren [26]. Im inaktivierten Zustand liegt p53 als Protein ständig in der Zelle vor und wird durch Stressoren, wie Anoxie, ungenügendes Vorhandensein von Nukleotiden für die DNA-Synthese, unpassende oder übermäßige Onkogenaktivierung oder ein DNA-Schaden, aktiviert [27]. Vermutlich erkennen bestimmte Kinasen, wie ATM (Ataxia-telangiectasia mutated), ATR (Ataxia-telangiectasia and Rad3 related) oder JNK (c-Jun N-terminal kinase), die beschädigten Stellen in der DNA und aktivieren so genannte Checkpointkinasen (Chks). Die aktivierte Checkpointkinase 2 (Chk2) oder auch die initial aktivierten Kinasen selbst phosphorylieren anschließend p53. Durch die Phosphorylierungen an den Resten Serin 15, 20, 33 oder Threonin 18 wird P53 stabilisiert und eine weitere Ubiquitinylierung durch die E3-Ubiquitin-Ligase Mdm2 (transformed 3T3 cell double minute 2) verhindert. Neben der Inhibition des proteosomalen Abbaus von p53 durch Phosphorylierung ist auch die Stabilisierung des p53 durch die Inhibition der Mdm2-Expression oder des Mdm2 selbst beschrieben worden. Das stabilisierte p53 wandert anschließend in den Zellkern und aktiviert die Transkription seiner Zielgene [27].
  • Die p53 Zielgene spielen nach einem DNA-Schaden bzw. an den so genannten Kontrollpunkten im Zellzyklus eine entscheidende Rolle. Zu diesen Kontrollpunkten gehören der G1/S-, der S-Phasen- und der G2/M-Kontrollpunkt [28]. An diesen Stellen im Zellzyklus muss sichergestellt werden, dass alle Abläufe vor und während der DNA-Verdopplung korrekt verlaufen sind, bevor die eigentliche Zellteilung (Mitose) eingeleitet wird [29]. Kommt es zu Fehlern, wie z. B. einem DNA-Strangbruch während der Reparatur, ist es die Aufgabe der Kontrollpunktproteine den Zellzyklus anzuhalten oder zu verzögern, die DNA-Reparaturmaschinerie zu aktivieren und nach behobenem Schaden die Zellzyklusprogression einzuleiten. Kann der Schaden nicht behoben werden, muss der programmierte Zelltod eingeleitet werden, um die Entstehung von mutierten/entarteten Zellen zu verhindern [29].
  • Kommt es zum funktionellen Ausfall eines Tumorsuppressorgens, wie p53, so hat dies fatale Folgen. Mutationen/Deletionen im p53-Gen sind die am häufigsten vorgefundenen Veränderungen in humanen Tumoren und wurden z. B. für das erblich bedingte Li-Fraumeni-Syndrom beschrieben [26, 29]. Des Weiteren führen Mutationen in DNA-Reparaturgenen zu Erkrankungen, wie z. B. Xeroderma Pigmentosum [30]. Patienten mit diesem Defekt in der Nuckleotid-Exzisions- bzw. Postreplikationsreparatur entwickeln Hauttumoren mit einer besonders hohen Frequenz [30].
  • Neben der funktionellen Beeinträchtigung von Tumorsuppressoren, hat die Überexpression oder Fehlregulation von Onkogenen schwerwiegende Auswirkungen [28]. Beispiele sind die Überexpression oder verstärkte Aktivität von Wachstumsfaktorrezeptoren, Proteinkinasen oder Transkriptionsfaktoren. Erb-B (Erythroblastic leukemia viral oncogene), ein EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), wurde in ungefähr 30% der Brusttumoren aufgrund einer Genamplifikation als überexprimiert gefunden. Bcr-Abl (Break point cluster region-Abelson murine leukemia viral oncogene) ist ein chimäres Proteinfusionsprodukt, welches durch eine Translokation zwischen Chromosom 9 und 22 entsteht. Durch die Fusion wird die Tyrosinkinase c-Abl konstitutiv aktiviert, was zur Entstehung der chronischen myeloischen Leukämie führt. Die Ursache liegt vermutlich in der übermäßigen Aktivierung verschiedener Wachstumsfaktoren [28].
  • Die angeführten Beispiele und Mechanismen zeigen, wie DNA-Veränderungen, welche ursprünglich durch genotoxische Chemikalien hervorgerufen werden, über die unangemessene Expression von Onkogenen oder funktionelle Beeinträchtigung von Tumorsuppressorgenen zu einer Störung der normalen Balance von Zellteilung und Zelltod und letztendlich zur Entwicklung von Krebs führen können.
  • 1.2.2 Klassifizierung von Kanzerogenen
  • Chemische Kanzerogene können aufgrund ihrer Wirkungen in die beiden Gruppen der gentoxischen Kanzerogene und epigenetischen, nicht-gentoxischen Substanzen unterteilt werden [22, 23]. Gentoxische Kanzerogene führen zu Veränderungen an der DNA, indem sie kovalente Bindungen mit der DNA eingehen oder reaktive Stoffwechselintermediate der Verbindung erbgutschädigend wirken. Bei den Verbindungen, welche erst nach metabolischer Aktivierung gentoxisch wirken spricht man auch von indirekt-wirkenden gentoxischen Verbindungen oder Prokanzerogenen. Beispiele für Prokanzerogene sind aromatische Amine, Nitrosamide, Nitrosamine, Mykotoxine, halogenierte Kohlenwasserstoffe und Nitroverbindungen [22, 23]. Der Mechanismus der Aktivierung dieser Substanzen ist im Abschnitt 1.2.4.4 näher erläutert.
  • Direkte genotoxische Kanzerogene sind meist organisch-synthetische oder natürlich vorkommende Stoffe [31, 32]. Beispiele sind Verbindungen mit alkylierender Wirkung unter anderem Methansulfonsäureester, Stickstoff- und Schwefellostverbindungen. Methylmethansulfonat (MMS), ein Methansulfonsäureester, alkyliert Guanin in der DNA am N7 oder Adenin am N3 über einen SN2-Mechanismus ( ). O6-akylierte Produkte spielen beim MMS nur eine sehr geringe Rolle [31, 32]. Die alkylierten Produkte sind sensitiv gegenüber einer nukleophilen Abspaltung der Base vom Zuckerphosphatrückrat. MMS bewirkt über diesen Mechanismus die Entstehung von Doppelstrangbrüchen und führt zum Erliegen der Replikationsmaschinerie [32].
  • Andere Mechanismen von direkten genotoxischen Verbindungen sind Beeinträchtigung der DNA-Replikation und Transkription durch interkalierende Eigenschaften oder Hemmung von Enzymen, die essentiell für diese Prozesse sind. Actinomycin D (ACT), ein Peptid-Antibiotikum und Zytostatikum in der Krebstherapie, das vom gram-positiven Bakterium Streptomyces parvulus gebildet wird, lagert sich über die Phenoxazin-Einheit im Molekül spezifisch in Guanin-Cytosin-reiche Bereiche der DNA ein ( ) [33]. Somit verhindert ACT das Entwinden und Öffnen der beiden DNA-Stränge und die Anlagerung der RNA-Polymerase für die Transkription [34]. In höheren Dosierungen hemmt ACT auch die DNA-Replikation und inhibiert die Aktivität von Topoisomerasen [35–37].
  • Im Gegensatz zum ACT hemmt Etoposid (ETO), ein Glycosidderivat aus der Wurzel des amerikanischen Maiapfels (Podophyllum peltatum), spezifisch die Topoisomerase II und unterdrückt so die Zellteilung (s. ) [38, 39]. Topoisomerasen sorgen dafür, die Spannung, die bei der Aufwindung der DNA für die Replikation und Transkription entsteht, zu lösen [25]. Typ II-Topoisomerasen führen dazu ATP-abhängig Superspiralisierungen in die DNA ein. Durch die Hemmung der Topoisomerasen kann es zu Strangbrüchen in der DNA kommen [25]. Die Entstehung von Doppelstrangbrüchen wird als Hauptmechanismus für die ETO-vermittelte Genotoxizität angesehen [40]. ETO wird, wie auch ACT, als Zytostatikum in der Krebstherapie eingesetzt [38].
  • Im Gegensatz zu den genotoxischen Kanzerogenen, führen epigenetische/nicht-gentoxische Kanzerogene indirekt zur neoplastischen Transformation oder fördern die Tumorentwicklung von bereits initiierten Zellen [23]. Der Mechanismus beruht nicht primär auf einer DNA-schädigenden Wirkung, sondern auf der Auslösung von Entzündungen und der Begünstigung proliferationsfördernder Ereignisse [22, 23]. Epigenetische Kanzerogene sind synthetische Pestizide (DDT), Lebensmittelzusatzstoffe, Infektionserreger (Hepatitis B-Virus), Hormone (17β-Estradiol, Diethylstilbestrol) oder Medikamente [22, 23]. Die genauen Mechanismen der epigenetischen Kanzerogene sind bis heute nicht bekannt. Einerseits kann es durch zytotoxische Substanzwirkung zur Schädigung von Zellen und zu ihrem Untergang kommen. Die nach chronischer Gewebeschädigung in Gang gesetzten regenerativen Wachstumsprozesse erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass DNA-Schäden als Mutationen etabliert werden und begünstigen daraufhin die Entstehung von Karzinomen. Andererseits können Chemikalien durch die Modulation wachstumsregulierender oder apoptotischer Signalwege tumorpromovierend wirken [22]. Auch epigenetische Mechanismen, wie Veränderungen von Chromatinstrukturen, welche zu einer veränderten Expression von Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen führen kann, scheinen eine entscheidende Rolle in der Tumorentwicklung zu spielen [24].
  • Eine Beispielsubstanz für eine nicht-genotoxische tumorpromovierende Substanz ist der Tabakinhaltsstoff Nikotin. West und seine Mitarbeiter zeigten, dass Nikotin durch die Bindung an Acetylcholinrezeptoren zur Phosphorylierung und Aktivierung der Proteinkinase B (Akt) führt [42]. Akt phosphoryliert unter anderem zellzyklusregulatorische Proteine, wie Cyclin D1 sowie proapoptotische Proteine (z. B. Bad) [43]. Zellzyklusprogression und Apoptoseinhibition sind die Folge des Akt-Signaling [43]. Durch die Akt-vermittelte verringerte Sensitivität auf apoptotische Stimuli, werden bereits initiierte Zellen nicht mehr eliminiert und bleiben damit im Gewebe erhalten [42]. Außerdem begünstigt die erhöhte Proliferation die Etablierung von Mutationen in der DNA der betroffenen Zelle und somit deren Transformation zur Tumorzelle [42].
  • Ein anderer tumorpromovierender Mechanismus wird unter anderem im Zusammenhang mit dem erhöhten Krebsrisiko durch Alkoholkonsum diskutiert. Ethanol selbst ist nicht-genotoxisch und zeigte sich im Tierversuch bei chronischer Verabreichung als nicht-kanzerogen. Allerdings wirkt Ethanol unter bestimmten Bedingungen kokanzerogen und tumorpromovierend [44]. Acetaldehyd, ein Metabolit des Ethanol, kann mit DNA-Basen und Proteinen Addukte bilden, welche zur Produktion von Autoantikörpern durch die Aktivierung einer B-Zell-abhängigen Immunantwort führen können [45]. Immunkomplexe führen anschließend zur Rekrutierung von Makrophagen (z. B. Kupffer-Zellen in der Leber), welche entscheidend am Entzündungsgeschehen beteiligt sind. Durch die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies kommt es zur Schädigung des umliegenden Gewebes und Induktion regenerativer Zellproliferation. Reaktive Sauerstoffspezies werden zudem durch den mikrosomalen Metabolismus von Ethanol gebildet [45]. Außerdem induziert Ethanol die CYP2E1 Expression in der Leber und kann somit die Aktivierung genotoxischer Kanzerogene (z. B. Nitrosamin) begünstigen [44]. Ein weiterer nicht-genotoxischer Mechanismus des Ethanols wird in der Beeinträchtigung der Vitamin-A/Retinolsäuresynthese gesehen. Retinolsäure wird unter anderem über die Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase aus Retinol synthetisiert. Chronischer Alkoholkonsum führt dadurch zur verringerten Retinolabsorption, zum verstärkten Abbau von Retinol in der Leber und zur Mobilisation von Retinol aus der Leber in andere Organe. Die erhöhte CYP2E1-Aktivität führt zudem zum verstärkten Abbau von Retinolsäure in der Leber. Durch diese Prozesse kommt es zu einer Herunterregulation der Retinolsäurerezeptoren und zur verstärkten Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1, welcher eine Vielzahl von proliferationsfördernden Genen reguliert. Das führt zur Hyperproliferation und begünstigt so die maligne Transformation. Des Weiteren soll ein durch Hypomethylierung vermittelter Expressionsanstieg in Onkogenen über eine Hemmung der Folsäure-/Pyridoxalphosphatsynthese durch Ethanol zur tumorpromovierenden Wirkung beitragen [44]. Der komplexe Mechanismus der Kanzerogenität von Ethanol zeigt, dass die Wirkungsweise der Gruppe der nicht-genotoxischen Kanzerogene extrem vielfältig und substanzspezifisch verschieden sein kann.
  • 1.2.4 Die Rolle des Fremdstoffmetabolismus bei der Krebsentstehung
  • 1.2.4.1 Die Leber als zentrales Organ des Fremdstoffmetabolismus
  • Die Leber ist das zentrale Organ des Stoffwechsels und ist maßgeblich an der Umwandlung und Ausscheidung von Fremdstoffen (Xenobiotika) beteiligt ( ) [46]. Sie kommt über das aus dem Gastrointestinaltrakt abfließende Pfortaderblut als erstes Organ mit resorbierten Fremdstoffen in Kontakt. Außerdem werden Stoffwechselprodukte zum Abbau über die Leberarterie, welche sauerstoffreiches Blut führt, in die Leber transportiert. Die menschliche Leber besteht aus vier Leberlappen, rechter und linker Leberlappen, quadratus und caudatus, welche in weitere Untereinheiten (Lobuli, Läppchen) unterteilt sind. Bei Ratten und Mäusen werden die Leberlappen rechts, links, median und caudatus unterschieden, wobei alle Leberlappen, bis auf den linken noch einmal in zwei weitere Untereinheiten untergliedert werden [46]. Das portalvenöse und arterielle Blut, welches die Fremdstoffe bzw. Stoffwechselprodukte zum Abbau enthält, vereinigt sich in den als Sinusoiden bezeichneten feinen Leberkapillaren, welche die balkenförmig angeordneten Leberparenchymzellen (Hepatozyten) umgeben [22]. Die Kapillarwand der Sinusoide besteht einerseits aus den Endothelzellen, welche durch die gefensterte Anordnung den Stoffaustausch zwischen Blut und Hepatozyten ermöglichen und andererseits aus den Kupffer'schen Sternzellen, Pittzellen und Itozellen. Die Kupffer- und Pittzellen sind bei der Immunabwehr von Bedeutung, wogegen die Itozellen Vitamin A und Fette speichern und an der Synthese der extrazellulären Matrix beteiligt sind [22].
  • Die parenchymalen Leberzellen (Hepatozyten) stellen mit 60% den größten Anteil der hepatischen Zellen dar [46]. Das Leberparenchym ist bezüglich der enzymatischen Aktivitäten und Sauerstoffsättigung jedoch nicht einheitlich strukturiert. Die periportalen (gefäßnahen) Hepatozyten sind sauerstoffgesättigt und weisen hohe Aktivitäten an Glucose-6-Phosphatase, der an der Zellatmung beteiligten Enzyme Cytochromoxidase und Succinatdehydrogenase sowie von Enzymen des Harnstoffzyklus (z. B. Carbamoylphosphat-Synthetase) auf. Bevorzugte Stoffwechselwege sind außerdem die Glykogensynthese und -speicherung sowie die Aufnahme von Gallensäuren. Im Gegensatz dazu finden sich in der sauerstoffärmeren zentrilobulären Zone hohe Enzymaktivitäten glykolytischer Enzyme (z. B. Lactatdehydrogenase), Glutaminsynthetase und von Enzymen des Fremdstoffmetabolismus [46].
  • Die Hepatozyten selbst besitzen eine polygonale Form und sind polarisiert [48]. Die basolaterale Seite wird durch die Lymphflüssigkeit des Disse'schen Raums umgeben und zeichnet sich durch eine Mikrovilli-Oberfläche aus. Diese Oberfläche ist spezialisiert zur Aufnahme von Stoffen aus dem sinusoidalen Raum und enthält eine Vielzahl an Transporter. OATP (Organischer Anionentransporter) spielt zum Beispiel bei der Aufnahme von Xenobiotika in die Hepatozyten eine Rolle. Hingegen wird die basolaterale Aufnahme von Gallensalzen über NTCP (Natrium-Taurocholat-Cotransporter) realisiert [48]. Die kanalikuläre Membran grenzt dagegen an den Gallengang und an benachbarte Hepatozyten [49]. Zur Exkretion von Substanzen in den Gallengang enthält die kanalikuläre Membran ebenfalls spezifische Transportsysteme für Gallensalze, Lipide (MDR2: Multidrug resistance 2 P-glycoprotein), organische Kationen (MDR3: Multidrug resistance 3 P-glycoprotein) und organische Anionentransporter (cMOAT: Multispecific organic anion transporter) [49].
  • 1.2.4.2 Phasen des Fremdstoffmetabolismus
  • Die Metabolisierung von Fremdstoffen kann grundlegend in drei Phasen unterteilt werden [1]. Alle drei Phasen des Fremdstoffmetabolismus haben dabei einen entscheidenden Einfluss auf die Toxizität von Substanzen, da sie sowohl zur Toxifizierung als auch Detoxifizierung führen können [50–52]. In der Phase I, der so genannten Funktionalisierung, werden lipophile Stoffe in Oxidations-, Reduktions- oder Hydrolysereaktionen in polare Verbindungen umgewandelt bzw. polare Gruppen freigelegt [1]. Diese Reaktionen werden von Cytochrom-P450-abhängigen Monooxygenasen, Flavin-abhängigen Monooxygenasen, Monoaminoxidasen, Cyclooxygenasen, Dihydrodioldehydrogenasen, DT-Diaphorase, Epoxidhydrolasen, Alkohol- und Aldehyddehydrogenasen katalysiert. Die polaren Produkte werden in der Phase II des Fremdstoffmetabolismus von Glutathion-, UDP-Glukuronosyl-, Sulfo-, Acetyl- und Methyltransferasen mit polaren endogenen Molekülen konjugiert, um eine ausreichende Hydrophilität für die Ausscheidung der Substanzen zu erreichen. Konjugationspartner sind unter anderem Glutathion, Sulfate, Glukuronide und Acetate. In der dritten Phase werden die Subtanzen aktiv aus der Zelle transportiert und anschließend über das renale oder biliäre System ausgeschieden. Der Transport aus den Hepatozyten erfolgt über Membrantransportproteine, welche aus den Klassen der Anionen-, Kationen oder ABC-Transporter stammen. Zu den bekanntesten Transporter gehören der organische Anionentransporter OATC und die ABC-Transporter MDR (Multiple Drug Resistance Protein) oder MRP (Multidrug Resistance-Related Protein). Die zuletzt genannten beiden Transportproteine wurden aufgrund von Zytostatikaresistenzen von Tumorzellen identifiziert. Beide besitzen sechs Transmembranhelices und transportieren ihre Substrate unter Verbrauch von ATP. MDR und MRP werden nicht nur in der Leber, sondern auch in Darm-, Leber- und Nierengewebe exprimiert [1].
  • 1.2.4.3 Cytochrom-P450-Monooxygenasen
  • Die zentralen Enzyme des Phase I-Metabolismus sind Cytochrom-P450(CYP)-Enzyme. Diese sind mischfunktionelle Oxygenasen, welche hauptsächlich im endoplasmatischen Retikulum von Leberzellen und in Darmgewebe aber auch in anderen Organen, wie Lunge, Niere, Hodengewebe, Gehirn etc., exprimiert werden [53]. Die durch diese Enzymfamilie katalysierten Hydroxylierungsreaktionen spielen nicht nur im normalen Stoffwechselgeschehen z. B. bei der Synthese von Steroidhormonen und Gallensäuren, sondern auch bei der Entgiftung von Xenobiotika (Phase I-Metabolismus) eine große Rolle [54]. Das Einführen von Hydroxylgruppen führt zu einer Erhöhung der Wasserlöslichkeit von Verbindungen und erleichtert somit ihre Ausscheidung [54]. Neben den klassischen Hydroxylierungsreaktionen katalysieren CYP-Enzyme aber auch Dealkylierungsreaktionen, oxidative Spaltung von C-C-Bindungen, Hydroxylierungsreaktionen an Aromaten, Epoxidierungsreaktionen, Dehydrogenierungs- und Deaminierungsreaktionen [55].
  • Die CYP-Enzyme kommen ubiquitär vor und haben sich in der Evolution aus einem gemeinsamen Vorläufergen entwickelt [1]. Deshalb kann die Einteilung anhand der Sequenzhomologie dieser Enzyme in Genfamilien (Homologie > 40%) und Subfamilien (Homologie > 55%) erfolgen [1]. 57 CYP-Enzyme sind für den Menschen bisher bekannt. Für den Xenobiotika-Metabolismus spielen vor allem die Familien 1, 2 und 3 eine Rolle [53, 55]. Entdeckt wurden die CYP-Enzyme erstmals in Mikrosomenproben von Säugern, aufgrund ihrer Fähigkeit mit Kohlenstoffmonoxid Komplexe zu bilden, die zu einer Verschiebung der Hauptabsorptionsbande (Soretbande) zu 450 nm führen [55]. Diese Beobachtung führte zur Namensgebung der Enzyme, wobei das „P” für Pigment und die 450 für die Absorption bei 450 nm steht [55]. Die charakteristische Funktionsweise begründet sich in der Struktur des aktiven Zentrums dieser Proteine. Das aktive Zentrum wird durch ein Eisen(III)-Ion, welches an den vier äquatorialen Positionen durch ein Protoporphyrin IX (Häm b) komplexiert ist, gebildet. Die axiale Position des Eisen(III)-Ions verbindet die Häm-Einheit mit dem Proteinrückrat über einen Cysteinrest, während die zweite axiale Position im nicht-aktiven Zustand mit einem leicht austauschbaren Wassermolekül besetzt ist [55]. Nach der Bindung eines lipophilen Substratmoleküls an das aktive Zentrum des Enzyms erfolgt die Hydroxylierung des Substrates in einer komplexen Reaktionsfolge, die als katalytischer Zyklus der CYP-Enzyme bezeichnet wird ( ) [54].
  • Die Expression der CYP-Enzyme erfolgt entweder konstitutiv oder kann durch bestimmte Substanzen (z. B. Arzneistoffe oder Verbindungen in Nahrungs- und Genussmitteln) induziert oder gehemmt werden [1]. Zu den induzierbaren humanen CYP-Enzymen gehören CYP1A1, CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 und CYP3A4 [53]. Dagegen ist beispielsweise CYP2D6 nicht induzierbar. Die Induzierbarkeit der CYP-Enzyme beruht auf der transkriptionellen Aktivierung, welche zu einem Anstieg der mRNA-Konzentration und schließlich im CYP-Protein führt. Die transkriptionelle Regulation geschieht hauptsächlich über nukleäre Rezeptoren z. B. Pregnan-X-Rezeptor, konstitutiver Androstanrezeptor, Glucocorticoidrezeptor und Vitamin-D-Rezeptor für die Induktion von CYP3A und CYP2B Isoformen oder der Arylhydrocarbon-Rezeptor für CYP1A Isoformen. Häufig verwendete CYP-Induktoren sind Dexamethason, Phenobarbital (PB), β-Naphthoflavon (β-NF), Isoniazid, 3-Methylchonathren (3-MC), oder Rifampicin (RIF). Ein anderer Mechanismus der Induktion wurde für CYP2E1 gefunden. Dieses wird durch Proteinstabilisierung und nicht auf transkriptioneller Ebene reguliert [53].
  • Die Induktion der CYP-Enzyme durch exogene Substanzen auf Basis der Transkription und Proteinsynthese ist in der Regel ein relativ langer Prozess, welcher Tage dauern kann [53]. Hingegen erfolgt die Inhibition meist sofort oder innerhalb weniger Stunden. Inhibitoren, wie z. B. Ketokonazol (KETO) für CYP3A4, sind meist selbst Substrate für die CYP-Enzyme, die sie blockieren. Allerdings beeinflussen nicht nur Induktions- und Inhibitionsprozesse den Metabolismus von Xenobiotika. CYP Genpolymorphismen innerhalb einer Spezies, sowie vorangehend schon diskutierte Speziesunterschiede in den CYP-Gensequenzen spielen eine entscheidende Rolle bei der Umsetzung von Fremdstoffen. Polymorphismen können einen Verlust der Aktivierbarkeit oder die Synthese nicht-aktiver CYP-Proteine verursachen. Beim Menschen sind einige Polymorphismen bekannt, welche in einer unterschiedlichen Toxizität oder Wirksamkeit von Arzneistoffen resultieren [53].
  • 1.2.4.4 CYP-abhängige Metabolisierung von Prokanzerogenen
  • Aufgrund ihrer Funktionsweise sind CYP-Enzyme Schlüsselenzyme in der Krebsentstehung und Krebstherapie. Diese Enzyme vermitteln die metabolische Aktivierung einer Vielzahl von Prokanzerogenen und sind in die Aktivierung und Inaktivierung vieler Krebsmedikamente involviert [56]. Die entstehenden Zwischenprodukte der CYP-Reaktionen sind auch Substrate für Phase II-Enzyme, welche diese in inaktive, polare, leicht ausscheidbare Stoffe umsetzen sollen. Die bedeutendsten CYP-Enzyme für die Metabolisierung von Prokanzerogenen sind CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2B6, CYP2E1 und CYP3A4/5/7. Tabelle 1.1 gibt einen Überblick über diese CYP-Enzyme mit Beispielen für Prokanzerogene, welche durch diese Enzyme aktiviert werden [56]. Tabelle 1.1: CYP-abhängiger Metabolismus verschiedener Prokanzerogene Legende: Aflatoxin B1 (AFB1), Benzo[a]pyren (BaP), 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo-[4,5-b]pyridin (PhIP), Diethylnitrosamin (DEN), Diethylnitrosamin (DMN), 2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]chinolin (IQ), 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), 4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK), 4-(Methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL), N9-Nitrosonomikotin (NNN), N-Nitrosoanatabin (NATB). [Tabelle modifiziert nach 56]
    Enzym Aktivierte Prokanzerogene
    CYP1A1 Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe z. B. BaP, Dimethylbenz[a]anthracen, PhIP
    CYP1A2 Aryl- und Heterozyklische Amine z. B. DMN, DEN, 4-Aminobiphenyl, 2-Acetyl-aminofluoren, PhIP, IQ, AFB1
    CYP1B1 Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe z. B. BaP, Dimethylbenz[a]anthracen, Benz[a]anthracen, DMBA, 3-Methycholanthren, Estradiol
    CYP2A6 Aktivierung von N-Nitrosaminen aus Tabak z. B. NNK, NNAL, NNN, NATB, DEN und AFB1, 1,3-Butadien, 2,6-Dichlorbenzonitril
    CYP2B6 AFB1 und NNK
    CYP2E1 Niedrig molekulare toxische Stoffe und vermutete krebserregende Substanzen z. B. Benzen, Tetratchlorkohlenstoff, Chloroform, Styren, Vinylchlorid, Vinylbromid, DMN, NNK
    CYP3A4/5/7 Diverse Kanzerogene z. B. AFB1, Aflatoxin G1, BaP, Naphtalen, NNN, 1-Nitropyren, 6-Aminochrysen, Estradiol, Senecionin, Stergmatocystin
  • In Abhängigkeit von der Struktur der Prokanzerogene unterscheidet sich die Aktivierung zum ultimalen gentoxischen Metaboliten. Eine der bekanntesten Klassen von progenotoxischen Verbindungen sind die polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAKs) [1]. PAKs entstehen hauptsächlich durch die unvollständige Verbrennung von organischen Materialien und bei der Pyrolyse von Kohlenhydraten, Amino- und Fettsäuren. Des Weiteren sind PAKs im Zigarettenrauch und in geräucherten Lebensmitteln zu finden. Das krebserzeugende Potential dieser Verbindungen ist seit über einem Jahrhundert bekannt und beruht auf der Interaktion von gebildeten Metaboliten mit der DNA [1]. Dabei sind nur solche Substanzen krebserregend, die aufgrund eines gewinkelten (angulären) Benzolrings eine Einbuchtung („Bay-Region”) im Molekül besitzen [57]. Die Bay-Region erschwert sterisch die Entgiftung der Phase I-Metaboliten durch Phase II-Enzyme [57]. Eine höhere DNA-Reaktivität im Vergleich zu den Phenanthren-artigen Verbindungen weisen jedoch PAKs mit einem Benzo[c]phenanthren-Strukturelement („Fjord-Region”) auf [58]. Vertreter der PAKs sind unter anderem Naphtalin, Phenanthren, Benzo[a]pyren und 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA).
  • Im Gegensatz zu anderen PAKs, wie Benzo[a]pyren, kommt DMBA nicht in der Natur vor [60]. DMBA wird vom Boden und Sediment stark absorbiert und freigesetztes DMBA wird durch Photolyse- und Photooxidationsprozesse abgebaut [60]. Die Metabolisierung von DMBA ( ) erfolgt, wie die anderer PAKs, durch enzymatische Hydroxylierung durch die Enzyme CYP1A1 oder CYP1B1 ( /I), wobei letzteres das Hauptenzym für die Bildung des endgültigen kanzerogenen Metaboliten darstellt [61]. Das gebildete 7,12-DMBA-1,2-Epoxid ist ein DNA-reaktives Zwischenprodukt, welches normalerweise von der Epoxidhydrolase zum 3,4-DMBA-diol umgesetzt wird ( /II) [59]. DMBA besitzt allerdings noch eine gut zugängliche Doppelbindung, welche als Angriffspunkt für eine zweite CYP-abhängige Hydroxylierungsreaktion dient ( /III). Das entstandene 7,12-DMBA-1,2-diol-3,4-epoxid ist das ultimale Kanzerogen und kann mit Desoxyadenosin und Desoxyguanosin in der DNA Addukte bilden ( /IV) [59].
  • Neben PAKs werden auch Naturstoffe, wie AFB1, zu einem DNA-reaktiven Epoxid metabolisch aktiviert [1]. AFB1 ist ein Toxin, produziert vom Schimmelpilz Aspergillus flavus. Aflatoxin-bildende Schimmelpilze können bei feuchtwarmer Lagerung auf verschiedenen Lebensmitteln, vor allem Nüssen, Getreide und Mohn entstehen [1]. Eines der Hauptzielorgane des potenten Kanzerogens AFB1 ist die Leber [62]. AFB1 induziert in der Leber zelltyp-spezifische Tumoren ausgehend von parenchymalen und Gallengangepithelzellen [62]. Allerdings existieren starke Speziesunterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber AFB1-vermittelten Bildung von Lebertumoren [1]. Während Ratten sehr sensitiv sind, haben Mäuse ein bestimmtes Glutathion-S-Transferase-Isoenzym, welches den aktiven Metaboliten, das AFB1-Epoxid, effektiv entgiftet [1]. Allerdings sind Ratten in diesem Fall eher für den Menschen prädiktiv, da beide Spezies im Gegensatz zur Maus schlechte Konjugatoren sind [62]. Das AFB1-8,9-Epoxid, entsteht durch Epoxidierung des Hydroxylierungsproduktes der Enzyme CYP1A2 und CYP3A4 ( /I). Das hochreaktive AFB1-Epoxid führt zur Alkylierung der DNA am N7 von Guaninbasen ( /II). Durch spontane Hydrolyse kann das AFB1-Guanin-Addukt leicht vom Zuckerphosphatrückgrat abgespalten werden ( /III) und zu AP-Läsionen führen. Die Folgen sind G→T-Transversionen und C→T-Transitionen. G→T-Transversionen in der dritten Position des Codon 249 (AGG) des p53 Tumorsuppressorgens wurden in der Hälfte aller hepatozellulären Karzinome von Menschen, welche mit AFB1 exponiert waren, gefunden. C→T-Transitionen wurden bei in hepatozellulären Karzinomen von Ratten im Codon 12 des RAS-Onkogens gefunden [62]. Des Weiteren kommt es durch die AFB1-DNA-Addukte aufgrund der flachen Struktur des AFB1 zu einer Verzerrung der DNA-Helix, was eine fehlerhafte oder behinderte Replikation nach sich zieht [32].
  • Eine andere Klasse von Prokanzerogenen sind alkylierende Verbindungen, zu welchen die Lost(Senfgas)-Verbindungen (Stickstoff- und Schwefelloste) gehören [1]. Der Name Lost von den Erfindern des Senfgases Lommel und Steinkopf. Lost-Verbindungen sind als chemische Kampfstoffe bekannt [1]. Sie werden aber auch in der Krebstherapie als Zytostatika eingesetzt. Beispiele sind Cyclophosphamid (Endoxan®) und dessen Derivate (Ifosamid, Melphalan) [63]. Cyclophosphamid (CPA) kann von einer Vielzahl von CYP-Enzymen hydroxyliert werden ( /I) [63]. Eines der Hauptenzyme ist wahrscheinlich CYP2B6 [64]. Das entstehende 4-Hydroxy-CPA tautomerisiert anschließend zum Aldophosphamid ( /II) und bildet dann durch Abspaltung von Acrolein das Phosphoramidsenfgas ( /III) [65]. Das Phosphoramidsenfgas zerfällt spontan oder Phosphoramidase-katalysiert in ein Stickstofflost-Derivat, Ammoniak und ein Hydrogenphosphation ( /IV). Das Stickstofflost reagiert in einer intramolekularen SN 1-Reaktion durch Angriff des Stickstoffatoms auf das Chlor-gebundene Kohlenstoffatom zum Aziridiniumion ( /V). Im nächsten Schritt ( /VI) kommt es zum nukleophilen Angriff auf das stark gespannte Aziridiniumion durch N7 des Guanins der DNA. Das führt zur Bildung von N7-alkylierten DNA-CPA-Produkten. Reagiert der zweite Teil des CPA-Moleküls mit einem weiteren Guanin kann es zu Quervernetzungen in der DNA kommen [66].
  • Neben den PAKs, Naturstoffen und alkylierenden Verbindungen gehören auch die Nitrosamin zu den prokanzerogenen Substanzen [1]. Nitrosamin findet man in vielen Nahrungs- und Genussmitteln (gepökeltes Fleisch, alkoholische Getränke und Tabak). N-Nitrosoverbindungen können zudem im Magen aus sekundären Aminen der Nahrung und Nitrit gebildet werden [1]. Diethylnitrosamin (DEN), ein Vertreter dieser Substanzklasse, wird durch CYP2E1 und CYP2A6 enzymatisch in Alpha-Stellung hydroxyliert ( /I) [67–69]. Nach Abspaltung von Acetaldehyd ( /II) tautomerisiert das entstandene N-Nitrosoethylamin zum 1-Ethyl-2-hydroxydiazen ( /III) [70, 71]. In einem zweistufigen Prozess erfolgt anschließend die Eliminierung von Wasser ( /IV) und Stickstoff ( /V) unter Bildung eines Carbeniumions. Das Carbeniumion kann DNA-Basen durch elektrophilen Angriff alkylieren [70, 71]. /VI zeigt den elektrophilen Angriff des Carbeniumions auf den Sauerstoff im Guanin unter Entstehung eines O6-alkylierten Produktes [71]. Neben Guanosin-Addukten wurden auch Thymidinaddukte beschrieben. O4-Ethylthymidin wird dabei als Hauptaddukt für die Induktion von Lebertumoren angesehen [72].
  • 1.3 Testung auf Genotoxizität und Kanzerogenität und Risikobewertung von Substanzen dieser Klassen
  • 1.3.1 Standardtestverfahren zur Prüfung auf Mutagenität (Genotoxizität)
  • 1.3.1.1 Regulatorische Aspekte der Arzneimittel- und Chemikalienzulassung
  • Aufgrund der hohen Inzidenz von Krebserkrankungen, der schlechten Heilbarkeit und des bösartigen Krankheitsverlaufes, haben krebserzeugende Substanzen einen besonderen Stellenwert bei der Bestimmung toxischer Wirkungen von Chemikalien und ihrer toxikologischen Bewertung [1]. Die Identifizierung, Klassifizierung und Risikobewertung von Kanzerogenen spielt deshalb für die Arzneimittelentwicklung, als auch für die Zulassung von Chemikalien eine bedeutende Rolle. Bei der Testung wird zwischen Mutagenitäts(Genotoxizitäts-) und Kanzerogenitätstests unterschieden. Die Genotoxizitätstestung für die Zulassung von Arzneimitteln wird durch die EMA-Richtlinien ICHS2A/B von 1998 reguliert. Im Jahr 2008 wurde allerdings eine neue international harmionisierte Richtlinie, die ICH S2 (R1), entworfen, welche künftig die anderen beiden Richtlinien ersetzen soll [73]. Aufgrund der Vielfalt an genotoxischen Agenzien und Wirkungsmechanismen ist es notwendig eine Batterie von in vitro- und in vivo-Tests durchzuführen, deren Ergebnisse komplementär bei der Dateninterpretation zusammenfließen sollen [73].
  • Die vorgeschlagene Standardbatterie nach ICH S2 (R1) setzt sich prinzipiell aus zwei Teilen zusammen:
    • 1. Mutagenitätstestung durch einen Rückmutationstests in Bakterien
    • 2. Genotoxizitätstestung in Säugerzellen in vitro und/oder in vivo
  • Für die genaue Teststrategie werden zwei verschiedene Möglichkeiten angegeben:
  • Option 1
    • 1. Ein Genmutationstest in Bakterien
    • 2. Ein Test auf DNA-schädigende Wirkung in Säugerzellen in vitro: Entweder ein Test mit zytogeneticher Untersuchung von Chromosomenschäden (Mikrokerntest oder Metaphasechromosomenaberrationstest) oder ein Maus-Lymphoma tk Genmutationstest
    • 3. Ein in vivo-Test auf Chromosomenschäden in hämatopoetischen Zellen von Nagern (Chromosomenaberrationstest in der Metaphase oder Mikrokerntest)
  • Option 2
    • 1. Ein Genmutationstest in Bakterien
    • 2. Ein in vivo-Test auf Genotoxizität mit zwei verschiedenen Geweben (normalerweise Mikrokerntest an hämatopoetischen Zellen von Nagern und ein anderer in vivo-Test)
  • Im Sinne des 3R-Prinzips sollten die in vivo-Studien der Testbatterie wenn möglich mit in die Routinetoxizitätsstudien mit wiederholter Gabe (Repeated-dose toxicity studies) integriert werden [73]. Außerdem entfällt die Notwendigkeit von Positivkontrollen in vivo [73]. Protokolle zur Durchführung der Tests sind in den zum Teil schon international harmonisierten Richtlinien der OECD (OECD Guidelines) festgeschrieben. Die Guidelines zur Genotoxizitäts- und Kanzerogenitätstestung befinden sich in Sektion 4 der Richtlinien für die Chemikalientestung der OECD [74]. Zudem werden in der ICH S2 (R1) spezifische Aspekte, welche bei der Testung zu beachten sind, angeführt. Beispielsweise wird die vorgeschriebene Testdosis von 5 mg/Platte für die bakterielle Mutationstestung und 1 mM für Säugerzelltests in vitro angegeben. Für zytotoxische Substanzen muss diese entsprechend der Vorgaben in der Richtlinie verringert werden. Des Weiteren enthält die ICH S2 (R1) Hinweise für die Interpretation der Testresultate und für mögliche weiterführende Studien [73].
  • Im Gegensatz zur Zulassung von Arzneistoffen, wird die Testung für die Zulassung von Chemikalien innerhalb der EU durch die REACH-Verordnung reguliert. Die Mutagenitätstestung unter REACH hängt dabei, wie auch die anderen toxikologischen Tests, von der entsprechenden Produktions- bzw. Importmenge der Substanzen ab. Beispielsweise würde für Substanzen mit einem Produktions-/Importvolumen von ≥ 1 Tonne aber < 10 Tonnen pro Jahr ein negatives Ergebnis aus einem Mutagenitätstest in Bakterien ausreichen [75]. Ein Produktions-/Importvolumen von ≥ 10 Tonnen pro Jahr oder ein positives Ergebnis für die 1–10 t Kategorie würden hingegen zusätzliche Studien erfordern [75].
  • 1.3.1.2 Genmutationstest in Bakterien (Ames-Test)
  • In den frühen 1970ern begann Bruce Ames mit der Mutagenitätstestung einer Reihe von bekannten Kanzerogenen mithilfe des reversen Mutationstests in Salmonella typhimurium [76]. Dieser Test wurde später als Ames-Test weltbekannt [76]. Das Testprinzip ( ) basiert darauf, dass Bakterienstämme (Salmonella typhimurium oder Escherichia coli) mit einer Mutation in einem Gen, welches für eine essentielle Aminosäure codiert, verwendet werden [77]. S. typhimurium besitzen diese Mutation im Histidingen und E. coli im Genlocus Tryptophan [77].
  • Mutagene Agenzien können eine Rückmutation in diesen Genen verursachen und somit die Fähigkeit der Bakterien zur Produktion der entsprechenden essentiellen Aminosäure wieder herstellen [77]. Rückmutierte Bakterien können infolgedessen auf einem speziellen Minimalagar wachsen. Die Kolonienzahl auf dem Minimalagar wird nach 2–3 Tagen ermittelt und gibt Aufschluss über die genotoxische Aktivität einer Substanz. Mit dem Rückmutationstest in Bakterien können Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen von einem oder mehreren Basenpaaren erfasst werden [77]. Für den Genmutationstest in Bakterien gibt es zum Beispiel spezielle Vorgaben für die zu verwendenden S. typhimurium oder E. coli Stämme, um möglichst ein großes Spektrum an verschiedenen Basensubstitutionen und Leserasterpunktmutationen (frameshift point muations) sowie quervernetzende Agenzien zu erfassen. Die vorgeschriebene Testkombination umfasst fünf verschiedene Teststämme [77]:
    • 1. S. typhimurium TA1535 und
    • 2. S. typhimurium TA1537 oder TA97 oder TA97a und
    • 3. S. typhimurium TA98 und
    • 4. S. typhimurium TA100 und
    • 5. E. coli WP2 uvrA oder E. coli WP2 uvrA (pKM101) oder S. typhimurium TA102.
  • Die Stämme unter 1–4 besitzen GC-Basenpaare an der primären Rückmutationsstelle und können deshalb nicht bestimmte oxidierende Mutagene, quervernetzende Agenzien und Hydrazine erfassen. Deshalb muss zusätzlich einer der unter 5 angegebenen Stämme, welche AT Basenpaare an der primären Rückmutationsstelle haben, getestet werden [77].
  • Limitationen des Rückmutationstests in Bakterien sind für bakterizide Substanzen (Antibiotika) oder Stoffe, die spezifisch auf die Säugerzellreplikation wirken, bekannt [77]. Des Weiteren sind die Bakterien nicht in der Lage progenotoxische Substanzen metabolisch zu aktivieren. Deshalb müssen die Bakterien bei der Testung von unbekannten Substanzen zusätzlich in Kombination mit einem metabolischen Aktivierungssystem getestet werden. Als typische Positivkontrollen werden im Ames-Test mit metabolischer Aktivierung DMBA, CPA und Benzo[a]pyren verwendet. Hingegen dienen 2-Nitrofluoren, Natriumazid, 9-Aminoacridin und Mitomycin C als Kontrollsubstanzen im Ames-Test ohne metabolisches Aktivierungssystem [77].
  • Zur metabolischen Aktivierung können entweder die subzelluläre S9-Fraktion oder auch die mikrosomale Fraktion herangezogen werden. Beide Fraktionen werden durch differentielle Zentrifugation von Leberhomogenaten hergestellt. Die S9-Fraktion wird durch 20-minütige Zentrifugation von Leberhomogenaten in einem geeigneten Puffer bei 9000 × g gewonnen und enthält neben der mikrosomalen Fraktion noch das Zytosol [79]. Durch erneute Zentrifugation der S9-Fraktion bei 100.000 × g für 60 min, lässt sich die zytosolische von der mikrosomalen Fraktion trennen. Mikrosomen sind sphärische Partikel, die in lebenden Zellen nicht vorkommen, sich aber aus endoplasmatischen Retikulum in Homogenaten bilden [79]. Die mikrosomale Fraktion enthält Ribosomen und hydroxylierende Enzyme, wie z. B. CYP-Monooxygenasen, aber auch Enzyme wie Uridinglukuronosyltransferasen (UGTs), Glucose-6-Phosphatase, Nukleosiddiphosphatasen und NADPH-abhängige Lipidhydroxylasen [80, 81]. Hingegen sind in der zytosolischen Fraktion, welche in der S9-Fraktion noch enthalten ist, zusätzlich Enzyme des Phase II-Fremdstoffmetabolismus, wie N-Acetyltransferasen, Glutathion-S-Transferasen, Sulfotransferasen sowie Enzyme der Glykolyse wie Glucose-6-phosphatdehydrogenase, aber auch Malatenzym, Enzyme des Zitratzyklus und Lactatdehydrogenase, vorhanden [80, 81]. Allerdings müssen für die katalytische Aktivität der Enzyme NADPH oder ein NADPH-regenerierendes System als Energiequelle und für Phase II-Enzyme Kofaktoren, wie Uridindiphosphoglukuronsäure, Acetyl-COA, DTT und Glutathion exogen zugeführt werden [81].
  • Für die Genotoxitätstestung wird vorwiegend S9 von Ratten, welche zuvor mit CYP-Induktoren behandelt worden, verwendet. Eine solche Behandlung führt zu einer erhöhten Konzentration an bestimmten CYP-Enzymen. Höhere CYP-Konzentrationen ermöglichen es, geringere Mengen des metabolischen Aktivierungssystems einzusetzen und eine effektivere Aktivierung von Substanzen zu gewährleisten. Lange Zeit wurde Aroclor 1254, ein Gemisch aus polychlorierten Biphenylen (PCBs), für die Induktion verwendet. Aroclor induziert ein breites Spektrum an CYP-Enzymen, welches die Familien A bis E einschließt und einer Kombinationsbehandlung von 3-MC und PB ähnelt [82]. Polychlorierte Biphenyle wurden unter dem Handelsnamen Aroclor von 1929 bis 1970 in großen Mengen zur Anwendung als dielektrische Flüssigkeiten in Kondensatoren und Transformatoren, für Schmieröle, als hydraulische Flüssigkeiten sowie als Zusatzstoffe für Farben, Pestizide, Durchlagpapier, Dichtungsmittel und Plastikmaterialien produziert [83]. Aufgrund weitreichender toxischer Effekte und der Persistenz wurde die Produktion der PCBs im Jahr 1976 in den USA durch die TSCA(Toxic Substances Control Act)-Verordnung und später im Jahr 2001 dann auch in Europa durch die Stockholmer Konvention (Stockholm convention an persistent organic pollants) gestoppt [83, 84]. Wegen dem Produktionsverbot von Aroclor müssen künftig Alternativen gefunden werden. Bereits 1992 kam ein britischer Arbeitsausschuss zu dem Schluss, dass ein Gemisch aus β-NF und PB ein ähnliches Spektrum an CYP-Enzymen induziert wie Aroclor und somit eine gute Alternative zu diesem darstellt [85]. Außerdem sind die durch β-NF/PB-induzierten Enzyme CYP2B1/2 und CYP1A für die Metabolisierung vieler progenotoxischer Stoffe verantwortlich [85].
  • 1.3.1.3 Säugerzellmutationstests in vitro
  • Nach dem Rückmutationstest in Bakterien, sieht die nächste Stufe der Mutagenitätstestbatterie für Option 1 einen Mutationstest an Säugerzellen in vitro vor. Dabei kann entweder ein Test auf Chromosomenaberration in Säugerzellen oder der Maus-Lymphoma tk Test durchgeführt werden [86]. Für den Maus-Lymphoma-Test wird die Zelllinie L5178Y verwendet, welche eine homo- oder heterozygote Mutation im Thymidinkinase(tk)-Locus tragen. Für den Test werden die Zellen mit dem Thymidinanalogon Trifluorothymidin (TFT) inkubiert. Zellen mit aktiver Thymidinkinase sind sensitiv gegenüber TFT und werden im Wachstum und Metabolismus gehemmt, während Thymidinkinase-defiziente Zellen auch in Gegenwart von TFT wachsen können. Dem Maus-Lymphoma ähnliche Tests sind der HPRT und XPRT Test. Für diese beiden Tests werden CHO, AS52 oder V79 Zellen des chinesischen Goldhamsters oder TK6 (humane lymphoblastoide) Zellen verwendet. Als Endpunkte werden Mutationen Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase(HPRT)- bzw. Xanthin-Guaninphosphoribosyltransferase(XPRT)-Locus bestimmt. Die Zellen werden dabei anhand der Resistenz gegenüber 6-Thioguanin bzw. 8-Azaguanin selektiert. Während das Thymidinkinasegen und XPRT autosomal lokalisiert sind, liegt der HPRT-Locus auf dem X-Chromosom. Dadurch werden durch die verschiedenen Tests unterschiedliche genetische Veränderungen erfasst Auch bei diesen Tests ist es erforderlich mit und ohne metabolisches Aktivierungssystem zu testen, um auch prokanzerogene Substanzen zu erfassen. Die Behandlungszeit mit der Testsubstanz beträgt 3–6 h [86].
  • Die zweite Testoption, ein Chromosomenaberrationstest in vitro, wird durch die OECD-Richtlinie 473 beschrieben [87]. Durch einen solchen Test sollen strukturelle Veränderungen an Chromosomen erfasst werden. Polyploidie von Chromosomen oder Chromosomenaberrationen spielen bei verschiedenen genetisch bedingten Krankheiten z. B. Trisomie 21 eine Rolle. Deshalb ist es wichtig die chromosomenschädigende Wirkung von Substanzen zu untersuchen. Für einen solchen Test können alle Zelllinien verwendet werden, die einen stabilen Karyotyp (Chromosomeneigenschaften) und eine möglichst geringe bzw. stabile chromosomale Mutationsfrequenz aufweisen. Häufig verwendete Zellen sind Fibroblasten des chinesischen Goldhamsters und periphere Blutzellen von Säugetieren. Die Zellen werden für den Test für 3–6 h mit der Testsubstanz mit und ohne metabolisches Aktivierungssystem behandelt und nach definierten Zeitintervallen mit Colchizin in der Metaphase arretiert. Die Arretierung sollte etwa nach einem 1,5-fachen Zellzyklus erfolgen. Danach werden die Zellen geerntet, gefärbt und mikroskopisch auf Chromosomenschäden untersucht [87].
  • 1.3.1.4 Chromosomenaberrationstests in vivo
  • Neben der Testung in vitro gehört ein in vivo-Test auf Chromosomenschäden in hämatopoetischen Zellen von Nagern zur Standardtestbatterie. Durchgeführte Standardtests sind der Mikrokerntest oder ein Chromosomenaberrationstest in der Metaphase [88, 89]. Die Testung in vivo zielt vor allem darauf ab, den Metabolismus, die Pharmakokinetik einer Substanz und DNA-Reparaturprozesse mit abzudecken, was in vitro nicht oder nur sehr begrenzt möglich ist. Allerdings müssen Spezies-spezifische Unterschiede bei der Interpretation und Abschätzung des Risikos für den Menschen beachtet werden, da für die in vivo-Testung Nager als Modellspezies herangezogen werden [88, 89].
  • Beim Mikrokerntest werden Schädigungen der Testsubstanz auf Chromosomen und den mitotischen Apparat durch die Analyse der Mikrokernformation in Erythrozyten aus Nagerknochenmark oder in peripheren Blutzellen von Nagern bestimmt [88]. Während der Reifung von Erythroblasten zu polychromatischen Erythrozyten im Knochenmark stoßen diese ihren Hauptzellkern ab. Kommt es durch den Einfluss von mutagenen Substanzen zu Chromosomenbrüchen (klastogene Wirkung) oder zum Verlust ganzer Chromosomen (aneugene Wirkung), so können diese in Form von Mikrokernen im Zytoplasma zurückbleiben. Ein Anstieg in der Zahl an Mikrokernen gegenüber der Kontrolle ist ein Indiz für die chromosomenschädigende Wirkung einer Substanz. Für den Mikrokerntest werden die Nager mit der Testsubstanz behandelt und an geeigneten Zeitpunkten Blutproben aus der Schwanzvene entnommen bzw. das Tier getötet und das Knochenmark aus den Femora oder Tibiae isoliert. Für die Analyse von Knochenmark werden in der Regel zwei Zeitpunkte gewählt, wobei der erste Zeitpunkt mindestens 24 h nach der Behandlung aber unter 48 h liegen sollte. Das Behandlungsregime und die Zeitpunkte der Probenentnahme richten sich nach der jeweiligen Testsubstanz. Die Dosis sollte entweder bei mindestens 2000 mg/kg für Behandlungen bis 14 Tage und 1000 mg/kg für Behandlungen über 14 Tage liegen. Bei toxischen Substanzen oder Substanzen, die bei diesen Dosierungen bereits Letalität hervorrufen, müssen die Dosierungen entsprechend verringert werden. Als Positivsubstanzen können z. B. Ethylmethansulfonat, Mitomycin C oder CPA mitgeführt werden. Allerdings sollen künftig, wie vorangehend schon erwähnt, aus Tierschutzgründen die Positivkontrolltiere eingespart werden. Die Färbung der Präparate kann mit Farbstoffen, wie Giemsa oder speziellen DNA-Farbstoffen wie z. B. Hoechst oder Acridinorange, erfolgen. Zur Auswertung werden mindestens 200 Erythrozyten bei Knochenmarksproben und 1000 bei Blutproben ausgezählt [88].
  • Neben dem Mikrokerntest in vivo kann auch ein Chromosomenaberrationstest in vivo im Rahmen der Standardtestbatterie durchgeführt werden. Für diesen Test werden ebenfalls routinemäßig Nager genutzt [89]. Diese werden zusätzlich zu der Behandlung mit der Testsubstanz noch mit einem Spindelgift, wie Colchizin, welches zur Metaphasearretierung führt, vor der Tötung für 3–5 h behandelt. Anschließend werden Knochenmarkausstriche angefertigt, gefärbt und auf Chromosomenschäden untersucht. Die empfohlenen Positivkontrollen, die Dosierungen der Testsubstanz und Tiergruppenstärken von mindestens 5 Tieren entsprechen den Vorgaben zum Mikrokerntest in vivo. Für die Auswertung müssen mindestens 100 Zellen auf Chromosomenschäden untersucht und eine Zytotoxizitätsauszählung in mindestens 1000 Zellen durchgeführt werden [89].
  • 1.3.2 Kanzerogenitätstestung
  • Während in Mutagenitätsstudien lediglich das mutagene Potenzial von Substanzen evaluiert wird, kann mit Kanzerogenitätsstudien die krebserzeugende Wirkung sowie potentielle Zielorgane und die Art der induzierten Tumoren nachgewiesen werden [1]. Zudem werden in Kanzerogenitätsstudien nicht nur genotoxische, sondern auch nicht-genotoxische Kanzerogene erfasst. In der Regel werden für die Langzeitkanzerogenitätsstudien Nager als Modellspezies genutzt. Die Testdauer umfasst gewöhnlich zwei Jahre und somit fast die gesamte Lebenszeit des Nagers. Es sollten sowohl männliche als auch weibliche Tiere eingesetzt werden. Die Gruppenstärken sollten pro Geschlecht mindestens 50 Tiere pro Gruppe betragen, um eine valide statistische Auswertung zu ermöglichen [1]. Eine typische 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie an Nagern benötigt etwa 800 Tiere und kostet zwischen 1,5 und 3 Millionen Euro [90]. Neben der Verwendung von Nagern, können unter bestimmten Umständen, wenn z. B. der Metabolismus in den Nagerspezies nachgewiesenermaßen nicht relevant für den Menschen ist, auch andere Nicht-Nagerspezies zur Kanzerogenitätstestung verwendet werden [91].
  • Folgende Ziele stehen hinter der Kanzerogenitätstestung im Versuchstier [1, 91]:
    • 1. Erhöhte Inzidenz von (spontan) auftretenden Tumoren im Vergleich zur Kontrolle bzw. erhöhte Tumoranzahl pro Tier und Testkollektiv im Vergleich zu den Kontrollgruppen
    • 2. Testung ob die Zeit des Auftretens von Spontantumoren im Vergleich zur Kontrolle verkürzt ist
    • 3. Identifizierung von Zielorganen der Tumorbildung
    • 4. Charakterisierung der Beziehung zwischen Tumorbildung und Substanzdosis
    • 5. Ermittlung des NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) oder einer Referenzdosis
    • 6. Extrapolation zu niedrigen humanrelevanten Expositionen
    • 7. Aufdecken von Hinweisen zur vermuteten Wirkungsweise der Substanz
  • Die untersuchten Endpunkte der Kanzerogenitätsstudien umfassen neben der abschließenden histopathologischen Untersuchung auch Parameter wie Körpergewicht, Futteraufnahme, klinische und hämatologische Analysen [91].
  • 1.3.3 Genotoxizitäts- und Kanzerogenitätsdaten der Testsubstanzen
  • Die Ergebnisse aus den Standardtestungen für die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Modellsubstanzen sind in Tabelle 1.2 zusammengestellt. Tabelle 1.2: Genotoxizitäts- und Kanzerogenitätsdaten von ausgewählten Modellssubstanzen. IARC Gruppierungen: Gruppe 1 – humane Kanzerogene, Gruppe 2A – wahrscheinlich kanzerogen für den Menschen, Gruppe 2B – möglicherweise kanzerogen für den Menschen, Gruppe 3 – nicht als humanes Kanzerogen klassifizierbar, Gruppe 4 – möglicherweise nicht kanzerogen im Menschen. Legende: AFB1 = Aflatoxin B1, DMBA = 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen, DEN = Diethylnitrosamin, CPA = Cyclophosphamid, ACT = Actinomycin D, ETO = Etoposid, MMS = Methylmethansulfonat, MA = metabolische Aktivierung.
    CAS Nummer MA Genotoxizität in vitro Genotoxizität in vivo Kanzerogenität
    AFB1 1162-65-8 + (+) Ames [92]; (+) MN [93]; (+) CA [94] (+) MN [95], (+) CA [96] IARC Gruppe 1 Kanzerogen [92, 97]
    DMB A 57-97-6 + (+) Ames [98]; (+) MLA [99]; (+) MN [100]; (+) CA [94] (+) MN [101] Nicht IARC klassifiziert, kanzerogen in Ratten und Mäusen [92, 102]
    DEN 55-18-5 + (+) Ames [103–105], (+) MLA [106], (+) MNT [93], (+) MN [107], (+) CA [108] Wahrscheinlich kanzerogen für den Menschen, IARC, Gruppe 2A [97]
    CPA 50-18-0 + (+) Ames [98]; (+) MLA [99]; (+) MN [100, 109]; (+) CA [94] (+) CA [110]; (+) MN [111] IARC Gruppe 1 Kanzerogen [97]
    ACT 50-76-0 – (+/–) Ames [112, 113]; (+) MLA [99]; (+) MN [114]; (+) CA [94] (+) MN [112] Nicht als humanes Kanzerogen klassifizierbar, IARC Gruppe 3 [92, 97]
    ETO 33419-42-0 – (–) Ames [115]; (+) MLA [116]; (+) MN [114]; (+) CA [117] (+) MN [118]; (+) CA [118] IARC Gruppe 1 Kanzerogen [97]
    MMS 66-27-3 – (+) Ames [98]; (+) MLA 1991; (+) MN [100]; (+) CA [94] (+) MN [119] Wahrscheinlich kanzerogen für den Menschen, IARC, Gruppe 2A [92, 97]
  • 1.3.4 Risikobewertung von kanzerogenen Substanzen
  • Die Klassifizierung und Risikobewertung von kanzerogenen Substanzen, insbesondere gentoxischen Verbindungen, wird bis heute weltweit kontrovers diskutiert [120]. Die konservative Annahme war für lange Zeit, dass es für gentoxische Kanzerogene keine Schwellenwerte (Thresholds) gibt [62]. Ein nicht vorhandener Schwellenwert in Dosis-Wirkungsbeziehungen bedeutet, dass eine lineare Extrapolation des Risikos auf die Nulldosis angesetzt werden muss [62]. Die Problematik des „kein-Schwellenwert”-Prinzips ist eine Konsequenz der Teststrategie für Kanzerogene mit Hilfe von Langzeitversuchen an Nagern [1]. Durch die begrenzte Anzahl an Versuchstieren kann nur ein geringer Dosisbereich abgedeckt werden. Dieser wird zur Kompensation der geringen Tierzahl (50–60 Tiere pro Gruppe) um einige Größenordnungen höher gewählt, als der tatsächlich relevante Bereich für die Exposition des Menschen liegt. Die Folgen dieses Versuchdesigns sind, dass die Tierversuche im Niedrigdosisbereich keine für die Bewertung des Risikos relevanten Daten liefern und der Niedrigdosisbereich somit extrapoliert werden muss ( ) [1]. Selbst unter Erweiterung des Dosisbereichs auf niedrige Dosierungen bleibt das statistische Problem der niedrigen Tierzahl bestehen. Die Problematik zeigt eine bekannte Dosis-Wirkungsstudie von Peto et al. mit 4080 Wistarratten, welche mit DEN in 15 verschiedenen Dosierungen behandelt worden [121]. In den vier niedrigsten Dosisgruppen konnte keine Tumorbildung beobachtet werden [121]. Dennoch schließt dieses Ergebnis die Unsicherheit, dass niedrige Dosierungen kanzerogen wirken, nicht aus. Bei 60 Tieren pro Gruppe ist es schwierig unter 0,5% an Tieren mit Tumoren zu detektieren, da 60 × 0,5%/100% = 0,3 Tiere ergibt [120]. Das Ergebnis entspricht demzufolge dem Ergebnis von keinen beobachteten Tumoren. Um eine ausreichende statistische Prüfung vorzunehmen, müsste man die Anzahl der Tiere pro Gruppe 10- bis 100-fach höher wählen [120]. Dieses Detektionsproblem lässt somit keine genaue Aussage zum Verlauf der Dosis-Wirkungskurve zu. Würde man die experimentellen Daten einfach extrapolieren, würde ein Schwellenwert existieren (Kurvenverlauf Schwellenwert ). Verläuft die Kurve in Wirklichkeit nach den anderen drei Beispielverläufen (supralinear, linear, sublinear), würde jedoch kein Schwellenwert existieren ( ).
  • In der Schwellenwertdiskussion gibt es außerdem berechtigte Argumentationen, dass Prozesse, wie metabolische (In-)aktivierung, DNA-Reparatur, Zellzykluskontrolle, Apoptose oder die Immunsystem-vermittelte Kontrolle für die Existenz von Schwellenwerten sprechen [62]. Solche Mechanismen könnten im Niedrigdosisbereich ausreichend sein, um die Tumorbildung zu unterbinden. Allerdings kann nicht davon ausgegangen werden, dass solche Mechanismen 100% protektiv wirken. Deshalb führte man den Begriff praktischer Schwellenwert ein und grenzt ihn vom perfekten Schwellenwert ab. Eine solche Argumentation erfordert allerdings eine mechanistische Untersuchung von Substanzen. Außerdem müssen Unterschiede zwischen verschiedenen gentoxischen Substanzen mit betrachtet werden. So können bei der Expression von Enzymvarianten für die DNA-Reparatur oder den Metabolismus von Substanzen Speziesunterschiede eine große Rolle spielen. Beispielsweise würde das Fehlen eines bestimmten CYP-Isoenzyms beim Nager dazu führen, das ein humanes Kanzerogen nicht erkannt wird oder im umgekehrten Fall das Risiko überwertet wird [62].
  • Die Notwendigkeit der Fallbetrachtung und Unterklassifizierung der genotoxischen Kanzerogene ist mittlerweile in Fachkreisen akzeptiert. In verschieden Kongressen, wie dem Salzburger Symposium im Jahr 1998 der ECETOC/EEMS Gesellschaften, der Eurotox im Jahr 2002 in Budapest und des IC-TST Kongresses in Antalya im Jahr 2003, wurde über die praktische Umsetzung einer solchen fallbasierten Risikoabschätzung debattiert. Im Jahr 2004 stellte dann die Europäische Akademie zur Erforschung von Folgen wissenschaftlichtechnischer Entwicklungen (Bad Neuenahr-Ahrweiler) einen neuen Ansatz zur Bewertung und Klassifizierung von Kanzerogenen vor ( ) [120, 122].
  • Streffer et al. schlugen die Unterscheidung von vier verschiedenen Kategorien bei der Risikobewertung vor [122]. Das gesamte Konzept basiert zunächst auf einer Unterscheidung von genotoxischen und nicht-genotoxischen Kanzerogenen [120]. Gentoxische Kanzerogene werden zudem weiter unterteilt in DNA-reaktive, mutagene Substanzen und Substanzen, welche nur auf chromosomaler Ebene genotoxisch wirken. Letztere werden gemeinsam mit den nicht-genotoxischen Kanzerogenen in die Gruppe D eingeordnet. Substanzen der Gruppe D haben einen so genannten perfekten Schwellenwert und werden in der Risikobewertung nach dem NOAEL-Prinzip behandelt. Das NOAEL-Prinzip bedeutet, dass eine Konzentration, bei der kein adverser Effekt beobachtet werden konnte, aus Dosis-Wirkungsstudien ermittelt wird. Unter Einbeziehung von Unsicherheitsfaktoren (Division des NOAEL durch den Unsicherheitsfaktor) wird dann eine sichere Expositionsdosis für den Menschen abgeleitet [120].
  • DNA-reaktive, mutagene Verbindungen werden für die Bewertung erneut unterteilt in eindeutig DNA-reaktive und initiierende Substanzen (Gruppe A), Grenzfälle (Gruppe B) und schwach genotoxische Substanzen mit sekundären Mechanismen (Gruppe C) [120]. Gruppe A sind typische genotoxische Kanzerogene, welche keinen Schwellenwert besitzen. Für die Risikobewertung im Niedrigdosisbereich wird hier das LNT(Linear-no-threshold)-Prinzip angewendet. Es wird also von einer linearen Extrapolation der Dosis-Wirkungskurve, welche keinen Schwellenwert liefert, ausgegangen. Die behördliche Regulation erfolgt nach dem ALARA-Prinzip. ALARA bedeutet as low as reasonably achievable, das heißt die Exposition sollte so gering wie möglich im Rahmen von technischen Möglichkeiten und soziopolitischen Betrachtungen sein. Die Gruppe B wird aufgrund des Fehlens fundierter Daten zur Unterstützung der Existenz eines Schwellenwertes, wie die Gruppe A, nach dem LNT/ALARA-Prinzip eingestuft und reguliert. Hingegen gibt es für genotoxische Substanzen der Gruppe C genügend Hinweise für die Existenz eines praktischen Schwellenwertes durch mechanistische und/oder toxikokinetische Untersuchungen. Deshalb werden diese Substanzen, wie auch Substanzen der Gruppe D, in der Risikobewertung nach dem NOAEL-basierten System behandelt [120].
  • Beispiele für die einzelnen Gruppen zeigt Tabelle 1.3. ETO kann aufgrund seiner ausschließlich auf chromosomalem Niveau genotoxischen Wirkung der Gruppe D zugeordnet werden [120]. Hingegen ist AFB1 ein typisches Kanzerogen der Gruppe A mit einem linearen Verlauf der Dosis-Wirkungskurven im Niedrigdosisbereich. DEN wurde aufgrund von verschiedenen tierexperimentellen Daten ebenfalls der Gruppe A zugeordnet. Allerdings zeigte DEN in Abhängigkeit vom Administrationsschema unterschiedliche Verläufe der Dosis-Wirkungskurve. Generell wurde eine lineare Beziehung für die kontinuierliche lebenslange Exposition und eine nicht-lineare Beziehung mit praktischem Schwellenwert bei 1 mmol DEN/kg bei wöchentlicher und somit unterbrochener Behandlung anhand vorhandener Daten im Niedrigdosisbereich von DEN postuliert. Während die linearen Daten in Lebenszeitstudien gut mit der DNA-Adduktformation korrelieren, spielen wahrscheinlich zytotoxische und proliferative Prozesse bei unterbrochener Kurzzeitexposition für die Bildung von Lebertumoren eine Rolle. Trotz der Annahme, dass die unterbrochene Exposition beim Menschen eher relevant ist, wurde DEN aufgrund verbleibender Unsicherheiten und der proliferationsfördernden Wirkung in die Gruppe A eingeordnet [62, 120]. Tabelle 1.3: Beispielsubstanzen für die vier verschiedenen Risikogruppen von Kanzerogenen. [Tabelle modifiziert nach 120]
    Gruppe A Gruppe B Gruppe C Gruppe D
    Ionisierende Strahlung Acrylnitril Formaldehyd Tumorpromotoren (TCDD)
    Vinylchlorid Acrylamid Vinylacetat Spindelgifte (Paclitaxel)
    4-Aminobiphenyl Arsen Topoisomerase II-Toxine (Etoposid)
    Diethylnitrosamin Hormone
    Acetaminofluoren
    Aflatoxin B1
    NNK
  • 1.3.5 Toxicogenomics als neue Methode zur Identifizierung von genotoxischen und kanzerogenen Verbindungen
  • Das neue Konzept der Risikobewertung von Kanzerogenen basiert auf der mechanistischen Einstufung von genotoxischen Substanzen. Eine solche mechanistische Bewertung ist zudem bedeutend, da die bisherige Standardbatterie für gentoxische Verbindungen sich durch eine hohe Sensitivität, insbesondere für die Tests mit Säugerzellen, aber geringe Spezifität auszeichnet [123, 124]. Die Analysen von Kirkland et al. zeigten, dass 75–95% unter den getesteten nicht-kanzerogenen Substanzen in mindestens einem von drei der Standardtests (Ames, Maus-Lymphoma, Mikrokerntest oder Chromosomenabberration in vitro) ein positives Resultat anzeigten [123, 124]. Außerdem zeigten Erhebungen von Snyder und Green, dass 50% der nicht-kannerogenen pharmazeutischen Substanzen mindestens ein positives Resultat in der Standardtestbatterie für Gentoxizität aufwiesen [125]. Des Weiteren ergab sich aus der Analyse von Datenbanken, dass 50% der Verbindungen in Kanzerogenitätsstudien in mindestens einer Spezies oder einem Geschlecht positiv sind [126]. Diese hohe Inzidenz und andere Untersuchungen werfen Zweifel an der Relevanz dieser Ergebnisse für den Menschen auf [127]. Mechanismusbasierte Tests könnten künftig bei der Identifizierung von falsch-positiven Resultaten der Standardtestbatterie oder zur Erklärung von Befunden innerhalb der Kanzerogenitätsstudien behilflich sein. Allerdings sind mechanistische Daten aus klassischen Toxizitätsstudien und der Standardtestbatterie für gentoxische Substanzen nur begrenzt oder überhaupt nicht erfassbar. Deshalb sind für die mechanistische Untersuchung neue Technologien gefragt, welche die erforderlichen Daten für die „moderne Risikobetrachtung” liefern können. Bereits im Jahr 2002 konnten Hamadeh und Mitarbeiter zeigen, dass die Genexpressionsprofile in Rattenleberproben charakteristisch für die jeweilige Chemikalienklasse, mit der die Ratten behandelt worden, sind [128]. Sie konnten dabei die Profile von verschiedenen Peroxisomenproliferatoren von denen mit enzyminduzierenden Eigenschaften abgrenzen [128]. Ellinger-Ziegelbauer et al. zeigten später, dass die genotoxischen Hepatokanzerogene Dimethylnitrosamin, 2-Nitrofluoren, AFB1 und NNK in Ratten, die über 14 Tage behandelt worden, übereinstimmende Signaturen bezüglich der Regulation von Genen der DNA-Schadensantwort, Detoxifikation und Zellproliferation besitzen [129]. Außerdem konnten histopathologische Besonderheiten in Form von Nekrosen und Entzündung für Dimethylnitrosamin und AFB1 auch auf Genexpressionsebene nachgewiesen werden [129]. In darauffolgenden Studien identifizierten Ellinger-Ziegelbauer et al. charakteristische Unterschiede zu nicht-genotoxischen Kanzerogenen [130] und stellten anhand einer Vielzahl von genotoxischen und nicht-genotoxischen Hepatokanzerogenen sowie Nicht-Hepatokanzerogenen ein Klassifikationsmodell auf [131]. Für das Klassifikationsmodell wurden verschiedene Ranking-Algorithmen (SVM, ANOVA, Recursive feature Elimination) miteinander verglichen und unbekannte Substanzen konnten mit einer Genauigkeit von 75–88% richtig klassifiziert werden. Diese Analysen zeigten, dass es möglich ist das kanzerogene Potential von Substanzen mittels Toxicogenomics bereits mit einer Kurzzeit-in vivo-Studie an Nagern vorherzusagen [131]. Die Arbeiten von Ellinger-Ziegelbauer et al. werden durch die Resultate anderer Arbeiten gestützt. Nakayama et al. und Iida et al. wiesen nach, dass man nach Behandlung von Nagern mit verschiedenen Kanzerogenen und Nicht-Kanzerogenen schon nach 2–4 Wochen repräsentative Genexpressionsveränderungen erhält [132, 133].
  • Neben der Omics-basierten Prädiktion in vivo gibt es auch schon einige Publikationen mit permanenten Zelllinien. Harris et al. zeigten, dass von 31.000 untersuchten Genen 2974 Gene in HepG2 basal exprimiert waren [134]. Von diesen Genen waren 29% in primären humanen Hepatozyten (serumfreie Kollagen-Monolayerkulturen) von allen drei getesteten Donoren basal exprimiert, 40% zeigten eine teilweise Übereinstimmung zwischen beiden Zellsystemen und 31% waren charakteristisch für die HepG2-Zelllinie [134]. Die relativ hohe Übereinstimmung zwischen primären Hepatozyten und HepG2 sprechen grundsätzlich für die Verwendung im mechanistischen Screening. Hingegen spiegelt der Anteil spezifisch exprimierter Gene wahrscheinlich den transformierten Phänotyp der Zelllinie wider und ist in der Leber (in vivo) vermutlich nicht exprimiert [134]. Neben den Unterschieden zur in vivo-Situation aufgrund des transformierten Phänotyps der Zelllinien, müssen auch Diskrepanzen zwischen den Hepatozytenkulturen im Vergleich zur gesamten Leber immer berücksichtigt und in die Interpretation der Daten kritisch mit einbezogen werden [135]. Obwohl primäre Hepatozytenkulturen als derzeitiger „Gold-Standard” hepatischer in vitro-Systeme gelten, unterscheiden sich die Morphologie sowie Gen- und Proteinexpressionsmuster in Abhängigkeit von der Kultivierung zum Teil beträchtlich von der Situation in vivo [134, 136, 137].
  • In einer anderen in vitro-Studie von Ellinger-Ziegelbauer et al. wurde die Eignung von Genexpressionsanalysen in TK6-Zellen zur Identifizierung DNA-reaktiver Verbindungen evaluiert [138]. Die verwendeten 47 Gene wurden anhand bereits publizierter Daten zusammengestellt und ihre Expression 20 h nach einer 4-stündigen Behandlung in neun verschiedenen Laboratorien untersucht. Die gewonnenen Daten waren zwischen den verschiedenen Laboratorien vergleichbar und ließen eine Unterscheidung DNA-schädigender Verbindungen von Spindelgiften und Substanzen, die aufgrund von Zytotoxizität zu Chromosomenbrüchen führen, zu [138]. Im Jahr 2006 wurde dann ein großes Projekt, das carcinoGENOMICS Projekt, zur Entwicklung von Alternativen in vitro für Nagerkanzerogenitätstest ins Leben gerufen [90]. An diesem 5-jährigen Projekt sind 20 verschiedene Gruppen aus verschiedenen Forschungseinrichtungen von Universitäten, der Industrie bis hin zu regulatorischen Institutionen beteiligt [90].
  • Diese Vielzahl an Studien in vivo und in vitro zeigt den Trend zur Nutzung von Toxicogenomics auf. Die Methode stellt ein zukunftsträchtiges Instrument in der Testung von gentoxischen/kanzerogenen Substanzen auf Basis des zugrunde liegenden Wirkmechanismus dar.
  • 1.4 Zielstellung der Arbeit
  • Mit Hilfe von toxikogenomischen Untersuchungen sollten in dieser Arbeit neue Ansätze für die Identifizierung und Charakterisierung von genotoxischen Substanzen entwickelt werden. Ziel des ersten Teils der Arbeit war es, in vitro Genexpressionsprofile genotoxischer Modellsubstanzen mit einem direkten DNA-schädigenden Wirkungsmechanismus (ACT, ETO und MMS) zu erstellen. Als zelluläres Modellsystem wurde dazu die Hepatomzelllinie HepG2 gewählt. Anhand der globalen Genexpressionsveränderungen sollten potentielle Übereinstimmungen in der Regulation bestimmter Gene, welche charakteristisch für den Wirkmechanismus dieser Modellsubstanzen sind, aufgedeckt werden. Solche repräsentativen Genregulationen, „Markergene”, könnten künftig zur Identifizierung von genotoxischen Verbindungen herangezogen werden.
  • Da der überwiegende Teil genotoxischer Substanzen jedoch keinen direkten DNA-schädigenden Mechanismus besitzt, sondern erst nach metabolischer Aktivierung eine solche Wirkung entfaltet, sollte das System auf diese progenotoxischen Verbindungen erweitert werden. Deshalb war der nächste Fokus der Arbeit die Etablierung eines kombinierten Systems aus HepG2 und einem metabolischen Aktivierungssystem. Nach der Etablierung des Systems und funktioneller Prüfung mit den Modellsubstanzen CPA, DMBA, AFB1 und DEN wurden erneut Genexpressionsstudien durchgeführt. Die gefundenen Genexpressionsprofile galt es anschließend mit den für die genotoxischen Substanzen gewonnenen Profilen abzugleichen und prädiktive Gene für die beiden Substanzklassen zu evaluieren.
  • 2 Material und Methoden
  • 2.1 Verwendete Materialien
  • 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien
  • Tabelle 2.1: Reagenzien für molekularbiologische Arbeiten
    Name Hersteller Firmensitz
    Biotin-16-UTP, 10 mM PerkinElmer Life and Analytical Sciences Waltham, USA
    Cy3-Streptavidin Amersham Biosciences/GE Healthcare Buckinghamshire, England
    DEPC Wasser Ambion/Applied Biosystems Austin, USA
    E1BC Puffer Illumina Inc. San Diego, USA
    Ethanol Lichrosolv® Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    High Temperature Wash buffer Illumina Inc. San Diego, USA
    HybE1 Puffer Illumina Inc. San Diego, USA
    β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Nuklease freies Wasser Ambion Austin, USA
    Propanol Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    Tabelle 2.2: Substanzen und Lösungsmittel für Genotoxizitätsexperimente
    Name Hersteller Firmensitz
    Actinomycin D Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Aflatoxin B1 Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Cyclophosphamid Monohydrat Calbiochem/Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    7,12-Dimethylbenz[a]antracen (DMBA) Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Dimethylnitrosamin Supelco/Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Dimethylsulfoxid Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Etoposid Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Ketokonazol Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    3-Methylcholanthren Fluka/Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Metformin (1,1-Dimethylbiguanid) Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Methylmethansulfonatester (MMS) Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    α-Naphthoflavon Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Phenobarbital Natriumsalz Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Rifampicin Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Theophyllin Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Tabelle 2.3: Zellkultivierungsreagenzien und Reagenzien für die metabolische Aktivierung
    Name Hersteller Firmensitz
    CASY®Ton Schärfe System GmbH Reutlingen Deutschland
    di-Natriumhydrogenphosphat-Heptahydrat Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    DMEM F12 (1:1), mit Glutamin, 15 mM Hepes, Glucose und Phenolrot Gibco/Invitrogen Karlsruhe, Deutschland
    Fötales Kälberserum (FCS) Hyclone/Perbio Logan, USA
    Gentamicin 50 mg/ml Gibco/Invitrogen Karlsruhe, Deutschland
    Kaliumchlorid Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    Magnesiumchlorid Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    Mikrosomen (Isoniazid induziert) Lot 0510064 Tebu-bio Offenbach, Deutschland
    Mikrosomen (β-Naphtoflavon, Phenobarbital induziert) Lot 0310131 Tebu-bio Offenbach, Deutschland
    β-Nicotinamidadenindi-nucleotid-2'-phosphat tetranatriumsalzhydrat, reduzierte Form (NADPH) Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    Natrium-Pyruvat 100 mM Gibco/Invitrogen Karlsruhe, Deutschland
    PBS Dulbeccos w/o Ca, Mg Gibco/Invitrogen Karlsruhe, Deutschland
    Penicillin(10 kU/ml)-Streptomycin (10 mg/ml) Lösung Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    S9 (induziert mit β-Naphtoflavon/Phenobarbital) Lot 0310129 Tebu-bio Offenbach, Deutschland
    Trypsin/EDTA-Lösung Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Tabelle 2.4: Kits und Reagenzien für biochemische Tests
    Name Hersteller Firmensitz
    Agencourt® RNACleanTM Agencourt/Beckman Coulter Beverly, USA
    CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Promega Madison USA
    Coomassie Brilliant Blue G250 Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    Ethanol Lichrosolv® Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    7-Ethoxy-3H-phenoxazin-3-on (Resorufinethylether) Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-on (Resorufin) Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    MessageAmpTM II aRNA Amplification Kit Ambion/Applied Biosystems Austin, USA
    RNeasy Mini Kit Qiagen Hilden, Deutschland
    RNase-free DNase Set Qiagen Hilden, Deutschland
    RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies Waldbronn, Deutschland
    RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies Waldbronn, Deutschland
    Nuclear Extract Kit Active Motif Rixensart, Belgien
    Phosphorsäure (85%) Merck KGaA Darmstadt, Deutschland
    qPCR Mastermix Plus Eurogentec Seraing, Belgien
    Salicylamid Sigma Aldrich Steinheim, Deutschland
    Schreddersäulchen, QIAshredder Qiagen Hilden, Deutschland
    TaqMan® Low Density Array, Custom panels Applied Biosystems Darmstadt, Deutschland
    TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG Applied Biosystems Darmstadt, Deutschland
    TransAMTM p53 Transcription Factor Assay Kit Active Motif Rixensart, Belgien
    Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit Roche Applied Science Mannheim, Deutschland
  • 2.1.2 Zelllinien
  • Die verwendete humane Hepatomzelllinie HepG2 (ATCC Bestellnummer: HB-8065, Lot. 3129867) wurde von ATCC (Manassas, USA) bezogen [139].
  • 2.1.3 Gebrauchsmaterialien
  • Tabelle 2.5: Gebrauchsmaterialien
    Name Hersteller Firmensitz
    Kombitips plus, 2, 2,5, 5, 10 ml Eppendorf Eppendorf Hamburg, Deutschland
    PCR Reaktionsgefäße 0,2 ml Eppendorf Hamburg, Deutschland
    Pipetten, serologisch, 2, 5, 10, 25, 50 ml Nunc (Thermo Fisher Scientific) Langenselbold, Deutschland
    Pipettenspitzen, unsteril, 200–300 μl Brand Wertheim, Deutschland
    Pipettenspitzen, RNase-frei, steril, 10REACH, 20P, 100E, 200, 1000E MolecularBioProducts San Diego, USA
    Reaktionsgefäße, Safe-Lock Tubes, RNase-frei, 1,5 ml und 2 ml Eppendorf Hamburg, Deutschland
    Reaktionsröhrchen, Cellstar, Plastik, 15 ml Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland
    Reaktionsröhrchen, Falcon tubes, Plastik, 50 ml (steril) BD Biosciences Franklin Lakes, USA
    Rundbodenplatten 96-Well Bilatec AG Viemheim, Deutschland
    Thermosprint® PCR-Platten, 96-Well Bilatec AG Viemheim, Deutschland
    6-Well Platte, MultiwellTM 6-Well, steril Becton Dickinson Labware Franklin Lakes, USA
    24-Well Platte, Cellstar, steril Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland
    96-Well Platten, steril, schwarz mit transparenten Boden Becton Dickinson Labware Franklin Lakes, USA
    96-Well Platte, transparent, steril Becton Dickinson Labware Franklin Lakes, USA
    96-Well Platte, transparent, ELISA Microplates Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland
    96-Well Platte, steril, weiß mit transparentem Boden Becton Dickinson Labware Franklin Lakes, USA
    96-Well Platte, weiß, für luminometrische Tests Nunc (Thermo Fisher Scientific) Langenselbold, Deutschland
    Zellkulturflaschen, Cellstar, T75 Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland
    Zellkulturflaschen, Cellstar, T175 Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland
    Zellschaber, steril Corning Inc. New York, USA
  • 2.2 Geräte
  • Tabelle 2.6: Geräte
    Name Hersteller Firmensitz
    AbiPrism 7900 HT Sequence Detection System Applied Biosciences Darmstadt, Deutschland
    Agilent Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies Waldbronn, Deutschland
    Agilent Bioanalyzer Priming Station Agilent Technologies Waldbronn, Deutschland
    BeadChip® Hyb Cartridge (Hybridisierungskammer) Illumina Inc. San Diego, USA
    Brutschränke Hera cell Heraeus GmbH Hanau, Deutschland
    CASY TTC Zellzählsystem Schärfe System GmbH Reutlingen Deutschland
    Chemiluminometer Lumistar Galaxy BMG Lab Technologies Offenburg, Deutschland
    Edelstahlkugeln Qiagen Hilden, Deutschland
    Hybridisierungsofen Illumina Inc. San Diego, USA
    Illumina BeadArray Reader Illumina Inc. San Diego, USA
    Illumina Sentrix® HumanRef-8 V2 BeadChip Arrays Illumina Inc. San Diego, USA
    HybexTM Microarray Incubation System SciGene Sunnyvale, USA
    Mikroplattenspektrophotometer MWG Discovery HT-R AVIS Jena, Deutschland
    Mikrobiologische Sicherheitswerkbänke Herasafe Heraeus GmbH Hanau, Deutschland
    Mikroskop Axiovert 25 Zeiss Jena, Deutschland
    Mikrozentrifuge 5415R Eppendorf Hamburg, Deutschland
    Multifuge® 3S-R Heraeus (Thermo Fisher Scientific) Langenselbold, Deutschland
    Mehrkanalpipetten 10–300 μl Eppendorf Hamburg, Deutschland
    NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies Wilmington, USA
    Pipetten 2-10001 Eppendorf Hamburg, Deutschland
    Pipetten 2–1000 μl Gilson Middleton, USA
    Pipettierhilfe Pipetus-akku Hirschmann Laborgeräte Eberstadt, Deutschland
    pH-Meter 766 Calimatic Knick GmbH & Co. KG Berlin, Deutschland
    QIAcube Qiagen Hilden, Deutschland
    Reinstwasseraufbereitungsgerät Pure Lab Plus ELGA Celle, Deutschland
    Schüttler Titramax® 101 Heidolph Instruments Schwabach, Deutschland
    Schüttler Phero-shaker BIOTEC-FISCHER GmbH Reiskirchen, Deutschland
    Spektralphotometer Polarion Tecan Deutschland GmbH Crailsheim, Deutschland
    Sterilbank Herasafe Thermo Fisher Scientific (Heraeus) Waltham, USA
    Theonyx Liquid Performer AVIS Jena, Deutschland
    Thermomixer comfort Eppendorf Hamburg, Deutschland
    Thermocycler, Mastercycler gradient Eppendorf Hamburg, Deutschland
    Thermocycler, Primus 96 advanced PEQLab GmbH Erlangen, Deutschland
    Tissue Lyzer Qiagen Hilden, Deutschland
    Vacuubrand Absaugpumpe BVC 01 Vacuubrand GmbH & CoKG Wertheim, Deutschland
    Vakuumkonzentrator (Concentrator 5301) Eppendorf Hamburg, Deutschland
    Versiegelungsgerät (TLDA) Applied Biosciences Darmstadt, Deutschland
    Vortexer für Agilent-Chips IKA® Werke GmbH Staufen, Deutschland
    Vortexer Vortex Genie 2 Scientific Industries Bohemia, USA
    Waage Navigator Ohaus Giessen, Deutschland
    Waage Sartorius BP211D Sartorius Göttingen, Deutschland
    Wasserbad Julabo SW22 Julabo GmbH Seelbach, Deutschland
  • 2.3 Software
  • Tabelle 2.7: Software zur Datenanalyse
    Name Hersteller Firmensitz
    ABI PRISM® SDS 2.1 Applied Biosystems Darmstadt, Deutschland
    BeadScan Illumina Inc. San Diego, USA
    BeadStudio 3.2 Illumina Inc. San Diego, USA
    ChemDraw® Ultra 8.0 Cambridge Soft Corporation Cambridge, USA
    2100 Expert software Agilent Technologies Waldbronn, Deutschland
    Expressionist® Analyst Pro Version 5.3.2 Genedata AG Basel, Schweiz
    GeneGo's MetaCoreTM Version 5.3 GeneGo St.Joseph, USA
    OriginLab Version 7.0 OriginLab Northampton, USA
    ToxWiz Version 2.3 Cambridge Cell Networks Cambridge, UK
  • 2.4 Zellbiologische Methoden
  • 2.4.1 HepG2 Zellkultivierung
  • Für die Untersuchungen wurde als in vitro-System die humane Hepatomzelllinie HepG2 verwendet. Die HepG2-Zellen wurden erstmals im Jahr 1979 aus einem primären Hepatoblastom eines 11-jährigen argentinischen Jungen isoliert. Im Gegensatz zu Primärhepatozyten behalten die HepG2 in Kultur ihre Teilungsaktivität bei. Mit HepG2-Zellen konnten bereits für verschiedene Substanzklassen, z. B. für PAKs sowie aromatische und heterozyklische Amine positive Resultate in Genotoxizitätstests (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase(HGPRT)-Test, Schwesterchromatidenaustausch, Mikronukleustest), verzeichnet werden [140].
  • Die Kultivierung der adhärenten HepG2-Zellen erfolgte routinemäßig in DMEM-F12 Medium mit L-Glutamin und 15 mM Hepes versetzt mit 10% (v/v) FCS, 1% (v/v) Penicillin (10 kU/ml)-Streptomycinlösung (10 mg/ml), 0,1% (v/v) Gentamicin (50 mg/ml) und 1 mM Natriumpyruvat bei 37°C und 5% CO2 in Zellkulturflaschen. Nach dem Erreichen einer 80–100%igen Konfluenz des Zellrasens wurden die Zellen passagiert oder für die Experimente ausgesät. Dazu wurden die Zellen einmal mit 10 ml warmen PBS und anschließend für 1 min mit Trypsin-EDTA versetzt. Nach dem Absaugen der Trypsin-EDTA-Lösung wurden die Zellen im Inkubator bei 37°C und 5% CO2 solange weiter inkubiert, bis sie sich von der Flaschenoberfläche lösten. Die Zellen wurden dann abgeklopft, im warmen Medium aufgenommen und in entsprechenden Verdünnungen eine neue Zellkulturflasche oder Aussaatplatten überführt. Das Trypsin-EDTA- und Kulturmediumvolumen richtete sich nach den verwendeten Zellkulturflaschen und Platten (Tab. 2.8). Die optimalen Zellzahlen für die Aussaat wurden anhand der Wachstumsgeschwindigkeiten der entsprechenden ZellCharge festgelegt.
  • Zur Bestimmung der Zellzahl zur Aussaat für die Experimente wurden 20 μl der Zellsuspension in 10 ml Casy®ton resuspendiert und mit dem Casy TTC Zellzählsystem vermessen. Das Casy-Prinzip basiert auf der Messung von Widerständen von Zellen anhand ihrer Membranintegrität. Für die Messung wurden die Zellen in einer speziellen isotonen Elektrolytlösung, dem CASY®ton, suspendiert und mit konstanter Strömungsgeschwindigkeit durch eine Präzisionsmesspore definierter Größe und Form gesaugt. Während der Messung wurde ein Niederspannungsfeld an die Kapillarstrecke angelegt. Intakte Zellen können dabei als Isolatoren betrachtet werden und verdrängen eine definierte Menge der Elektrolytlösung, die einen elektrischen Widerstand darstellt. Die Widerstandsänderung ist ein Maß für das Volumen der Zellen. Tote Zellen, deren Membranintegrität bereits zusammengebrochen ist, werden über die Größe ihres Zellkerns erfasst. Die Auswertung des Messsignals erfolgte anschließend mit einem Pulsflächenanlyseverfahren [141]. Tabelle 2.8: Zellzahl, Kulturmedium- und Trypsinvolumen für die Kultivierung/Aussaat und Behandlung von HepG2-Zellen
    Kulturgefäß Wachstumsfläche Zellzahl Mediumfüllvolumen Aussaat/Behandlung Trypsinvolumen Anwendung
    T75 Flasche 75 cm2 - 10 ml/- 1 ml Routinekultur
    T175 Flasche 175 cm2 - 20 ml/- 2 ml Routinekultur
    96-Well 0,32–0,6 cm2 0,04–0,08 × 106 0.2 ml/0.1 ml - Zellviabilitäts- & enzymatische Tests
    6-Well 9,5 cm2 0,75–3 × 106 2 ml/1 ml - Genexpressionsanalysen, p53-Proteinbestimmung
  • 2.4.2 Substanzbehandlung
  • Die Zellen wurden, wie unter 2.4.1 beschrieben, in den entsprechenden Zellkulturgefäßen für die jeweilige Anwendung ausgebracht und vor Beginn der Behandlung für mindestens 24 h bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.
  • Die Substanzen für die Versuche mit den genotoxischen Verbindungen (Tab. 2.9) wurden in DMSO gelöst und 200-fach verdünnt im Behandlungsmedium eingesetzt, um eine DMSO-Konzentration von 0.5% (v/v) nicht zu überschreiten. DMSO sollte in geringen Konzentrationen eingesetzt werden, da höhere DMSO-Konzentrationen zytotoxische Effekte haben können und der Einfluss auf die Genexpression durch DMSO möglichst gering gehalten werden soll. Die Behandlung der Zellen erfolgte täglich. Die Genexpressionsexperimente wurden dreimal unter Verwendung von verschiedenen Zellpassagen zwischen Passage 3 und 25 wiederholt.
  • Die Behandlung für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität von CYP-Enzymen und die Genexpressionsanalysen zur Charakterisierung der Expression von Genen des Fremdstoffmetabolismus in HepG2-Zellen erfolgte täglich über einen Zeitraum von drei Tagen. Die Substanzen (Induktoren) (Tab. 2.9) wurden für die Experimente in DMSO gelöst und 1000-fach verdünnt im Behandlungsmedium eingesetzt, um eine DMSO-Konzentration von 0.1% (v/v) nicht zu überschreiten. DMSO-Konzentrationen sollten im Allgemeinen ≤ 0.2% (v/v) betragen, da höhere Konzentrationen einen inhibitorischen Einfluss auf CYP-Enzyme haben können. Außerdem sollen lösungsmittelvermittelte Genexpressionsveränderungen möglichst gering gehalten werden. Als Induktoren, werden Stoffe bezeichnet, welche die Expression eines CYP-Enzyms steigern können (siehe Abschnitt 1.2.4.3). Diese Stoffe induzieren meist die Expression der CYP-Enzyme, von denen sie selbst metabolisiert werden. Als Induktoren wurden RIF, 3-MC und PB ausgewählt. RIF induziert effektiv CYP-Enzyme der 2C Familie (CYP2C8, CYP2C19, CYP2C9) sowie CYP3A4. PB induziert ebenfalls die Expression einer Reihe von CYP-Enzymen, wie z. B. CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9 und CYP3A4. 3-MC ist hingegen als Induktor für CYP1A2 geeignet. Die verwendeten Induktoren und die eingesetzten Konzentrationen orientierten sich an den Empfehlungen der Richtlinie für die Industrie im Appendix C-3 In vitro Evaluation of CYP Induction [142]. Zusätzlich wurden Zellviabilitätstests mit verschiedenen Konzentrationen der Induktoren durchgeführt, um einen Einfluss auf die Zellviabilität bei den verwendeten Dosierungen auszuschließen. Jedes Experiment wurde dreimal unter Verwendung von verschiedenen Zellpassagen zwischen Passage 3 und 25 durchgeführt. Tabelle 2.9: Übersicht und Kategorisierung der verwendeten Substanzen
    Genotoxische Verbindungen Progenotoxische Verbindungen Negativsubtanzen CYP-Induktoren CYP-Inhibitoren
    Actinomycin D (ACT) Cyclophosphamid (CPA) Theophyllin (THEO) Rifampicin (RIF) Ketokonazol (KETO)
    Methylmethansulfonat (MMS) 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) Metformin (MET) Phenobarbital (PB) α-Naphthoflavon (α-NF)
    Etoposid (ETO) Diethylnitrosamin (DEN) 3-Methylcholanthren (3-MC)
    Aflatoxin B1 (AFB 1)
  • Die Behandlung der HepG2-Zellen mit den progenotoxischen Verbindungen erforderte die Kokultivierung der Zellen mit einem System zur metabolischen Aktivierung (MAS) der Substanzen. Als MAS wurden S9 oder Mikrosomen eingesetzt. Dazu wurden 0,3 ml pro ml des Behandlungsmediums mit S9- oder Mikrosomenmix ersetzt. Die Zusammensetzung des S9- bzw. Mikrosomenmix ist in Tabelle 2.10 aufgeführt. Der verwendete Phosphatpuffer mit pH 7,4 (0,2 M) wurde durch Mischen von einer 0,4 M Dinatriumhydrogenphosphat-Heptahydratlösung mit einer 0,4 M Natriumdihydrogenphosphat-Monohydratlösung im Verhältnis 1:5 und anschließender Zugabe von sterilem Wasser im Verhältnis 1:2 hergestellt.
  • Die Substanzen für die Versuche wurden in Abhängigkeit von ihrer Löslichkeit entweder in Zellkulturmedium (CPA, DEN) oder DMSO (DMBA, AFB1) gelöst. Die in Kulturmedium gelösten Substanzen wurden 10- bis 100-fach in das Behandlungsmedium verdünnt und 0,2% (v/v) DMSO zugesetzt, um ein einheitliches Behandlungsschema mit den DMSO-gelösten Substanzen zu erreichen. Die in DMSO gelösten Substanzen wurden 500-fach verdünnt eingesetzt, um eine DMSO-Konzentration von 0,2% (v/v) nicht zu überschreiten. Aufgrund der begrenzten Löslichkeit der Substanzen musste auf 0,2% (v/v) statt 0,1% (v/v) DMSO, wie für die Charakterisierung des Fremdstoffmetabolismus eingesetzt wurde, ausgewichen werden. Die Zellen wurden über 6 h mit dem Substanz-MAS-Medium bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Danach wurde das Behandlungsmedium abgesaugt, die Zellen einmal mit Zellkulturmedium gewaschen und frisches Zellkulturmedium ohne Substanz zugegeben. Die Zellen wurden bis zum jeweiligen Test oder der nächsten Behandlung für weitere 18 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Für Behandlungszeitpunkte von mehr als 24 h wurde die vorangehend beschriebene Prozedur mit 6 h Behandlungszeit und 18 h Erholungsphase täglich wiederholt. Tabelle 2.10: Zusammensetzung des S9-Mix und Konzentrationen der Komponenten im Behandlungsmedium
    Reagenz Eingesetzte Menge pro 1 ml Mix Endkonzentration im Behandlungsmedium
    MgCl2 (0,4 M)/KCl-Lösung (1,64 M) 0,02 ml 2,4 mM/9,8 mM
    NADPH (0,1 M in 0,2 M Phosphatpuffer) 0,12 ml 3,6 mM
    Phosphatpuffer (0,2 M, pH 7,4) 0,50 ml 37,2 mM
    steriles Wasser ad 1,00 ml -
    S9 oder Mikrosomen S9: 2500 pmol CYP oder 2,8 mg Protein Mikrosomen: 2000 pmol CYP S9: 900 pmol CYP/ml oder 0,84 mg Protein/ml Mikrosomen: 600 pmol CYP/ml
  • Für die Substanzen DMBA und AFB1 konnte bei höheren Konzentrationen bereits ohne Zugabe des MAS eine P53-Induktion detektiert werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine metabolische Aktivierung durch fremdstoffmetabolisierende Enzyme der HepG2-Zellen hin.
  • Um die Hypothese zu stützen, wurden die HepG2-Zellen mit spezifischen Inhibitoren (Tab. 2.9) zur Reprimierung der CYP-Enzymaktivität behandelt.
  • Die HepG2-Zellen wurden für die Inhibitionsversuche 30 min mit dem entsprechenden Inhibitor vorinkubiert. Als Lösungsmittel für die Substanzen wurde DMSO verwendet. Der Inhibitor wurde 0,1%ig (v/v) im Behandlungsmedium eingesetzt. Danach wurde das Behandlungsmedium abgesaugt und durch ein Behandlungsmedium mit der genotoxischen Substanz (1:1000 verdünnt im Behandlungsmedium) und dem Inhibitor (1:1000) ausgetauscht. Als Kontrolle wurde 0,2% (v/v) DMSO (Lösungsmittelkontrolle) sowie die Inhibitoren allein eingesetzt. Um den DMSO-Gehalt immer konstant bei 0,2% (v/v) zu halten, wurde bei der Vorinkubation und den Kontrollen 0,1% (v/v) DMSO zugesetzt. Die Behandlungszeit mit den genotoxischen Substanzen betrug 6 h. Danach wurde das Medium abgesaugt und einmal mit frischem Medium gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen in Medium mit Inhibitor aber ohne genotoxische Substanz für weitere 18 h inkubiert. Die Behandlungsprozedur wurde am nächsten Tag wiederholt bis die Zellen nach 48 h (beginnend ab dem Zeitpunkt der ersten Behandlung am Tag eins) geerntet wurden.
  • 2.5 Molekularbiologische Methoden
  • 2.5.1 RNA-Isolierung aus permanenten Zelllinien
  • Die Isolierung der Gesamt-RNA aus permanenten Zelllinien wurde mit Hilfe des RNeasy Mini Kits einschließlich eines DNase-Verdau nach den Angaben des Herstellers Qiagen durchgeführt [143]. Zur Gewinnung der Zelllysate wurde das Zellkultur- bzw. Behandlungsmedium nach Ende der Behandlungszeit abgenommen und die Zellen mit 800 μl PBS pro Well (Loch) gewaschen. Anschließend wurden die adhärenten Zellen in 350 μl RLT Lysepuffer (versetzt mit 1% (v/v) β-Mercaptoethanol) mit einem Zellschaber von der Oberfläche abgelöst. Das Lysat wurde zur Homogenisierung auf eine Shreddersäule pipettiert und für 3 min bei maximaler Drehzahl zentrifugiert. Der Durchfluss wurde bis zur weiteren Aufbereitung bei –80°C eingefroren.
  • Für die Isolierung der Gesamt-RNA wurden die tiefgefrorenen Proben aufgetaut und für 15 min bei 37°C im Thermoblock äquilibiert, um ein vollständiges Lösen der im Puffer enthaltenen Salze zu gewährleisten. Anschließend wurden die Lysate für 3 min bei maximaler Drehzahl zentrifugiert und der Überstand des Durchflusses in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Danach wurden die Proben mit 350 μl 70%igem Ethanol versetzt, durch Auf- und Abpipettieren gemischt und auf eine RNA-bindende Säule pipettiert. Nach Zentrifugation bei 10.000 rpm für 30 s wurde der Durchfluss verworfen und die Säule mit 350 μl RW1-Puffer gewaschen. Um verbleibende Reste von genomischer DNA zu entfernen wurden 80 μl eines Gemisches aus 10 μl DNase I und 70 μl RDD-Puffer auf die Säule gegeben und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Säule erst mit 350 μl RW1-Puffer und dann mit 500 μl RPE-Puffer bei 10.000 rpm für 30 s gewaschen. Ein zweiter RPE-Waschschritt unter Zentrifugation bei 10.000 rpm für 2 min wurde zum Trocknen der Silicagel-Membran durchgeführt. Nach einer zusätzlichen Trockungszentrifugation für 1 min bei maximaler Drehzahl mit einem neuen Säulenauffanggefäß wurden die Proben mit 30–50 μl RNase-freiem Wasser eluiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die RNA-Proben bei –80°C gelagert.
  • 2.5.2 Qualitätskontrolle von Nukleinsäuren
  • 2.5.2.1 Konzentrationsbestimmungen mit dem NanoDrop
  • Zur Bestimmung der Konzentration von RNA, cRNA und cDNA wurde das NanoDrop Spektrophotometer verwendet. Für die Messung wurde 1 μl der Probe auf die Probenvorrichtung, welche ein Glasfaserkabel enthält, pipettiert. Durch Schließen des Gerätes gelangt das im Deckel eingesetzte Glasfaserkabel ebenfalls mit der Flüssigkeitsoberfläche in Kontakt, wodurch eine Flüssigkeitsbrücke zwischen beiden Glasfaserkabeln entsteht. Eine Xenon-Blitzlampe erzeugt Licht, dessen Durchtritt durch die Probe von einem Silizium-CCD Chip detektiert wird. Das Resultat ist ein UV-Vis Spektrum im Bereich von 220–750 nm. Zur Berechnung der Konzentration wurde die Absorption bei 260 nm zugrunde gelegt. Eine OD = 1 entspricht dabei 33 μg/ml RNA, 50 μg/ml doppelsträngiger DNA und 40 μg/ml einzelsträngiger DNA. Der Quotient der Absorption bei A260 nm/A280 nm ist ein Qualitätsparameter und gibt Aufschluss über Verunreinigungen mit Proteinen oder aromatischen Verbindungen, wie Phenol, welche bei 280 nm ein Absorptionsmaximum zeigen. Der Quotient sollte für reine RNA ungefähr zwischen 1.8 und 2.0 liegen, kann jedoch in Abhängigkeit von der Nukleotidzusammensetzung und dem pH-Wert der Lösung variieren [144].
  • 2.5.2.2 Qualitätskontrolle mit dem Agilent Bioanalyzer
  • Zur Kontrolle der Qualität der RNA und cRNA sowie zur Bestimmung der Konzentration von cDNA wurde die Lab-on-a-Chip-Technologie von Agilent Technologies verwendet. Mit dem Agilent Bioanalyzer können mit Hilfe spezieller Chip-Systeme Nukleinsäuren elektrophoretisch vermessen werden. Agilent Technologies bietet daneben auch Chips für die Proteinanalyse sowie durchflusszytometrische Tests mit Zellen an. Das Messprinzip ( ) basiert auf der Mikrofluidik-Technik, das heißt der Steuerung winziger Flüssigkeitsmengen in miniaturisierten Systemen. Das Innere eines Chips besteht aus Systemen winziger geschlossener Kanäle und Wells, die in einen Glas- oder Kunststoff-Mikrochip geätzt sind. Durch Druck oder elektrokinetische Kräfte strömen die Proben kontrolliert durch die vorgegebenen Kanäle. Im Separationskanal werden die Probenbestandteile dann für die nachfolgende Detektion aufgetrennt. Die Detektion erfolgt mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes, welcher gemeinsam mit der Gelmatrix in die Kanäle appliziert wurde [145].
  • Die gemessenen Fluoreszenzsignale wurden anschließend mit der 2100 Expert Software in ein Elektropherogramm und gelähnliches Bild transformiert. Zudem wurden Qualitätsparameter und die Konzentrationen der Proben mit dieser Software berechnet. Die Konzentrationen werden mit Hilfe der Fläche unter dem Elektropherogramm der Probe im Vergleich zur Fläche der entsprechenden RNA-Leiter ( ) mit bekannter Konzentration kalkuliert.
  • Die Messung der RNA und cRNA erfolgte mit den Agilent RNA 6000 Nano Chips und dem zugehörigen Agilent RNA 6000 Nano Kit. Der qualitative Bereich des Systems liegt bei 25-500 ng/μl RNA-Konzentration der Probe. Mit den Agilent RNA 6000 Nano Chips können 12 Proben gleichzeitig analysiert werden. Alle im Kit enthaltenen Reagenzien wurden zunächst auf Raumtemperatur äquilibriert, bevor mit dem Protokoll begonnen wurde. Danach wurden 550 μl der Agilent RNA 6000 Nano Gelmatrix in ein Zentrifugationsfilterröhrchen mit Auffanggefäß pipettiert und für 10 min bei 1.500 × g zentrifugiert. Das gefilterte Gel wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und kann bei Einhaltung der Lagerungstemperatur von 4°C bis zu einen Monat lang verwendet werden. Vom gefilterten Gel wurden 65 μl mit 1 μl RNA 6000 Nano Farbstoffkonzentrat, welches vorher durch Vortexen sorgfältig gemischt und anschließend herunterzentrifugiert wurde, vermischt. Das Gel-Farbstoffgemisch wurde für 10 min bei Raumtemperatur mit 13.000 × g zentrifugiert. Ein Agilent RNA Nano Chip wurde in die Vorbereitungsvorrichtung (Priming Station) eingelegt und 9 μl des Gel-Farbstoffgemisches in das untere der drei mit „G” gekennzeichneten Wells pipettiert. Danach wurde die Vorrichtung für 30 s geschlossen, um das Gel-Farbstoffgemisch in den Kapillaren des Chips zu verteilen. Danach wurden jeweils 9 μl in die beiden oberen Gelwells verteilt. Anschließend wurden 5 μl RNA 6000 Nano Marker in jedes Probenwell und das Well für die Leiter pipettiert. Die Proben und die RNA-Leiter wurden für 2 min bei 70°C denaturiert, bevor 1 μl in das jeweilige Well aufgetragen wurde. Der Chip wurde danach für 60 s bei 2.400 rpm gevortext, bevor die Messung im Agilent Bioanalyzer gestartet wurde [148].
  • Das Elektropherogramm der Gesamt-RNA zeigt zwei Peaks der ribosomalen RNA-Untereinheiten 18s und 28s bei ca. 1800 nt bzw. 3800 nt ( ). Als Qualitätsparameter dient bei der Gesamt-RNA die so genannte RNA-Integritätsnummer (RIN), welche Hinweise auf mögliche Degradation der RNA-Probe widerspiegelt. Ein zweiter Qualitätsparameter, der ebenfalls von der 2100 Expert Software automatisch für jede Probe kalkuliert wird, ist das Verhältnis der ribosomalen RNAs 28s zu 18s. Hoch qualitative RNA sollte etwa ein Verhältnis der beiden rRNAs von 2,0 oder größer aufweisen. Mit zunehmender Degradation sinkt das Verhältnis der beiden rRNAs ab. Allerdings ist es schwierig einen festen Grenzwert für die Qualität der RNA festzulegen, da das 28s/18s-Verhältnis oft eine große Variabilität in Abhängigkeit von der eingesetzten Konzentration der RNA zeigt. Die RIN erwies sich dagegen als gut reproduzierbarer Parameter, da der verwendete Algorithmus zu ihrer Berechnung das gesamte Elektropherogramm mit einbezieht [149, 150]. Die RIN kann Werte von 1 bis 10 einnehmen, wobei 1 „am meisten degradiert” und 10 „am intaktesten” bedeutet. Zur Entwicklung der RIN wurden 1.300 RNA-Proben aus verschiedenen Geweben vom Menschen, der Ratte und der Maus mit verschiedener Qualität von Fachleuten untersucht und einer RIN zugeordnet. Die Elektropherogramme wurden anschließend mit Hilfe von bioinformatischen neuronalen Netzwerken, welche adaptive, fehlertolerante Lernsysteme darstellen, analysiert. Solche Netzwerke erlauben es kritische Eigenschaften aus den Elektropherogrammen zu extrahieren (z. B. Signalflächen, -intensitäten oder -verhältnisse) und wurden genutzt um einen Algorithmus zur Berechnung der RIN aufzustellen. zeigt Beispiele für RNA-Proben mit unterschiedlicher Qualität und die zugeordnete RIN [149, 150].
  • Die RIN erlaubt es anhand von experimentellen Erfahrungen Grenzwerte festzulegen, welche als Minimum für nachfolgenden Applikationen, wie real-time-PCR oder Microarrays, gelten. Für die Microarrayexperimente in dieser Arbeit sollte die RNA möglichst eine RIN größer oder gleich 7 besitzen. Dieser Wert ist ein Erfahrungswert und wurde willkürlich festgelegt.
  • Im Gegensatz zur Gesamt-RNA wurden zur Überprüfung der Qualität der biotinylierten cRNA andere Parameter verwendet. cRNA ist aufgrund der Synthese und Amplifikationsprozedur eine Mischung aus Fragmenten verschiedener Länge und zeigt sich im Elektropherogramm als ein breites Spektrum im Bereich von 250–5500 nt mit einem Peak bei ungefähr 1000–1500 nt ( ).
  • Für die Messung der cDNA wurden Agilent RNA 6000 Pico Chips in Kombination mit dem Agilent RNA 6000 Pico Kit verwendet. Der Kit erlaubt die Quantifizierung einzelsträngiger Nukleinsäuren im Bereich von 250–5000 pg/μl. Die Agilent RNA 6000 Pico Chips erlauben es, 11 Proben gleichzeitig zu untersuchen. Alle im Kit enthaltenen Reagenzien wurden auf Raumtemperatur äquilibieren gelassen, bevor mit dem Protokoll begonnen wurde. Anschließend wurden 550 μl der Agilent RNA 6000 Pico Gelmatrix in ein Zentrifugationsfilterröhrchen mit Auffanggefäß pipettiert und für 10 min bei 1.500 × g zentrifugiert. Vom gefilterten Gel wurden 65 μl mit 1 μl RNA 6000 Pico Farbstoffkonzentrat, welches vorher durch Vortexen sorgfältig gemischt und anschließend herunterzentrifugiert wurde, vermischt. Das Gel-Farbstoffgemisch wurde für 10 min bei Raumtemperatur mit 13.000 × g zentrifugiert. Ein Agilent RNA Pico Chip wurde in die Vorbereitungsvorrichtung (Priming Station) eingelegt und 9 μl des Gel-Farbstoffgemisches in das untere der drei mit „G” gekennzeichneten Wells pipettiert. Danach wurde die Vorrichtung für 30 s geschlossen, um das Gel-Farbstoffgemisch in den Kapillaren des Chips zu verteilen. Danach wurden jeweils 9 μl in die beiden oberen Gelwells verteilt. Anschließend wurden zuerst 9 μl RNA 6000 Pico Konditionierungslösung in das entsprechende Well und dann 5 μl RNA 6000 Pico Marker in jedes Probenwell und das Well für die Leiter pipettiert. Die RNA-Leiter wurde mit Nuklease-freiem Wasser 1:5 verdünnt und denaturiert (2 min bei 70°C) eingesetzt, 1 μl der RNA-Leiter und der Proben in das jeweilige Well aufgetragen und der Chip danach für 60 s bei 2.400 rpm gevortext. Die Messung erfolgte anschließend mit dem Agilent Bioanalyzer [151]. Das entstehende Elektropherogramm der cDNA ist ein breites Spektrum im Bereich von 50 nt bis 4000 nt mit einem Maximum bei etwa 100 nt bis 500 nt ( ).
  • 2.5.3 Real-time PCR
  • 2.5.3.1 cDNA-Synthese
  • Von der aus den Zellen isolierten Gesamt-RNA wurden 2–5 μg in der reversen Transkription mit dem Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit unter Nutzung von hexameren Zufallsprimern (Random hexamer primers) und einer rekombinanten reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Diese spezielle Reverse Transkriptase ist thermostabil und hochsensitiv und besitzt eine RNA- und DNA-abhängige DNA-Polymeraseaktivität sowie die Fähigkeit zum Entwinden von Nukleinsäuren. Zudem hat das Enzym eine intrinsische RNase-Aktivität, welche den Abbau der RNA in RNA:DNA-Hybriden vermittelt. Aufgrund der RNase-Aktivität entfällt ein zusätzlicher RNase H-Verdauschritt. Die Verwendung von Zufallsprimern erlaubt es, alle RNA-Sequenzen in cDNA umzuschreiben, auch wenn kein Poly(A)-Ende mehr vorhanden ist [152]. Tabelle 2.11 enthält die für die Reaktion verwendeten Reagenzien und Volumina. Die PCR wurde in 0,2 ml Eppendorf-Gefäßen angesetzt und im Thermocycler wie folgt inkubiert: 10 min bei 25°C und 1 h bei 50°C zur Synthese der cDNA, 5 min bei 85°C zur Inaktivierung der reversen Transkriptasereaktion und Abkühlen auf 4°C. Die cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert. Tabelle 2.11: Ansatz für die cDNA-Synthese
    Reagenz Volumen pro Reaktion in μl
    RNA-Probe 11,0
    Random hexamer Primer 2,0
    5 × RT Reaktionspuffer 4,0
    RNase Inhibitor 0,5
    dNTPs 2,0
    Reverse Transkriptase 0,5
    Gesamtvolumen 20,0
  • 2.5.3.2 TaqManTM low density arrays (TLDAs)
  • Zur Charakterisierung der HepG2-Zellen bezüglich ihrer Expression an fremdstoffmetabolisierenden Enzymen, Transkriptionsfaktoren und Transportern wurden 45 ausgewählte Gene mit Hilfe von TaqManTM low density arrays (TLDAs) untersucht. Tabelle 2.12 gibt eine Übersicht über die individuell angefertigte TLDA-Karte „Human DME” mit den untersuchten 41 Ziel- und 3 Referenzgenen (Housekeeper). Tabelle 2.12: Genbeschreibungen der Gene der TLDA-Karte „Human DME” Die Kodierung von Applied Biosystems (ABI) besteht aus dem Symbol für die Spezies (Hs = Homo sapiens), einer 8-stelligen Nummer von ABI für den Test und einem Kürzel mit Informationen zur Sonde: s = Primer und Sonde binden innerhalb eines Exons, genomische DNA wird deshalb detektiert; m = Sonde hybridisiert über eine Exon-Exon-Grenze hinweg, keine Detektion von genomischer DNA; g = mit diesem Test könnte auch genomische DNA detektiert werden; mH = dieser Test ist für ein Transkript, dass zu einer Genfamilie mit hoher Sequenzhomologie gehört. Der Test ist jedoch speziell entwickelt, dass das entsprechende Transkript mit einer Ct-Differenz von 10–15 Einheiten bzw. einer 1.000–30.000-fach höheren Sensitivität als das naheste Homolog detektiert wird. Die Zahlen hinter dem Buchstaben für die Sondencodierung geben das Exon an, innerhalb dem die Sonde bindet, z. B. 1 = Sonde bindet innerhalb von Exon 1.
    Gensymbol Genname ABI-Kodierung RefSeq-ID
    Housekeeper
    18S 18S rRNA Hs99999901_s1 NR_003286.2
    B2M beta-2-microglobulin Hs99999907_m1 NM_004048.2
    PPIA peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A) Hs99999904_m1 NM_021130.3
    CYP-Enzyme (Phase I)
    CYP1A1 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 Hs00153120_m1 NM_000499.3
    CYP1A2 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 2 Hs00167927_m1 NM_000761.3
    CYP2A6 cytochrome P450, family 2, subfamily A, polypeptide 6 Hs00868409_s1 NM_000762.5
    CYP2B6 cytochrome P450, family 2, subfamily B, polypeptide 6 Hs00167937_g1 NM_000767.4
    CYP2C18 cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 18 Hs001595322_mH NM_000772.2/NM_001128925.1
    CYP2C19 cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 19 Hs00426380_m1 NM_000769.1
    CYP2C8 cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 8 Hs00258317_m1 NM_000770.3
    CYP2C9 cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 9 Hs00426397_m1 NM_000771.3
    CYP2D6 cytochrome P450, family 2, subfamily D, polypeptide 6 Hs00164385_m1 NM_000106.4
    CYP2E1 cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypeptide 1 Hs_00559368_m1 NM_000773.3
    CYP3A4 cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4 Hs_00430021_m1 NM_017460.3
    CYP3A5 cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 5 Hs_00241417_m1 NM_000777.2
    CYP3A7 cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 7 Hs00426361_m1 NM_000765.2
    Phase II-Enzyme
    GSTA1 glutathione S-transferase A1 Hs00275575_m1 NM_145740.3
    GSTP1 glutathione S-transferase pi Hs00168310_m1 NM_000852.3
    SULT1A1, 1A2, 1A3, 1A4 sulfotransferase family, cytosolic, 1A, phenolpreferring, member 2 Hs00236900_m1 NM_001055.2, NM_001054.2/NM_177528.1, NM_003166.3/NM_177552.2, NM_001017389.1/NM_001017390.1
    UGT1A9, 1A5, 1A10, 1A4, 1A3, 1A7, 1A8, 1A1, 1A6 UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A10 Hs00166592_m1 NM_021027.2, NM_019078.1, NM_019075.2, NM_007120.2, NM_019093.2, NM_019077.2, NM_019076.4, NM_000463.2, NM_001072.3/NM_205862.1
    UGT1A6 UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A6 Hs01592477_m1 NM_001072.3/NM_205862.1
    UGT2B7 UDP glucuronosyltransferase 2 family, polypeptide B7 Hs00426592_m1 NM_001074.2
    Nukleare Rezeptoren/Transkriptionsfaktoren
    AHR aryl hydrocarbon receptor Hs00169233_m1 NM_001621.3
    HNF4A hepatocyte nuclear factor 4, alpha Hs00230853_m1 NM_000457.3/NM_001030003.1/NM_001030004.1/NM_175914.3/NM_178849.1/NM_178850.1
    NR0B2 (SHP) nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2 Hs00222677_m1 NM_021969.2
    NR1H2 (LXRB) nuclear receptor subfamily 1, group H, member 2 Hs00173195_m1 NM_007121.4
    NR1H3 (LXRA) nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3 Hs00172885_m1 NM_001130101.1/NM_001130102.1/NM_005693.2
    NR1H4 (FXR) nuclear receptor subfamily 1, group H, member 4 Hs00231968_m1 NM_005123.2
    NR1I2 (BXR, PXR) nuclear receptor subfamily 1, group I, member 2 Hs00243666_m1 NM_003889.3/NM_022002.2/NM_033013.2
    NR1I3 (CAR) nuclear receptor subfamily 1, group I, member 3 (constitutive androstane receptor) Hs00231959_m1 NM_001077469.1 (Isoform 6), 14 weitere Isoformen werden von diesem Genlocus erfasst
    NR2F2 (COUPTFB) nuclear receptor subfamily 2, group F, member 2 Hs00819630_m1 NM_021005.2
    NR3C1 (GR) nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1 (glucocorticoid receptor) Hs00230818_m1 NM_000176.2/NM_001018074.1/, NM_001018075.1/NM_001018076.1/NM_001018077.1/NM_001020825.1/NM_001024094.1
    Transporter
    ABCB11 (BSEP) ATP-binding cassette, subfamily B (MDR/TAP), member 11 Hs00184824_m1 NM_003742.2
    ABCB1 (MDR1) ATP-binding cassette, subfamily B (MDR/TAP), member 1 Hs00184491_m1 NM_000927.3
    ABCB4 (MDR2/3) ATP-binding cassette, subfamily B (MDR/TAP), member 4 Hs00240956_m1 NM_000443.3/NM_018849.2/NM_018850.2
    ABCC1 (MRP1) ATP-binding cassette, subfamily C (CFTR/MRP), member 1 Hs00219905_m1 NM_004996.3/NM_019862.2/NM_019898.2/NM_019899.2/NM_019900.2
    ABCC2 (cMOAT, MRP2) ATP-binding cassette, subfamily C (CFTR/MRP), member 2 Hs00166123_m1 NM_000392.3
    ABCC3 (cMOAT2, MRP3) ATP-binding cassette, subfamily C (CFTR/MRP), member 3 Hs00358656_m1 NM_001144070.1/NM_003786.3
    SLC10A1 (NTCP) solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 Hs00161820_m1 NM_003049.2
    SLC22A1 (OCT1) solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 1 Hs00427550_m1 NM_003057.2/NM_153187.1
    SLCO1A2 (OATPA) solute carrier organic anion transporter family, member 1A2 Hs00366488_m1 NM_021094.3/NM_134431.3
    SLCO1B1 (LST1, OATP2) solute carrier organic anion transporter family, member 1B1 Hs00272374_m1 NM_006446.3
    SLCO1B3 (LST3, OATP8) solute carrier organic anion transporter family, member 1B3 Hs00251986_m1 NM_019844.2
    SLCO2B1 (OATPB) solute carrier organic anion transporter family, member 2B1 Hs00200670_m1 NM_007256.2
  • TLDAs sind eine Weiterentwicklung der TaqManTM Assays von Applied Biosystems. Eine TLDA-Karte enthält 384-Wells und 8 Probenkanäle, die es erlauben bis zu 48 Gene pro Probe parallel zu bestimmen. Der Vorteil in der Verwendung von TLDAs im Vergleich zu den einfachen TaqManTM Tests liegt im viel geringeren Arbeitsaufwand, da die Sonde und Primer für jedes Gen bereits als Lyophilisate in den Wells vorliegen. Über ein spezielles Kanalsystem wird eine Probe nach dem Auftragen auf die 48 verschiedenen Wells verteilt.
  • Das Prinzip der TLDAs entspricht einer real-time-PCR mit einer TaqManTM Sonde. Die Idee einer solchen fluorogenen Sonde wurde im Jahr 1993 von Lee und seinen Mitarbeitern erstmals umgesetzt [153]. Eine TaqManTM Sonde ist komplementär zur Sequenz des Zieltranskripts und sollte eine Länge von 20–30 Nukleotiden besitzen, um eine ausreichende Spezifität zu gewährleisten. Die Sonde enthält am 5'-Ende einen fluorogenen Reporter (Fluoreszeinderivat) und am 3'-Ende einen Quencherfarbstoff (Rhodaminderivat). Als Quencher wird standardmäßig FAM (6-Carboxy-Fluorescein) und als Reportermolekül TAMRA (6-Carboxy-Tetramethylrhodamin) verwendet. Die Bindung an das Oligonukleotid hält Reporter und Quencher in räumlicher Nähe, so dass bei Anregung einer intakten Sonde bei 488 nm die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs durch einen Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt wird. Während der PCR hybridisiert die Sonde zunächst an die Matrize. Bei der Amplifikation durch die Taq-Polymerase kommt es durch ihre 5'-3'-Exonukleaseaktivität zur Zersetzung der Sonde und somit zur Trennung des Reporters vom Quencher. Damit wird der FET zwischen Reporter und Quencher unterbrochen und die Detektion eines Fluoreszenzsignals möglich. Mit der Akkumulation des PCR-Produktes steigt die Fluoreszenz mit jedem PCR-Zyklus an [154, 155]. Einen Überblick über die Reaktionsfolge gibt .
  • Da einige CYP-Enzyme erst nach Induktion exprimiert werden, wurden die Zellen für die TLDA-Experimente mit den Induktoren PB, 3-MC und RIF, wie unter 2.4.1/2.4.2 beschrieben, ausgesät und behandelt. Die RNA wurde mit Hilfe des RNeasy Mini Kits isoliert (siehe Abschnitt 2.5.1.1) und in cDNA revers transkribiert (siehe Abschnitt 2.5.3.1). In jeden Probenkanal der TLDA-Karten wurden 100 μl einer Suspension aus 100 ng cDNA-Probe (resuspendiert in 50 μl Nuklease-freiem Wasser) und 50 μl TaqMan® Universal PCR Mastermix appliziert. Die Karten wurden anschließend in eine spezielle Halterung gesetzt und zweimal für je 1 min bei 1200 × g zentrifugiert, um die Probe gleichmäßig über die 48 Wells eines Probenkanals zu verteilen. Danach wurden die Kanäle mit einem speziellen Gerät versiegelt und die Probenreservoirs abgetrennt. Die PCR-Reaktion und fluorimetrische Detektion wurden anschließend im ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Darmstadt/Deutschland) durchgeführt.
  • Die PCR wurde unter folgenden Bedingungen gefahren:
    Figure 00720001
  • Die Auswertung der Daten und Berechnung der Ct-Werte erfolgte mit der ABI Prism 7900HT SDS Software 2.1. Für die Analyse wurden dazu die gemessenen Intensitäten des Fluoreszenzsignals gegen die Anzahl der PCR-Zyklen aufgetragen. Anschließend wurden die Kurven analysiert und für jede Kurve (entspricht einem Gen) ein Ct-Wert ermittelt. Dieser Ct-Wert (Threshold-Cycle = Schwellenwertzyklus) gibt die Zyklenzahl an, die bis zur Erreichung des Schwellenwertes nötig sind. Der Schwellenwert entspricht dabei dem Mittelpunkt des exponentiellen Anstiegsbereiches der aufgezeichneten Kurven. Je größer die Ausgangskopienzahl eines Gens ist, desto eher wird der Schwellenwertzyklus erreicht und umso kleiner ist der Ctt-Wert für das Gen.
  • Die Genregulationen wurden anschließend mit der ΔΔCt-Methode von Livak und Schmittgen berechnet. Bei dieser Methode wird die Regulation eines Gens (R) bezogen auf das entsprechende Gen der Lösungsmittelkontrollprobe und einen Housekeeper z. B. Cyclophilin A (PPIA) berechnet [157]:
    Figure 00730001
    Formel 2.1: Berechnung der Genregulation nach der ΔΔCt-Methode.
    • R
    Regulation eines Gens
    E
    reale Effizienz
    Ct
    Schwellenwertzyklus
    ΔCt
    Differenz der Ct-Werte von Kontrolle und Probe
  • Die Variable E steht für die Effizienz mit der die Amplifikation während der PCR erfolgt. Theoretisch erfolgt in der exponentiellen Phase eine Verdoppelung der Kopienzahl (E = 2) in jedem PCR-Zyklus. Dieser Wert wird in der Realität jedoch nicht immer erreicht und muss deshalb vor dem Versuch für jedes Gen einer TLDA-Karte ermittelt werden. Dazu wurde eine Verdünnungsreihe mit cDNA bekannter Konzentration hergestellt: 0,1 ng, 0,5 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng pro 100 μl Probenansatz (50 μl Probe und 50 μl TaqMan® Universal PCR Mastermix). Die cDNA wurde durch reverse Transkription von Gesamt-RNA aus unbehandelten HepG2-Zellkulturproben gewonnen. Zur Auswertung wurden die Ct-Werte gegen den Logarithmus der cDNA-Konzentrationen aufgetragen und der Anstieg der Geraden (m) ermittelt. Die reale Effizienz E wurde anschließend aus der Zehnerpotenz des negativen Kehrwertes des Geradenanstiegs nach Formel 2.2 berechnet. Diese ermittelte reale Effizienz wurde zur Berechnung der Genregulationen mit der ΔΔCt-Methode herangezogen. Die ermittelten Effizienzwerte sind in Anhang 3 zusammengestellt.
    Figure 00740001
    Formel 2.2: Berechnung der realen Effizienzen für die Gene der TLDA-Experimente anhand der cDNA-Eichkurven.
    • E
    reale Effizienz
    m
    Anstieg der Eichkurve
  • Zur Prüfung auf statistische Signifikanz wurde der Student's T-Test verwendet (siehe Abschnitt 2.7.5). Dazu wurden die auf den Housekeeper normalisierten Werte der Effizienzen (E) potenziert mit dem entsprechenden Ct-Wert der behandelten Proben (Term 2) gegen die Kontrollen (Term 1) getestet (siehe Formel 2.1).
  • Für den Vergleich der Basalexpression von HepG2 mit humanen Hepatozytenkulturen wurden die ausschließlich mit dem Lösungsmittel (DMSO) behandelten Proben herangezogen. Die Daten der humanen Hepatozytenkulturen sind interne bereits publizierte Daten [158]. Die Leberproben stammen von Biopsien männlicher Patienten und wurden, wie von Richert et al. beschrieben, in einer Monolayerkultur ausplattiert [158]. Analog der ΔΔCt-Methode wurde die Regulation in HepG2 im Vergleich zu den humanen Hepatozyten nach Formel 2.3 berechnet:
    Figure 00740002
    Formel 2.3: Berechnung der relativen Basalexpression von HepG2 im Vergleich zu humanen Hepatozyten.
    • R
    Regulation eines Gens in humanen Hepatozytenkulturen im Vergleich zu HepG2
    E
    reale Effizienz
    Ct
    Schwellenwertzyklus
  • 2.5.4 Illumina
  • 2.5.4.1 Illumina-Technologie
  • Die amerikanische Firma Illumina brachte im Jahr 2005 eine neue, kostengünstige Technologie für die globale Genexpressionsanalyse auf den Markt [159]. Die so genannte Illumina Sentrix® BeadChip-Technik unterscheidet sich von den Affymetrix-Microarrays, welche als Gold-Standard in der Genomanalyse gelten, in der Art der Oligonukleotide und wie diese auf die Chipoberfläche aufgebracht sind. Illumina nutzt im Vergleich zum Affymetrix kurze 50-Basen große Oligonukleotidsequenzen, welche mit einer 29-Basen-Adresssequenz verbunden sind und mittels Standardoligonukleotidsynthese hergestellt werden ( ) [160]. Die genspezifischen Sequenzen der Oligonukleotide wurden anhand der NCBI Referenzsequenz-(National Center for Biotechnology Information Reference Sequence)Datenbank ausgewählt. Dabei wurde ein spezieller mehrstufiger Algorithmus benutzt, der Parameter, wie Ungleichheit zu anderen Gensequenzen, die Abwesenheit repetitiver genomischer Sequenzen, Selbstkomplementarität und die Schmelztemperatur mit einbezieht [161, 162]. Die Oligonukleotide werden nach ihrer Synthese kovalent an 3 μm große Silikakugeln (Beads) gebunden. Jeder Kugeltyp enthält dabei mehr als 108 Kopien einer spezifischen Oligonukleotidsequenz für ein Transkript und ist ungefähr 30-mal auf jedem Probenfeld vertreten [163]. Diese hohe Anzahl an Oligonukleotiden pro Bead und die 30-fache Präsenz stellen interne technische Replikate dar und tragen auf diese Weise zur Stabilität und einer guten Reproduzierbarkeit des Systems bei. Ein weiterer Unterschied zu den Affymetrix-Microarrays ist die randomisierte Anordnung der einzelnen Beads über das Probenfeld in Löcher (Wells), die in die Oberfläche eingeätzt worden ( ) [164]. Die willkürliche Anordnung macht es notwendig, jedes Probenfeld einem Dekodierungsverfahren zu unterziehen, um die Positionen der Transkripte/Beads zu identifizieren. Dafür entwickelte Illumina einen hocheffizienten Dekodierungsalgorithmus, welcher auf einer sequenziellen Hybridisierungs- und Rehybridisierungsfolge zu der Adresssequenz aufbaut [165].
  • Für die Versuche mit den HepG2-Zellen wurde der Illumina Sentrix® HumanRef-8 V2 BeadChip verwendet. enthält einen Überblick über die Anzahl der Transkriptvarianten und Gene auf dem Chip. Ein großer Vorteil dieser Illumina-Chips ist es, dass bis zu acht Proben gleichzeitig auf einem Chip gemessen werden können. Das ermöglicht einen hohen Durchsatz und trägt aufgrund des geringeren Arbeitsaufwands zu einem günstigeren Kostenverhältnis im Vergleich zu Affymetrix bei.
  • 2.5.4.2 cRNA-Synthese
  • Vor der Hybridisierung der Proben auf den Genchip ist es notwendig, die RNA innerhalb der Probe so zu modifizieren, dass gebundene RNA-Moleküle auf dem Chip detektiert werden können. Dazu wurde die mRNA in einem mehrstufigen Prozess unter Verwendung des MessageAmpTM II aRNA Amplification Kit in Biotin-markierte cRNA umgeschrieben ( ).
  • Zur Optimierung und Standardisierung der Prozedur wurde diese in einem automatischen Verfahren mit dem Theonyx Liquid Performer-Roboter und mit angepassten Volumen durchgeführt (Tab. 2.13). 500 ng Gesamt-RNA wurden in eine Thermosprintplatte vorgelegt, in der Vakuumzentrifuge eingetrocknet und in den Roboter gestellt. Alle Reaktionsmischungen für die verschiedenen Syntheseschritte wurden ebenfalls im Voraus zusammen pipettiert und auf den Roboter geladen. Alle Pipettierschritte, außer denen für die Aufreinigung, wurden unter Kühlung der Platte bei 4°C durchgeführt. Die enzymhaltigen Reaktionsmischungen wurden ebenfalls auf Kühlpositionen des Roboters aufbewahrt. Für die reverse Transkription zur Synthese des ersten cDNA-Stranges von der mRNA-Probe wurden vom Roboter 5 μl des Erststrangreaktiongemisches (Tab. 2.13) zu jeder RNA-Probe pipettiert und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Anschließend wurde die Platte in einem im Robotersystem integrierten Thermocycler für 2 h bei 42°C inkubiert. Nach der Reaktion wurden 20 μl des Zweitstrangreaktionsgemisches (Tab. 2.13) zugegeben und für weitere 2 h bei 16°C im Thermocycler die Synthese der doppelsträngigen cDNA durchgeführt.
  • Die Aufreinigung der cDNA erfolgte mit magnetischen Beads (Agencourt® RNACleanTM) durch den Theonyx. Dazu wurden 88 μl der Bead-Suspension zu jeder Probe pipettiert und anschließend die gesamte Probe in eine Rundbodenplatte überführt. Die Reaktion wurde zur Bindung der cDNA an die Beads für 5 min bei Raumtemperatur belassen. Danach erfolgte die 10-minütige Separation der Beads auf einer Ringmagnetplatte. Dabei ordnen sich die Beads kreisförmig entlang des magnetischen Feldes an und erlauben somit die Trennung der cDNA-gebundenen Beads von der restlichen Probe. Diese wird einfach mittig aus dem Well heraus pipettiert. Die Probe wurde dann dreimal mit 200 μl Ethanol für jeweils 25 s gewaschen. Nach dem dritten Waschschritt wurde das Ethanol möglichst vollständig entfernt und die Beads für 15 min getrocknet. Die Platte verblieb während des gesamten Waschvorganges auf der Ringmagnetplatte und wurde erst nach dem Trocknen auf den Schüttler im Theonyx überführt. Nach Zugabe von 30 μl Nuklease-freiem Wasser, wurde die cDNA unter Schütteln bei 1500 rpm für 2 min von den Beads gelöst. Nach weiteren 3 min Inkubation ohne Schütteln wurden die Beads auf dem Magnetseparator für 10 min separiert. Die im Wasser gelöste cDNA wurde in eine neue Thermosprintplatte überführt und für 5 h bei 50°C im Thermocycler mit geöffnetem Deckel eingetrocknet. Danach wurde die Platte zurück auf die Kühlposition überführt und 10 μl des in vitro-Transkriptions(IVT)gemisches (Tab. 2.13) hinzu pipettiert. Tabelle 2.13: Reaktionsgemische für die cRNA-Synthese
    Erststrangreaktionsgemisch Zweitstrangreaktionsgemisch IVT-Reaktionsgemisch
    Reagenz Volumen in μl/Probe Reagenz Volumen in μl/Probe Reagenz Volumen in μl/Probe
    Erststrangpuffer (10×) 0,50 Zweitstrangpuffer (10×) 2,50 Reaktionspuffer (10×) 1,00
    - - - - ATP 1,00
    - - - - GTP 1,00
    T7 Primer 0,25 - - CTP 1,00
    dNTPs 1,00 dNTPs 1,00 UTP 0,50
    Nuklease-freies Wasser 2,75 Nuklease-freies Wasser 15,75 Nuklease-freies Wasser 0,75
    RNase Inhibitor 0,25 RNase H 0,25 Biotin-UTP 3,75
    Reverse Transkriptase 0,25 DNA Polymerase 0,50 T7 Enzym 1,00
    Gesamtvolumen 5,00 Gesamtvolumen 20,00 Gesamtvolumen 10,00
  • Die Reaktion zur Synthese der Biotin-markierten cRNA wurde für 16 h bei 37°C im Thermocycler durchgeführt. Der Einbau von Biotin in den neuen cRNA-Strang wird über spezielle biotinylierte UTP-Nukleotide, welche dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, gewährleistet. Nach der cRNA-Synthese werden die Proben mit 10 μl Nuklease-freiem Wasser eingestellt und mit 88 μl Bead-Suspension versetzt. Die Aufreinigung der cRNA erfolgte analog der für die cDNA. Die Trocknungszeit nach dem Ethanolwaschvorgang wurde jedoch auf 30 min erhöht, um sicherzustellen, dass keine Ethanolreste in der Probe zurückbleiben. Die Elution der cRNA erfolgte in 40 μl unter 5 min Schütteln bei 1500 rpm. Die cRNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
  • 2.5.4.3 Hybridisierungsprozess
  • Für die Hybridisierung wurden 750 ng cRNA in 5 μl Nuklease-freiem Wasser eingestellt und für 10 min zum Resuspendieren der cRNA bei Raumtemperatur belassen. Die Puffer GEX-HYB und GEX-HCB wurden für 10 min bei 58°C erwärmt, um die darin enthaltenen Salze vollständig zu lösen. Anschließend wurden die Puffer wieder auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Danach wurden 10 μl des Hybridisierungspuffers GEX-HYB zu jeder cRNA-Probe pipettiert und die Proben bei 65°C für 5 min zur Denaturierung in den Thermocycler gestellt. Währenddessen wurde in die Reservoirs der Hybridisierungskammer 200 μl des GEX-HCB-Puffers gegeben, welcher für eine humide Atmosphäre während der Hybridisierung sorgt. Nachdem die cRNA-Proben kurz vorsichtig gevortext und herunterzentrifugiert worden waren, wurden 15 μl Probe auf den BeadChip pipettiert. Die Chips wurden in die Hybridisierungskammer gesetzt und für 20 h bei 58°C und einer Schwenkgeschwindigkeit von 5 im Hybridisierungsofen inkubiert.
  • Nach Ende der Inkubationszeit folgte der Wasch- und Färbeprozess der Chips. Die Herstellung der dafür notwendigen Puffer ist in Tabelle 2.14 zusammengestellt. Zunächst wurden die Chips aus der Hybridisierungskammer entfernt und sofort in eine Schale mit 250 ml E1BC-Puffer gelegt. Die Schutzfolie, welche die Probenauftragung ermöglichte, wurde unter der Flüssigkeitsoberfläche vom Chip entfernt und die Chips in einer neuen Schale mit E1BC-Puffer gesammelt. Im nächsten Schritt wurden die Chips 10 min in ein auf 55°C vorgeheiztes Bad (Heizblock) mit High-Temperature-Waschpuffer gegeben. Eine Benetzung der Chipoberfläche wurde bei diesem und den folgenden Waschschritten in E1BC-Puffer und Ethanol durch 10-maliges Auf- und Abheben des Tragegestells erreicht. Anschließend erfolgte ein 5 min Waschschritt in einer Schale mit 250 ml frischem E1BC-Puffer auf einem Orbitalschüttler mit der höchstmöglichen Geschwindigkeit ohne dass es zum Herausschwappen von Pufferlösung kommt. Danach wurden die Chips in eine weitere Schale mit 250 ml 100%igem Ethanol überführt und für weitere 10 min geschüttelt. Nachdem ein weiterer Waschschritt in 250 ml frischem E1BC-Puffer für 2 min unter Schütteln durchgeführt worden war, wurden die Chips in 4 ml Block E1-Puffer in einer Plastikeinwegwanne für 10 min bei einer Geschwindigkeit von 5 im Hybridisierungsofen bei 22°C geschwenkt. Anschließend wurden die Chips in eine neue Plastikeinwegwanne mit 2 ml Block E1-Puffer mit Streptavidin-Cy3 gelegt und erneut für 10 min geschwenkt. Nach dem Färbeschritt erfolgte ein letzter Waschschritt in 250 ml frischem E1BC-Puffer für 5 min auf dem Orbitalschüttler. Die Chips wurden schließlich bei 275 × g und Raumtemperatur zum Trocknen zentrifugiert. Das Scannen der Chips erfolgte mit dem Illumina Bead Array Reader bei 532 nm mit einer Auflösung von 0,8 μm. Tabelle 2.14: Puffer für den Hybridisierungsprozess
    Puffer Zusammensetzung
    E1BC – 1 L DEPC Wasser – 3 ml E1BC-Stammlösung
    High Temperature-Waschpuffer – 450 ml DEPC Wasser – 50 ml High Temperature-Waschpufferstammlösung
    Block E1-Puffer mit Strepatvidin-Cy3 – 2 ml Block E1-Puffer – 2 μl Streptavidin-Cy3-Stammlösung (1 mg/ml)
  • 2.6 Funktionelle Tests/Biochemische Methoden
  • 2.6.1 Cytochrom-P450-Aktivitätsbestimmung
  • 2.6.1.1 Bestimmung der CYP1A-Aktivität mit dem EROD-Test
  • Die direkte fluorimetrische Messung der O-Dealkylierung von 7-Ethoxyresorufin zu 7-Hydroxyresorufin durch das Enzym 7-Ethoxyresorufindeethylase (EROD), eine Cytochrom-P450-Monooxygenase der 1A-Familie, ist eine sehr empfindliche und spezi-fische Methode zur Bestimmung der CYP1A-Aktivität [166]. Bei dieser Reaktion wird das Fluoreszenzsignal des gebildeten 7-Hydroxyresorufins in einem definierten Zeitraum zur Berechnung der CYP1A-Aktivität genutzt. Das Reaktionsprinzip ist in dargestellt. Der Zusatz von Salicylamid zum Reaktionsansatz verhindert, dass das 7-Hydroxyresorufin durch Konjugationsenzyme zu einem nicht-fluoreszierenden Sulfat umgewandelt und dadurch ein geringerer Umsatz gemessen wird [167].
  • Die Aussaat und Behandlung der Zellen erfolgte in schwarzen 96-Well-Zellkulturplatten mit durchsichtigem Boden (siehe Abschnitt 2.4.3). Die Behandlung der Zellen wurde täglich über 72 h mit verschiedenen Induktoren der CYP-Expression durchgeführt. Zum Ende der Behandlungszeit wurden die Zellen mit 100 μl Zellkulturmedium gewaschen und 50 μl einer 1%igen (v/v) Salicylamidarbeitslösung in jedes Well gegeben. Die 1%ige (v/v) Salicylamidarbeitslösung wurde durch Verdünnen einer 0,3 M Salicylamidstammlösung (in Aceton als Lösungsmittel) mit 1 × PBS hergestellt. Nach 10 min Inkubation bei 37°C im Brutschrank wurden 50 μl einer 10 μM Ethoxyresorufinsubstratlösung zu jedem Well pipettiert und die Messung gestartet. Die Herstellung der 10 μM Ethoxyresorufinsubstratlösung erfolgte durch Verdünnen einer 1 mM 7-Ethoxy-3H-phenoxazin-3-one-Stammlösung (in DMSO) mit 1 × PBS. Die Messung wurde bei 37°C mit einer Anregungswellenlänge von 544 nm und einer Emissionswellenlänge von 595 nm bei 80-facher Verstärkung und unter kreisförmigem Schütteln für 10 s vor Beginn der Messung im Tecan Polarion Mikroplattenfluorometer durchgeführt. Die Gesamtdauer der Messung betrug 20 min mit Messintervallen im Abstand von 1 min. Für die Berechnung der Aktivität müssen die Messwerte zunächst auf die vorhandene Zellzahl im Well normalisiert werden. Zur Bestimmung der Zellviabilität, als Maß für die Anzahl bzw. Aktivität der Zellen, wurde der CellTiter-Glo®-Test (Promega) im Anschluss an die EROD-Messung durchgeführt. Dazu wurden die Lösungen aus den Wells abgesaugt und ein Gemisch aus 50 μl CellTiter-Glo®-Reagenz und 50 μl Zellkulturmedium zu jedem Well gegeben. Die Durchführung der Messung ist unter 2.6.2 beschrieben.
  • Zur Quantifizierung des bei der Reaktion gebildeten 7-Hydroxyresorufin wurde eine Eichkurve mit 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one (Resorufin) als Standard erstellt. Dafür wurde eine 10 mM Stammlösung des 7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one in DMSO hergestellt. Aus der Stammlösung wurden zwei verschiedene Verdünnungsreihen in 1 × PBS hergestellt. Die erste Verdünnungsreihe umfasst die Konzentrationen 1 pmol/ml, 2,5 pmol/ml, 10 pmol/ml, 25 pmol/ml, 50 pmol/ml und 100 pmol/ml. Die zweite Verdünnungsreihe schließt 50 pmol/ml, 100 pmol/ml, 500 pmol/ml und 1000 pmol/ml ein. Für die Erstellung der Eichkurven wurden 50 μl einer 1%igen (v/v) Salicylamidarbeitslösung in jedes Well einer schwarzen Zellkulturplatte gegeben und für 10 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden 50 μl der jeweiligen Resorufinverdünnung oder 1 × PBS als Hintergrundwert zu jedem Well pipettiert. Die Messung erfolgte im Tecan Polarion mit den oben angeführten Messeinstellungen. Für beide Eichkurven wurde der Anstieg in RFU/(pmol/ml) ermittelt.
  • Die Berechnung der Aktivitätsrate A in pmol/(ml × min × RLU) wurde wie folgt durchgeführt: A = FI / F × t × ZV
  • Formel 2.4: Berechnung der CYP1A-Aktivitätsrate.
    • A
      CYP1A-Aktivitätsrate
      FI
      gemessene Fluoreszenz in RFU
      F
      Steigung der Eichkurve in RFU/(pmol/ml)
      t
      Zeit in min
      ZV
      Zellviabilität in RLU
  • Die Induktion der CYP1A-Aktivität wurde anschließend wie folgt berechnet:
    Figure 00820001
  • Formel 2.5: Berechnung der CYP1A-Induktion.
  • Dabei wurde die berechnete Aktivitätsrate des CYP1A der Zellen, welche mit dem Induktor behandelt wurden, auf die Aktivitätsrate des CYP1A in den Zellen, behandelt mit dem Lösungsmittel DMSO als Kontrolle, bezogen.
  • 2.6.1.2 Bestimmung der CYP3A4-Aktivität
  • Für die Bestimmung der CYP3A4-Aktivität in HepG2-Zellen nach täglicher Behandlung mit verschiedenen Induktoren für 72 h wurde der Promega P450-GloTM-Test verwendet [168]. Die Zellen wurden dafür in weißen Zellkulturplatten mit durchsichtigem Boden ausgebracht. Der P450-GloTM-Test ermöglicht es basale CYP-Aktivitäten oder Veränderungen (Induktion oder Inhibition) der CYP-Aktivitäten durch Behandlung der Zellen mit entsprechenden Substanzen zu messen. Dafür wird ein luminogenes Substrat in das Zellkulturmedium gegeben und mit den Zellen inkubiert. Intrazelluläre CYP-Enzyme setzten das Substrat in D-Luziferin um, welches aus den Zellen heraus in das Medium diffundiert. Dort kann es durch Zugabe von Luziferase, welche D-Luziferin unter ATP-Verbrauch und Lichtemission (Lumineszenz) in Oxyluziferin umsetzt, detektiert werden ( ). Das entstehende Lumineszenzsignal ist dabei proportional zur CYP-Enzymaktivität [168].
  • Nach dem Ende der Induktionsbehandlungszeit wurde das Medium von den Zellen abgesaugt und die Zellen einmal mit 0,1 ml frischem Medium gewaschen, um Substanzreste zu entfernen, die die Testreaktion stören könnten. Anschließend wurden 60 μl einer 50 μM Luziferin-PFBE-Substratlösung (Luciferin-6'-Pentafluorobenzylether oder 4,5-dihydro-2-(6-(perfluorobenzyloxy)benzo[d]thiazol-2-yl)thiazol-4-Carbonsäure) in jedes Well pipettiert und für 3 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Das Luziferin-PFBE ist ein speziell entwickeltes CYP3A4-Substrat, welches auch in Gegenwart von DMSO (bis 0.25% (v/v)) effektiv umgesetzt wird. Danach wurden 60 μl Luziferin-Detektionsreagenz, welches die Luziferase und die benötigten Kofaktoren, wie ATP und Mg2+, enthält, zu den Zellen gegeben. Das Detektionsreagenz stoppt die Reaktion und sorgt für die Bildung eines stabilen Lumineszenzsignals. Die Platte wird dann zur Lyse der Zellen kurz auf einem Plattenschüttler geschüttelt und anschließend sofort im Luminometer (Lumistar) vermessen [168].
  • Für die Berechnung der CYP3A4-Aktivität wurden die gemessenen Lumineszenzwerte zunächst auf die vorhandene Zellzahl im Well normalisiert. Zur Bestimmung der Zellviabilität wurde der CellTiter-Glo®-Test (Promega) im Anschluss an die CYP3A4-Messung durchgeführt. Dazu wurden die Lösungen aus den Wells abgesaugt und ein Gemisch aus 50 μl CellTiter-Glo®-Reagenz und 50 μl Zellkulturmedium zu jedem Well gegeben. Die Durchführung der Messung ist unter 2.6.2 beschrieben.
  • 2.6.2 Zellviabiltätsbestimmung
  • Zur Bestimmung der Zellviabilität wurde der CellTiter-Glo® Kit von Promga eingesetzt [170]. Dieser Test basiert auf der Quantifizierung von ATP, welches als Maß für die metabolische Aktivität und somit Vitalität von Zellen herangezogen werden kann. Für die Reaktion werden Luziferase und das Luziferasesubstrat D-Luziferin zu den Zellproben gegeben. Luziferase setzt D-Luziferin unter ATP-Verbrauch und Lichtemission (Lumineszenz) in Oxyluziferin um ( ). Das entstehende Lumineszenzsignal ist dabei proportional zum ATP-Gehalt der Probe [170].
  • Die Zellen wurden für die Messung in weißen Mikrotiterplatten ausgesät und behandelt (siehe Abschnitt 2.4). Das CellTiter-Glo® Substrat wurde in 10 ml des im Kit enthaltenen Puffers gelöst. Von diesem Substrat wurden 100 μl zu den Zellen, welche sich in 100 μl Kulturmedium befinden, hinzu pipettiert. Um die Zellen zu lysieren, wurde die Platte für 2 min auf einem Plattenschüttler mit 600 rpm geschüttelt. Anschließend wurde die Platte für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Entstehung eines stabilen Lumineszenzsignals zu gewährleisten. Die Messung wurde dann im Luminometer durchgeführt.
  • 2.6.3 P53 Proteinbestimmung
  • Zur Bestimmung der Aktivierung des Tumorsuppressorproteins P53 infolge der Behandlung mit genotoxischen Substanzen wurde der TransAMTM P53 Transkriptionsfaktortest von ActiveMotif genutzt [171]. Dieser Test basiert auf einem ELISA mit hoher Spezifität und Sensitivität und bietet zudem im Vergleich zu konventionellen Methoden, wie Western blot oder EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay), den Vorteil eines hohen Probendurchsatzes [171]. Eine Übersicht über den gesamten Ablauf des TransAMTM P53 gibt .
  • Im Testkit enthalten ist eine 96-Well-Platte, auf welcher ein Oligonukleotid immobilisiert ist. Dieses Oligonukleotid enthält die Konsensussequenz für die P53 Bindung (5'-GGACATGCCCGGGCATGTCC-3') [171]. Das P53 besteht aus einer N-terminalen Transaktivierungsdomäne, einer stark konservierten Kerndomäne für die DNA-Bindung, einer Oligomerisierungsdomäne und einer regulatorischen Domäne am C-Terminus [172]. Tetrameres P53 bindet über die Kerndomäne spezifisch an eine Konsensussequenz, die aus zwei palindromischen 10 bp großen Motiven mit der Sequenz 5'-RRRCWWGYYY-3' (R = Purin, Y = Pyrimidin, W = Adenin oder Thymin) besteht, welche durch 0 bis 13bp getrennt voneinander liegen [173]. Durch das Tetramer wird P53 stabilisiert und die DNA-Bindungsaktivität erhöht [171].
  • Zur Bestimmung des P53 in den Zellproben wurde zunächst die Kernproteinfraktion isoliert ( /1). Enthält der Kernextrakt aktiviertes P53, so bindet das P53 an das in den 96-Well-Platten immobilisierte Oligonukleotid ( /2) [171]. Der im Kit eingesetzte Primärantikörper erkennt anschließend ein Epitop des P53-Proteins ( /3), welches nach der Bindung an das Oligonukleotid zugänglich wird. Durch Zugabe eines sekundären Meerrettich-Peroxidase-gekoppelten Antikörpers gegen den Primärantikörper ( /4) wird ein kolorimetrischer Nachweis ermöglicht [171]. Als Substrat für die Peroxidasereaktion dient 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in der Entwicklungslösung. TMB wird in Gegenwart von Wasserstoffperoxid zu einem löslichen blauen Produkt umgesetzt. Die TMB-Reaktion wird anschließend durch Zugabe von 2 M H2SO4 gestoppt (Stopplösung) und die Absorption der gelb umgeschlagenen Lösung spektrophotometrisch bei 450 nM gemessen ( /5) [175].
  • 2.6.3.1 Gewinnung des Kernextraktes
  • Zur Gewinnung der Kernproteine wurde der Nuclear Extract Kit von ActiveMotif verwendet [176]. Die benötigten Puffer und Reagenzien wurden, wie in Tabelle 2.15 beschrieben, hergestellt. Tabelle 2.15: Herstellung der Reagenzien für die Gewinnung des Kernextraktes
    Reagenz Komponenten Volumen pro Well in μl
    PBS/Phosphatase Inhibitor-Puffer 10 × PBS 400
    Destilliertes Wasser 3400
    Phosphatase Inhibitoren 200
    Lysepuffer DTT (10 mM) 10
    Lysepuffer AM1 89
    Proteaseinhibitor-Cocktail 1
    Hypotonischer Puffer 10 × Hypotonischer Puffer 50
    Destilliertes Wasser 450
  • Von den im 6-Well behandelten HepG2-Zellen (siehe Abschnitt 2.4) wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit 2,5 ml eiskaltem PBS/Phosphataseinhibitor-Puffer gewaschen. Die Aufnahme der Zellen in eiskaltem Puffer und die Zugabe von Phosphataseinhibitoren wurde vorgenommen, um weitere Proteinmodifikationen (Expression, Proteolyse, Dephosphorylierung, etc.) zu verhindern. Anschließend wurden die Zellen in 1,5 ml eiskaltem PBS/Phosphataseinhibitor-Puffer mit einem Zellschaber abgekratzt, in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und für 5 min bei 800 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 500 μl hypotonischem Puffer durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Die Zellen wurden für 15 min auf Eis inkubiert. Durch den hypotonischen Puffer wird erreicht, dass die Zellmembran anschwillt und durchlässig wird. Danach wurde 25 μl Detergenz zu jeder Probe gegeben und für 10 s auf höchster Stufe gevortext. Das Detergenz führt dazu, dass die zytoplasmatischen Proteine durch die Zellmembran in den Überstand übergehen. Die folgende Zentrifugation für 30 s bei 14.000 × g und 4°C wurde durchgeführt, um die Zellkerne zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und die Kernfraktion in 50–100 μl Lysepuffer durch Auf- und Abpipettieren gelöst. Zur vollständigen Lyse der Kernfraktion wurden die Proben für 30 min auf Eis bei 150 rpm geschüttelt. Die Proben wurden dann für 30 s auf höchster Stufe gevortext und 10 min bei 4°C und 14.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und bei –80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Der Proteingehalt der Proben wurde mittels Bradford bestimmt (siehe Abschnitt 2.7.4). Dazu wurden die Proben je nach Proteingehalt 1:2 bis 1:4 verdünnt in Lysepuffer gemessen.
  • 2.6.3.2 Durchführung des Trans AM P53 Tests
  • Die Kernextraktproben wurden nach der Proteinbestimmung auf 0,06–0,6 μg Protein/μl für den TransAMTM P53 eingestellt. Die benötigten Puffer und Reagenzien für den Test wurden, wie in Tabelle 2.16 aufgeführt, hergestellt. In jedes Well der mit dem Kit mitgelieferten 96-Well-Platte wurden 40 μl des Bindungspuffer pipettiert. Anschließend wurden 10 μl der verdünnten Proben zu jedem Well gegeben. Als Positivkontrolle wurden 10 μl (0,05 μg/μl) eines mit Wasserstoffperoxid behandelten MCF-7-Extrakts in ein zusätzliches Well pipettiert. Ein weiteres Well mit 10 μl Lysepuffer diente als Hintergrundwert. Die Reaktion wurde für 1 h bei leichtem Schütteln mit 100 rpm auf einem Plattenschüttler zur Bindung des P53 an das Oligonukleotid inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand in den Wells durch Abkippen verworfen und die Flüssigkeitsreste durch vorsichtiges Abklopfen auf einem Papiertuch entfernt. Danach wurde die Platte gleichermaßen dreimal mit 1 × Waschpuffer gewaschen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 100 μl verdünntem P53-Antikörper (1:1000 in 1 × Antikörperbindungspuffer) in jedes Well. Die Bindung des Primärantikörpers wurde für 1 h bei Raumtemperatur (ohne Schütteln) durchgeführt. Danach wurde der Überstand, wie vorangehend beschrieben, verworfen, die Platte dreimal mit 1 × Waschpuffer gewaschen und 100 μl des verdünnten Sekundärantikörpers (1:1000 in 1 × Antikörperbindungspuffer) hinzu pipettiert. Die Inkubation wurde 1 h bei Raumtemperatur ohne Schütteln durchgeführt. Der Überstand wurde erneut verworfen und die Platte viermal mit 1 × Waschpuffer gewaschen. Zu jedem Well wurden 100 μl Entwicklungslösung pipettiert und für 2–10 Minuten lichtgeschützt inkubiert. Die optimale Entwicklungszeit hängt von der Charge des P53-Antikörpers ab und wird im Datenblatt zu jedem Kit angegeben. Die Farbreaktion wurde anschließend durch Zugabe von 100 μl Stopplösung abgebrochen und die Absorption bei 450 nm gegen eine Referenzwellenlänge bei 650 nm gemessen. Die Referenzwellenlänge entspricht der Absorption des TMB ohne die Umsetzung mit H2SO4 und sollte deshalb gering sein. Zur Auswertung wurde von allen Messwerten der Hintergrundwert, welcher im Well mit ausschließlich Lysepuffer gemessen wurde, abgezogen und die Proben auf den Proteingehalt normalisiert. Die Normalisierung auf Absorption/μg Protein ermöglicht es, die verschiedenen Proben untereinander zu vergleichen. Tabelle 2.16: Herstellung der Puffer für den TransAMTM P53
    Reagenz Komponenten Volumen pro Well in μl
    Bindungspuffer DTT (1M) 0,040
    Poly[d(1-C)] 0,400
    Bindungspuffer AM5 39,560
    Lysepuffer DTT (1M) 0,009
    Proteaseinhibitor-Cocktail 0,107
    Lysepuffer AM2 9,884
    1 × Waschpuffer Destilliertes Wasser 1800
    10 × Waschpuffer AM2 200
    1 × Antikörperbindungspuffer Destilliertes Wasser 180
    10 × Antikörperbindungspuffer AM2 20
    Entwicklungslösung fertig zur Verwendung 100
    Stopplösung fertig zur Verwendung 100
  • 2.6.4 Bradford-Proteinbestimmung
  • Die Proteinbestimmung nach Bradford ist eine sehr sensitive Methode, die auf der Wechselwirkung von Proteinen mit dem Triphenylmethanfarbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 beruht [177]. Dieser bildet in saurer Lösung sowohl mit basischen (vor allem Arginin) und aromatischen Aminosäuren von Proteinen Komplexe [178]. Es gibt drei verschiedene Formen in denen der Farbstoff vorkommt: eine kationische rote Form, eine neutrale grüne Form und eine anionische blaue Form [178]. Unter sauren Bedingungen ist vorwiegend die rote kationische Form mit einem Absorbtionsmaximum von 470 nm zu finden [179]. Durch die Bindung der Proteine an den Farbstoff wird dieser in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfonatform stabilisiert und es verschiebt sich das Absorptionsmaximum von 470 nm auf 495 nm. Die Zunahme der Absorption bei 595 nm kann photometrisch gemessen werden und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung [179]. Allerdings ist das Ausmaß der Farbreaktion vom Proteintyp abhängig, weshalb zur genauen Quantifizierung eine Eichgerade mit dem entsprechenden Protein in bekannten Konzentrationen erforderlich ist [180]. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration von Gemischen, von denen kein Standard zur Verfügung steht, werden Standardproteine, wie z. B. Rinderserumalbumin oder Rindergammaglobulin, verwendet [180].
  • Die Herstellung des Bradford-Reagenz für die Messung erfolgte durch das Lösen von 100 mg Coomassie-Brilliant-Blau G250 in 250 ml Ethanol und anschließender Zugabe von 100 ml 85%ige Phosphorsäure. Für die Durchführung der Messung wurden 10 μl von jeder Probe bzw. vom Lysepuffer als Hintergrundwert in eine transparente Mikrotiterplatte pipettiert. Alle Proben wurden in vier Replikaten vermessen. Zu jeder Probe wurden 200 μl Bradford-Reagenz hinzu pipettiert und für 5–10 min unter leichtem Schütteln (150 rpm) inkubiert. Anschließend wurde die Absorptionsmessung bei 595 nm im Plattenphotometer durchgeführt. Zur Quantifizierung der Proteinproben wurde vorher eine Eichkurve mit einem Proteinstandard aufgenommen. Dazu wurde eine Verdünnungsreihe aus einer 2 mg/ml Rinderserumalbuminstammlösung hergestellt. Die Rinderserumalbuminstammlösung wurde in destilliertem Wasser angesetzt. Hingegen wurden die nachfolgenden Verdünnungen von 100, 250, 400 und 500 μg/ml im Lysepuffer aus dem Nuclear Extract Kit (ActiveMotif) hergestellt. Als Nullwert für die Verdünnungsreihe diente reiner Lysepuffer. Die Messung erfolgte, wie für die Probenmessung vorangehend beschrieben.
  • 2.7 Datenanalysemethoden
  • 2.7.1 Allgemeine Einleitung und Herausforderungen der statistischen Datenanalyse für Omics-Daten
  • Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen basieren generell darauf, dass eine Deregulation der behandelten Proben gegenüber den entsprechenden Kontrollproben kalkuliert wurde. Ermittelt man nun eine Deregulation nach Behandlung mit einer bestimmten Substanz, bleibt jedoch die Frage ob das Ergebnis vielleicht nur das Resultat eines experimentellen Fehlers oder reinen Zufalls ist. Deshalb ist es notwendig, das Experiment mehrfach unter gleichen Bedingungen zu wiederholen und die „Signifikanz” mit Hilfe von statistischen Methoden anhand der Varianz der verschiedenen experimentellen Replikate zu ermitteln. Für eine solche Testung unterscheidet man parametrische und nicht-parametrische Tests. Parametrische Tests, zu denen der Student's T-Test, Regressions- und Varianzanalysen (ANOVA) gehören, stellen bestimmte Vorrausetzungen an die Daten. Voraussetzungen sind die Unabhängigkeit der Beobachtungen und die Normalverteilung (auch als Gauss'sche Glockenkurve bekannt), dass heißt die symmetrische, glockenförmige, eingipfelige Verteilung der Daten. Die meisten natürlich vorkommenden Merkmale sind normalverteilt. Die Normalverteilung lässt sich anhand eines Histogramms durch Bestimmung von Mittelwert, Median, Wölbung und Schiefe ab einem Stichprobenumfang von etwa 30 ermitteln. Schief verteilte Daten, zum Beispiel aufgrund der Existenz einer unteren oder oberen Grenze, lassen sich zudem häufig durch eine logarithmische oder potenzierende Transformation in eine Normalverteilung bringen. Kann man eine Normalverteilung der Daten nicht prüfen, können nicht-parametrische Tests (Rangsummentests), die auf der Analyse der Ränge von Daten basieren und somit auch für diskrete Merkmale geeignet sind, genutzt werden. Der Nachteil dieser Tests ist die geringe Power, da die Information der Daten nur unvollständig genutzt wird. Mit der Power ist die Fähigkeit des Tests, ein real signifikantes Ergebnis auch als signifikant zu klassifizieren, gemeint.
  • Bei Laborversuchen besteht das generelle Problem, dass viele Messungen, z. B. bei sehr teuren und aufwändigen Tests, wie Microarrays, nicht ausreichend oft wiederholt werden können, um eine solide statistische Auswertung durchzuführen. Zur statistischen Auswertung im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene parametrische Tests verwendet, da bei diesen geringen Stichprobenumfängen nicht-parametrische Tests wegen der zu geringen Power nur begrenzt geeignet sind. Zudem wurde aufgrund des zentralen Grenzwertsatzes, dass die Summen von unabhängigen Zufallsvariablen normalverteilt sind [181] und unter der Annahme, dass die auf die Laborexperimente wirkenden Einflussfaktoren sich eher additiv als potenzierend verhalten, von einer Normalverteilung der Daten ausgegangen. Zufällige Faktoren, die vom Menschen nicht beeinflussbar sind, verhalten sich in der Regel normalverteilt, da die einwirkenden Faktoren dann additiv aufeinander wirken. Neben dieser Annahme wurden die Rohdaten der Genexpressionsdaten vor der statistischen Testung logarithmisch transformiert. Diese Transformation wird wegen der meist asymmetrischen Verteilung der Daten genutzt, um wie vorangehend schon genannt die Daten in eine Normalverteilung zu transformieren sowie um die statistische Auswertung mit Relativdatensätzen durchführen zu können [182]. Li et al. konnten für Genexpressionsanalysen zeigen, dass die logarithmische Transformation der Daten keinen Einfluss auf die top-rangierten Gene im T-Test hat. Außerdem zeigten Giles und Kipling, dass die Abweichung von der Normalverteilung für die meisten Probensätze von Affymetrixdaten gering ist [183]. Des Weiteren sind die Methoden T-Test und ANOVA robust gegenüber moderaten Abweichungen von der Normalverteilung [184]. Alle diese Annahmen sprechen für die Verwendung von parametrischen Tests zum Zweck der statistischen Analyse der Daten.
  • Im Folgenden werden die in dieser Arbeit relevanten statistischen Methoden noch näher erläutert. Zudem wird auf Besonderheiten in der Analyse von Microarraydaten näher eingegangen. Dazu gehören die Qualitätskontrolle der enormen Datenmengen sowie die Normalisierung der Daten, um eine Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Chips und Experimenten zu gewährleisten. Des Weiteren werden Methoden zur Visualisierung der Daten und der Analyse von Datenzusammenhängen angesprochen. Die statistische Analyse der Microarraydaten wurde mit der Software Expressionist® Analyst von Genedata (Basel/Schweiz) durchgeführt. Der letzte Teil der Datenanalyse bestand dann in der biologischen Interpretation, welche mit verschiedenen Softwaresystemen (ToxWiz von Cambridge Cell Networks (Cambridge, UK) und Metacore von GeneGo (St. Joseph, USA)) und Datenbanken (NCBU NCBI AceView) [185, 186] durchgeführt wurde.
  • 2.7.2 Qualitätskontrolle der Microarrays
  • Die Überprüfung der Qualität der Illumina-Microarrays erfolgte mit der BeadStudio Software von Illumina. Zur Überprüfung der Laborprozesse der cRNA-Synthese, der Hybridisierung bis hin zur Generierung des Fluoreszenzsignals gibt es von Illumina sechs verschiedene Kontrollen auf den BeadChips. Die erste Kontrolle stellen 14 verschiedene Sonden für Housekeeper dar. Dabei werden zwei verschiedene Oligonukleotidsonden für je einen Housekeeper eingesetzt. Die von Illumina gewählten Housekeeper sind speziesspezifisch charakteristisch und sollten für die verwendete Spezies immer exprimiert werden. Die nächsten drei Kontrollen sind zur Qualitätskontrolle des Hybridisierungsprozesses vorhanden. Dazu gehören eine Cy3, eine hoch-stringente und eine niedrig-stringente Hybridisierungskontrolle. Die Cy3-Kontrolle besteht aus sechs verschiedenen Oligonukleotidproben auf dem Chip und den korrespondierenden Cy3-markierten Oligonukleotiden, welche über den HybE1-Puffer in die Reaktion eingebracht werden. Damit liefern die Cy3-Kontrollen bei erfolgreicher Hybridisierung unabhängig von der RNA-Probenqualität und dem Präparationsprozess der Proben ein Signal. Die niedrig-stringente Kontrolle entspricht der Cy3-Kontrolle, besitzt aber zwei Fehlpaarungsstellen in der Oligonukleotidsequenz auf dem Chip. Außerdem setzt sie sich nur aus vier verschiedenen Proben zusammen. Bei optimaler Hybridisierung liefern diese Proben nur ein schwaches Signal. Im Gegensatz dazu liefert die hoch-stringente Kontrolle, aufgrund des hohen GC-Gehaltes im Oligonukleotid ein sehr starkes Signal. Die fünfte Kontrolle ist die Biotinkontrolle, welche aus zwei Proben besteht. Diese Biotin-markierten Oligonukleotide gelangen über den HybE1-Puffer in die Reaktion und zeigen den Erfolg der sekundären Färbereaktion mit dem Cy3-Farbstoff an. Die sechste Kontrolle besteht aus 20 verschiedenen Oligonukleotiden mit randomisierter Sequenz, welche keinen Partner im Genom der jeweiligen Spezies besitzt. Diese Kontrolle dient als Negativkontrolle und definiert den Hintergrund des Systems. Sie zeigt damit auch unspezifische Bindungen des Farbstoffs oder Kreuzreaktionen bei der Hybridisierung an. Anhand dieser Kontrolle wird im BeadStudio die Detektionsgrenze für die Genexpression des Experiments festgelegt [187].
  • Neben einer zusammenfassenden Darstellung der Kontrollen erlaubt es die BeadStudio Software durch verschiedene Möglichkeiten die Daten zu visualisieren (Log-Log-Plots, Histogramme, Box-Plot-Analysen), um experimentelle Ausreißer zu identifizieren. Arrays, welche die Qualitätsmerkmale nicht erfüllten, wurden aus der Analyse entfernt bzw. erneut hybridisiert.
  • 2.7.3 Normalisierung der Microarraydaten
  • Zum Vergleich von Genexpressionsdaten, welche unter verschiedenen Bedingungen (z. B. verschiedene Zeitpunkte, Technologien, Experimenten oder Gewebe) gewonnen wurden, ist es notwendig, die Daten auch vergleichbar zu machen [188]. Dazu werden die Daten mit speziellen Algorithmen normalisiert. Systematische Fehler, die zu Abweichungen in der Signalintensität verschiedener Arrays führen, können durch eine normalisierende Transformation ausgeglichen werden [184]. Solche Unterschiede in der Signalintensität zwischen verschiedenen Arrays können aus verschiedenen Gründen, wie unterschiedliche Protokolle, Einsatzmengen der mRNA, Scannereinstellungen, Hybridisierungen oder cRNA-Synthesekits, zustande kommen. Unter den Normalisierungsmethoden werden lineare und nicht-lineare Methoden unterschieden. Zu den linearen Methoden gehören Mittelwert- bzw. Median-Normalisierungen, bei denen alle Intensitäten um den entsprechenden Wert korrigiert werden. Des Weiteren können Referenzgene (Housekeeper), die gleiche Expressionswerte zwischen verschiedenen Arrays aufweisen sollten, als Normalisierungsausgangspunkt genutzt werden. Dabei wird jeweils der Abweichungsfaktor zwischen den verschiedenen Arrays errechnet und die Genintensitäten um diesen Faktor korrigiert [188]. Solche Methoden bieten sich an, wenn sich im Log-Log-Plot der Intensitäten zwischen verschiedenen Arrays eine Verschiebung der Datenwolke parallel zur Mittellinie zeigt. Für Datensätze, welche einen nicht-linearen Verlauf (häufig bananenförmig) im Log-Log-Plot (bananenförmiger Verlauf) zeigen, werden nicht-lineare Methoden genutzt. Zu diesen Methoden gehören zum Beispiel die LOWESS-, Quantil- und Cubic Spline-Normalisierung.
  • LOWESS (Locally Weighted Polynomial Regression) unterteilt die Daten in eine Anzahl von überlappenden Intervallen und passt eine Funktion ähnlich einer exponentiellen Normalisierung aber in polynomischer Form an [188]. Nachteile der LOWESS-Normalisierung sind, dass sie nicht einfach in einer mathematischen Formel darstellbar und durch die komplizierte Berechnung sehr zeitintensiv ist. Dieser Nachteil kann heute allerdings durch effektive Computersoftware aufgefangen werden. Ein anderer Nachteil ist, das LOWESS anfällig gegenüber Hintergrundrauschen und Ausreißern ist. Deswegen sollten Ausreißer vorher aus dem Datensatz entfernt werden [188]. Die Software Expressionist® Analyst bietet zur Datennormalisierung mit LOWESS einen modifizierten Algorithmus von Cleveland an [189]. Dabei werden die Daten gegen ein Referenzexperiment normalisiert. Werden mehrere Daten ausgewählt, so wird ein gemitteltes Referenzexperiment verwendet.
  • 2.7.4 Globale Datenbetrachtung
  • 2.7.4.1 Hauptkomponentenanalyse
  • Die Hauptkomponentenanalyse (Principal component analysis, PCA) ist eine Visualisierungsmöglichkeit für umfangreiche Datensätze, wie Microarraydaten [188]. Das Ziel der Analyse ist es den multidimensionalen Datensatz auf wenige bedeutende Dimensionen zu reduzieren, wobei der Informationsverlust möglichst minimal sein soll. Jedes Experiment und jedes Gen repräsentieren in einem Microarraydatensatz jeweils eine Dimension. Hat man beispielsweise zehn verschiedene Experimente, in welchen 20.000 Gene gemessen wurden, so wäre die Darstellung einer Datenwolke aus den zehn Experimentpunkten im 20.000-dimensionalen Raum. Für die Hauptkomponentenanalyse werden die Dimensionen als bedeutende Dimensionen angesehenen, welche zwischen den Daten stark variieren. Anderen Dimensionen mit einer geringen Varianz innerhalb des Datensatzes werden vernachlässigt. Bei der Hauptkomponentenanalyse werden statistische Eigenschaften erster Ordnung der Daten (Varianz) genutzt, um die Daten in einem neuen Koordinatensystem mit einigen wenigen Dimensionen darzustellen. Häufig werden zwei- oder dreidimensionale Darstellungen genutzt. Die Richtungen der neuen Achsen im Koordinatensystem sind Eigenvektoren der Korrelationsmatrix der Daten und stehen senkrecht aufeinander. Wird die Hauptkomponentenanalyse anhand von Genen verschiedener Experimente durchgeführt, dann werden im Graph die einzelnen Experimente jeweils als Punkt dargestellt. Wird die Analyse hingegen mit einem bestimmten Experiment durchgeführt, dann wird jedes Gen im Graph als ein Datenpunkt dargestellt. Die Hauptkomponentenanalyse kann somit einen in den Daten vorhandenen Trend wiedergeben, aber auch Ausreißer aufzeigen oder dazu genutzt werden, Gene mit niedriger Variabilität zwischen verschiedenen Experimenten herauszufiltern [188].
  • 2.7.5 Student's T-Test
  • Der T-Test wurde 1908 von William Sealy Gosset, einem Chemiker der Guiness Brauerei in Dublin, für die Qualitätskontrolle des Brauprozesses eingeführt [188]. Da die Guiness Brauerei Gosset nicht erlaubte unter seinem Namen zu publizieren, schrieb er alle seine Veröffentlichungen unter dem Künstlernamen „Student”, wodurch der T-Test als Student's T-Test weltbekannt wurde. Der T-Test ist eine Form der Hypothesentestung und wird zur Kalkulation der Wahrscheinlichkeit, dass die beobachteten Werte gefunden wurden, obwohl die Nullhypothese gilt, angewendet. Die Nullhypothese besagt, dass sich der Mittelwert zwischen den beiden Verteilungen (Kontrolle und behandelten Proben) nicht unterscheidet. Zur Berechung der Wahrscheinlichkeit werden der Mittelwert und die Varianz der Proben verwendet. Die Zugrunde liegende Wahrscheinlichkeitsverteilung wird t-Verteilung genannt und hängt von der Anzahl der Freiheitsgrade ab. Die Anzahl der Freiheitsgrade berechnet sich aus der Anzahl n an unabhängigen Messungen minus der Anzahl an in die Berechnung einfließenden Parameter [188]. Die Berechnungen des t-Wertes für zwei normalverteilte Stichproben mit gleichen Varianzen wurden wie folgt vorgenommen [190]:
    Figure 00940001
    Formel 2.6: Berechnung des t-Wertes für zwei verbundene Stichproben.
    • d
    Mittelwert der Differenzen vor und nach der Behandlung
    sd
    Stichprobenstandardabweichung der Differenzen vor und nach der Behandlung
    n
    Stichprobenumfang
  • Die Anzahl der Freiheitsgrade für die Berechnung des p-Wertes beträgt für verbundene Stichproben n – 1.
    Figure 00940002
    Formel 2.7: Berechnung des t-Wertes für zwei unverbundene Stichproben.
    • x
    Mittelwert der Stichprobe 1
    y
    Mittelwert der Stichprobe 2
    n
    Stichprobenumfang der Stichprobe 1
    m
    Stichprobenumfang der Stichprobe 2
    s
    gepoolte Standardabweichung
    Figure 00950001
    Formel 2.8: Berechnung des gepoolten Standardabweichung für die Berechnung des t-Wertes für zwei unverbundene Stichproben.
    sx 2
    Varianz der Stichprobe 1
    sy 2
    Varianz der Stichprobe 2
    n
    Stichprobenumfang der Stichprobe 1
    m
    Stichprobenumfang der Stichprobe 2
  • Die Anzahl der Freiheitsgrade für die Ermittlung des p-Wertes errechnet sich bei zwei unverbundenen Stichproben aus n + m – 2 [190]. Anhand der ermittelten t-Werte und mit Hilfe der Freiheitsgrade kann aus der t-Verteilung mit Hilfe von Tabellen oder geeigneter Statistik-Software die Wahrscheinlichkeit (p-Wert), dass die Nullhypothese gilt, ermittelt werden. Ein kleiner p-Wert sagt somit aus, dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Mittelwerte der beiden Verteilungen übereinstimmen (Nullhypothese) sehr gering ist und somit die Alternativhypothese angenommen werden kann [190]. Dazu wird ein bestimmtes Signifikanzniveau festgelegt. Häufig wird aus historischen Gründen 0,05 als Signifikanzniveau in der Statistik verwendet, d. h. bei einem p-Wert von 0,05 hat man eine 5%ige Irrtumswahrscheinlichkeit die Nullhypothese fälschlicherweise abgelehnt zu haben.
  • 2.7.6 ANOVA
  • Im Gegensatz zum T-Test erlaubt es die Varianzanalyse ANOVA, mehrere verschiedene Gruppen oder Bedingungen parallel zu testen [188]. Im einfachsten Fall von zwei Proben entspricht die ANOVA dem T-Test. Man unterscheidet bei der ANOVA zwischen unifaktorieller und mehrfaktorieller Varianzanalyse, die sich in der Anzahl der einfließenden Faktoren in die Analyse unterscheiden. Eine einfache ANOVA basiert darauf, dass die Variabilität zwischen den verschiedenen Testgruppen mit der Variabilität innerhalb der Testgruppe verglichen wird. Die Voraussetzungen für die ANOVA sind, wie für den T-Test, Varianzhomogenität und die Normalverteilung der Daten. Die zugrunde liegende Wahrscheinlichkeitsverteilung ist die F-Verteilung [188].
  • Das mathematische Prinzip hinter einer einfaktoriellen ANOVA ist die Zerlegung der Quadratsumme der Gesamtvarianz (SSTotal), d. h. der Quadratsumme aller Differenzen der individuellen Beobachtungen vom globalen Mittelwert [188]: SSTotal = SSFehler + SSKond.
  • Formel 2.9: Zerlegung der Quadratsumme für die Gesamtvariabilität als Grundprinzip der ANOVA.
  • SSFehler ist dabei die Quadratsumme der Varianz innerhalb der Gruppen [188]. Sie sollte im Prinzip gering sein, da jegliche Abweichungen zwischen den Replikaten einer Gruppe durch experimentelle Fehler zustande kommen. Deshalb wird diese Varianzquadratsumme als SSFehler bezeichnet. Die SSKond. steht für die Varianz der Gruppen um den globalen Mittelwert (Varianz zwischen den Gruppen) und charakterisiert die Varianz einer bestimmten Kondition/Bedingung (oder Behandlung). Mit Hilfe der entsprechenden Freiheitsgrade können dann die mittleren Fehlerquadrate für SSFehler und SSKond. berechnet werden [188]:
    Figure 00960001
    Formel 2.10: Berechnung der mittleren Fehlerquadrate für die Variabilität innerhalb der Gruppen (A) und zwischen den Gruppen (B) zur Berechnung des F-Wertes bei der ANOVA.
    • k
    Anzahl an verschiedenen Bedingungen
    N
    Gesamtanzahl an Messungen im Datensatz
    SSFehler
    Quadratsumme der Varianz innerhalb der Gruppen
    SSKond.
    Quadratsumme der Varianz zwischen den Gruppen
    Figure 00970001
    Formel 2.11: Berechnung des F-Wertes bei der einfaktoriellen Varaianzanalyse.
    SSKond.
    Quadratsumme der Varianz zwischen den Gruppen
    MSF
    mittlere Fehlerquadrate für die Variabilität innerhalb der Gruppen
  • Anhand des F-Wertes und mit den Freiheitsgraden k – 1 und N – k kann anschließend der p-Wert ermittelt werden [188]. Dieses Grundprinzip gilt auch für die mehrfaktorielle Varianzanalyse, bei der verschiedene Faktoren gleichzeitig, z. B. Behandlung und Zeitverlauf, untersucht werden können. Die Varianzanalyse wurde in dieser Arbeit genutzt, um die genotoxischen Behandlungsgruppen in verschiedenen Dosierungen gegen die nicht-genotoxischen Kontrollen zu vergleichen. Die Berechnungen erfolgten mit der Software Expressionist® Analyst von Genedata (Basel/Schweiz).
  • 2.7.7 Fehler beim statistischen Testen und Probleme des multiplen Testens
  • Bei der statistischen Hypothesentestung gibt es zwei verschiedene Fehlerarten, α- und β-Fehler [188, 190]. Der α-Fehler bedeutet, dass man die Nullhypothese fälschlicherweise ablehnt, obwohl sie gilt. Dieser Fehler ist mit dem p-Wert kalkulierbar. Im Gegensatz dazu, tritt der β-Fehler unter der Alternativhypothese auf, d. h. man nimmt fälschlicherweise die Nullhypothese an, obwohl sie nicht gilt. Dieser Fehler ist nicht kalkulierbar und ist vor allem bei kleinen Stichprobenumfängen groß [188, 190]. Tabelle 2.17: Fehlerarten beim statistischen Testen. Die Tabelle gibt einen Überblick über mögliche Fehler beim statistischen Testen und bezeichnet die aufgeschlüsselten Ausgänge mit entsprechenden Variablen. G = Anzahl der Hypothesen (z. B. Gene auf dem Microarray), R = Testergebnis (als signifikant deklarierte Gene durch den Test), G0 = Anzahl wahre Nullhypothesen, G1 = Anzahl wahre Alternativhypothesen, B/G0 = Falsch-Positiv-Rate, 1 – (B/G0) = Spezifität (Richtig-Negativ-Rate), D/G1 = Sensitivität (Richtig-Positiv-Rate), C/G1 = Falsch-Negativ-Rate [Tabelle modifiziert nach 188, 190]
    Testentscheidung
    Nullhypothese Alternativhypothese
    Realität Nullhypothese ist richtig (A) Richtige Entscheidung 1 – α (B) Falsche Entscheidung α (Fehler 1. Art) G0
    Alternativhypothese ist richtig (C) Falsche Entscheidung β (Fehler 2. Art) (D) Richtige Entscheidung 1 – β G1
    G – R R G
  • Ein weiteres Problem, auf welches man vor allem bei der Testung von tausenden Hypothesen parallel bei der Analyse von Microarraydaten stößt, ist es, dass der Fehler 1. Art (α-Fehler) sehr groß werden kann [188]. Bei 1.000 Tests und einem Signifikanzlevel von 0,05 sind schon 50 falsch positive Ergebnisse wahrscheinlich. Die Wahrscheinlichkeit, dass wenigstens ein p-Wert kleiner ist als α konvergiert für unabhängige Tests mit steigendem k nach 1 – (1 – α)k. Nimmt man zum Beispiel ein α von 0,01 an und testet 1.000-mal, dann ist die Wahrscheinlichkeit mindestens ein signifikantes Ergebnis zu bekommen schon 0.9999568. Die individuellen p-Werte reichen deshalb allein nicht aus, um die falsch-positiven Ergebnisse zu kontrollieren [188].
  • Eine Möglichkeit zur Kontrolle ist die Adjustierung von p-Werten. Viele dieser Methoden sind allerdings zu konservativ für Microarrays und können zu einer niedrigen Sensitivität führen [191]. Eine bessere Möglichkeit ist die so genannte False Discovery Rate (FDR). Definiert ist die FDR als der erwartete Anteil an falsch-positiven (Fehlern 1. Art) unter den als signifikant deklarierten Resultaten [191]. Folgendes Beispiel soll das Problem des multiplen Testens illustrieren: Angenommen von 10.000 (G) untersuchten Genen sind 9.500 (G0) in Wirklichkeit nicht dereguliert und 500 (G1) sind dereguliert. Die Hypothesentestung liefert nun als Ergebnis 875 (R) signifikant deregulierte Gene (siehe Tab. 2.17 für die Buchstabenbezeichnungen). Nimmt man an, dass davon nur 400 Gene (D) auch in Wirklichkeit exprimiert und 475 (B) falsch-positiv sind, dann ist die Falsch-Positiv-Rate 475 (B)/9.500 (G0) = 5%, d. h. der Anteil an falsch-positiven Genen, an den in Wirklichkeit nicht deregulierten Genen. Das wiederum bedeutet, dass der Test eine Richtig-Negativ-Rate (Spezifität) von 95% besitzt. Auch die Sensitivität (Richtig-Positiv-Rate) des Tests ist für das folgende Beispiel hoch: 400 (D) von 500 (G1) Genen wurden richtig erkannt, was 80% entspricht. Betrachtet man nun aber die FDR: 475 (B, falsch-positiv identifizierte Gene)/875 (R, vom Test als signifikant deklarierte Gene) = 54%, d. h. in diesem Fall sind 54% der als signifikant durch den Test gefundenen Gene fingiert. Dieses Beispiel zeigt, dass wenn nur die Signifikanz mit dem p-Wert, also die Falsch-Positiv-Rate kontrolliert wird, trotzdem eine hohe Rate an falsch-signifikanten (gefundenen/discovered) Genen existieren kann und das trotz einer adäquaten Power des Tests. Der Grund dafür liegt eben an der großen Anzahl an getesteten Hypothesen (im Beispiel 10.000 Gene) und dem nur geringen Anteil an deregulierten Genen im Vergleich zur Gesamtanzahl der untersuchten Gene. Durch Reduktion des p-Wertes kann auch die FDR minimiert werden, allerdings hängt diese aber immer vom Anteil der Gene ab, die auch in Wirklichkeit reguliert sind. Der p-Wert ist also nur ein indirekter Weg zur Kontrolle der FDR, besser ist es, die FDR selbst als Kriterium zu verwenden [191]. Deshalb wurde bei der Analyse der Microarraydaten in der vorliegenden Arbeit die FDR von Benjamini und Hochberg als Signifikanzkriterium anstelle des p-Wertes verwendet [192].
  • 2.7.8 K-Means
  • Das K-Means Clustering gehört zu den nichtüberwachten (unsupervised) statistischen Lernverfahren. Das Ziel einer K-Means Cluster-Analyse ist es M verschiedene Datenpunkte (Gene) in N Dimensionen in eine Anzahl von k Clustern einzuteilen, so dass die Summe der Quadrate minimal wird [193]. Vor der Analyse wird festgelegt, in wie viele verschiedene Cluster man den Datensatz einteilen möchte. Zuerst werden dann alle Gene zufällig auf die k Cluster verteilt und die Distanz jedes Gens zu jedem der k Cluster-Zentren berechnet. Wenn für ein Gen dabei eine niedrigere Distanz zu einem anderen Cluster-Zentrum errechnet wird, als zu dem ursprünglich zugeordneten Cluster-Zentrum, wird es neu dem anderen Cluster-Zentrum zugeordnet. Sind alle Gene zugeordnet, werden die Distanzen erneut berechnet. Nach einigen Iterationen wird es keine Veränderungen in den Zuordnungen mehr geben und der Algorithmus stoppt [184]. Mit der Sofware Expressionist® Analyst ist es zudem möglich, die optimale Anzahl an k berechnen zu lassen. Das K-Means Clustering wurde in dieser Arbeit verwendet, um Gene, welche mittels ANOVA als statistisch signifikant reguliert gefunden wurden, in verschiedene Gruppen (z. B. hoch- und herunterreguliert) einzuteilen und den Verlauf der Deregulation zwischen den verschiedenen Kontroll- und Behandlungsgruppen näher zu analysieren.
  • 2.7.9 Maschinelles Lernen (Supervised Learning)
  • Die Extraktion nützlicher Informationen aus den massiven Datenmengen bei Omicsstudien ist eine der größten Herausforderungen der modernen Bioinformatik. Maschinelles Lernen (Überwachtes Lernen oder engl. Supervised Learning) heißt, mittels Computerprogrammierung ein bestimmtes Leistungskriterium in Form von Parametern eines mathematischen Modells anhand von Beispieldaten aus der Vergangenheit zu optimieren [194]. Das wiederum bedeutet, dass mit Hilfe des Computerprogramms gewisse Muster oder Gesetzmäßigkeiten aus den Lerndaten abgeleitet werden, welche prädiktiv für die Beurteilung unbekannter Daten sein können. Darin liegt zudem der Unterschied zwischen überwachtem und unüberwachtem Lernen. Während das Ziel beim überwachten Lernen das Erlernen der Abbildung von Ein- auf bekannte Ausgabewerte ist, sind die Ausgabewerte beim unüberwachten Lernen nicht bekannt. Für die Erstellung mathematischer Modelle im Rahmen des maschinellen Lernens werden statistische Theorien mit effizienten Algorithmen verarbeitet. Die verschiedenen maschinellen Lernalgorithmen unterscheiden sich entweder in den vorausgesetzten Modellen, den verwendeten Verlustmaßen oder in der eingesetzten Optimierungsprozedur [194].
  • 2.7.9.1 Klassifikationsalgorithmen beim maschinellen Lernen
  • Die in dieser Arbeit verwendeten Klassifikationsalgorithmen waren K-Neorest Neighbours, Sparse Linear Discriminant Analysis und die Supportvektormaschinen. Das Nächste-Nachbarn-(K-Neorest Neighbour)-Modell ist ein Klassifikationsverfahren, bei dem die Zuordnung einer Probe zur jeweiligen Klasse aufgrund der Betrachtung der Annotation der k nächsten Nachbarproben vorgenommen wird [194].
  • Hingegen basiert die lineare Diskriminanzanalyse (LDA) auf der Konstruktion einer Hyperebene zwischen den Datengruppen. Die Hyperebene wird dabei durch eine lineare Diskriminanzfunktion beschrieben [194]. Im Allgemeinen werden die Daten bestehend aus k Gruppen bei der LDA versucht im niedrig-dimensionalen Raum anhand der am besten diskriminierenden Komponenten mit höchstens k – 1 zu trennen [195]. Die diskriminierenden Komponenten sind dabei diejenigen orthogonal zueinander stehenden Komponenten, bei welchen die Varianz zwischen den Klassen maximal und innerhalb der Klassen minimal ist. Allerdings ist die einfache LDA oft nicht geeignet, wenn die Anzahl der Prädiktionsvariablen zu groß, im Vergleich zur Anzahl der Beobachtungen ist, wie es bei Omics-Analysen vorkommt. Außerdem ist es bei Omics-Analysen wichtig, die essentiellen Merkmale des Datensatzes zu selektieren. Das kann durch die Verwendung einer speziellen Modifikation der LDA, der so genannten spärlichen LDA (Sparse Linear Discriminant Analysis, SLDA), erreicht werden. Diese beschränkt sich auf nur wenige Merkmale, welche für die Trennung von zwei oder mehr Klassen notwendig sind. Da die Merkmalsselektion, die Dimensionsreduktion und die anschließende Klassifizierung in einer Analyse vereint sind, ist die SLDA schneller als traditionelle LDA-Methoden [195].
  • Die so genannten Supportvektormaschinen (SVMs) basieren auf der Präprozessierung der Daten, um ein charakteristisches Muster in einer hohen Dimension darzustellen und anhand dessen eine Trennung durch Berechnung einer Hyperebene vornehmen zu können ( ) [196]. Das Ziel bei den SVMs ist es, eine klassenseparierende Hyperebene mit maximaler Breite zu ermitteln, da erwartet wird, dass je breiter die Trennebene, umso besser auch die Generalisierung des Klassifikators ist. Die Hyperebene wird aufgrund von Stützvektoren definiert. Diese werden durch die Trainingsproben mit gleichem Abstand zur Trennebene verkörpert. Diese Proben sind einerseits die am schwierigsten zu klassifizierenden Proben, aber andererseits auch diejenigen, die die informativsten Muster für die Klassifizierung liefern.
  • 2.7.9.2 Kreuzvalidierungsmethode
  • Um die verschiedenen Klassifikationsalgorithmen miteinander zu vergleichen und die Güte der Klassifikatoren einschätzen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine k-fache Kreuzvalidierung herangezogen. Das Prinzip dieser Methode ist es, den Datensatz in k verschiedene Teile zu zerlegen und jeden Teil jeweils bei der Erstellung des Klassifikators herauszulassen [196]. Der ausgelassene Teil wird anschließend als Testdatensatz genutzt und die Fehlerrate bei der Einordnung des Testdatensatzes kalkuliert. Die Fehlerraten der verschiedenen Teiltestungen werden zu einer Gesamtfehlerrate zusammengefasst.
  • Die leave-one-out-Kreuzvalidierung ist ein Sonderfall der k-fachen Kreuzvalidierung, bei welcher immer eine Beobachtung herausgenommen wird [196]. Ambroise et al. konnten jedoch zeigen, dass für die Selektion von Genen innerhalb von Microarraystudien eine k-fache Kreuzvalierung mit k = 10 gegenüber der leave-one-out-Methode zu bevorzugen ist [197]. Deshalb wurde in dieser Arbeit auf eine 10-fache Kreuzvalidierung zurückgegriffen.
  • 2.7.9.3 Ermittlung von Rangordnungen (Ranking-Verfahren)
  • Neben der Erstellung eines Klassifikators ist es entscheidend, die Gene, mit der meisten Information bezüglich der Klassentrennung herauszufinden [198]. Außerdem kann generell angenommen werden, dass ein Satz von Genen existiert, bei welchem die Missklassifikationsrate minimal ist. Dafür wird einerseits ein Minimum an Genen für eine hinreichende Klassentrennung benötigt, andererseits führt die Verwendung zu vieler Gene durch den hohen Hintergrund meist zu einer reduzierten Trennschärfe ( ).
  • Zur Extraktion der informativsten Gene wurde in dieser Arbeit ein Ranking-Verfahren genutzt. Als Ranking-Methode wurde eine ANOVA herangezogen. Diese vergleicht, wie unter 2.7.6 bereits beschrieben, die Varianzen zwischen den Gruppen der Experimente mit den Varianzen innerhalb der Gruppen. Beim Ranking werden die Gene demzufolge nach ihrem ANOVA p-Wert sortiert. Anschließend wird die Missklassifikationsrate mit Hilfe einer k-fachen Kreuzvalidierung für verschiedene Untergruppen an Genen, beginnend mit dem gesamten Datensatz, gefolgt von der sukzessiven Auslassung weiterer Gene, berechnet [198]. Eine skizzierte Darstellung der erhaltenen Kurven gibt . Zum Vergleich mehrerer Klassifikationsalgorithmen können diese parallel getestet und anhand ihrer Kurvenverläufe vergleichend betrachtet werden.
  • 3 Ergebnisse und Diskussion
  • 3.1 Untersuchung genotoxischer Verbindungen in vitro
  • 3.1.1 Genexpressionsanalysen mit genotoxischen Verbindungen
  • 3.1.1.1 Globale Datenbetrachtung
  • Das Hauptziel der Microarraystudie mit den genotoxischen Verbindungen ACT, MMS und ETO war es, Gemeinsamkeiten im Genexpressionsprofil zu finden und diese von den Kontrollen abzugrenzen. Solche Übereinstimmungen im Profil könnten künftig zur Identifikation und Charakterisierung von Verbindungen mit unbekanntem Wirkmechanismus bezüglich ihrer Gentoxizität dienen. Vor der Analyse der Gemeinsamkeiten dieser Verbindungsklasse wurde jedoch eine globale Betrachtung des Datensatzes vorgenommen. Dazu wurden die Daten mittels Hauptkomponentenanalyse anhand von drei Hauptmerkmalen des Genexpressionsmusters aufgetrennt ( ).
  • Innerhalb der PCA-Komponente 3 ordnen sich die drei verschiedenen Zeitpunkte 6 h, 24 h und 48 h der Kontrollen DMSO und Theophyllin (THEO) sowie die genotoxische Substanz ETO an. Dabei ist der frühe Zeitpunkt deutlich von den beiden späteren Zeitpunkten abgrenzbar. Außerdem befinden sich entlang dieser Komponente die 6 h Behandlungen von MMS in beiden Dosierungen. Im Gegensatz dazu konnte ACT schon ab dem 6 h Zeitpunkt separat entlang der Komponente 1 aufgetrennt werden. Dies zeigt, dass in der verwendeten Konzentration von 250 nM bereits nach 6 h starke Genexpressionsveränderungen zu verzeichnen waren. Trotz alledem konnte der 6 h Zeitpunkt klar von den beiden späteren Zeitpunkten abgegrenzt werden. Im Gegensatz dazu schienen die Genexpressionsveränderungen zwischen 24 h und 48 h relativ konstant zu bleiben, da eine Auftrennung dieser beiden Zeitpunkte für ACT nicht beobachtet werden konnte.
  • Ein ähnliches Bild, wie für ACT, wurde für die DNA-methylierende Substanz MMS in der niedrigen Dosis (nd) von 500 μM erhalten. Die Behandlungen 24 h und 48 h waren gemeinsam entlang der Komponente 2 beobachtet worden. Für die hohe Dosierung (hd) des MMS von 2 mM konnte aufgrund starker zytotoxischer Effekte keine RNA für die Microarrayanalyse nach 24 h und 48 h gewonnen werden. Die 6 h Behandlungen in der nd und hd des MMS clustern, wie auch ETO, THEO und DMSO, entlang der Komponente 3. Allerdings konnten die MMS-Behandlungen innerhalb dieser Komponente klar von denen der anderen Proben abgegrenzt werden. Die Hauptkomponentenanalyse zeigt damit für MMS sowie ACT, die stärksten Veränderungen im Genexpressionsprofil unter den verwendeten Konzentrationen und Substanzen auf. Dennoch ist für beide Substanzen der frühe Zeitpunkt den Kontrollen noch ähnlicher als die späten Zeitpunkte, was einen klaren Zeitverlauf der zunehmenden Genexpressionsveränderungen widerspiegelt.
  • Im Gegensatz zu MMS und ACT konnte ETO in der Konzentration von 500 nM im globalen Profil noch nicht von den Kontrollen DMSO und THEO abgetrennt werden. Eine Begründung für die Beobachtung könnte die im Vergleich zu ACT und MMS geringere Dosierung sein, die sich anhand des Zytotoxizitätsstatus beobachten ließ. Während ETO optisch keine Zytotoxizität zeigte, konnte für ACT und MMS vor allem bei den späten Zeitpunkten mikroskopisch zytotoxische Effekte beobachtet werden. Neben zytotoxischen Aspekten müssen allerdings auch die starken Expressionsveränderungen von ACT und MMS mit in die Betrachtung einbezogen werden. Durch diese starken Veränderungen können die schwächeren Veränderungen durch ETO nicht in den drei Komponenten aufgetrennt werden. Die Hauptkomponentenanalyse kann deshalb lediglich einen Überblick über den Datensatz geben. Tiefgreifende Aussagen sind anhand dieser Darstellung nicht möglich. Sie erfordern eine weiterführende statistische Analyse und funktionelle Interpretation der Daten (siehe folgenden Abschnitt 3.1.1.2).
  • 3.1.1.2 Putative Markergene für genotoxische Verbindungen
  • Um gemeinsam regulierte Gene der gentoxischen Testsubstanzen zu finden, wurden die Substanzen zunächst in zwei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 enthielt die Kontrollen DMSO und THEO. Hingegen umfasste Gruppe 2 die genotoxischen Verbindungen ETO, ACT und MMS. Diese Gruppen wurden mit einer Varianzanalyse (ANOVA) auf Unterschiede untersucht. Dabei wurden Gene, welche einen p-Wert und einen BH-q-Wert2
    • 2
    False discovery rate nach Benjamini und Hochberg [192]
    von kleiner als 0,01 aufwiesen, gruppiert. Dieser Gensatz wurde weiterhin kondensiert, indem nur Gene, welche gegenüber der DMSO-Kontrolle eine Deregulation von ≥ 1,5-fach zeigten, ausgewählt worden. Einer der limitierenden Faktoren war ETO, da diese Substanz im Vergleich zu den anderen Substanzen vor allem bei den früheren Zeitpunkten 6 h und 24 h noch relativ wenige Genexpressionsveränderungen über 1,5-fach im Vergleich zur Kontrolle zeigte. Deshalb wurde das Kriterium, dass alle drei Substanzen wenigstens nach 48-stündiger Behandlung eine 1,5-fache Deregulation gegenüber der Kontrolle aufweisen sollten, gewählt. Der zentrale Gensatz, welcher diese Kriterien der Signifikanz und Deregulation erfüllte, beinhaltete 66 Gene. Von diesen 66 Genen waren 45 Gene hochreguliert und 21 herunterreguliert. Diese Gene wurden mit der Datenbank von GeneGo's Metacore und der NCBI AceView Genbank [186] funktionell gruppiert. Das Resultat ist in als Gen-Funktions-Darstellung gezeigt. Die Deregulationswerte sind in Anhang 9 aufgeführt.
  • Die erste Funktionsgruppe enthält Gene, die als charakteristische Gene innerhalb der Antwort auf einen DNA-Schaden bekannt sind. Eine Vielzahl dieser Gene sind in die P53-Signalkaskade involviert und wurden bei allen genotoxischen Substanzen nach 48 h hochreguliert gefunden ( ). Das Tumursuppressorgen P53 wird, wie einleitend schon beschrieben (siehe Abschnitt 1.2.1), nach einer DNA-Schädigung aktiviert und vermittelt die Transkription einer Reihe von regulatorischen Genen des Zellzyklus und der DNA-Reparatur. Eines der P53 Targetgene, das durch alle genotoxischen Substanzen stark hochreguliert wurde, ist Stratifin (SFN)3
    • 3
    Die Gensymbole der in dieser Arbeit verwendeten Genexpressionsplattformen (Illumina und TLDA) sind immer zusätzlich in Klammern aufgeführt, insofern sie nicht mit den im Text verwendeten gebräuchlichsten Genbezeichnungen bzw. Trivialnamen übereinstimmen.
    , auch bekannt als 14-3-3σ. 14-3-3σ wurde in vielen Krebsarten als unterexprimiert gefunden, was einerseits auf Mutationen im Gen selbst und andererseits auf Mutationen des transkriptionellen Aktivators P53 zurückgeführt werden kann [199]. Wird 14-3-3σ nach einem DNA-Schaden P53-abhängig exprimiert, inhibiert es durch Bindung an Cdc25 (cell division cycle 25 homolog) den Kernimport dieses Zellzyklusregulators. Cdc25 würde in aktiver Form, ohne den Inhibitor 14-3-3σ, die Cyclin-abhängige Kinase Cdk1 aktivatorisch dephosphorylieren und somit die Komplexierung von Cdk1 mit Cyclin B und dadurch die Mitoseprogression vermitteln. Die Hochregulation des 14-3-3σ führt somit zum Zellzyklusarrest in der G2-Phase [200]. Neben der Interaktion mit Cdc25 innerhalb der G2-Kontrollpunktregulation sind weitere zellzyklusregulatorische Signalwege des 14-3-3σ beschrieben worden. 14-3-3σ inhibiert die Proteinkinase B (PKB/AKT) und stabilisiert auf diese Weise den Tumorsuppressor p27 (Kip1) [201]. P27 inhibiert wiederum die Cyclin-abhängigen Kinasen CDK2 sowie CDK4 und CDK6 und verhindert somit deren Komplexierung mit Cyclin E (CDK2) bzw. Cyclin D (CDK4, CDK6), wodurch letztendlich der G1-Arrest ausgelöst wird [201].
  • Neben dem 14-3-3σ spielt auch ein anderes P53-Targetgen, das GADD45α (growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha/GADD45A), eine entscheidende Rolle für den Zellzyklusarrest nach einem DNA-Schaden. GADD45α war nach 48 h bei allen drei gentoxischen Substanzen hochreguliert ( ). GADD45α inhibiert Cdk1 und Cyclin B und bewirkt somit den Arrest in der G2-Phase des Zellzyklus [202]. GADD45α spielt allerdings nicht nur während des Zellzyklus- und Wachstumsarrestes nach einem DNA-Schaden eine Rolle, sondern auch bei DNA-Reparaturprozessen. GADD45α kann veränderte DNA-Stellen oder acetylierte Histone erkennen und erleichtert die Zugänglichkeit der geschädigten Stellen unter anderem durch die Destabilisierung der DNA-Histon-Wechselwirkung [203]. Dadurch können Topoisomerasen ihre relaxierende Funktion ausüben, welche für die Verhinderung von DNA-Strangbrüchen entscheidend ist [203]. Außerdem ist die verbesserte DNA-Zugänglichkeit wichtig für den Angriff von DNA-Reparaturenzymen. GADD45α interagiert auch selbst mit Komponenten der DNA-Reparatur, wie PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), welches in die Nukleotidexzisionsreparatur involviert ist [204].
  • Unter den putativen Markergenen der Funktionsgruppe 1 wurden zudem einige proapoptotische Gene bei allen Substanzen hochreguliert gefunden ( ). BAX (Bcl-2-associated X protein) ist ein Mitglied der Bcl-2-Familie Gruppe 2, welche zu den apoptoseregulierenden Proteinen gehören [205]. BAX kann ein Heterodimer mit BCL-2 bilden und interagiert mit einem Innenkanal, dem VDAC (Voltage dependent anion channel) in der mitochondrialen Membran. BAX löst auf diese Weise einen Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials aus und fördert die Freisetzung von Cytochrom c [206]. Freigesetztes Cytochrom c bindet im Zytoplasma APAF-1 (Apoptotic peptidase activating factor 1) und führt zu dessen Oligomerisierung [205]. Die Bindung von Pro-Caspase 9 führt zur Bildung des so genannten Apoptosomkomplexes. Die aktivierte Caspase 9 aktiviert dann Caspase 3 durch proteolytische Spaltung. Caspase 3 aktiviert schließlich CAD (Caspase activated DNase) im Zellkern, welches für den Abbau des Chromatins verantwortlich ist [205].
  • Ein weiteres Gen, das nach Behandlung mit gentoxischen Substanzen hochreguliert war, ist Annexin 1 (ANXA1). Annexin 1 gehört zur Familie der Ca2+-abhängigen Phospholipidbindenden Proteine und wurde ursprünglich als endogener Mediator der antiinflammatorischen Wirkung von Glukokortikoiden entdeckt [207]. Obwohl die genauen Mechanismen noch nicht richtig klar sind, gibt es mittlerweile zahlreiche Publikationen, die eine proapototische Funktion des antiinflammtorischen Annexin 1 zeigen konnten [207].
  • Ebenfalls hochreguliert war LRDD (Leucin-rich and death domain containing), welches bekannt dafür ist, dass es mit anderen Proteinen, die ebenfalls Death-Domänen enthalten, interagiert [208]. LRDD fungiert wahrscheinlich als Adapter für FADD (Fas associated protein with death domain) und MADD (MAP-Kinase death domain containing) Proteine [208]. Für das Maushomolog von LRDD konnte eine p53-abhängige Regulation nachgewiesen werden. Deshalb wird vermutet, dass LRDD eine Rolle bei der p53-vermittelten Apoptoseantwort spielt [209].
  • Abgesehen von LRDD war auch RhoGDI2 (Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta/ARHGDIB) bei allen gentoxischen Substanzen hochreguliert. RhoGDI2 gehört zur Familie der Rho GDIs, welche eine Rolle bei der Translokation von Rho GTPasen zwischen Membran und Zytoplasma spielen [210]. In ruhenden Zellen liegen die Rho-Proteine an die GDIs gebunden vor und die GDIs verhindern einen GTP/GDP-Austausch und dadurch die Aktiviät der Rho GTPasen. Es konnte zudem gezeigt werden, dass GDIs Targets von apoptotischen Proteasen (Caspasen) sind und deshalb möglicherweise eine Rolle im programmierten Zelltod spielen [210].
  • Neben der Aktivierung einer Vielzahl von Komponenten der DNA-Schadensantwort, wurden Gene mit Funktionen in der transkriptionellen Regulation und Entwicklungsprozessen herunterreguliert gefunden. FJX1 (four jointed box 1) ist ein homologes Gen zum four jointed in Drosophila und wurde als nachgeschaltetes Target von Notch gefunden [211]. Der Notch-Signalweg spielt unter anderem bei der Zellentwicklung in der Leber, Hepatoblastendifferenzierung und Gallengangentwicklung eine wesentliche Rolle [212]. Die genaue Funktion von FJX1 im menschlichen Organismus ist bisher nicht bekannt. Das Drosophila Homolog four jointed ist an der Entwicklung der Extremitäten und Augen beteiligt [211]. Fjx1 scheint zudem in Mäusen eine Rolle in der Entwicklung des Nervensystems, multipler Organe und der Beine zu spielen [211].
  • Zwei weitere Gene der Funktionsgruppe Entwicklung, welche durch alle drei genotoxischen Verbindungen nach 48 h herunterreguliert waren, sind Norrin (NDP) und Frizzled Homolog 4 (FZD4). Norrin ist ein ungewöhnlicher Frizzled-Ligand, welcher nicht zur WNT-Familie gehört, aber dennoch selektiv an den Frizzled-Rezeptorsubtyp 4 (FZD4) bindet und die WNT-Signalkaskade aktiviert [213]. Der WNT-Signalweg führt normalerweise durch Bindung von WNT Liganden (sezernierten Wachstumsfaktoren) an den Frizzled-Transmembranrezeptor unter Mitwirkung des LRP (Low-density lipoprotein receptor related protein) als Korezeptor über die Hyperphosphorylierung von Dishevelled zur Inhibition der Glycogensynthase-Kinase 3 (GSK3). Dadurch wird der APC-vermittelte Abbau von β-Catenin verhindert, welches wiederum im Zellkern die LEF/TCF (lymphoid enhancer factor/T-cell factor)-abhängige Transkription von wachstumsregulatorischen Genen (z. B. Myc oder Cyclin D1) stimuliert [213]. Die Suppression des c-Myc Genproduktes durch ACT und ETO konnte in dieser Arbeit ebenfalls beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Die Herunterregulation von FJX1, NDP und FZD4 durch die mutagenen Substanzen spiegelt damit eine Störung/negative Regulation der Zellentwicklung bzw. Zelldifferenzierung wider.
  • Zusammenfassend kann man sagen, dass die Ergebnisse dieses Studienteils demonstrieren, dass eine Aktivierung von verschiedenen Prozessen, wie Zellzyklusarrest, DNA-Reparatur und Apoptose, infolge der verursachten Schädigung der DNA durch die getesteten mutagenen Verbindungen, verzeichnet werden konnte. Gleichzeitig waren transkriptionelle sowie entwicklungsbezogene Vorgänge stark heruntergefahren. Außerdem waren Gene, involviert in Entgiftungs-, Transport- und Immunsystem-vermittelte Prozesse, metabolische Vorgänge, Entwicklung, Zellstruktur und Adhäsion, infolge der Exposition mit den Mutagenen dereguliert. Zehn der 66 putativen Markergene für diese Verbindungsklasse mussten in die Kategorie weitere Funktionen eingeordnet werden, da diese funktionell noch wenig erforscht sind.
  • 3.1.2 P53 als Marker für einen induzierten DNA-Schaden
  • Unter den mittels Microarrays identifizierten putativen Markergenen für gentoxische Verbindungen (siehe Abschnitt 3.2.1.2) war eine Vielzahl von Genen hochreguliert, die in den P53-Signalweg involviert sind. Eine Hochregulation der P53-mRNA selbst konnte nicht detektiert werden. Das steht jedoch in Übereinstimmung mit anderen Publikationen, welche die Regulation der P53-Aktivität ausschließlich auf Proteinebene ohne Veränderungen der mRNA-Expressionslevel beschreiben [214]. Zur Verifikation der Microarrayergebnisse wurde deshalb der Nachweis der Aktivierung des P53-Proteins nach Behandlung der HepG2-Zellen mit den genotoxischen Verbindungen mit Hilfe eines Transkriptionsfaktor-ELISAs durchgeführt. Bei diesem Test wurde die Bindung von aktiven P53 an ein Oligonukleotid mit der entsprechenden Konsensussequenz immunchemisch nachgewiesen. Das Ergebnis des P53-Transkriptionsfaktortests ist in dargestellt (P53-Induktionswerte siehe Anhang 1). Während die Negativkontrolle THEO keine erhöhte P53-Aktivität im Vergleich zur Kontrolle zeigte, konnte bei den gentoxischen Substanzen MMS, ETO und ACT sowohl nach 24- als auch 48-stündiger Behandlung eine signifikante Erhöhung (Student's T-Test p-Wert < 0,05) an aktivem P53 gegenüber der Lösungsmittelkontrolle detektiert werden. Die stärkste Induktion zeigte ACT bei 250 nM nach 48 h mit einer 21,3-fachen Deregulation. Dagegen lagen die P53-Induktionswerte für MMS und ETO nach 48 h nur bei 5,9 und 4,0.
  • Die p53-Induktion durch die Testsubstanzen MMS, ETO und ACT wurde bereits in früheren Publikationen beschrieben. Eine MMS- und ETO-vermittelte P53-Akkumulation, verbunden mit dem Auslösen des apoptotischen Zelltods über den mitochondrialen Signalweg, konnte von Brantley-Finley et al. bereits gezeigt werden [215]. Dabei wurde eine Schlüsselrolle für das mitochondriale permeabilisationsfördernde Protein BAX bei der Einleitung der Apoptose beschrieben [215]. Eine erhöhte Genexpression von BAX war auch in dieser Studie durch alle drei getesteten gentoxischen Verbindungen zu beobachten (siehe Abschnitt 3.1.1.2/ ). Außerdem scheint der ETO-induzierte Zelltod direkt von der Funktion des p53 abzuhängen, weil die Inhibition von P53 selbst oder von nachgeschalteten Targets der Apoptoseregulation Zellen vor dem durch diesen Topoisomeraseblocker verursachten Zelltod schützt [215]. Des Weiteren ist bekannt, dass die Funktionen des p53 in der Basenexzisionsreparatur (BER) alkylierter DNA-Basen, die durch Agenzien, wie MMS, entstehen können, durch direkte Wechselwirkung mit den BER-Proteinen 5'-AP-Endonuklease und β-Polymerase vermittelt werden [216]. In Übereinstimmung mit diesen Arbeiten, waren das Gen AP-Endonuklease 2 (APEX2) nach 24 h und 48 h Behandlung mit MMS sowie die β-Polymerase (POLB) nach 48 h MMS Behandlung deutlich hochreguliert ( ).
  • In der vorliegenden Studie wurde die stärkste P53-Induktion durch die DNA-interkalierende Substanz ACT bestimmt. Obwohl für ACT auch eine inhibierende Wechselwirkung mit Topoisomerasen in hohen Dosierungen beschrieben wurde, wird die Inhibition der RNA-Polymerase II als der bestimmende Faktor der p53-Akkumulation vermutet [217]. Ljungman et al. konnten zeigen, dass die Dosis, die für die p53-Induktion benötigt wird, gut mit der für die Inhibition der mRNA-Synthese erforderlichen Dosis korreliert. Zudem deutete die relativ niedrige Rate an Strangbrüchen sogar in hohen ACT-Dosierungen auf einen untergeordneten Einfluss der Topoisomeraseinhibition für die p53-Anreicherung hin [217]. Der postulierte Mechanismus der p53-Aktivierung wird in einer sensorischen Wirkung der durch die ACT-Interkalation behinderten RNA-Polymerase II oder der mit dieser assoziierten Transkriptionsfaktoren gesehen [218]. Innerhalb dieser Arbeit konnte eine Herunterregulation der Gene für die RNA-Polymerase II sowie die Topoisomerase II durch ACT beobachtet werden ( ). Abgesehen vom Einfluss der RNA-Polymerase II-Inhibition für die P53-Aktivierung durch ACT scheint der Verlust der Mdm2-Funktion eine wesentliche Rolle zu spielen. Dies belegen Studien von Lents et al., die zeigten, dass eine kürzlich entdeckte Spleißvariante des Mdm2, bezeichnet als Mdm2+108 durch ACT stark induzierbar ist [219]. Mdm2+108 fehlt die kritische P53-regulierende Domäne, wodurch es zu einer Entkoppelung der p53-Mdm2-Rückkoppelungsregulation und somit zu einer massiven p53-Anreicherung kommt. Die Aktivierung von Mdm2+108 könnte somit einen neuen Mechanismus, über welchen geschädigte Zellen eine sofortige p53-Antwort einleiten, darstellen [219]. Innerhalb dieser Arbeit konnte auf Genexpressionsebene jedoch keine wesentliche Aktivierung von HDM2 (dem humanen Homolog von Mdm2) detektiert werden ( ). Allerdings sind die verwendeten Sonden auf den Genchips gegen den Wildtyp von HDM2 und nicht gegen die verschiedenen Spleißvarianten gerichtet und sind deshalb für die nach einem DNA-Schaden induzierten Spleißvarianten auch nicht repräsentativ.
  • Ähnliche Ergebnisse wurden für APAK (ATM and P53-associated KZNF protein) erhalten, welches sich in seiner Regulation ebenfalls nicht beträchtlich von den Kontrollproben unterschied ( ). Kürzlich wurde ein neuartiger Regulationsmechanismus für p53 durch MMS publiziert, welcher über den negativen P53-Regulator APAK vermittelt wird [220]. Dieser spielt möglicherweise auch für die ETO-vermittelte p53-Induktion eine Rolle. Nach der Exposition der Zellen mit diesen DNA-schädigenden Agenzien, wird APAK von ATM-Kinasen phosphoryliert und dissoziiert daraufhin vom p53 ab, was zu dessen Aktivierung und damit verbundener Apoptoseinduktion führt [220]. Die Deregulationswerte der Illumina-Microarrayanalysen für die in diesem Abschnitt diskutierten Gene sind in Anhang 2 zusammengestellt.
  • 3.2 Etablierung eines kombinierten Systems aus HepG2 und einem MAS
  • Die Genexpressionsanalysen mit den gentoxischen Verbindungen haben gezeigt, dass HepG2-Zellen eine charakteristische Antwort in Form der Veränderungen der Genexpression für diese Verbindungsklasse zeigen. Eine Vielzahl von gentoxischen Verbindungen ist jedoch nicht per se aktiv, sondern wird erst durch die Umsetzung von fremdstoffmetabolisierenden Enzymen zur finalen DNA-reaktiven Verbindung. HepG2-Zellen sind Hepatomzellkulturen und deshalb mit der typischen dreidimensionalen Struktur der Leber mit ihren vielen verschiedenen Zelltypen und morphologischen Besonderheiten nicht vergleichbar. Zudem sind diese Tumorzellen entartet und entsprechen somit auch funktionell nicht mehr den Hepatozyten der Leber, welche fremdstoffmetabolisierende Enzyme und Transportsysteme enthalten. Allerdings können residuale Aktivitäten fremdstoffmetabolisierender Enzyme in den HepG2-Zellen vorhanden sein. Aufgrund unterschiedlicher Publikationen diesbezüglich und möglicher Unterschiede zwischen verschiedenen Chargen bzw. Kulturbedingungen der HepG2 wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Charakterisierung der HepG2-Zelllinie bezüglich ihrer fremdstoffmetabolisierenden Kapazität angefertigt. Neben der Untersuchung der Genexpression wurden von ausgewählten CYP-Enzymen, deren erhöhte Genexpression nachgewiesen werden konnte, Aktivitätstests durchgeführt. Anhand der Informationen über die metabolische Aktivität der Zelllinie kann später ein geeignetes Kombinationssystem als Ergänzung zur metabolischen Aktivierung entwickelt werden.
  • Um mit in vitro-Systemen auch progenotoxische Substanzen erfassen zu können, werden Substanzen in der Standardgenotoxizitätstestbatterie mit Leberhomogenatfraktionen, meist S9-Leberfraktionen, entweder präinkubiert oder gemeinsam mit der Substanz in das Kulturmedium der Zellen gegeben. Zur Erweiterung des in dieser Arbeit entwickelten Systems zur Charakterisierung von genotoxischen Substanzen auf Basis von Genexpressionsveränderungen in den HepG2-Zellen, sollte im nächsten Teil der Arbeit ein kombiniertes Kultursystem von HepG2 mit einem System zur metabolischen Aktivierung (MAS) entwickelt werden. Ein solches System erfordert die Abstimmung der Bedingungen, wie pH-Wert und Innenkonzentrationen für die Aktivität der fremdstoffmetabolisierenden Enzyme und den Wachstumsbedingungen der HepG2-Zellen. Zur metabolischen Aktivierung sind prinzipiell sowohl S9- als auch Mikrosomenfraktionen von verschiedenen Spezies denkbar. In der Standardtestung wird in der Regel induzierter S9 von Ratten eingesetzt. Die Behandlung mit Induktoren führt zur Steigerung der Aktivitäten fremdstoffmetabolisierender Enzyme und kann somit die metabolische Aktivierung verbessern. Die höheren Enzymaktivitäten haben zudem den Vorteil, dass weniger des MAS verwendet werden muss und somit zytotoxische Effekte durch das MAS selbst reduziert werden können. Durch die Verwendung spezifischer Induktoren und mit Hilfe der Daten aus der Charakterisierung der HepG2-Zellen bezüglich ihrer fremdstoffmetabolisierenden Kompetenz konnte ein optimales System zur Aktivierung der progenotoxischen Substanzen entwickelt werden, dass auf die Zelllinie abgestimmt ist. Neben der Verwendung geeigneter Induktoren, mussten dabei auch die Bedingungen des Reaktionsmediums sowie die optimale Behandlungszeit der HepG2-Zellen mit dem Substanz/S9-Gemisch bestimmt werden, um zytotoxische Effekte durch das MAS möglichst gering zu halten. Solche zytotoxischen Effekte können unter anderem durch reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS), welche durch die CYP-Enzyme im MAS aufgrund der ungekoppelten Oxidation von NADPH gebildet werden, verursacht werden [221]. ROS können zelluläre Strukturen, wie Nukleinsäuren, Proteine und Lipide (Membranen), schädigen. Dieser oxidative Stress kann letztendlich zum apoptotischen Zelltod führen [222].
  • Für die Evaluierung der optimalen Parameter des Systems wurde der P53-Transkriptionsfakortest genutzt und Zytotoxizitätsstudien mit dem MAS, den Substanzen und Kombinationen aus MAS und Substanz durchgeführt [Diplomarbeit Yasmin Dietz, Universität Mainz, 223]. Als optimale Behandlungszeit der Zellen mit dem MAS/Substanz-Gemisch ergab sich eine Zeit von 6 h. Die dabei verwendete Konzentration des MAS lag für S9 bei 0,84 mg Protein/ml Behandlungsmedium (das entspricht 900 pmol CYP-Gehalt/ml Behandlungsmedium) und für Mikrosomen bei 600 pmol CYP-Gehalt/ml Behandlungsmedium. In diesem Konzentrationsbereich konnten für die 6-stündige Behandlungszeit, auch bei wiederholter Behandlung der Zellen 18 h nach Ende der letzten Behandlung, zytotoxische Effekte mit Hilfe von Zellviabilitätstests ausgeschlossen werden. Ein Behandlungsschema von 6 h täglich mit wiederholter Behandlung 18 h nach Ende der letzten Behandlung und einer erneuten Erholungsphase von 18 h bis zur Messung erwies sich als notwendig, um eine Erhöhung des P53-Proteins gegenüber der Kontrolle in den progenotoxischen Behandlungen messen zu können. Als progenotoxische Modellsubstanz für die Parameteroptimierung wurde CPA, eine häufig verwendete Positivsubstanz der Standardtestbatterie, verwendet. Für CPA konnte sowohl mit β-NF/PB-induziertem S9 als auch β-NF/PB-induzierten Mikrosomen als MAS in den oben genannten Konzentrationen eine vergleichbare Induktion von P53 gegenüber der Kontrolle nachgewiesen werden [Diplomarbeit Yasmin Dietz, Universität Mainz, 223]. Da Mikrosomen und S9 eine vergleichbare Funktionalität zeigten, wurde aus Kosten- und Praktikabilitätsgründen für alle weiteren Versuche im Rahmen dieser Arbeit nur noch β-NF/PB-induzierter S9 verwendet. Im Rahmen der Etablierung des Systems wurden neben CPA noch weitere bekannte Prokanzerogene, wie AFB1, DMBA und DEN, getestet. Die Ergebnisse der P53-Studien mit den optimierten Parameter und Behandlungsbedingungen sind in der vorliegenden Arbeit in Abschnitt 3.2.2 zusammengestellt und diskutiert.
  • 3.2.1 Charakterisierung der HepG2-Zelllinie bezüglich ihrer metabolischen Kapazität
  • 3.2.1.1 Genexpressionsanalysen fremdstoffinetabolisierender Komponenten – basale Expression in HepG2 und humanen Hepatozytenkulturen
  • Im ersten Teil der Etablierung des HepG2-MAS-System wurde eine Charakterisierung der Zelllinie HepG2 bezüglich der Expression von Genen des Fremdstoffmetabolismus durchgeführt, um das MAS auf die Zelllinie abstimmen zu können. Für diese Studien wurde die TLDA-Karte „Human DME” angefertigt. Diese Karte enthält 41 verschiedene Gene und 3 Referenzgene (Housekeeper) (Kartendesign siehe Abschnitt 2.5.3.2). Von diesen Genen sind 13 CYP-Enzyme (Phase I), 6 Transferasen (Phase II), 10 nukleäre Rezeptoren/Transkriptionsfaktoren und 12 Innentransporter. Um ein Bezugssystem für die Genexpression der Zelllinie HepG2 zu haben, wurden die Daten mit internen, bereits publizierten Daten von primären humanen Hepatozytenmonolayerkulturen verglichen [158, 224]. Primäre Hepatozytenkulturen sind, wie einleitend bereits erwähnt, das derzeitige Referenzsystem hepatischer in vitro-Systeme für toxikologische und pharmakologische Untersuchungen insbesondere für Biotransformations-, Arzneimittel-Interaktions- oder Hepatotoxizitätsstudien, da sie eine hohe Ähnlichkeit zur Leber (in vivo-Situation) aufweisen [81, 137]. Die Basalexpression der HepG2-Zellen ist in im Vergleich zu den humanen Hepatozyten von drei verschiedenen Donoren gezeigt. Die Deregulationswerte sind tabellarisch in Anhang 4 zusammengestellt.
  • Basalexpression von Genen des Phase I-Fremdstoffmetabolismus
  • Mit Ausnahme von CYP2D6 und CYP1A1 waren alle untersuchten CYP-Enzyme in Primärhepatozyten bei mindestens zwei der drei Spender stärker exprimiert als in HepG2. Während CYP1A1 eine etwa gleich starke Basalexpression in HepG2 und humane Hepatozyten zeigte, war CYP2D6 stärker in HepG2 exprimiert. CYP2C8/9/18 und 19 sowie CYP4A11/22 waren in HepG2-Zellen nicht detektierbar. Hingegen konnte bei allen humanen Spendern eine dem mittelstark exprimierten Housekeeper PPIA ähnliche bis geringfügig schwächere Regulation gemessen werden.
  • Expression von Genen der Phase II des Fremdstoffmetabolismus
  • Bei den Phase II-Enzymen waren die Glutathion-S-Transferase GSTπ1 (GSTP1) und die Sulfotransferasen SULT1A1-4 in HepG2 stärker exprimiert als in den humanen Hepatozyten von Donor 1 und 2. Donor 3 zeigte für die SULT1A2 eine ähnliche Expression wie HepG2. Hingegen konnte die GSTπ1 bei Donor 3 gar nicht detektiert werden. Die GSTα1 (GSTA1) war bei den humanen Hepatozyten aller Donoren stärker exprimiert als in HepG2. Während die GSTπ1 zur π-Unterkategorie der Klasse der löslichen GSTs gehört, ist die GSTα1 zu den membrangebundenen Formen der GSTs der α-Klasse zuzuordnen und wird stark in der humanen Leber exprimiert [225, 226]. Die humanen zytosolischen GSTs werden im Allgemeinen in vier verschiedene Hauptklassen α, μ, π und θ unterteilt und katalysieren die Detoxifikation einer Vielzahl von elektrophilen Substanzen. Dabei spielen die GSTs zum Beispiel bei der Metabolisierung von Kanzerogenen (z. B. AFB1 und PAKs, wie Benzo[a]pyren) eine bedeutende Rolle [225, 227]. Des Weiteren sind die GSTs der Klasse α in den Bilirubin- und Gallensäurestoffwechsel eingebunden und besitzen eine schützende Funktion der Zellen gegenüber oxidativem Stress [228, 229].
  • Weiterhin wurde die Expression von verschiedenen Uridinglukuronosyltransferasen (UGTs) untersucht. Die UGT1A1/3-10 und 1A6 war bei den humanen Hepatozyten sehr viel stärker exprimiert als in HepG2. Der UGT1A-Genlocus codiert für neun verschiedene UGT-Subvarianten (1 und 3–10), welche unterschiedliche Spleißvarianten darstellen, die sich in ihrer Substratspezifität unterscheiden [230]. Die UGT1A1 ist zum Beispiel spezialisiert auf Bilirubin, einfache Phenole, Flavone und Steroide während die UGT1A6 phenolische oder planare Verbindungen als Substrate bevorzugt [230]. Ähnlich zu den UGT1A-Enzymen ließ sich auch eine erhöhte Expression für die UGT2B7 in humanen Hepatozyten von Donor 1 und 2 verzeichnen, die jedoch sehr viel schwächer war als für die beiden anderen UGTs. Die UGT2B7 ist eine der bedeutendsten humanen UGT-Isoformen und spielt bei der Konjugation von Fremdstoffen und endogenen Verbindungen, zu welchen zum Beispiel verschiedene Estrogenmetabolite aber auch kanzerogene Metabolite von PAKs gehören, eine Rolle [230].
  • Basale Expression von Genen, die für transkriptionsvermittelnde Faktoren codieren
  • In der Gruppe der Transkriptionsfaktoren und nukleären Rezeptoren, welche die transkriptionelle Expression verschiedener CYP-Enzyme regulieren, war nur CAR in humanen Hepatozyten aller Donoren sehr viel stärker exprimiert als in HepG2. CAR bindet als Homo- oder Heterodimer mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR) an so genannte PBREM(Phenobarbital response enhancer modules)-Elemente innerhalb der Promotorregion der Zielgene, die an Prozessen des Fremdstoffmetabolismus und der Ausscheidung von Bilirubin beteiligt sind [231, 232]. Zu den Zielgenen des CAR gehören unter anderem CYP-Enzyme der 2B- und 3A-Familie, aber auch CYP2C8 und CYP2C9 sowie Phase II-Enzyme, wie UGT1A1 [231, 233–236]. Im Gegensatz zu anderen Kernrezeptoren ist nur CAR auch ohne Ligandenanwesenheit (konstitutiv) aktiv [236]. Im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Genexpressionsstudien konnte für CAR eine starke konstitutive Expression der CAR-mRNA in allen drei Donoren der humanen Hepatozyten nachgewiesen werden, nicht jedoch für die weiteren untersuchten Kernrezeptoren ( ). Allerdings kann CAR zusätzlich zu der beschriebenen konstitutiven Expression durch Agonisten oder inverse Agonisten reguliert werden. Solche Liganden bewirken eine Translokation des CAR-Proteins in den Zellkern, wo es aktivatorisch oder inhibitorisch die Regulation der Zielgene beeinflussen kann. Liganden für CAR sind neben dem klassischen Induktor PB, Steroide (Androstane), Retinolsäuren, Clotrimazol, Chlorpromazin oder Kohlenwasserstoffe (CITCO, TCPOBOP) [237]. Die sehr schwache konstitutive Expression des Rezeptors in HepG2 könnte mit der schwachen Expression für CYB2B6 in HepG2 gegenüber den humanen Hepatozyten korrelieren. Des Weiteren waren die CAR-regulierten CYP-Enzyme CYP2C8 und 2C9 in HepG2 überhaupt nicht detektierbar. Hingegen zeigten diese CYP-Enzyme in den CAR-positiven humanen Hepatozyten sogar dem Housekeeper PPIA vergleichbar starke Expressionen.
  • Neben einer starken Basalexpression des CAR in humanen Hepatozyten, wurde auch eine geringfügig stärkere Expression in mindestens zwei der drei Spender für den Farnesoid-X-Rezeptor (FXR), den Pregnan-X-Rezeptor (PXR) und den Leber-X-Rezeptor (LXRβ/LXRB) beobachtet. Der PXR agiert als heterodimerer Transkriptionsfaktor mit RXR in ähnlicher Weise wie CAR [236]. Deshalb ist auch das Spektrum der Zielgene mit dem von CAR vergleichbar [233, 234, 236]. Als Hauptzielgene des PXR werden jedoch CYP-Enzyme der 3A-Familie angesehen [238]. Außerdem reguliert der PXR die Expression der UGT1A1, welche in die Metabolisierung von Bilirubin involviert ist. Damit ist der PXR gemeinsam mit CAR ein wichtiger Regulator der Bilirubin-Balance [232]. Liganden, die den PXR aktivierenk, sind unter anderem Dexamethason, RIF, Pregnenolon-16-α-Carbonitril [238]. Im Gegensatz zu PXR und CAR ist der FXR ein Rezeptor für Gallensäure und führt nach Aktivierung zu einer Inhibition der hepatischen Gallensäuresynthese und zu einem verstärkten Transport von Gallensäuren aus dem intestinalen Lumen in die Leber [236]. Außerdem reguliert der FXR die Transkription von CYP7A [236]. Die Leber-X-Rezeptoren (LXRs) sind ein weiterer Vertreter der Kernrezeptorfamilie und funktionell in den Cholesterolmetabolismus und -transport sowie in den Glucosestoffwechsel und Entzündungsprozesse eingebunden [239].
  • Im Unterschied zum FXR, PXR und LXRβ waren der AhR (Arylhydrocarbonrezeptor, AHR), HNF4α (Hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF4A), COUP-TFβ (chicken ovalbumin upstream promotor transcription faktor II, COUPTFB) und der Glukokorticoidrezeptor (GR) in HepG2 und humanen Hepatozyten des Donor 1 und 2 ähnlich stark exprimiert. Donor 3 wich im Allgemeinen stärker von den anderen beiden Donoren ab, was sich bei der Gruppe der Kernrezeptoren/Transkriptionsfaktoren besonders deutlich zeigte. Der AhR ist der einzige untersuchte Rezeptor, der nicht zur Kernrezeptorfamilie, sondern zur Gruppe der basischen Helix-Schleife-Helix Per-Amt-Sim Gensuperfamilie, gehört [236]. Liganden des AhR sind polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Dioxin oder 3-MC. Nach Bindung des Rezeptors kommt es zur Translokation des Ligand-Rezeptorkomplexes in den Zellkern und nach Heterodimerisierung mit ARNT (Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) zur Aktivierung der Expression von CYP1A-Genen über die Bindung an XREs (Xenobiotic response elements) in deren Promotorregion [236].
  • HNF4α ist ein in der Leber exprimierter Transkriptionsfaktor, welcher die Expression leberspezifischer Gene für den Glucose-, Harnstoff-, Cholesterol- und Fettsäuremetabolismus sowie für Blutgerinnungsfaktoren und Gene, die während der Entwicklung der Leber eine Rolle spielen, kontrolliert [240]. HNF4α braucht keinen exogenen Liganden, da es wahrscheinlich konstitutiv an endogene Fettsäuren gebunden vorliegt. Es bindet die DNA als Homodimer und vermittelt die konstitutive Expression vieler CYP-Enzyme [56]. Kamiyama et al. konnten mittels siRNA-Knockdown4
    • 4
    siRNAs (small interfering RNAs) sind kleine RNAs die von der RNase III (Dicer) aus längeren doppelsträngigen RNAs generiert werden. Synthetisch hergestellte, 21–23 nt lange siRNAs werden in der Molekularbiologie als Technik zur Verringerung der Expression von spezifischen Zielgenen (Knockdown) eingesetzt [241].
    die Bedeutung von HNF4a für die Expression einer Reihe von CYP-Enzymen (CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 und CYP3A4), Phase II-Enzymen (UGT1A1, UGT1A9 und SULT2A1), Transportern (ABCB1, ABCB11, ABCC2, OATP1B1 und OCT1) sowie der Kernrezeptoren PXR und CAR zeigen [242]. Rodriguez-Antona et al. konnten hohe Level an HNF4α in HepG2 nachweisen [56], was im Einklang mit den in dieser Arbeit ermittelten Daten steht. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des HNF4α in allen drei Donoren der humanen Hepatozyten ähnlich stark exprimiert war, wie in HepG2. Dass viele CYP-Enzyme in HepG2 dennoch weniger stark exprimiert sind oder nicht detektiert werden konnten, könnte daran liegen, dass Koaktivatoren für HNF4α fehlen. Martinez-Jimenez et al. demonstrierten, dass HepG2 nur sehr niedrige Expressionslevel der HNF4a-Koaktivatoren SRC1 und PGC1α aufweisen [240]. Die Transfektion von SRC1 in HepG2 verursachte eine signifikante Transaktivierung des HNF4-regulierten CYP2C9 Promoters [243]. Diese Daten indizieren, dass von HepG2-Zellen exprimiertes HNF4a auch funktionell aktiv ist und die verminderte Aktivität wahrscheinlich aufgrund der fehlenden Kofaktoren zustande kommt [243].
  • Der GR und COUP-TFβ gehören zur Familie der Kernrezeptoren und sind ebenfalls als transkriptionelle Regulatoren aktiv [244]. Beide sind in Prozesse, wie Glucose-, Fettsäure-, Cholesterol- und Xenobiotikametabolismus, involviert. GR und COUP-TFβ stimulieren zum Beispiel gemeinsam die Gluconeogenese in der Leber über die Hochregulation der Transkription der Phosphoenolpyruvatcarboxykinase. COUP-TFβ selbst supprimiert zudem die transkriptionelle Aktivität anderer nukleärer Rezeptoren, wie des Retinolsäure-, Thyroidhormon-, Vitamin D-Rezeptors, HNF4 aber auch von Peroxisomen-proliferiende Substanzen aktivierten Rezeptoren (PPARs) [244]. Der Mechanismus der Repression der COUP-TFs verläuft vermutlich entweder über eine Kompetition mit der DNA-Bindungstelle, einer Kompetition mit dem universellen Partner RXR für die Heterodimerisierung, eine aktive Repression per se oder eine Transrepression durch direkte Bindung an die Ligandenbindungsdomäne nukleärer Rezeptoren [243]. Eine Hochregulation der COUP-TFs in Hepatomzelllinien wird als ein möglicher Mechanismus der verminderten/fehlenden CYP-Expression angesehen [243]. Allerdings waren die gefunden Expressionslevel in HepG2 in vorangegangenen Studien ähnlich denen von kultivierten Hepatozyten [243], was sich im Rahmen dieser Arbeit bestätigen ließ. Der GR beeinflusst ähnlich dem COUP-TFβ die transkriptionelle Aktivität anderer Rezeptoren und reguliert dadurch indirekt die Expression vieler CYP-Enzyme [245]. Pacussi et al. konnten zeigen, dass Dexamethason, ein gut untersuchter Ligand des GR, die Expression der nukleären Rezeptoren PXR und RXR induzieren und dadurch die CYP3A4-Induktion in Gegenwart von PXR-Agonisten steigern kann [246]. Das einzige CYP-Enzym, welches direkt durch den GR induziert wird, ist CYP3A5 [247].
  • Zu den Transkriptionsfaktoren, welche bei HepG2 stärker exprimiert waren als in humanen Hepatozyten, gehörten die Gene des Leber-X-Rezeptor LXRα und SHP (Short heterodimer Partner, NROB2). SHP ist ein unkonventioneller Orphanrezeptor, dem die typische DNA-Bindungsdomäne fehlt [248]. SHP inhibiert die Kernhormonrezeptor-vermittelte Transaktivierung unter anderem über die Kompetition mit Koaktivatoren [248, 249]. Eine Hochregulation des SHP könnte ebenfalls ein Mechanismus sein, der in der HepG2 zu einer verminderten/fehlenden Expression einiger CYP-Enzyme im Vergleich zu primären Hepatozyten beiträgt.
  • Expression von Genen für hepatozytäre Transporter
  • Die letzte Gruppe der untersuchten Gene umfasste verschiedene hepatozytäre Transporter. Die organischen Anionentransporter (OATPs) SLCO1A2 (OATPA), 1B1 (OATP2), 1B3 (OATP8) und 2B1 (OATPB) sowie der organische Kationentransporter (OCT) SLC22A1 (OCT1) und der Kotransporter SLC10A1 (NTCP) waren über alle Donoren der humanen Hepatozyten hinweg stärker exprimiert als in HepG2-Zellen. SLCO1A2 (OATPA) konnte in HepG2 gar nicht detektiert werden. SLCO1A2 vermittelt den natriumunabhängigen Transport von organischen Anionen in die Leberzellen und hat Gallensäuren und steroidale Verbindungen als natürliche Substrate [250]. Zur gleichen Gruppe von Transporter gehören auch SLCO1B1, 1B3 und 2B1, welche sich jedoch im Substratspektrum unterscheiden. SLCO1B1 transportiert 17β-Glukuronosylestradiol, Thyroidhormone und Medikamente, wie Statine, aus dem Blut in die Hepatozyten [250]. SLCO1B1 ist in der hepatischen sinusoidalen Membran lokalisiert und wird bevorzugt in Hepatozyten der mittleren Zone bis hin zu den perivenös gelegenen Zellen exprimiert [236]. Im Gegensatz zu den SLCOs ist SLC22A1 ein polyspezifischer Kationentransporter für viele endogene kationische Verbindungen, wie biogene Amine (Neurotransmitter) aber auch eine Vielzahl von Xenobiotika [251]. SLC10A1 ist ebenfalls ein Kationentransporter und in die basolaterale Membran der Hepatozyten integriert [252]. SLC10A1 vermittelt die natriumabhängige Aufnahme von konjugierten Gallensäuren aus dem portalen Blut und ist somit in die enterohepatische Gallensäurezirkulation involviert [252].
  • Im Gegensatz zu den meisten der untersuchten Anionen- und Kationentransporter waren die ABC-Transporter MRP2 (ABCC2), MRP3 (ABCC3) und MDR1 (ABCB1) bei Donor 2 und 3 ähnlich stark exprimiert wie in HepG2. MRP2 und MRP3 gehören, wie auch MRP1 (ABCC1), zur MRP-Familie der ABC-Transportproteine [252]. MRP2 kommt in der kanalikulären Hepatozytenmembran vor und nimmt Funktionen, wie den biliären Transport und die Exkretion von Glutathion, wahr [252]. MRP3 ist ein basolateraler Effluxtransporter, der für die biliäre und intestinale Exkretion organischer Anionen, aber auch einer Reihe von anionischen Medikamenten, wie ETO oder Methotrexat, verantwortlich ist [236, 253]. MDR1 gehört hingegen zur MDR-Subfamilie der ABC-Transporter und katalysiert den ATP-abhängigen Transport einer Vielzahl von Substraten aus den Hepatozyten [252]. Exprimiert wird MDR1 nicht nur in der Leber, sondern auch in intestinalem Gewebe [236]. Lokalisiert auf der apikalen Seite von intestinalen Enterozyten, vermittelt MDR1 den Efflux von Xenobiotika (z. B. der Krebsmedikamente ETO, Doxorubicin und Vinblastin), Lipiden und Steroiden in das Darmlumen, bevor die Stoffe in die portale oder systemische Zirkulation gelangen [236, 254].
  • Die Transporter MRP1 (ABCC1) und MDR2/3 (ABCB4) zeigten in HepG2 eine stärkere Expression als in humanen Hepatozyten. Zu den Substraten von MRP1 gehören neben Glukuroniden, oxidiertem Glutathion und Leukotrienen auch Fremdstoffe, wie AFB1 und Glutathion-Konjugate von alkylierenden Krebsmedikamenten (VP-16 (ETO)-Glukuronid) [51]. MDR2/3 gehört, wie auch MDR1, und BSEP zur MDR/TAP-Subfamilie und ist vermutlich am Transport von Phospholipiden aus den Hepatozyten in die Galle beteiligt [255]. Der Transporter BSEP (ABCB11), eine Gallensäureexportpumpe, war in Donor 1 und 3, aber nicht in Donor 2 und HepG2 detektierbar.
  • 3.2.1.2 Genexpression fremdstoffmetabolisierender Komponenten nach Induktion
  • Viele fremdstoffmetabolisierende Enzyme und Transporter werden basal nur gering exprimiert, können aber durch bestimmte Induktoren in ihrer Expression aktiviert werden. Deshalb wurde nicht nur die basale Expression der TLDA-„Human DME”-Gene, sondern auch die Expression dieser Gene nach Behandlung der Zellen mit den Induktoren PB, RIF und 3-MC untersucht ( ). Das Barbitursäurederivat PB wird als Arzneimittel zur Behandlung von Epilepsie und zur prä- oder postoperativen Sedation eingesetzt. PB und Derivate induzieren CYP-Enzyme der Familien CYP3A und CYP2B, insbesondere CYP2B1 und CYP2B2 [256]. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass PB UDP-Glukuronosyltransferasen und verschiedene Glutathion-S-transferasen induziert [257, 258]. Das PBREM-Element im Promotorbereich des CYP2B-Genlocus vermittelt die PB-abhängige Expression von CYP2B-Genen. PB bewirkt wahrscheinlich eine Translokation des nukleären Rezeptors CAR in den Zellkern, wo dieser als Heterodimer mit RXR an PBREM bindet und die Expression der CYP2B-Gene stimuliert [259]. Im Gegensatz zum PB bindet 3-MC an den Ah-Rezeptor und vermittelt, wie im Abschnitt 3.2.1.1 bereits angesprochen, die Transkription von CYP1A-Genen. Das Antibiotikum RIF wirkt über die Aktivierung der nukleären Rezeptoren PXR bzw. RXR, welche als heterodimere Transkriptionsfaktoren die CYP3A-Expression vermitteln [246, 260]. Die Bindung von PXR im Promoterbereich von CYP3A-Genen wird durch das PXRRE (PXR response element) vermittelt [236]. Die bedeutendsten CYP3A-Isoformen für den Menschen sind CYP3A4 und CYP3A5. Diese Isoformen sind die häufigsten in der menschlichen Leber exprimierten bzw. induzierten CYP-Enzyme und sind an der Metabolisierung einer Vielzahl von Medikamenten beteiligt [53]. Allerdings gibt es bei der CYP3A-Familie auch starke Speziesunterschiede. Die CYP3A11-Isoform der Maus weist die höchste Homologie zum CYP3A4/5 des Menschen auf. Im Gegensatz dazu ist die Ratte keine optimale Modellspezies, da die beiden in der Leber vorkommenden Isoformen CYP3A1 und CYP3A2 ein zum humanen CYP3A4 teilweise verschiedenes Substratspektrum besitzen. Außerdem sind sie durch RIF nicht induzierbar [53].
  • Induktion von CYP-Enzymen (Phase I)
  • Die Gene CYP1A1 und CYP1A2 wurden sowohl in HepG2 als auch in humanen Hepatozyten am stärksten durch 3-MC induziert. CYP1A1 war in HepG2-Zellen signifikant um das 4,8-Fache durch 0,1 μM 3-MC und um das 156-Fache durch 1 μM 3-MC hochreguliert. In den humanen Hepatozyten lagen die Regulationen für die drei Donoren zwischen 80- und 1.500-fach bei einer Konzentration von 5 μM 3-MC. CYP1A2 war in HepG2-Zellen und bei den humanen Hepatozyten in Donor 1 und Donor 3 ebenfalls hochreguliert. Die Regulation war für HepG2-Zellen nicht signifikant, da nur zwei der drei Passagen eine 10–20-fache (0,1 μM 3-MC) bzw. 40–50-fache (1 μM 3-MC) Hochregulation zeigten. Für Donor 1 der humanen Hepatozyten konnte eine Deregulation von 116 und für Donor 2 von 161 ermittelt werden. Aufgrund der unterschiedlichen 3-MC-Konzentrationen sind die Deregulationswerte zwischen HepG2 und humanen Hepatozyten jedoch nicht direkt vergleichbar.
  • Mit den anderen beiden Induktoren PB und RIF konnten vor allem in humanen Hepatozyten die Expression einiger Gene gesteigert werden. CYP2B6 war nach Behandlung mit PB und RIF in zwei der drei Donoren stark hochreguliert gefunden worden. Dagegen war CYP2B6 bei den beiden Induktoren in HepG2 ähnlich der Kontrolle bzw. stark herunterreguliert. Das nicht nur CAR, sondern auch PXR an das PBREM im Promotorbereich von CYP2B-Genen binden kann, wurde bereits in einigen Publikationen gezeigt [236]. Außerdem ist bekannt, dass PXR-Aktivatoren, wie RIF, in humanen Hepatozyten CYP2B6 induzieren können [261]. Des Weiteren wurde ein neues distales Promotorelement, das XRE (Xenobiotic response element), im Promoter von CYP2B6 entdeckt und gezeigt, dass CAR und PXR dieses Element binden können [261]. Die fehlende Induktion von CYP2B6 in HepG2 könnte mit der schwachen basalen Expression von CAR in HepG2 zusammenhängen. Vor allem CAR war in den humanen Hepatozyten sehr viel stärker exprimiert gefunden worden (siehe Abschnitt 3.2.1.1.1). Mit Ausnahme von Donor 3 (RIF) ließ sich die Expression von CAR und PXR in humanen Hepatozyten allerdings nach Induktorbehandlung nicht steigern. Hingegen waren die PXR-Level in HepG2 nach Behandlung mit 3-MC und RIF erhöht, obwohl keine gesteigerte Expression des Targetgens CYP2B6 beobachtet wurde. Zudem konnten, die PXR-regulierten Gene der CYP2C-Familie in HepG2 gar nicht detektiert werden. Eine mögliche Ursache für die Aktivierung der Transkription der erwähnten CYP-Enzyme könnten fehlende Kofaktoren sein. Die fehlende Bildung von funktionellem PXR ist als Ursache eher unwahrscheinlich, da zum Beispiel CYP3A mit dem PXR-Agonisten RIF induzierbar war. Im Gegensatz zu den HepG2 waren CYP2C8 und CYP2C9 in humanen Hepatozyten bei Donor 1 und 2 nach PB- und RIF-Behandlung leicht bis stark hochreguliert. Lediglich Donor 3 zeigte eine Herunter- bzw. gar keine Regulation für die CYP2C-Gene. Eine CAR- und PXR-vermittelte Regulation von CYP2C wurde bereits von Chen und Goldstein beschrieben [262].
  • CYP2D6 gehört zu den CYP-Enzymen, welche konstitutiv exprimiert werden und nicht induzierbar sind. Das bestätigen die Daten in dieser Arbeit, da die Expression des CYP2D6-Gens weder in HepG2 noch in humanen Hepatozyten durch die drei verwendeten Induktoren gesteigert werden konnte. Die Basalexpressionsdaten zeigten bezüglich der konstitutiven Expression eine sehr viel stärkere Expression in HepG2 (13- bis 145-fach) als in humanen Hepatozyten.
  • CYP2E1 ist ebenfalls dafür bekannt, dass es nicht auf transkriptioneller Ebene reguliert wird. Dieses CYP wird vorwiegend substratabhängig auf Proteinebene stabilisiert [263]. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen, konnte bei keinem der drei Spender eine Induktion des CYP2E1 auf mRNA-Ebene detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigte sich nach RIF-Behandlung in den HepG2 eine 3- bzw. 4-fache Erhöhung der CYP2E1 mRNA. Inwieweit diese Erhöhung reproduzierbar ist und sich auch auf Proteinebene manifestiert, müsste jedoch mit weiteren Versuchen überprüft werden.
  • Die Gene der CYP3A-Familie waren bei den humanen Hepatozyten durch die Induktoren PB und RIF hochreguliert. CYP3A4 war bei Donor 1 und 2 nach PB-Behandlung um das 25-fache induziert. Eine ebenfalls starke Induktion ließ sich bei RIF mit Deregulationswerten von 21 bis 35 beobachten. CYP3A5 war bei allen drei Donoren nach PB-Behandlung 1,6- bis 2,4-fach hochreguliert. CYP3A7 war bei den Donoren 1 und 2 durch PB und RIF 3- bis 6-fach erhöht gefunden worden. RIF ist dafür bekannt, die Transkription von CYP3A-Genen PXR-vermittelt zu stimulieren [236], was die Beobachtungen, dass die stärksten Induktionen nach RIF-Behandlung auftraten, bestätigt. In HepG2 wurden ebenfalls nach RIF-Behandlung die stärksten Induktionen für CYP3A4 detektiert. Die ermittelten Deregulationswerte lagen bei 7,4 für 10 μM RIF und 6,9 für 50 μM RIF und wurden mittels Student's T-Test als signifikant (p-Wert < 0,05) bewertet. Durch Behandlung mit PB konnte lediglich in der Konzentration von 500 μM eine Erhöhung der CYP3A4 mRNA detektiert werden. Außerdem zeigte sich auch nach 3-MC-Behandlung ein Anstieg des CYP3A4. CYP3A5 und CYP3A7 waren ebenfalls bei allen drei Induktoren hochreguliert, wobei nur für CYP3A7 nach RIF-Behandlung eine statistische Signifikanz (p-Wert < 0,05) für beide Behandlungskonzentrationen ermittelt werden konnte.
  • Deregulation von Phase II-Enzymen
  • Im nächsten Teil wurde die Veränderung von Phase II-Enzymen nach Behandlung der HepG2 Zellen und humanen Hepatozyten mit den drei verschiedenen Induktoren untersucht. Die Glutathion-S-Transferase GSTA1 war in HepG2-Zellen nach Behandlung mit PB und RIF signifikant hochreguliert. In humanen Hepatozyten konnte bei PB für Donor 1 und Donor 2 ebenfalls ein Anstieg festgestellt werden. Die zweite untersuchte Glutathion-S-Transferase, die GSTP1, war in humanen Hepatozyten bei keinem der verwendeten Induktoren konsistent hochreguliert. Dagegen zeigten HepG2-Zellen nach Behandlung mit 1 μM 3-MC und 10 μM sowie 50 μM RIF eine Erhöhung der GSTP1, die jedoch nicht signifikant war. Der RIF- bzw. PB-vermittelte Einfluss auf die Regulation der untersuchten Glutathion-S-Transferasen lässt auf eine PXR- bzw. CAR-abhängige Regulation dieser Phase II-Enzyme schließen. Eine Induktion der GSTA1-mRNA-Level durch CAR- und PXR-Agonisten konnte in vivo bereits gezeigt werden [264]. Hingegen konnte in der Studie von Knight et al. auch keine signifikante Erhöhung der GSTP1-mRNA-Spiegel verzeichnet werden [264].
  • Für das nächste untersuchte Enzym, die Sulfotransferase 1A1-4, konnte keine konsistente Hochregulation in HepG2 oder humanen Hepatozyten festgestellt werden. Aus der Literatur ist eigentlich eine AhR- bzw. PXR-Agonisten-vermittelte Induktion von Sulfotransferasen der Klasse 1A bekannt [265]. Diese konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden.
  • Des Weiteren wurden verschiedene UDP-Glukuronosyltransferasen auf Veränderungen ihrer Expressionslevel untersucht. Die UGT2B7 zeigte lediglich nach 3-MC-Behandlung in HepG2 und bei Donor 1 der humanen Hepatozyten eine leichte aber nicht signifikante Erhöhung. Hingegen konnte für die UGT1A6 eine starke Induktion um das 5- bis 9-fache in HepG2 für 3-MC gezeigt werden. Eine durch AhR-Agonisten hervorgerufene Induktion der UGT1A6 in HepG2 ist bereits aus anderen Studien bekannt [265]. Westerink und Mitarbeiter zeigten allerdings, dass 3-MC zu einer stärkeren Erhöhung der UGT1A1-Genexpression im Vergleich zu UGT1A6 führt [266]. Die verwendeten Konzentrationen waren in der Westerink-Studie jedoch um ein bis zwei Zehnerpotenzen höher als in dieser Arbeit und sind deshalb nicht direkt vergleichbar [266]. Dennoch konnte auch für die UGT1A1 eine starke Deregulation von 7,6 bei 1 μM 3-MC ermittelt werden. Gleichzeitig zeigte sich auch bei RIF, sowohl für die UGT1A1, als auch für die UGT1A6, eine deutliche Erhöhung der mRNA-Level. Die UGT1A1 war zudem in HepG2 nach Behandlung mit 1000 μM PB signifikant hochreguliert. Eine Induktion der beiden Enzyme in HepG2 durch PXR-/CAR-Agonisten konnte bereits von Westerink et al. gezeigt werden [266]. Diese Daten deuten darauf hin, dass verschiedene nukleäre Rezeptoren (PXR, CAR und AHR) eine Rolle in der Regulation der UGTs in HepG2 spielen könnten. In Übereinstimmung mit den HepG2-Daten konnte auch für die humanen Hepatozyten eine Erhöhung der UGT1A1-Expression nach Behandlung mit PB und 3-MC für Donor 1 und Donor 2 festgestellt werden. Auf RIF sprach jedoch lediglich Donor 1 an. Die ermittelten Deregulationswerte waren jedoch sehr viel schwächer als in HepG2 (Faktoren 1,5–2,4). Zudem konnte für die UGT1A6 überhaupt keine Hochregulation in den humanen Hepatozyten ermittelt werden. Betrachtet man vergleichend die basale Expression in beiden Zellkultursystemen, so konnte eine sehr viel stärkere Expression der UGTs in humanen Hepatozyten gegenüber HepG2 festgestellt werden. Die höhere Basalexpression in humanen Hepatozyten gegenüber HepG2 beobachteten auch Westerink und Mitarbeiter [266]. Zudem war auch die Proteinaktivität der UGTs in humanen Hepatozyten deutlich höher als in HepG2 [266]. Die fehlende Induzierbarkeit der UGTs in humanen Hepatozyten könnte zum Beispiel mit dem Verlust von transkriptions-vermittelnden Kofaktoren während der Kultivierung zusammenhängen. Ein solcher Verlust, aufgrund der Kultivierung, könnte dadurch bedingt sein, dass die Basalexpression im Rahmen dieser Arbeit in den Kontrollen der Induktionsexperimente erst nach 72 h ermittelt wurde und nicht direkt in frisch ausplattierten Kulturen. Dass sich das Expressionsmuster bezüglich der metabolischen Komponenten im Verlauf der Kultivierung von primären Hepatozyten deutlich verändert und auch stark von der Art der Kultivierung abhängt, konnte in vorangegangenen Publikationen bereits gezeigt werden [136, 137].
  • Induktion der Expression von nuklearen Transkriptionsfaktoren
  • Im nächsten Teil der Genexpressionsanalysen fremdstoffmetabolisierender Komponenten wurden nukleäre Rezeptoren/Transkriptionsfaktoren auf ihre Induzierbarkeit untersucht. Dabei konnte keine konsistente Induktion für die drei Donoren der humanen Hepatozyten gefunden werden. Lediglich SHP zeigte nach Behandlung mit 3-MC für Donor 1 und Donor 3 einen Anstieg um den Faktor 3. Ein komplett anderes Bild zeigte sich für die Zelllinie HepG2. In HepG2 konnte für den AhR eine signifikante Erhöhung nach Behandlung mit 3-MC bzw. RIF festgestellt werden. Des Weiteren war in den gleichen Behandlungen der PXR bis zu 2,9-fach erhöht. Ein signifikanter Anstieg der mRNA-Level konnte zudem nach Exposition der Zellen mit RIF für COUPTFβ, PPARβ/δ und PPARγ gemessen werden. Ebenfalls signifikant erhöht zeigte sich der GR mit einer Deregulation von 3,8. Eine Besonderheit bei den HepG2 war, wie vorangehend schon erwähnt, dass CAR in den meisten Proben überhaupt nicht zu detektieren war.
  • Inwieweit die für die Zelllinie ermittelten Induktionen der genannten nukleären Rezeptoren möglicherweise einer positiven Feedback-Regulation entsprechen [267] oder durch koregulatorische Eigenschaften der Transkriptionsfaktoren zustande kommen, müsste jedoch in weiteren Experimenten abgeklärt werden. Des Weiteren müssen die Genexpressionslevel nicht zwangsläufig mit der Proteinexpression korrelieren, so dass möglicherweise in den humanen Hepatozyten trotzdem funktionelle Transkriptionsfaktoren exprimiert werden, auch wenn keine erhöhte Genexpression zu detektieren war. Diese Vermutung stützt sich auf der Induzierbarkeit einer Vielzahl von CYP-Enzymen, da diese unter der transkriptionellen Regulation der untersuchten Rezeptoren stehen.
  • Induktion von Transporter-codierenden Genen
  • Bei den Expressionsuntersuchungen von Genen, die für Transporter codieren, konnte vor allem mit dem PXR-Agonisten RIF für viele der getesteten Gene eine deutliche Steigerung der mRNA-Level verzeichnet werden. In HepG2 konnte eine Induktion aller ABC-Transporter, mit Ausnahme von BSEP, durch RIF detektiert werden. BSEP (ABCB11) konnte in HepG2 nicht detektiert werden. Zudem war in humanen Hepatozyten trotz basaler Expression keine Induktion mit den verwendeten Substanzen möglich. Dagegen konnte jedoch mit RIF sowie mit PB eine Induktion der meisten untersuchten ABC-Transporter in humanen Hepatozyten erreicht werden. Dabei zeigten Donor 1 und Donor 2 erneut eine größere Übereinstimmung im Vergleich zu Donor 3. Bei letztem Donor waren viele der Transporter gar nicht detektierbar oder wiesen eine abweichende Regulation zu den anderen beiden Donoren auf. So konnte zum Beispiel bei Donor 3 eine RIF-vermittelte Erhöhung der Expression von SLC10A1, SLCO1B1 sowie SLCO1A2 verzeichnet werden. Bei den anderen beiden Donoren konnte keine Erhöhung der untersuchten Kationen- bzw. Anionentransporter gemessen werden. Ein ähnliches Bild zeigte sich bei den HepG2 für die SLC-Transporter. Dabei wurde lediglich für SLCO1B3 und SLC22A1 bei RIF bzw. 3-MC eine Hochregulation beobachtet. Während 3-MC in den humanen Hepatozyten keine induktiven Effekte aufzeigte, konnte in der Zelllinie eine Hochregulation der Transporter ABCB1, ABCC1 und ABCC3 detektiert werden. Ein weiterer Unterschied zwischen den humanen Hepatozyten und den HepG2 war, dass PB in der Zelllinie keine konsistente Induktion für alle Transporter zeigte. Eine Ursache dafür könnte die fehlende CAR-Expression in den HepG2-Zellen sein. Die durch CAR-Agonisten-vermittelte Expression von Transportern ist unter anderem für ABCC2 (MRP2) bekannt [236]. Eine solche PB- und somit vermutlich CAR-vermittelte Hochregulation des ABCC2 wurde für die humanen Hepatozyten beobachtet. Des Weiteren wurde bereits beschriebenen, dass der PXR eine Rolle in der Regulation der Expression hepatischer Transportsysteme spielt. Vorangegangene Studien zeigten, dass die Aktivierung des PXR für die Induktion von Transportern, wie SLCO1B1 (OATP2), ABCC2 (MRP2) oder auch ABCC3 (MRP3), von Bedeutung ist [236]. Diese Beobachtungen entsprechen den im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Resultaten für diese Transporter, sowohl in humanen Hepatozyten als auch für die Zelllinie HepG2.
  • 3.2.1.3 CYP1A-Aktivitätsuntersuchungen
  • Nachdem für die HepG2-Zellen eine starke Erhöhung der CYP1A-Genexpression nach Behandlung der Zellen mit dem AhR-Agonisten 3-MC in denen TLDA-Experimenten gemessenen werden konnte, sollte im weiteren Verlauf der Arbeit überprüft werden, ob auch eine erhöhte Aktivität des Proteinproduktes nachgewiesen werden kann. Dazu wurde ein so genannter EROD-Test durchgeführt. Die Zellen wurden über drei Tage täglich mit dem Induktor 3-MC behandelt und anschließend mit Ethoxyresorufin inkubiert. Der Umsatz dieses CYP1A-Substrates wurde über 20 min fluorimetrisch verfolgt und anschließend die Aktivitätsrate bezogen auf die Lösungsmittelkontrolle nach Normalisierung auf die Zellviabilität bestimmt. Das Ergebnis ist in gezeigt. 3-MC verursachte eine starke, statistisch signifikante Erhöhung der CYP1A-Aktivität in den getesteten Konzentrationen von 0,1 μM und 1 μM. Die Deregulationswerte lagen dabei für 0,1 μM 3-MC bei 48,4 und für 1 μM des Induktors bei 138. Diese Daten zeigten, dass HepG2-Zellen funktionell aktives CYP1A exprimieren und die Aktivität substratabhängig induzierbar ist.
  • 3.2.1.4 CYP3A4-Aktivitätsuntersuchungen
  • Neben dem CYP1A fiel bei den Genexpressionsanalysen die Induzierbarkeit einer weiteren CYP-Enzymfamilie, welche CYP3A4, CYP3A5 und CYP3A7 umfasst, auf. CYP3A4 spielt bei der Metabolisierung von verschiedenen progenotoxischen Verbindungen eine bedeutende Rolle. Für die Untersuchung CYP3A4-Proteinaktivität wurde ein lumineszenzbasierter Test der Firma Promega (P450-GloTM) eingesetzt. Wie für den EROD-Test wurden die Zellen täglich über drei Tage mit den entsprechenden Induktoren behandelt. Für die Messung wurden die Zellen über drei Stunden mit einem spezifischen CYP3A4-Substrat inkubiert und anschließend dessen Umsetzung luminometrisch gemessen. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in dargestellt. In den Genexpressionsstudien war CYP3A4 nach Behandlung mit RIF in den Konzentrationen 10 μM und 50 μM um den Faktor 8,3 bzw. 9,4 hochreguliert ( ). In Übereinstimmung mit den beobachteten Genexpressionsveränderungen konnte eine erhöhte Aktivität des CYP3A4 Enzyms gegenüber der Kontrolle nach Behandlung mit dem PXR-Agonisten RIF verzeichnet werden ( ). Die Deregulation lag dabei bei 2,2 für die niedrige RIF-Konzentration bzw. 3,8 für die hohe Konzentration. Letztere war zudem statistisch signifikant dereguliert gegenüber der Kontrolle.
  • Des Weiteren wurden auch 3-MC und PB getestet, da sich auf Genexpressionsebene teilweise eine Induktion für CYP3A4 gezeigt hatte. Die Proteinaktivität lag jedoch im Bereich der Lösungsmittelkontrolle (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigen, dass erhöhte Genexpressionslevel nicht zwangsläufig mit dem Proteinlevel korrelieren müssen. Ursachen können ein frühzeitiger Abbau der mRNA, eine unvollständige Translation in Protein, keine funktionelle Proteinfaltung oder auch ein frühzeitiger Abbau des Proteins sein.
  • 3.2.1.5 Zusammenfassung zur Charakterisierung der metabolischen Kapazität der HepG2-Zellen
  • Die Ergebnisse der Charakterisierung der HepG2-Zelllinie demonstrieren, dass ein Teil der untersuchten fremdstoffmetabolisierenden Komponenten noch nachzuweisen und auch funktionell aktiv war. Für CYP1A1 konnten in HepG2-Zellen vergleichbare Expressionswerte mit humanen Hepatozytenkulturen gemessen werden. Zudem war eine Steigerung der Aktiviäts- und Genexpressionslevel dieses Enzyms mit einem typischen AhR-Agonisten, dem 3-MC, beobachtet worden. Des Weiteren konnte auch für CYP3A4 eine Induzierbarkeit mit einem typischen PXR-Agonisten, dem RIF, bestätigt werden. Die basale CYP3A4-Aktivität war allerdings deutlich geringer als in humanen Hepatozyten. Eine Induktion der CYP-Enzyme 1A und 3A durch Behandlung mit den Induktoren 3-MC und RIF ist in HepG2-Zellen bereits beschrieben worden [81, 268]. Im Vergleich zu humanen Hepatozyten waren die Konzentrationen jedoch meist gering [81, 268].
  • Neben den Enzymen CYP1A und CYP3A4 konnte auch für CYP2D6 eine im Vergleich zu den humanen Hepatozyten hohe Basalexpression detektiert werden. Eine schwache Expression und begrenzte Induzierbarkeit wurde für CYP2B6 und CYP2E1 nachgewiesen. Außerdem konnten Enzyme der Familie CYP2C in HepG2 nicht detektiert werden. Ähnliche Erkenntnisse wurden bereits von Westerink et al. veröffentlicht [268]. Westerink et al. konnten in dieser Studie ebenfalls moderate Expressionen der CYP-Enzyme 1A1, 1A2, 2B6, 2D6, 2E1 und 3A4 detektieren. Schwache Basalexpressionen wurden hingegen, wie auch in dieser Arbeit, für CYP2A6, CYP2C9 und CYP2C19 gemessen. Das bestätigt die Vermutung im Rahmen dieser Arbeit, dass die CAR-vermittelte CYP-Regulation in HepG2 gestört ist. Des Weiteren konnten auch Westerink et al. keine 3-MC- oder RIF-abhängige Induktion des CYP2B6 für Induktorkonzentrationen bis 1 μM (3-MC) bzw. 10 μM (RIF) nachweisen [268].
  • Abgesehen von der fehlenden Expression des CAR-Rezeptors spielen wahrscheinlich noch andere Mechanismen für die fehlende oder geringe Expression vieler CYP-Enzyme in HepG2 eine Rolle. Dabei besitzen verschiedene Lebertranskriptionsfaktoren wie HNF4α, HNF3α, HNF3γ, HNF1α, C/EBPα und C/EBPβ einen entscheidenden Einfluss innerhalb der Regulation der Expression typischer hepatischer Gene [243]. Mit Ausnahme von HNF4α, welches in dieser Arbeit in Übereinstimmung mit anderen Publikationen eine vergleichbare Basalexpression in HepG2 und humanen Hepatozyten zeigte, sind diese transkriptionellen Faktoren in den meisten Hepatomzelllinien nur sehr schwach exprimiert [243]. Publikationen belegen, dass die funktionelle Wiederherstellung einzelner Faktoren, wie z. B. HNF3γ oder C/EBPα, eine Wideraktivierung verschiedener CYP-Enzyme der Familien 2 und 3 bewirkt. Allerdings zeigten diese Studien auch, dass die Wiederherstellung einzelner Faktoren nicht ausreicht, um die globale CYP-Expression in Hepatomzelllinien zu erhöhen. Dadurch zeigt sich das komplexe Zusammenspiel mehrerer Transkriptionsfaktoren für die Regulation fremdstoffmetabolisierender Komponenten [243]. Andere mögliche Mechanismen für die fehlende bzw. verminderte CYP-Expression in HepG2 sind das Fehlen von Koaktivatoren oder die Überexpression von Korepressoren (siehe 3.2.1.1, Basalexpression von Transkriptionsfaktoren/Kernrezeptoren). Außerdem sind möglicherweise epigenetische Prozesse (DNA-Methylierung und Histon-Deacetylierung) für die Repression der CYP-Enzyme verantwortlich [243]. Das zeigen Studien von Castell und seinen Mitarbeitern, in denen die Überexpression von HNF3γ nur in Gegenwart eines Histondeactetylaseinhibitors zu einer Transaktivierung der endogenen CYP2C8- und CYP2C19-Gene führte [243].
  • Bei den Phase II-Enzymen waren die UGTs in HepG2, trotz einer geringeren Basalexpression im Vergleich zu den humanen Hepatozyten, induzierbar. Ebenfalls induzierbar zeigten sich die getesteten GSTs. Die Expression der untersuchten Sulfotransferase war dagegen weder in HepG2 noch in humanen Hepatozyten durch Behandlung mit induktiven Substanzen steigerbar. Die basale Expression war in HepG2 sogar stärker als in humanen Hepatozyten. Westerink et al. konnten ebenfalls eine schwache Basalexpression und Basalaktivität der UGTs in HepG2-Zellen im Vergleich zu humanen Hepatozyten detektieren [266]. Die Sulfotransferasen zeigten bei Westerink et al. in Übereinstimmung mit den Daten dieser Arbeit ebenfalls hohe, mit den humanen Hepatozyten vergleichbare Expressionslevel. Im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Arbeit waren die untersuchten Sulfotransferasen bei Westerink et al. jedoch induzierbar. Allerdings konnten die besten Induktionen mit anderen AhR-Agonisten (Indirubin, Indigo) bzw. PXR/CAR-Agonisten (CITCO, T0901317), welche in dieser Arbeit nicht verwendet wurden, erreicht werden. Die Ergebnisse der Studien im Rahmen dieser Arbeit demonstrieren zusammen mit den bereits publizierten Daten von Westerink et al., dass HepG2 einen relativ vollständigen Phase II-Metabolismus, mit Ausnahme der UGT, im Vergleich zu humanen Hepatozyten besitzen [266].
  • Abgesehen von dem Phase I- und Phase II-Metabolismus wurden Transportsysteme in HepG2-Zellen untersucht. Während die untersuchten ABC-Transporter in humanen Hepatozyten und HepG2 eine vergleichbare Basalexpression zeigten und auch auf Induktoren ansprachen, war die Induzierbarkeit der Anionen- und Kationentransporter begrenzt. Zudem war die basale Expression dieser Transporter in HH sehr viel stärker als in HepG2.
  • Die Ergebnisse der HepG2-Charakterisierung zeigten, dass HepG2 noch eine begrenzte Metaboliserungsfähigkeit (Phase I-Metabolismus) besitzen. Die Eignung von HepG2-Zellen per se als System für Biotransformationsstudien bleibt, wie schon in vorangegangenen Studien gefunden, zweifelhaft. Eine Studie von Vickers et al., in welcher die Biotransformation von Cyclosporin A in HepG2-Zellen zu humanen Leberschnitten und Mikrosomen verglichen wurde, zeigte, dass HepG2-Zellen als Modell für diese Substanz nicht geeignet sind. HepG2-Zellen waren lediglich in der Lage, einen der drei Metaboliten des Cyclosporin A zu bilden [269]. Die Studien von Wilkening et al. bestätigen, dass die HepG2-abhängige Metabolisierung substanzspezifisch ist [270]. Während alle Testkanzerogene positive Resultate im Comet-Test mit primären Hepatozyten lieferten, konnte nur eine der Verbindungen positiv in HepG2-Zellen getestet werden. Aktivitätstests im Rahmen der Studie belegten eine starke Induktion im EROD (CYP1A), aber nicht für ECOD (CYP2B6, CYP2E1 und CYP1A2) [270]. Andere Studien konnten wiederum zeigen, dass spezielle Kulturbedingungen, wie die Kultivierung in Earle's Medium, eine Aktivitätssteigerung der Enzyme CYP1A und CYP2B bewirkt [81, 271]. Hewitt und Hewitt zeigten, dass die Aktivität von Phase I- und II-Enzymen zwischen HepG2-Zellen verschiedener Chargen und in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen variiert [272].
  • Die Charakterisierungsdaten verdeutlichen somit zusammen mit den bisherigen Veröffentlichungen, dass die Zelllinie allein sicherlich nicht geeignet ist, um das ganze Spektrum an progenotoxischen Verbindungen abzubilden. Zudem könnte die Funktionalität der Phase II-Enzyme bei begrenztem Phase I-Metabolismus zu einer Unterschätzung der (Geno-)Toxizität vieler Substanzen führen. Die Problematik könnte zusätzlich durch die in HepG2 vorhandenen induzierbaren Transportsysteme (MRPs, MDRs) gestützt werden. Diese sind am Efflux vieler Krebsmedikamente (z. B. ETO) aber auch kanzerogener Substanzen, wie AFB1, aus den Hepatozyten und damit an deren Entgiftung maßgeblich beteiligt [273, 274]. Für ein Toxizitätsscreening ist es daher wichtig, den Phase I-Metabolismus der Zelllinie zu komplementieren, um einerseits ein breites Substratspektrum zu erfassen und andererseits das natürliche Gleichgewicht des Phase I-Metabolismus im Vergleich zu den Entgiftungsmechanismen (Phase II und Transportsysteme) widerzuspiegeln. Einleitend wurde bereits beschrieben, welche CYP-Enzyme bei der Metabolisierung verschiedenster Prokanzerogene eine Rolle spielen. Bei der Auswahl eines MAS war es nun wichtig, dass Enzyme, wie CYP2B, CYP2C sowie CYP2E, enthalten sind, da sich in der Charakterisierung nur eine begrenzte bzw. fehlende Expression dieser Enzyme gezeigt hatte. Bei Verwendung von S9 oder Mikrosomen von Ratten bieten sich somit PB-, β-NF- oder Isoniazid-induzierte Leberfraktionen an.
  • 3.2.2 Zellviabilitätsuntersuchungen mit den progenotoxischen Modellsubstanzen
  • Zur Dosisfindung für die P53-Studien wurden zunächst Zellviabilitätsexperimente mit verschiedenen Dosierungen von progenotoxischen Modellsubstanzen durchgeführt. Als Modellsubstanzen wurden, wie einleitend schon erwähnt, die Verbindungen CPA, AFB1, DMBA und DEN verwendet. Zur metabolischen Aktivierung der Substanzen wurde PB/β-NF-induzierter S9 von Ratten eingesetzt. Die Ergebnisse sind in dargestellt.
  • CPA wurde in einem Konzentrationsbereich von 1 μM bis 1 mM getestet. Ein Einfluss auf die Zellviabilität zeigte sich ausschließlich bei Zugabe von S9. Der ermittelte EC50 lag bei 195 μM und gibt an, dass bei dieser Konzentration nur noch 50% der ursprünglichen Zellvitalität zu detektieren war. Ohne metabolische Aktivierung konnte durch die Behandlung mit CPA keine zytotoxische Wirkung auf die HepG2-Zellen bis zu einer Konzentration von 1 mM festgestellt werden. Für die P53-Experimente wurden daraufhin Konzentrationen bis 75 mM ausgewählt. Diese liegen auch für die Behandlungen mit MAS im nicht zytotoxischen Bereich.
  • Für AFB1 zeigte sich bei dem Zellviabilitätskurven, dass AFB1 ohne MAS bis zu einer Konzentration von 600 μM ebenfalls keinen Einfluss auf die Zellviabilität hat. Nachdem jedoch AFB1 gemeinsam mit 59 zu den HepG2 gegeben wurde, war ab 10 μM eine deutliche Verringerung der Zellviabilität auf 56% im Vergleich zur Kontrolle zu verzeichnen. Eine Steigerung der Konzentration auf bis zu 600 μM brachte jedoch keinen weiteren Verlust der Zellviabilität mit sich. Höhere Konzentrationen konnten aufgrund der schlechten Löslichkeit des AFB1 nicht getestet werden. Deswegen war es auch nicht möglich eine EC50-Ermittlung durchzuführen. Für die P53-Experimente wurde AFB1 bis zu einer Konzentration von 10 μM eingesetzt. Aufgrund des untypischen Verlaufs der Dosis-Wirkungskurve mit gleichbleibender Zellviabilität von 10 μM bis 600 μM wurden Konzentrationen bis in den zytotoxischen Bereich hinein untersucht. Zusätzlich wurden aber auch Konzentrationen unter 1 μM, welche sich als nicht zytotoxisch erwiesen haben, getestet.
  • Die Zellviabilitätskurven für DMBA wiesen einen ähnlichen Verlauf, wie die des AFB1 auf. Bis zu einer Konzentration von 10 μM konnte mit S9 keine zellviabilitätsverringernde Wirkung gemessen werden. Ab 100 μM fiel die Zellviabilität auf etwa 68% im Vergleich zur Kontrolle ab und blieb bis zu einer Konzentration von 400 μM konstant. Ohne Zugabe eines MAS konnte jedoch auch für DMBA keine zytotoxische Wirkung auf die HepG2-Zellen verzeichnet werden. Im P53 wurden, wie auch für AFB1, Konzentrationen im nicht zytotoxischen Bereich, das heißt bis 10 μM, aber auch Konzentrationen im Bereich beginnender Zytotoxizität (bis 100 μM) eingesetzt.
  • Für das Nitrosamin DEN war sowohl mit als auch ohne MAS eine Zellviabilitätskurve mit sigmoidalem Verlauf detektiert worden. Allerdings stimmten die Kurvenverläufe mit und ohne MAS nahezu überein. Der EC50 lag sowohl mit als auch ohne S9 bei ungefähr 80 mM. Diese Studien zeigten, dass DEN über 10 mM auch ohne metabolische Aktivierung zytotoxisch auf die HepG2-Zellen wirkt. Da die Zugabe des MAS, nicht wie bei den anderen Substanzen eine Verringerung der Zellviabilität verursachte, ist es fragwürdig, ob eine metabolische Aktivierung stattgefunden hat. Neben dem PB/β-NF-induzierten S9 wurden deshalb auch Isoniazid-induzierte Mikrosomen getestet, um zu untersuchen, ob eine CYP2E1-vermittelten Metabolisierung eine Rolle spielt [Diplomarbeit Yasmin Dietz, Universität Mainz, 223]. Allerdings ergaben sich auch mit diesem MAS die gleichen Zellviabilitätskurven, wie mit und ohne PB/β-NF-induzierten S9. Trotz dieser Ergebnisse wurde DEN in den P53-Studien und auch später bei den Genexpressionsexperimenten mitgeführt. Der verwendete Konzentrationsbereich reichte mit bis zu 75 mM an den EC50 heran. Die niedrigeren Konzentrationen von 25 mM und 50 mM lagen noch in einem Bereich mit einer Zellviabilität von größer 90% (unterhalb des EC20-Wertes) und demzufolge in einem Bereich mit vergleichbarer Zellviabilität zur Kontrolle.
  • 3.2.3 P53-Induktion durch progenotoxische Substanzen
  • Nachdem für die gentoxischen Substanzen eine Aktivierung des P53 im Rahmen der Antwort auf den induzierten DNA-Schaden festgestellt werden konnte, sollte für die progenotoxischen Verbindungen die P53-Bestimmung zur Etablierung des kombinierten Systems aus HepG2 und MAS sowie zur Dosisfindung für die nachfolgenden Genexpressionsanalysen genutzt werden. Als Kontrollen wurden die Negativsubstanzen Metformin (MET), THEO und KETO sowie ACT als Positivkontrolle in jedem P53-Test mitgeführt. zeigt die P53-Induktion nach der Behandlung mit den angeführten Kontrollverbindungen (Induktionswerte siehe Anhang 7).
  • Als erste progenotoxische Testsubstanz wurde CPA getestet. Die Ergebnisse der P53-Bestimmung sind in dargestellt. Eine Erhöhung an aktivem P53 konnte lediglich in Gegenwart des metabolischen Aktivierungssystems (S9) festgestellt werden. Ohne Zugabe der S9-Fraktion lag die gemessene P53-Induktion im Bereich der Lösungsmittelkontrolle. Wie einleitend bereits erwähnt, spielen eine Reihe von CYP-Enzymen bei der metabolischen Aktivierung von CPA eine Rolle. Insbesondere CYP-Enzyme der Familie 2, wie zum Beispiel CYP2B6, CYP2A6, CYP2C19 aber auch CYP2C9, sind an der Bildung des DNA-reaktiven Phosphoramidsenfgases beteiligt [63, 64]. Bis auf CYP2B6 konnten alle dieser genannten CYP-Enzyme auf Genexpressionsebene im Rahmen der Charakterisierung überhaupt nicht detektiert werden. CYP2B6 zeigte zudem eine sehr schwache Expression gegenüber den humanen Hepatozytenkulturen. Außerdem ließ sich die Expression durch die Behandlung mit verschiedenen CYP-Induktoren nicht steigern. Aufgrund der fehlenden Enzymaktivität für die CYP-Enzyme 2C8/9/18/19 und der eingeschränkten Expression des CYP2B6 sowie der fehlenden Expression des CAR, welcher die Expression dieser CYP-Isoenzyme reguliert [234–236], sind die HepG2-Zellen wahrscheinlich nicht in der Lage den DNA-reaktiven Metaboliten des CPA zu bilden. Die beobachtete P53-Aktivierung nach Zugabe von S9, welcher mit PB/β-NF induziert wurde und somit erhöhte Konzentrationen der benötigten CYP2-Enzyme enthält, deutet als Surrogat für einen induzierten DNA-Schaden auf eine metabolische Umsetzung des CPAs unter Bildung des mutagenen Senfgaszwischenproduktes hin.
  • Im Gegensatz zum CPA konnte für DEN bis zu einer Testkonzentration von 75 mM weder mit noch ohne MAS eine Aktivierung des P53 verzeichnet werden ( ). Für die Metabolisierung von DEN sind die Enzyme CYP2E1 und CYP2A6 verantwortlich [67–69]. Beide Enzyme wurden im Rahmen der Charakterisierung der HepG2-Zellen im Vergleich zu humanen Hepatozyten als sehr schwach basal exprimiert gefunden. CYP2A6 mRNA konnte sogar in den meisten Proben überhaupt nicht detektiert werden. Da vor allem CYP2E1 bei der Aktivierung einer Reihe von Nitrosaminen eine Rolle spielt [69], wurde neben dem βNF/PB-induzierten S9 auch noch ein Isoniazid-induzierter Mikrosomenmix als MAS getestet. Jedoch konnte auch mit diesem System zur metabolischen Aktivierung keine Erhöhung des aktivierten P53 nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Da in den P53-Studien keine Induktion und auch in den Zytotoxizitätsstudien keine erhöhte Zytotoxizität der Proben mit MAS gegenüber denen ohne MAS infolge der Exposition mit dem Nitrosamin detektiert werden konnten, scheint eine Aktivierung des DEN mit dem entwickelten Zell-MAS-System eher fragwürdig.
  • Die nächste Testsubstanz, AFB1, zeigte ein abweichendes P53-Induktionsprofil im Vergleich zur ersten Testsubstanz CPA. Die Untersuchungen des AFB1 ließen feststellen, dass es bei ausreichend hohen Konzentrationen des Mutagens auch ohne Zugabe des MAS zu einer Aktivierung des P53 kommt ( ). Bis zu einer Konzentration von 1 μM war die detektierte P53-Induktion ohne MAS allerdings äußerst gering. In diesem Konzentrationsbereich ließ sich die Aktivierung des P53 durch Zugabe des S9 erheblich steigern. Hingegen bewirkte die Zugabe des MAS ab einer Konzentration von 5 μM eine Steigerung der Zytotoxizität (siehe Abschnitt 3.2.2) und führte dadurch zu einem verringerten P53 Signal. Hingegen zeigten die Proben, behandelt mit 5 μM und 10 μM AFB1, eine 3- bis 5-fache Induktion, wenn kein MAS zugegeben wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass die HepG2-Zellen in der Lage sind, AFB1 selbst zu metabolisieren, wenn die Substanzen ausreichend hoch dosiert wird.
  • Ein ähnliches P53-Induktionsprofil, wie das des AFB1, konnte für die letzte Testsubstanz, DMBA, beobachtet werden. DMBA zeigte ebenfalls eine induktive Wirkung auf das zelluläre P53 ohne dass ein MAS verwendet wurde ( ). Mit steigenden Konzentrationen wuchs auch das P53-Signal auf das bis zu 3,4-fache gegenüber der Kontrolle an. Diese Ergebnisse deuten, wie auch die vom AFB1, auf eine metabolische Aktivität der Zelllinie selbst hin. Des Weiteren führte die Zugabe von S9 nicht zu einer Steigerung der P53-Antwort, sondern lediglich zu einer erhöhten Varianz der Messwerte der biologischen Replikate. Da für DMBA in den Zytotoxizitätstests ab 10 μM ein Abfall der Zellviabilität nachgewiesen werden konnte (siehe Abschnitt 3.2.2), ist es möglich, dass auch hier zytotoxische Effekte eine Rolle spielen und sich deshalb keine Steigerung der P53-Aktivität mit dem MAS erzielen lässt.
  • Die innerhalb der P53-Sudien gewonnenen Resultate spiegeln die Erkenntnisse früherer Studien wider. Kürzlich zeigten Wilkening et al., dass eine DNA-schädigende Wirkung für Benzo[a]pyren in HepG2-Zellen mit dem Comet-Test nachweisbar ist [270]. Hingegen konnte für andere Promutagene, wie DEN oder PhIP, mit dem gleichen Test kein positives Resultat erzielt werden [270]. Des Weiteren bestätigen die Arbeiten von Westerink und seinen Mitarbeitern, die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten [275]. Westerink et al. demonstrierten, dass AFB1 und DMBA eine deutliche Aktivierung eines P53-Reportergens in Abwesenheit eines metabolischen Aktivierungssystems in HepG2 verursachen. Abgesehen davon, konnten sie für CPA nur nach Zugabe von S9 zu den Zellen eine Reportergeninduktion erzielen [275]. Yang et al. konnten ebenfalls zeigen, dass die P53-Induktion in NCTC 929-Zellen charakteristisch für gentoxische und progenotoxische Substanzen ist [276, 277]. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Arbeit, stellten Yang et al. fest, dass die P53-Aktivierung durch Promutagene im Vergleich zu unmittelbaren Mutagenen erst zu späteren Zeitpunkten detektiert werden kann [277]. Eine Limitation des von Yang et al. genutzten Zellsystems scheint jedoch die metabolische Aktivierung zu sein, da die eingesetzten Testkonzentrationen sehr viel höher waren als in dem HepG2-MAS-System in der vorliegenden Arbeit. AFB1 hatte bei Yang et al. bis zu einer Dosis von 5 μg/ml, was einer Konzentration von 16 μM im Behandlungsmedium entspricht, keinen Effekt auf die P53-Induktion in NCTC-Zellen [277]. Dagegen konnte mit dem HepG2-MAS-Modell ab einer AFB1-Konzentration von 1 μM ohne MAS und 0,1 μM mit MAS eine signifikante P53-Antwort detektiert werden. Obwohl ein absoluter Vergleich der beiden Systeme aufgrund der verschiedenen Behandlungsschemata und Zeitpunkte nicht möglich ist, zeigen diese Daten, dass es wichtig, den optimalen Messzeitpunkt für jedes System zu finden, um falsch negative Resultate zu vermeiden.
  • 3.2.4 Einfluss der Inhibition der HepG2-CYP-Aktiviät auf die genotoxische Wirkung der Prokanzerogene AFB1 und DMBA
  • Im Rahmen der P53-Induktionsstudien konnte für AFB1 und DMBA auch ohne metabolische Aktivierung eine Erhöhung an aktivem P53 nachgewiesen werden. Eine mögliche Erklärung wären residuale CYP-Enzymaktivitäten der HepG2-Zellen selbst. Die HepG2-Zellen könnten somit auch ohne Zugabe des metabolischen Aktivierungssystems die Substanzen in die gentoxischen Epoxidverbindungen umsetzen und dadurch die P53-Akkumulation auslösen. Um die Hypothese zu bestätigen, sollte versucht werden, die metabolische Umsetzung und dadurch verursachte P53-Induktion durch DMBA und AFB1 mittels Zugabe von spezifischen CYP-Inhibitoren zu verringern. Anhand der Charakterisierungsstudien konnte gezeigt werden, dass HepG2-Zellen eine Restaktivität und Induzierbarkeit für die Enzyme CYP1A1/2 und CYP3A4 besitzen. Daraufhin wurden die CYP-Inhibitoren α-Naphthoflavon (α-NF) und KETO ausgesucht. α-NF ist ein potenter und spezifischer Inhibitor für CYP1A und CYP1B [278, 279]. Hingegen wurde KETO als reversibler Inhibitor für CYP3A4 beschrieben [280]. Vor den P53-Studien wurden Zellviabilitätstests mit den beiden CYP-Inhibitoren durchgeführt, um zytotoxische Wirkungen durch die Inhibitoren selbst auszuschließen ( ). Es konnte für keine der beiden Verbindungen eine zytotoxische Wirkung im getesteten Konzentrationsbereich von 0,1 μM bis 10 μM nachgewiesen werden.
  • Auf Basis der Zytotoxizitätsdaten und vorangegangener Publikationen wurden die Inhibitordosierungen 1 μM, 5 μM und 10 μM für die P53-Inhibitionsexperimente ausgewählt [142, 281, 282]. Die Behandlung der Zellen erfolgte täglich über insgesamt 48 h in Kombination mit einer 30-minütigen Präinkubation mit dem entsprechenden Inhibitor bzw. Lösungsmittel für die Kontrollen vor der 6 h-Behandlung mit den Prokanzerogenen in Gegenwart oder Abwesenheit der Inhibitoren. Als Kontrollen wurden die HepG2-Zellen mit den Inhibitoren alleine behandelt, um zu zeigen, dass diese selbst keinen Einfluss auf die P53-Aktivierung besitzen (Anhang 8). Für beide Inhibitoren konnten im Konzentrationsbereich von 1 μM bis 10 μM ausschließlich P53-Induktionswerte im Bereich der DMSO-Lösungsmittelkontrolle nachgewiesen werden (Anhang 8).
  • Die Ergebnisse der Inhibitionsstudien mit AFB1 und DMBA sind in dargestellt (Induktionswerte siehe Anhang 8). Für AFB1 konnte mit KETO eine deutliche Verringerung der P53-Induktion nach der 48-stündigen Behandlungsperiode nachgewiesen werden ( ). Für die KETO-Konzentrationen von 1 μM bis 10 μM konnte eine vollständige Inhibition der durch 5 μM AFB1 induzierten P53-Antwort ermittelt werden. In der hohen Dosierung von AFB1 (10 μM) konnte zudem ein klarer dosisabhängiger Anstieg der Inhibition durch KETO beobachtet werden. Im Gegensatz zum KETO verursachte α-NF lediglich in Kombination mit der niedrigen AFB1-Dosis von 5 μM eine geringfügige aber nicht signifikante Reduktion der P53-Aktivität. Bei einer AFB1-Konzentration von 10 μM, konnte keine Verringerung des P53-Signals im Vergleich zum AFB1 allein detektiert werden.
  • Im Gegensatz zum AFB1 wurde für DMBA mit α-NF eine beträchtliche Inhibition der P53-Aktivierung unter Verwendung von Konzentrationen größer oder gleich 1 μM erreicht. KETO bewirkte ebenfalls eine Verminderung des aktivierten P53 im Vergleich zu den Behandlungen mit DMBA allein. Allerdings konnten erst ab einer Konzentration von 5 μM KETO inhibitorische Effekte detektiert werden. Bei einer Konzentration von 10 μM KETO wurde dann eine vollständige Inhibition der DMBA-vermittelten P53-Aktivierung festgestellt.
  • Die signifikante P53-Induktion durch DMBA in Abwesenheit eines metabolischen Aktivierungssystems könnte damit erklärt werden, dass CYP1A1 noch eine beträchtliche Expression in HepG2-Zellen aufwies, die sogar mit der in humanen Hepatozyten vergleichbar war. Außerdem konnte für CYP1A1 eine starke Induktion durch 3-MC erreicht werden (siehe Abschnitt 3.2.1). CYP1A1 ist eng verwandt mit CYP1B1, welches vermutlich eines der Hauptenzyme in der metabolischen Aktivierung von DMBA ist [61]. Frühere Publikationen belegen, dass α-NF ein potenter und selektiver Inhibitor beider Enzyme ist [278, 279]. Die vollständige Suppression der DMBA-vermittelten P53-Aktivierung durch α-NF indiziert die Verhinderung der Bildung des DNA-reaktiven Metaboliten.
  • Mit KETO konnte zwar ebenfalls eine Reduktion des aktivierten P53 im Vergleich zu den DMBA Behandlungen ohne Inhibitor beobachtet werden, allerdings waren höhere Inhibitorkonzentrationen nötig, um die DMBA-induzierte P53-Akkumulation zu unterdrücken. Obwohl KETO in niedriger Dosierung als potenter und selektiver Inhibitor von CYP3A4 bekannt ist, verursachen hohe Dosierungen, die für die vollständige Inhibition von CYP3A4 zu etwa 95% eingesetzt werden müssen, auch eine Inhibition anderer CYP-Enzyme, wie CYP1B1, CYP2B6 und CYP2C8/9/19, zu 20–60% [283]. Diese dosisabhängige Selektivität kann gemeinsam mit der Kreuzreaktivität in hohen Dosierungen des KETO die reduzierte P53-Antwort bei steigenden Inhibitorkonzentrationen erklären.
  • Die wichtigsten Enzyme, welche die metabolische Umsetzung von AFB1 vermitteln, sind CYP3A4 und CYP1A2 [52]. Im Rahmen der Charakterisierungsexperimente konnte für CYP3A4 eine induzierbare Expression nachgewiesen werden, welche im Einklang mit bereits publizierten Daten steht [268]. Allerdings waren die gefundenen Basalexpressionslevel des CYP3A4 in den HepG2-Zellen generell geringer als in Hepatozyten. Andererseits stellten Hewitt und Hewitt fest, dass die Umsatzraten von CYP3A4-abhängigen Substraten in HepG2-Zellen mit den von humanen Hepatozyten vergleichbar waren [272]. Ein beträchtlicher Einfluss von CYP3A4 für die AFB1-Epoxidbildung könnte für die durch KETO inhibierte P53-Induktion in Abwesenheit eines metabolischen Aktivierungssystems verantwortlich gemacht werden. Im Gegensatz zum DMBA, bei welchem nur hohe KETO-Dosierungen eine P53-Reduktion vermutlich aufgrund von unspezifischen CYP-Kreuzreaktivitäten, verursachten, konnte für AFB1 bereits in niedrigen Dosierungen eine verminderte P53-Induktion nachgewiesen werden. Andererseits führte die Kombinationsbehandlung mit α-NF nicht zu einer signifikanten Verringerung der P53-Antwort. In Übereinstimmung mit vorangegangenen Veröffentlichungen unterstreichen diese Daten, dass CYP3A4 wahrscheinlich die Schlüsselrolle für die metabolische Aktivierung von AFB1 spielt [284].
  • 3.3 Genexpressionsanalysen mit progenotoxischen Verbindungen
  • 3.3.1 Globale Datenanalyse
  • Im nächsten Teil der Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit den progenotoxischen Verbindungen AFB1, DMBA, DEN und CPA durchgeführt. Als Negativkontrollen wurden THEO und MET eingesetzt. Die Auswahl der Dosierungen und Zeitpunkte orientierte sich an den vorangegangenen P53- und Zellviabilitätsuntersuchungen (siehe Abschnitt 3.2.2/3.2.3). Nach einer globalen Normalisierung auf einen gemeinsamen Median der Intensitätswerte von 100 wurden die Daten mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) eingehender betrachtet ( ). Dabei konnte festgestellt werden, dass die verschiedenen Experimente (Zellpassagen) keinen wesentlichen Einfluss auf die globale Datenverteilung hatten ( ). Als Haupttrennungsmerkmale des Datensatzes konnten die verschiedenen Zeitpunkte (24 h und 48 h) sowie das MAS identifiziert werden ( /C). Den größten Effekt schien dabei das MAS ( ) zu besitzen, da zwei gut getrennte Datenwolken der Proben mit S9 und ohne S9 sichtbar waren. Eine klare Trennung der verschiedenen Testsubstanzen bzw. der gentoxischen und nicht-genotoxischen Behandlungsgruppen konnte im globalen Datenprofil aufgrund der überlagernden Effekte des MAS nicht detektiert werden. Außerdem wurden die verwendeten Dosierungen und Zeitpunkte so gewählt, dass sie möglichst im nicht-zytotoxischen Bereich lagen. Damit sollte eine beginnende DNA-Schadensantwort induziert werden, ohne die Zellen bereits zu töten. In den Abschnitten 3.1.1.2 und 3.2 wurde bereits beschrieben, dass die P53-Aktivierung meist mit einer Induktion des apoptotischen Zelltods einher geht. Sind diese Prozesse bereits weit fortgeschritten und ein Großteil der Zellen bereits tödlich beschädigt, können diese möglicherweise wenig spezifischen zytotoxischen Ereignisse die charakteristische genotoxische Antwort überlagern und somit eine gute Klassifizierung der Substanzen erschweren. Umgekehrt sind sehr schwache Veränderungen der Genexpression bezogen auf das Gesamtprofil durch die technisch begrenzte Replikatanzahl statistisch schwierig zu erfassen. Deswegen mussten auch die Grenzwerte für die FDR (False Discovery Rate) in der folgenden statistischen Auswertung entsprechend angepasst werden.
  • Eine weitere Herausforderung für die Datenanalyse stellt die Verwendung des MAS dar. Bereits an den Lösungsmittelkontrollen mit und ohne S9 ließ sich, wie bereits genannt, ein beträchtlicher Einfluss des MAS erkennen. Um die Substanzeffekte herauszuarbeiten, mussten die Daten um den Effekt des MAS korrigiert werden. Deshalb wurde zusätzlich mit einer so genannten Pointwise Division-Normalisierungsmethode gearbeitet. Durch Division jeder Probe auf die jeweilige S9-/DMSO-Kontrolle des gleichen Experimentes (gleiche Zellpassage) wurden auf diese Weise substanzspezifische Relativwerte generiert ( /D). Im späteren Verlauf (siehe /3.4.1) konnte gezeigt werden, dass durch die „MAS-Korrektur” eine Trennung der gentoxischen von den nicht-gentoxischen Proben möglich wird.
  • 3.3.2 Genexpressionsmuster von progenotoxischen Substanzen
  • Zur Evaluierung spezifischer Genexpressionsmuster der progenotoxischen Testsubstanzen wurde eine ANOVA der Proben des 48 h-Behandlungszeitpunktes mit dem Trenneffekt MAS durchgeführt, da die gentoxischen Effekte nach metabolischer Aktivierung auftreten sollten. Die Auswahl des 48 h-Zeitpunktes erfolgte auf Basis von statistischen Einzeltestungen, welche zeigten, dass nach 24 h in nahezu allen Proben keine wesentlichen Genexpressionsveränderungen auftraten (Daten nicht gezeigt). Mit Hilfe der Varianzanalyse konnten 808 Gene, welche einen p-Wert < 0,01 (bzw. BH-q-Wert < 0,3) aufwiesen, selektiert werden. Auf Basis von vorangegangenen statistischen Analysen (paarweise T-Tests mit den Median-normalisierten Ausgangsdaten), den p53-Studien sowie einer K-Means Clusteranalyse mit den ANOVA-Genen wurde eine Experimentgruppe „positive genotoxische Behandlungen” definiert. Diese Gruppe beinhaltet die Experimente, welche moderate bis starke Genexpressionsveränderungen aufwiesen: AFB1 1 μM + S9 und 10 μM – S9, DEN 25 mM/50 mM + S9, CPA 25 μM/50 μM + S9 und DMBA 10 μM + S9. Anschließend wurden die 808 ANOVA-Gene nach einem Deregulationsgrenzwert von 1,5 gefiltert. Für 88 Gene konnte eine Deregulation von ≥ 1,5-fach oder ≤ –1,5-fach in über 40% der Proben der Gruppe „positive genotoxische Behandlungen” nachgewiesen werden ( ). Diese 88 vorwiegend hochregulierten Gene können somit als charakteristisch für die verwendeten progenotoxischen Substanzen angesehen werden. Während die 88 Gene beim CPA ohne MAS fast ausschließlich Regulationen vergleichbar der Kontrolle zeigten, konnte beim AFB1 und auch für DMBA und DEN eine tendenziell ähnliche Regulation, wie in den Proben ohne S9, detektiert werden. Diese Beobachtungen bestätigen die vorangegangen P53-/CYP-Inhibitionsstudien, welche die metabolische Umsetzung von AFB1 und DMBA durch die HepG2-Zellen selbst schlussfolgern ließen. Die beiden verwendeten Negativkontrollen MET und THEO zeigten mit und ohne MAS erwartungsgemäß keine bzw. kaum Deregulationen der 88 Gene. Eine Übersicht über die Deregulationswerte der 88 gefundenen Gene ist im Anhang 10 zusammengestellt.
  • Die funktionelle Einordnung dieser Gene in acht verschiedene Kategorien wurde mit der Metacore und ToxWiz Datenbank vorgenommen ( ). Die größte Funktionsgruppe stellten mit 29% die Gene, die an zellulären Prozessen, wie Proliferation, Differenzierung und Entwicklung, beteiligt sind, dar. Beispiele sind die zellzyklusregulierenden Gene Cyclin D1 (CCND1), GOS2 (G0/G1 switch 2) und FSD1 (Fibronectin type III and SPRY domain containing 1), aber auch Gene mit Funktionen in der Gewebeumstrukturierung, wie die Matrix Metallopeptidase 7 (MMP7), der Hyaloronrezeptorligand CD44 oder HPLN4 (Hyaluronan and proteoglycan link protein 4). Die nächste große funktionelle Gruppe umfasste 15% der durch die progenotoxischen Substanzen regulierten Gene. Die Gene dieser Gruppe vermitteln als Komponenten verschiedener Signaltransduktionswege die Kommunikation zwischen Zellen. AMRH2 (Anti-Mullerian hormone receptor, type II) fungiert als Rezeptor im TGFβ-Signalweg, während das G-Protein GNA15 (Guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 15 (Gq class)) als Transduktor einer Vielzahl von membranständigen Signalkomponenten agiert. Weitere Gene, die in die G-Proteinsignaltransduktion involviert sind, sind der G-Protein-gekoppelte Rezeptor GPR110 oder das regulatorische Gen RGS16 (Regulator of G-protein signalling 16). Neben den Genen der Signaltransduktionskaskaden konnte eine ausgeprägte Immun- und Entzündungsantwort festgestellt werden. Insgesamt 13% der signifikant regulierten Gene konnte diesem Bereich zugeordnet werden. Hochreguliert waren Gene, wie der Interleukin-1-Rezeptor (IL1R2), NMI (N-Myc and STAT interactor), ein Koaktivator für Myc- und STAT-Transkriptionsfaktoren, aber auch Gene der Antigenpräsentation und -prozessierung. Zur gefundenen Funktionsgruppe Antigenpräsentation/-prozessierung gehörten, wie zum Beipsiel PROCR (Protein C receptor), MR1 (Major histocompatibility complex, class I-related) oder die G-Antigene GAGE4 und GAGE12I.
  • In Übereinstimmung mit den genotoxischen Substanzen konnte zudem eine ausgeprägte DNA-Schadensantwort festgestellt werden. Ungefähr 8% der putativen Markergene für progenotoxische Substanzen gehören zu dieser Funktionsgruppe. Ähnlich zu den genotoxischen Substanzen scheint P53 eine bedeutende Rolle in der Vermittlung der DNA-Schadensantwort zu spielen, da sowohl einige direkt mit der Funktion des P53 assoziierte Gene identifiziert werden konnten, als auch eine Vielzahl von deregulierten Gene innerhalb der gesamten P53-Signalkaskade gefunden worden ( ). Eine ausführliche Diskussion der DNA-Schadensantwort der progenotoxischen Substanzen ist gemeinsam mit den genotoxischen Substanzen im Rahmen des Klassifikationsmodells unter 3.4.2–4 zu finden. Trotz der zum Teil unterschiedlichen Rangfolge der Gene in Abhängigkeit von der Analyse und dem Betrachtungsschwerpunkt, waren die betroffenen toxikologischen Signalwege für beide Substanzgruppen nahezu identisch.
  • 3.4 Vergleichende Analyse genotoxischer und progenotoxischer Verbindungen
  • 3.4.1 Klassifikationsmodell
  • In den vorangegangenen Abschnitten wurden die Genexpressionsprofile genotoxischer und progenotoxischer Verbindungen separat interpretiert. Im folgenden Abschnitt wurde nun eine Gesamtanalyse der beiden mechanistischen Klassen durchgeführt. Diese hatte das Ziel, überlappende Gene zwischen den beiden Klassen zu definieren. Dazu fanden Methoden des maschinellen Lernens Verwendung (siehe Abschnitt 2.7.9). Um die beiden verschiedenen Datensätze miteinander vergleichen zu können, wurden die relativen Deregulationswerte für die Erstellung eines Klassifikationsmodells herangezogen. Für die Evaluierung eines geeigneten Modells wurden die Proben, welche zuvor in der statistischen Analyse eine angemessene Antwort zeigten, zusammengestellt. Bei diesen Proben handelt es sich um die Proben der Zeitpunkte 24 h und 48 h des Datensatzes der gentoxischen Verbindungen sowie die Proben des 48 h Behandlungszeitpunktes der progenotoxischen Verbindungen (Tab. 3.1). Diese Proben dienten als Trainingsgruppe für die Klassifikatorermittlung. Der 6 h-Zeitpunkt der genotoxischen Verbindungsklasse sowie der 24 h-Zeitpunkt der Promutagene wurden aufgrund fehlender Responsivität von den Analysen ausgeschlossen. Vor den Klassifikationsanalysen wurden die Proben anhand der Ergebnisse der P53-Studien und der statistischen Genexpressionsanalyse der Einzelproben (Daten sind nicht gezeigt) in gentoxisch und nicht-genotoxisch kategorisiert (Tab. 3.1). Dabei wurden CPA – S9 sowie ANB1 0,5 μM – S9 und DMBA 10 μM – S9 aufgrund der extrem schwachen Genexpressionsantwort (ermittelt durch gepaarte T-Testung gegen die jeweiligen Kontrollen/Daten nicht gezeigt) als nicht-genotoxisch eingestuft. THEO, MET und die S9-Kontrolle wurden ebenfalls der Kontrollgruppe (nicht-genotoxisch) zugeordnet. DEN wurde aufgrund der fehlenden P53-Antwort und somit fragwürdigen Annotationszuordnung aus dem Datensatz ausgegliedert und anschließend als unbekannte Trainingssubstanz zum Testen des erstellten Klassifikationsmodells verwendet. Tabelle 3.1: Kategorisierung des Trainingsdatensatzes für das Klassifikationsmodell basierend auf den Daten der P53- und Genexpressionsstudien.
    Substanz Dosis Zeitpunkt MAS Verbindungsklasse Kategorisierung
    THEO 100 μM 24 h – nicht-genotoxisch nicht-genotoxisch
    THEO 100 μM 48 h – nicht-genotoxisch nicht-genotoxisch
    MMS 500 μM 24 h – genotoxisch genotoxisch
    MMS 500 μM 48 h – genotoxisch genotoxisch
    ACT 250 nM 24 h – genotoxisch genotoxisch
    ACT 250 nM 48 h – genotoxisch genotoxisch
    ETO 500 nM 24 h – genotoxisch genotoxisch
    ETO 500 nM 48 h – genotoxisch genotoxisch
    CPA 25 μM 48 h – progenotoxisch nicht-genotoxisch
    CPA 25 μM 48 h + progenotoxisch genotoxisch
    CPA 50 μM 48 h – progenotoxisch nicht-genotoxisch
    CPA 50 μM 48 h + progenotoxisch genotoxisch
    AFB1 0,5 μM 48 h – progenotoxisch nicht-gentoxisch
    AFB1 10 μM 48 h – progenotoxisch gentoxisch
    AFB1 0.5 μM 48 h + progenotoxisch gentoxisch
    AFB1 1 μM 48 h – progenotoxisch gentoxisch
    AFB1 1 μM 48 h + progenotoxisch gentoxisch
    DMBA 10 μM 48 h – progenotoxisch nicht-gentoxisch
    DMBA 75 μM 48 h – progenotoxisch gentoxisch
    DMBA 10 μM 48 h + progenotoxisch gentoxisch
    MET 1 mM 48 h + nicht-genotoxisch nicht-gentoxisch
    MET 1 mM 48 h – nicht-genotoxisch nicht-genotoxisch
    THEO 100 μM 48 h – nicht-genotoxisch nicht-genotoxisch
    THEO 100 μM 48 h + nicht-genotoxisch nicht-genotoxisch
    S9-Kontrolle 0,2% DMSO 48 h + nicht-genotoxisch nicht-genotoxisch
  • Vor der Erstellung des Klassifikationsmodells wurde die Probenverteilung mit Hilfe einer Hauptkomponentenanalyse betrachtet ( ). zeigt, dass ACT und MMS deutlich separat vom Rest der Proben clustern. Eine Begründung dafür könnte die starke Genexpressionsantwort unter den verwendeten relativ hohen Dosierungen und die bereits moderate Zytotoxizität, vor allem nach 48 h Behandlung, sein. Um die Cluster genotoxisch und nicht-genotoxisch besser auflösen zu können, wurde eine zweite Hauptkomponentenanalyse ohne diese beiden Substanzen durchgeführt ( ). Die dabei erhaltene Probenverteilung im dreidimensionalen Raum zeigt zwei separate Bereiche für die gentoxischen und nicht-genotoxischen Proben. Es sollte demzufolge mit einem Klassifikationsmodell gut möglich sein, beide Verbindungsklassen voneinander zu unterscheiden.
  • Zur Evaluierung eines geeigneten Algorithmus für das Klassifikationsmodell wurde zunächst ein Ranking mit der Trainingsgruppe auf Basis des globalen Datensatzes durchgeführt (siehe Abschnitt 2.7.9.3). zeigt das Ergebnis des Ranking auf Basis einer ANOVA mit drei verschiedenen Klassifikationsalgorithmen (Support Vector Machine, Sparse Linear Discrimant Analysis und K Neorest Neighbours). Die Güte der Algorithmen wurde mit einer k-fachen Kreuzvalidierung ermittelt. Die niedrigsten Missklassifikationsraten ergaben sich unter Verwendung der Support-Vektormaschinen(SVM)-Methode. Bereits mit 11 Genen konnte eine Klassentrennung mit dem SVM-Klassifikator mit einer Missklassifikationsrate von nur 7,1% erreicht werden. Unter Verwendung von 91 Genen war die beobachtete Missklassifikationsrate minimal und lag bei nur 4,7%.
  • Aufgrund des besten Ergebnisses mit der SVM-Methode im Ranking wurde dieser Algorithmus für das finale Klassifikationsmodell favorisiert. Das Ergebnis der k-fachen Kreuzvalidierung (k = 10, 50 Wiederholungen) für die Klassifizierung mit dem SVM-Algorithmus ist in dargestellt. Wenn für die Erstellung des Klassifikationsmodells alle Gene verwendet werden, liegt die Misklassifikationsrate bei 8,2% ( ). Bei den falsch klassifizierten Proben handelt es sich um ETO (24 h) und DMBA – S9 (48 h). Das schwache Farbschema zeigt, dass die Zuordnung dieser Proben generell nicht eindeutig zu der einen oder anderen Klasse war. Beide Proben zeigten in der statistischen Einzelanalyse (Daten nicht gezeigt) geringere Genexpressionsveränderungen gegenüber der Kontrolle im Vergleich zu den anderen genotoxischen Proben. Diese Tatsache kann die Schwierigkeiten bei der Klassifizierung dieser Proben erklären. Der starke Hintergrund bei globalen Datensätzen, der dadurch zustande kommt, dass immer nur ein geringer Teil an Genen differentiell exprimiert wird, erschwert die Zuordnung zu der richtigen Substanzklasse. Das Klassifikationsmodell lässt sich verbessern, wenn man nur die 91 höchstrangierten Gene für die Berechnung des Klassifikators verwendet ( ). Alle Proben werden dann korrekt klassifiziert und die Missklassifikationsrate sinkt auf 0,25%.
  • 3.4.2 Klassifizierung von DEN
  • Mit Hilfe des mit dem Trainingsdatensatz erstellten Klassifikationsmodells wurde im nächsten Teil der Arbeit DEN als „unbekannte” Substanz getestet. DEN wurde anhand des Modells mit metabolischer Aktivierung als genotoxisch, ohne S9 hingegen als nicht-genotoxisch eingestuft ( ).
  • Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den P53-Resultaten für DEN, da auch unter Zugabe eines MAS keine P53-Induktion detektiert werden konnte (siehe Abschnitt 3.2.3). Aufgrund der widersprüchlichen Ergebnisse der Genexpressionsanalysen und P53-Studien wurde die DEN-vermittelte Genexpressionsantwort noch einmal genauer untersucht. Infolge der statistischen Analyse wurden 145 Gene (ANOVA gegen die Negativkontrollen MET und THEO, BH-q-Wert < 0,01), die in mindestens 40% der 48 h-DEN-Proben über 1,5-fach dereguliert waren, selektiert ( ). Von diesen Genen waren infolge der Behandlung mit dem Nitrosamin 88 hoch- und 57 herunterreguliert ( ).
  • Die 145 Gene wurden mit ToxWiz von Cambridge Cell Networks (Cambridge, UK) funktionell genauer betrachtet (Tab. 3.2). Die generellen toxikologischen Signalwege spiegeln die zelluläre Stresssituation nach Behandlung mit dem Kanzerogen DEN wider, da die betroffenen Gene an Prozessen, wie der Beseitigung von Superoxidradikalen, letaler gentoxischer Stress und dem xenobiotischen Metabolismus, beteiligt waren (Daten nicht gezeigt). Das Hauptaugenmerk der funktionellen Analyse lag jedoch auf der Untersuchung der typischen Prozesse innerhalb der DNA-Schadensantwort, um eine mögliche Begründung für die Diskrepanz zwischen den P53-Studien und den Microarrayanalysen zu finden. Deshalb wurden die Prozesse, welche die Erkennung des DNA-Schadens, die Aktivierung der Kontrollpunkte (Checkpoints) innerhalb der Zellzykluskontrolle und die Einleitung des programmierten Zelltods umfassen, detailliert analysiert. Tabelle 3.2 zeigt die diesbezüglich gefundenen Signalwege und die darin enthaltenen Gene, welche nach der Exposition mit DEN dereguliert gefunden worden. Tabelle 3.2: Veränderte Signalwege infolge der Exposition mit DEN in HepG2-Zellen und die mit diesen Signalwegen assoziierten, deregulierten Gene.
    Figure 01460001
  • Figure 01470001
  • Figure 01480001
  • Eine Überlegung war, dass die Diskrepanz zwischen den P53-Studien und den Genexpressionsdaten möglicherweise darauf beruht, dass die Zellen über einen anderen, P53-unabhängigen, Mechanismus auf den durch das Nitrosamin induzierten DNA-Schaden reagieren. Allerdings sprechen die Ergebnisse der Genexpressionsanalysen eher gegen diese Vermutung, da einige typische Gengruppen um den Tumorsuppressor P53 identifiziert werden konnten (Tab. 3.2). Die in diesen Gruppen enthaltenen Gene konnten zudem in vielen anderen Signalwegen, wie der Zellzykluskontrolle, der Apoptose sowie der DNA-Schadensantwort, wieder gefunden werden (Tab. 3.2). Es wurden zwar auch P53-unabhängige Signalwege für die Einleitung der Apoptose, unter anderem über den TNFR(Tumor necrosis factor receptor)-Caspase 8/10-Caspase 3-Signalweg sowie über den mitochondrialen Signalweg gefunden, diesen konnte jedoch keine bevorzugte Gewichtung gegenüber den P53-abhängigen Signalwegen zugeordnet werden.
  • Aufgrund dieser Daten, ist die beobachtete Diskrepanz zwischen den beiden Testsystemen wahrscheinlich viel mehr mit einer unzureichenden metabolischen Aktivierung des DENs, welche bei den P53-Studien bereits angesprochen wurde, zu begründen. Diese These kann von den Genexpressionsdaten ebenfalls gestützt werden. Bei der Betrachtung der Regulation der 145 durch DEN induzierten Gene, konnte festgestellt werden, dass insbesondere bei den hochregulierten Genen, die meisten Gene zwar in Gegenwart des MAS (S9) am stärksten dereguliert waren, die Regulationstendenz war jedoch ohne S9 meist die gleiche ( ). Da die HepG2-Zellen die beiden für die metabolische Umsetzung des Nitrosamins entscheidenden Enzyme, CYP2A6 und CYP2E1, nicht ausreichend exprimieren, ist eine Aktivierung durch die Zelllinie selbst unwahrscheinlich. Das bedeutet, die Zugabe des MAS kann das Nitrosamin zum Teil aktivieren, jedoch reicht die Aktivierung in diesem Fall vermutlich nicht aus, um eine ausreichend starke P53-Akkumulation zu induzieren, die mit dem TransAMTM P53-Test detektiert werden kann. Hingegen konnten mithilfe der Genexpressionsanalysen die schwachen Veränderungen zwischen den Proben mit und ohne MAS detektiert werden. Außerdem zeigte sich, dass diese Veränderungen ausreichend sind, um DEN mit S9 korrekt als genotoxisches Kanzerogen einzuordnen. In Zukunft müsste versucht werden, das System weiter zu optimieren, so dass auch mit dem TransAMTM P53 positive Resultate gewonnen werden können. Die Genexpressionsdaten suggerieren, dass es prinzipiell möglich sein müsste P53 auch für diese Substanzklasse als Marker zu verwenden, wenn man die Bildung des aktiven, DNA-reaktiven Metaboliten und die Exposition der Zellen mit diesem steigern kann. Eine Möglichkeit wäre, die Substanz mit dem S9 zu präinkubieren, um eine höhere Konzentration des aktiven Metaboliten zu erhalten, ohne die Zellen stärker zu belasten. Des Weiteren sollte versucht werden, eine bessere Durchmischung des dispersen Systems aus dem Nitrosamin und dem Zellkulturmedium mit MAS zu gewährleisten, um das System weiter zu verbessern. Das könnte z. B. durch die Verwendung eines geeigneten Lösungsvermittlers erreicht werden.
  • Die Problematik des Screenings von Nitrosaminen in HepG2-Zellen ist in der Literatur bereits mehrfach beschrieben worden. Obwohl die DNA-Reaktivität und Kanzerogenität in vivo für diese Verbindungsklasse erwiesen ist (die meisten Nitrosamin sind in die IARC Gruppen 2A und 2B als potentielle Humankanzerogene eingestuft), konnten mit verschiedenen Endpunkten, wie Mikrokerntest oder alkalischer DNA-Elutionstest, in HepG2 meist nur negative Resultate oder nur bei hohen Konzentrationen positive Resultate gewonnen werden [285]. Diese Studien bestätigen gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit die relative Unempfindlichkeit der HepG2-Zellen gegenüber den Nitrosaminen. Diese könnte auch dadurch zu Stande kommen, dass HepG2-Zellen einen noch relativ ausgeprägten Phase II-Metabolismus besitzen und die Substanzen deshalb möglicherweise effektiv entgiften können. Die Phase II-Biotransformation von Nitrosaminen erfolgt durch Konjugation mit Glutathion, Aminosäuren, Glukuron- oder Schwefelsäure [286]. Eine typische Konjugationsreaktion der Nitrosamin zu Glukuroniden wird durch UGT-Enzyme katalysiert [286, 287]. Obwohl die Basalexpression dieser Enzyme in HepG2-Zellen sehr schwach im Vergleich zu den primären humanen Hepatozyten war, konnte eine beträchtliche Induktion der untersuchten UGT1A-Enzyme mit RIF und 3-MC nachgewiesen werden. Des Weiteren waren die Transporter MRP1 und MRP2 partiell durch die beiden Induktoren verstärkt exprimiert worden. Beide Transporter sind vermutlich an der Exkretion von Nitrosaminen beteiligt [288].
  • 3.4.2 Gene des Klassifikationsmodells
  • Die mit Hilfe des Klassifikationsmodells evaluierten 91 putativen Markergene für (pro-)genotoxische Verbindungen sind in dargestellt (Deregulationswerte siehe Anhang 11). Die funktionelle Einordnung der Gene zeigte in Übereinstimmung mit den Einzelbetrachtungen der beiden Substanzklassen, dass eine Vielzahl der von den Substanzen gemeinsam deregulierten Gene in proliferative und generelle metabolische Prozesse involviert sind. Außerdem konnten gemeinsam regulierte Gene der ausgeprägten DNA-Schadensantwort ermittelt werden. Bei der tiefergehenden Analyse wurde auf die Signalnetzwerke DNA-Schadensregulation und Zellzykluskontrolle besonders eingegangen, da diese die spezifische Antwort auf die Schädigung der DNA und somit den Wirkmechanismus der Substanzen ist (siehe Abschnitt 3.4.2). Hingegen werden Veränderungen, wie beispielsweise im Metabolismus, vermutlich eher sekundär durch die induzierte Stresssituation in den Zellen verursacht. Hier müssten künftig sicherlich noch weiterführende Studien durchgeführt werden, um spezifische Marker der Genotoxine von allgemeinen stressinduzierten Genregulationen abgrenzen zu können. Obwohl es wahrscheinlich schwierig ist aus den zuletzt genannten Signalwegen einzelne Gene („putative Marker”) herauszugreifen, spiegeln sie in der Gesamtheit der 91 Gene eine charakteristische Antwort auf die genotoxischen Verbindungen wider und eignen sich daher als Gensatz durchaus für ein Screeningsystem.
  • 3.4.3 Modulation der unmittelbaren Prozesse infolge des substanzinduzierten DNA-Schadens
  • Zur Erforschung des Zusammenspiels der Gene der DNA-Schadensantwort wurde eine Netzwerkanalyse mit der Software ToxWiz von Cambridge Cell Networks (Cambridge, UK) durchgeführt. zeigt einen Ausschnitt aus dem Netzwerk der DNA-Schadensantwort mit Bezug auf ausgewählte Regulationen durch die Testsubstanzen. Als Hauptmodulatoren konnten die drei verschiedenen Transkriptionsfaktoren P53, STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1) und SP1/3/4 identifiziert werden. Obwohl diese selbst nicht hochreguliert waren, konnten entscheidende Zielgene dieser transkriptionellen Regulatoren gefunden werden. Am Beispiel P53 wurde vorangehend bereits beschrieben, dass der Transkriptionsfaktor selbst nur auf Proteinebene ohne Veränderungen der Genexpressionslevel reguliert wird. STAT1 liegt ebenfalls im Zytoplasma von ruhenden Zellen vor und wird durch bestimmte Signale, wie Interferone, durch Phosphorylierung aktiviert [289]. Die regulatorische Aktivität des SP1-Transkriptionsfaktors wird ebenfalls entscheidend vom Phosphorylierungsstatus des Proteins bestimmt [290].
  • Der Mechanismus der P53-vermittelten Regulation von verschiedenen Prozessen, wie Zellzyklus, Apoptose und DNA-Schadensreparatur, wurde bereits ausführlich diskutiert (siehe Abschnitt 3.1.1/2). STAT1 spielt eine essentielle Rolle in der Vermittlung von Interferonsignalen und somit in der angeborenen Immunantwort sowie der Regulation des Zellwachstums und programmierten Zelltods [291]. Aufgrund der hohen Anfälligkeit Stat1-defizienter Mäuse gegenüber chemikalieninduzierten Tumoren ist STAT1 vermutlich ähnlich dem P53 ein wichtiger Tumorsuppressor. STAT1 vermittelt wahrscheinlich die Induktion des Zellzyklusarrestes und der Apoptose nach gentoxischem Stress. Der postulierte Mechanismus der Wachstumsinhibition der Zellen durch STAT1 verläuft über die ATM-NBS1-SMC1- und die ATM-Chk2-Cdc25-Signalkaskaden (siehe Abschnitt 1.2.1/3.1.1.2), welche eine schnelle Inhibition der DNA-Synthese nach einer Schädigung der DNA bewirken. Des Weiteren beschrieben Townsend et al., dass STAT1 direkt mit p53 interagieren kann und dadurch koaktivatorisch die p53-vermittelten transkriptionellen Effekte und p53-induzierte Apoptose moduliert. Außerdem ist STAT1 als negativer Regulator des p53-Inhibitors Mdm2 beschrieben worden [291]. Neben der koregulatorischen Wirkung von STAT1 zu p53 gehören viele weitere Apoptose- und Zellzyklusregulatoren, wie Fas, Fas ligand und die CDK-Inhibitoren p21 und p27, zu den Zielgenen [291]. Unter den 91 Genen reguliert durch die (pro-)genotoxischen Substanzen war zudem auch der IL27RA (Interleukin 27-Rezeptor, alpha; auch TCCR/WSX1) hochreguliert (49/A). IL27, Ligand dieses Rezeptors, wird eine Beteiligung bei der Inhibition der Immunantwort und Typ 1-T-Helfer(TH1-)Zelldifferenzierung sowie antiangiogenetische und antiproliferative (antitumor) Eigenschaften zugeschrieben [292]. Durch die Bindung von IL27 an den Rezeptorkomplex IL27R/Glycoprotein 130 kommt es zur Phosphorylierung des Rezeptors durch assoziierte Kinasen (Januskinasen) [293]. Anschließend kann STAT1 über seine SH2 (Src Homology 2)-Domänen an die phosphorylierten Stellen binden und selbst durch Tyrosinphosphorylierung aktiviert werden. STAT1 kann dann in den Zellkern gelangen und dort die Transkription der Zielgene anschalten [293]. Zwei weitere mit der Funktion des STAT1 assoziierte Gene, die in den Analysen dieser Arbeit hochreguliert waren, sind ISG15 (interferon-stimulated gene 15 kDa) und TAP1 (transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B) (49/A). TAP1 ist ein Transporter der TAP/MDR-Familie, welcher für die Beladung von MHC I innerhalb der Antigenpräsentation verantwortlich ist. Die Herunterregulation von TAP1 in Tumorzellen wird als ein möglicher Mechanismus der malignen Transformation durch Verhinderung einer Immunreaktion gegen die entarteten Zellen postuliert [294]. Eine Fehlregulation des zweiten Genproduktes ISG15 kann ebenfalls zur Tumorpromotion beitragen [295]. Allerdings ist derzeit noch nicht klar ob ISG15 eher tumorsupprimierend oder promovierend wirkt. Neben den Funktionen in der angeborenen Immunantwort nach Induktion durch STAT1 wurde ISG15 auch als Targetgen des p53-Transkriptionsfaktors entdeckt [296].
  • Neben P53 und STAT1 konnte eine weitere Familie von transkriptionellen Regulatoren, die Cystein/Histidin-Zinkfinger Transkriptionsfaktoren SP, aufgrund der Assoziation mit der Expression der 91 Gene aus dem Klassifikationsmodell gefunden werden (49/B). Derzeit sind vier Mitglieder der SP-Familie bekannt: SP1, SP2, SP3 und SP4 [297]. Während SP3 und SP4 ubiquitär exprimiert werden, ist SP4 vorwiegend im Gehirn zu finden. SP3 und SP4 binden mit ähnlichen Affinitäten an die gleichen Konsensussequenzen in der DNA wie SP1. Allerdings fungiert SP3 wahrscheinlich als kompetitiver Repressor der SP1-vermittelten Transkription [297]. SP1 selbst ist an der Regulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen, wie Zellzyklus, hormonelle Aktivierung, Apoptose und Angiogenese, beteiligt [298]. Aktiviert wird SP1 durch eine Reihe von Zellzyklusregulatoren, wie CDK4, RAD51, E2F-DP1, CDKN1A oder STAT3 [298]. Des Weiteren wurde entdeckt, dass SP1 von DNA-PK und ATM nach einem DNA-Schaden mit einer H2AX vergleichbaren Kinetik aktivatorisch phosphoryliert werden kann [299]. Die Funktion von SP1 ist zudem stark vom P53-Status der Zellen abhängig. Es konnte gezeigt werden, dass der SP1-induzierte apoptotische Zelltod nur in Gegenwart von P53 ausgelöst werden kann [300]. Abgesehen von der proapoptotischen Funktion von SP1 sind auch wachstumsstimulatorische Eigenschaften beschrieben worden. Eines der Zielgene von SP1 ist c-Myc, welches die Zellzyklusprogression und gemeinsam mit SP1 die hTERT (humane Telomerase reverse Transkriptase) reguliert. Diese spielt wiederum eine wesentliche Rolle in der Kanzerogenese. MYC war im Rahmen dieser Arbeit durch die gentoxischen Kanzerogene ACT, ETO und teilweise MMS herunterreguliert (Daten nicht gezeigt).
  • EGR1, ein weiterer Transkriptionsfaktor mit Funktionen in der Zellproliferation und Differenzierung [297], der in das SP1/3-Netzwerk innerhalb der DNA-Schadensantwort involviert ist, wurde ebenfalls als dereguliert durch einige Testsubstanzen gefunden. Da jedoch lediglich MMS, DEN, AFB und teilweise CPA eine Hochregulation zeigten, gehört EGR1 nicht zu den 91 putativen Markern des Klassifikationsmodells (Daten nicht gezeigt). Eine Induktion des EGR1 durch verschiedene DNA-schädigende Substanzen wurde bereits beschrieben [301]. EGR1 ist zudem an der Aktivierung von P53 beteiligt und inhibiert gleichzeitig den PI3K/Akt-Signalweg durch Hochregulation des Tumorsuppressors PTEN [302, 303]. Obwohl eine Wechselwirkung zwischen HOMER3 und EGR1 vermutet wird, ist die genaue Funktion dieser Interaktion noch unklar. HOMER3 wurde in dieser Arbeit als putativer Marker innerhalb des Klassifikationsmodells identifiziert ( ).
  • Drei weitere durch die gentoxischen Testsubstanzen hochregulierte Gene im SP-Netzwerk waren RhoGDI2 (ARHGDIB), AXL und Neuregulin 1 (NRG1). Die Funktionen des Rho-GTPase Inhibitors RhoGDI2 in Zusammenhang mit einem DNA-Schaden und Apoptose wurden bereits in 3.1.1.2 beschrieben. AXL, eine Rezeptortyrosinkinase, und NRG1 haben normalerweise eine stimulatorische Wirkung auf das Zellwachstum, die über die AKT (v-akt murine thymoma viral oncogene) vermittelt werden [304–306]. Allerdings wurde für NRG1 auch eine inhibitorische Wirkung in Abhängigkeit von der zellulären Situation beschrieben [304]. Die AKT1 konnte in den Microarrayanalysen in dieser Arbeit allerdings nicht verändert vorgefunden werden (Daten nicht gezeigt). Dies indiziert einen anderen Mechanismus, über den die beiden Gene in die Regulation des Zellwachstums infolge der Exposition mit den gentoxischen Substanzen eingreifen.
  • 3.4.4 Selektion weiterer potentieller Markergene mit Hilfe des Klassifikationsmodells
  • Neben den vorangehend beschriebenen Genen der DNA-Schadensreparatur, die potentielle Marker für die (pro-)genotoxischen Verbindungen darstellen, wurde nach weiteren charakteristischen Genregulationen gesucht. Unter den 91 Genen, welche mit Hilfe des Klassifikationsmodells gefunden worden, konnten 8 Gene mit konsistenten Regulationen im Bereich von 1,5- bis 10-fach höher im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle in den als gentoxisch annotierten Proben gefunden werden (Tab. 3.3). IER5 (immediate early response 5), Galectin 7 (lectin, galactoside-binding, soluble, 7/LGALS7) und CDKN1A (cyclindependent kinase inhibitor 1A/p21/Cip1) sind Gene mit Funktionen innerhalb von spezifischen Prozessen infolge des entstandenen DNA-Schadens. Hingegen sind EMP3 (epithelial membrane protein 3), CRABP2 (cellular retinoic acid binding protein 2), EMP1 (epithelial membrane protein 1) und PLAU (plasminogen activator, urokinase) funktionell an der proliferativen Regulation sowie an Vorgängen, wie Wachstum und Differenzierung, beteiligt. PROCR (protein C receptor, endothelial/EPCR)) moduliert als ein typischer Mediator entzündliche und immunchemische Prozesse. Tabelle 3.3: Deregulation ausgewählter Gene mit konsistenten Regulationen infolge der Behandlung mit (pro-)genotoxischen Modellsubstanzen. Die Tabelle zeigt die Deregulation von ausgewählten Genen aus dem Klassifikationsmodell auf Basis der Illumina-Microarraydaten. Diese acht Gene zeigten in HepG2-Zellen nach 48 h eine signifikante Induktion (FC ≥ 1,5 (orange unterlegt) in mind. 80% der responsiven Proben/„Gruppe positiv genotoxische Behandlungen”) infolge der Behandlung mit den verschiedenen (pro-)genotoxischen Modellsubstanzen. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte der Deregulationswerte gegenüber den entsprechenden S9-/Lösungsmittelkontrollen aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25. Legende: Actinomycin D (ACT), Methylmethansulfonat (MMS), Etoposid (ETO), Aflatoxin B1 (AFB1), 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), Cyclophosphamid (CPA), Diethylnitrosamin (DEN). * Signifikanz im Student's T-Test p < 0,05
    Figure 01560001
    Figure 01570001
  • Kürzlich konnte bereits die Induktion von IER5 sowie PROCR infolge ionisierender Bestrahlung festgestellt werden [307, 308]. Eine siRNA-basierte Supprimierung von IER5 bewirkte zudem in Hela-Zellen eine Verstärkung des strahlungsinduzierten G2/M-Arrestes der Zellen. Diese Daten belegen, dass IER5 eine wichtige Rolle in der Kontrolle des Zellzyklus spielt [307]. Galectin 7 ist ein proapoptotisches Protein, das vermutlich über die Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase JNK und der Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien zur Auslösung des Zelltodes führt [309]. Die Expression von Galectin 7 steht zudem, wie auch die des CDKNIA (p21), unter Kontrolle von P53 [310, 311]. CDKN1A bindet und inhibiert nach dessen Aktivierung Cdk2/Cyclin E (Cyclin-dependent kinase 2/Cyclin E)-Komplexe und verhindert so die aktivatorische Phosphorylierung von Rb (Retinoblastoma) [29]. Dadurch wird die Rb-E2F-vermittelte Transkription S-Phasepromovierender Gene unterbunden, was zum Stopp des Zellzyklus während der G1-Phase führt [29].
  • EMP1 induziert ebenfalls eine Verlängerung der G1-Phase und eine verkürzte S-Phase und wurde in verschiedenen Tumoren überexprimiert gefunden [312]. Außerdem konnte bei transienter Expression des EMP1 eine spezifische Inhibition der Zellproliferation nachgewiesen werden. In NIH3T3-Zellen konnte zudem nach Überexpression ein apoptoseähnlicher Phänotyp beobachtet werden [312]. EMP3 gehört, wie EMP1, zur Genfamilie der peripheren 22-kDa Myelinproteine (PMP22 oder auch als TMP-Genfamilie bekannt) [313]. Es wird postuliert, dass EMP3 eine Rolle bei der Zell-Zell-Kommunikation und Zellproliferation spielt. Alaminos et al. konnten zudem zeigen, dass das Einbringen von EMP3 in defiziente Krebszellen das Tumorwachstum und die Kolonieformation hemmt. Diese Studien indizieren die Funktion von EMP3 als Tumorsuppressor [313]. Eine zytoprotektive Wirkung von EMP3 konnte zudem durch Li und seine Mitarbeiter in HepG2-Zellen nachgewiesen werden [314].
  • CRABP2 codiert für ein kleines (15-kDa) Protein mit einer Lipocalindomäne für die Bindung an Retinolsäure (RA) [315]. Dadurch transloziert RA in den Nukleus, wo sie über den RAR die Transkription einer Vielzahl von Genen kontrolliert. Die Targetgene regulieren wiederum Prozesse, wie Entwicklung, Embryogenese, Differenzierung und Apoptose. CRABP2 vermittelt dabei vermutlich hauptsächlich die antiproliferativen Effekte des RAR-Signalwegs. Die Fähigkeit zur Apoptoseinduktion durch CRABP2 konnte in MCF-7-Zellen und in einer Keratinozytenzelllinie nachgewiesen werden [315].
  • Im Gegensatz zu den vorangehend genannten proapoptotischen Genen stimulieren PROCR und PLAU vorwiegend das Zellüberleben [316]. Der antikoagulativ und antiinflammatorisch wirkende PROCR stammt aus der MHC-I Familie und wird normalerweise auf Endothelzellen der Aorta und von anderen großen Arterien exprimiert [316]. Die zellwachstumsfördernde Wirkung von PLAU wird vermutlich über die Aktivierung der MAPK(p38)-Signalkaskade nach Bindung von PLAU an den uPAR realisiert [317]. Neben den proliferationsfördernden Eigenschaften wirkt PLAU über die Aktivierung des RAS-ERK- bzw. PI3K-Akt-Signalweges antiapoptotisch. Des Weiteren wird eine funktionelle Verbindung von antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern sowie dem Fas(TNF-/Todes-)-Rezeptorsignalweg bei der PLAU-vermittelten Apoptosesuppression diskutiert [317].
  • Die Analyse der in diesem Abschnitt diskutierten Gene, welche besonders stark von den gentoxischen Testsubstanzen induziert waren, zeigte, dass sie in die komplexe Regulation von Zelltod und -überleben eingreifen. Dazu gehörte die Regulation des Zellzyklus, der Zellproliferation und der Apoptose. Die überwiegende Hochregulation proapoptotischer und antiproliferativer Gene im Vergleich zu wenigen Genen mit antiapoptotischen Eigenschaften deutet auf eine Induktion des programmierten Zelltodes infolge des substanzinduzierten DNA-Schadens hin. Die acht selektierten Gene sowie die im vorigen Abschnitt (siehe Abschnitt 3.4.2) diskutierten transkriptionellen Regulatoren der DNA-Schadensantwort stellen damit potentielle Kandidaten für die Entwicklung eines neuen Screeningsystems für (pro-)genotoxische Verbindungen dar.
  • 4 Schlußfolgerung und Ausblick
  • 4.1 Evaluierung von putativen Markergenen und Entwicklung neuer Screeningsysteme zur Prüfung auf Genotoxizität
  • Wie einleitend bereits erwähnt, nimmt die Charakterisierung krebserregender Substanzen einen besonderen Stellenwert bei der Bestimmung toxischer Wirkungen von Chemikalien und Arzneimitteln ein. Da die Mehrheit der Kanzerogene aufgrund ihrer gentoxischen (DNA-reaktiven/mutagenen) Wirkung Tumoren induzieren, ist die Genotoxizitätstestung ein entscheidender Bestandteil während der pharmazeutischen Entwicklung sowie bei der Beurteilung des Gefährdungspotentials von Chemikalien. Dabei ist die Mutagenität ein Surrogatmarker für das Risiko der direkten Entstehung somatischer Krebsarten aber auch der indirekten Krebsentstehung durch Keimzellmutationen, welche dann über Generationen weitergegeben werden. Scanner and Dybing konnten eine generelle Korrelation der mutagenen und kanzerogenen Potenzen von Substanzen entlang der log-log Skala feststellen [318]. Die Testsysteme der Standardtestbatterie für gentoxische Substanzen (Rückmutation in Bakterien und Evaluierung von Chromosomenschäden in Säugerzellen in vitro und/oder in vivo) sind sehr sensitiv bezüglich der Erkennung des gentoxischen Potentials von Substanzen, besitzen aber eine niedrige Spezifität. Diese geringe Spezifität und die damit verbundene hohe Rate an falsch positiven Resultaten erschwert die Extrapolation zur Abschätzung der Gefährdung für den Menschen erheblich. Deshalb ist die Entwicklung neuer spezifischerer Testsysteme von großer Bedeutung.
  • Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuer genomicsbasierter Ansatz zur Identifizierung von mutagenen und promutagenen Verbindungen in vitro entwickelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass mutagene und promutagene Verbindungen charakteristische Genexpressionsveränderungen in HepG2-Zellen induzieren. Die evaluierten 91 putativen Markergene, welche an Prozessen, wie der DNA-Schadensantwort, Regulation der Zellproliferation und Apoptose sowie Vermittlung einer Entzündungsantwort, beteiligt waren, können für die Identifizierung des genotoxischen Potentials unbekannter Substanzen herangezogen werden. Zudem konnte anhand der P53-Experimente gezeigt werden, dass mit Hilfe der Genexpressionsprofile neue Marker für genotoxische Substanzen entdeckt werden können, die ein schnelleres Screening ermöglichen. Die Aktivierung von P53 durch mutagene und promutagene Substanzen, welche durch die Regulation einer Vielzahl von P53-Targetgenen in den Microarraystudien indiziert worden war, konnte in den durchgeführten P53-Studien zweifelsfrei bestätigt werden. Andere Publikationen stützen die potentielle Verwendung von P53 als Genotoxizitätsmarker. Westerink et al. demonstrierten, dass die Analyse von P53 ein hochspezifischer und sensitiver Marker für das Screening genotoxischer Substanzen ist [275]. Im Rahmen der Untersuchung von 62 ECVAM5
    • 5
    Das European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) wurde 1991 mit dem Zweck des Schutzes von Versuchstieren durch Unterstützung der Entwicklung, Validierung Akzeptanz von Methoden, die Tierversuche reduzieren, verbessern oder ersetzen (3R-Prinzip) können, gegründet [319].
    Substanzen konnte die beste Prädiktivität für den P53-Luziferase-Reportergentests mit einer Spezifität von 85% und einer Sensitivität von 93% nachgewiesen werden. Eine weiterführende Validierungsstudie mit 192 Verbindungen zeigte zudem die hohe Korrelation des entwickelten P53-Reportergentests mit vorhandenen Mutagenitätsdaten und Klastogenitätsstudien in vivo [275]. Des Weiteren zeigten Studien von Yang, Duerksen-Hughes und Mitarbeitern, dass die Detektion von zellulärem P53 in NCTC 929-Zellen zur Diskriminierung von gentoxischen und nicht-gentoxischen Substanzen genutzt werden kann [276, 277]. In diesen Studien wurde die P53-Aktivierung infolge der Exposition mit verschiedenen (Pro-)mutagenen, epigenetischen nicht-DNA reaktiven Mutagenen und Nicht-Kanzerogenen gemessen und mit bereits vorhandenen Genotoxizitätsdaten verglichen. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Detektion von P53 bezüglich der Prädiktion eine ähnliche Genauigkeit, wie andere Mutagenitätstests (Salmonella und SHE Test) zulässt und eine gute Korrelation zu vorhandenen in vivo-Daten aufweist [276].
  • Neue, mit Hilfe von Omics-Analysen evaluierte Marker könnten zum Design von Screeningsystemen mit einem höheren Durchsatz sowie geringerem Zeit- und Kostenaufwand, wie zum Beispiel High Content Imaging(HCI)- oder TaqManTM low densitiy array(TLDA)-Testsystemen, genutzt werden. TLDA-Analysen könnten beispielsweise für ein Screening und die mechanistische Charakterisierung genotoxischer Verbindung unter Verwendung der 91 evaluierten Marker angewendet werden. Allerdings ist ein solches System nur für einen geringen Durchsatz an Testsubstanzen geeignet. Hingegen erlaubt die HCI-Technologie die Analyse einiger ausgewählter Endpunkte (Proteine) durch Kombination von immunchemischen Nachweisen mit automatisierter Mikroskopie und optimierten Bildgebungsverfahren [320]. Die HCI-Technologie bietet somit einen Screeningansatz mit mittlerem Durchsatz, wobei aber dennoch die biologische Komplexizität und molekularen Wechselwirkungen mit in die Untersuchungen eingeschlossen bleiben. Auf diese Weise könnten verschiedene genotoxische Endpunkte (z. B. Proteinmarker, Reportergenaktivierung oder Mikrokerne) bei gleichzeitiger Erfassung von Parametern, wie der Zellviabilität/Zytotoxizität, dem mitochondrialen Status oder der Zellzahl, untersucht werden. Als potentielle Marker könnten unter anderem die in dieser Arbeit gefundenen Gene IER5, CDKN1A, EMP1, EMP3, CRABP2, PROCR, Galectin 7 oder PLAU herangezogen werden (siehe Abschnitt 3.4.2). Außerdem könnte neben dem vorangehend bereits erwähnten P53 künftig auch die Eignung der transkriptionellen Regulatoren STAT1 oder SP1/3 als Genotoxizitätsmarker überprüft werden.
  • Allerdings müsste in künftigen Studien die Spezifität dieser putativen Genotoxizitätsmarker abgeklärt werden. Obwohl für viele dieser Gene bekannt ist, dass Sie funktionell in die Antwort auf einen DNA-Schaden eingebunden sind (unter anderem CDKN1A, P53, STAT1, Galectin 7, IER5) (siehe 3.4.3/3.4.4), gibt es auch andere Signale, die zur Aktivierung dieser Komponenten führen können. Beispielsweise kann P53 durch Nährstoffmangel oder Hypoxie [321] und STAT1 durch hyperosmotischen Stress, erhöhte zelluläre Glucosespiegel, Hypoxie oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) [322] aktiviert werden. Trotz der potentiellen anderen Stresssignale spielt die Aktivierung von P53 durch gentoxischen Stress eine integrale Rolle, da P53 bereits auf geringe DNA-Schädigungen extrem sensitiv reagiert [321]. Außerdem kann die Kombination mehrerer Gene, die mit Hilfe der Microarrayanalysen nach (pro-)genotoxischer Behandlung dereguliert waren, die charakteristische Antwort dieser Substanzen widerspiegeln. Für die Verwendung der diskutierten Gene als putative Genotoxizitätsmarker spricht zudem, dass diese im Rahmen dieser Arbeit bereits bei Behandlungen mit den (pro-)genotoxischen Substanzen im Bereich nicht-zytotoxischer Dosierungen dereguliert waren. Dagegen zeigten die Kontrollsubstanzen Metformin und Theophyllin keine Deregulationen dieser Gene. Dennoch sollten künftig neben weiteren genotoxischen Substanzen, auch (nicht-genotoxische) hepatotoxische sowie weitere Negativsubstanzen getestet werden. Insbesondere durch den Vergleich der Genexpressionsantwort mit hepatotoxischen Substanzen könnten wichtige Informationen darüber gewonnen werden, wie repräsentativ diese Gene bezogen auf Genotoxizität sind. Abgesehen davon muss jedoch immer berücksichtigt werden, dass solche „Marker” für das zelluläre System (hier HepG2-Zellen) charakteristisch sind und nicht direkt auf andere Zell- oder in vivo-Systeme übertragen werden können.
  • 4.2 Einsatz globaler Genexpressionsanalysen in der Genotoxizitäts- und Kanzerogenitätstestung
  • Abgesehen von der Auswahl gezielter Marker und der Entwicklung von Screeningsystemen mit mittlerem Durchsatz, könnten globale Expressionsprofile in HepG2 künftig auch begleitend zur Standard-in vitro-Testbatterie eingesetzt werden. Solche globalen Profilierungen könnten bei Verbindungen mit nicht eindeutigen Ergebnissen („Grenzfälle” mit widersprüchlichen Testergebnissen) in der Standard-in vitro-Testbatterie angewendet werden. Die dadurch erstellten mechanistischen Profile könnten in solchen Fällen helfen, eine Entscheidung zur Zuordnung der Substanzen zu treffen.
  • Zusätzlich zu den Analysen in vitro wäre es denkbar, Genomics in vivo zur Genotoxizitätstestung einzusetzen. Ohne zusätzlichen Tieraufwand könnten Genexpressionsmuster im Knochenmark oder der Leber von Nagern aus Mikrokernteststudien auf spezifische Veränderungen untersucht und zur mechanistischen Substanzcharakterisierung und eindeutigen Identifizierung von (Pro-)Mutagenen herangezogen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Knochenmarksproben von CPA behandelten Ratten bereits profiliert (Daten nicht gezeigt). Es wurde ein charakteristisches Muster, das sich zweifelsfrei von den Kontrollen unterschied und die Veränderungen in den hämatopoietischen Zellen nach einem DNA-Schaden widerspiegelt, gefunden. Allerdings konnten anhand der Daten dieser einen Substanz keine allgemeingültigen Rückschlüsse für die Eignung solcher globalen Profilierungen für die Genotoxizitätstestung gezogen werden. Dafür müssten künftig Studien mit weiteren Modellsubstanzen gemacht werden, um eine gentoxische Antwort zweifelsfrei von einer Stressantwort im Hintergrund oder generell einer zytotoxischen Reaktion abzugrenzen. Dennoch wäre es eine Möglichkeit die derzeitige Standardtestbatterie weiter zu verbessern. Über die Genotoxizitätstestung hinaus wurden bereits Studien, in welchen die Eignung von Genomics in der Kanzerogenitätstestung erforscht wurde, publiziert [131]. Besonderes Potential wird hierbei in der Identifizierung und Bewertung von Kanzerogenen mit einem nicht-gentoxischen Wirkmechanismus gesehen.
  • Im Allgemeinen sind die Vorteile der Omics-Testung in vitro gegenüber der in vivo vor allem in der Stabilität der untersuchten Parameter zu sehen. Während molekulare Effekte in vivo besser nachgebildet werden können, werden in vitro-Systeme nicht von individuellen Unterschieden der Testorganismen beeinflusst und können leichter zu Screeningsystemen mit mittlerem bis hohem Durchsatz ausgebaut werden. Somit ist die in vitro-Testung nicht nur aus Tierschutzgründen, sondern auch aus wirtschaftlichen Aspekten im Sinne der Kostenreduktion interessant. Eine Hauptlimitation der humanen Zelllinien ist jedoch die begrenzte metabolische Kompetenz (siehe Diskussion verschiedener zellulärer Systeme unter 4.3).
  • 4.3 Prävalidierung und Weiterentwicklung der neuen Testsysteme
  • Um das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte in vitro-Testmodell weiter zu verbessern und die Marker zu validieren ist es unerlässlich noch weitere Substanzen zu testen. Als potentielle Validierungssubstanzen könnten die von der ECVAM empfohlenen 62 Verbindungen für die Validierung bzw. Optimierung neuer Genotoxizitätstests in vitro verwendet werde. Der Verbindungsdatensatz besteht aus 20 DNA-reaktiven Genotoxinen („Richtig-Positive”), 23 nicht mutagenen Verbindungen („Richtig-Negative”) und 19 nicht DNA-reaktiven Substanzen, die aber positive Resultate im Test auf Maus-Lymphoma tk Mutationen oder Chromosomenabberationen zeigten [109]. Für eine breiter angelegte Validierungsstudie könnte zudem der Testdatensatz, vorgeschlagen von Westerink et al., bestehend aus 192 Substanzen genutzt werden [275]. Eine solche Validierungsstudie ermöglicht es die Prädiktivität der im Rahmen dieser Arbeit vorgeschlagenen in vitro-Testsysteme, welche Parameter, wie Sensitivität und Spezifität einschließt, zu ermitteln. Der Aufbau einer Datenbank für den künftigen Abgleich mit unbekannten Substanzen ist dabei ebenfalls von besonderer Bedeutung. Hat man Expressionsprofile von genügend Substanzen zur Verfügung, könnte mit Hilfe spezieller bioinformatischer Systeme, wie neuronaler Netzwerke, ein optimales Klassifikationsmodell erstellen und somit die Sensitivität und Spezifität des bestehenden Systems weiter verbessert werden.
  • In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verwendeten HepG2-Zellen in der Lage sind, Verbindungen CYP1A/1B1- und 3A4-abhängig selbst zu metabolisieren. Insbesondere spielt CYP3A4 eine bedeutende Rolle in der Biotransformation vieler Xenobiotika. Ungefähr 50% der in der Klinik angewendeten Medikamente sowie eine Vielzahl von Prokanzerogenen, wie z. B. AFB1, Benzo[a]pyren, Naphthalen, 1-Nitropyren oder 6-Aminochrysen, werden durch CYP3A4 metabolisiert [53, 56]. Auch die CYP-Enzyme 1A1/2 und 1B1 sind wesentlich an der metabolischen Aktivierung von Prokanzerogenen der Klassen polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, Aryl- und Heterozyklischen Amine und Benz[a]anthracen beteiligt. Durch die endogene Aktivität der genannten CYP-Enzyme in HepG2 kann bereits ohne Zugabe eines metabolischen Aktivierungssystems ein breites Spektrum an genotoxischen Substanzen erfasst werden. Das ist ein erheblicher Vorteil von HepG2 zum Beispiel gegenüber den TK6-Zellen, die im GreenScreen6
    • 6
    Der GreenScreen ist ein neuer in vitro-Genotoxizitätstest, der auf der Messung eines Gadd45α-Reportergens in TK6-Zellen basiert [323, 324].
    eingesetzt werden, und spricht damit für die Verwendung von HepG2-Zellen im Genotoxizitätsscreening.
  • Trotzdem reicht die fremdstoffmetabolisierende Aktivität der Zelllinie nicht aus um alle Verbindungsklassen an progenotoxischen Substanzen abzudecken. Deshalb wurde ein kombiniertes System aus HepG2 und einem metabolischen Aktivierungssystem (Rattenleber-S9-Homogenate) entwickelt und die Funktionalität bestätigt. Zur besseren Übertragbarkeit der Resultate für die Abschätzung der humanen Gefährdung könnte das System mit humanen Mikrosomenfraktionen anstatt des Ratten-S9 kombiniert werden. Allerdings sind humane MAS sehr teuer, was die Verwendung für große Screeningversuche einschränkt. Problematisch für die Etablierung eines solchen Systems sind außerdem die niedrigen Aktivitätsspiegel der fremdstoffmetabolisierenden Enzyme im Vergleich zum induzierten Ratten-S9-Mix oder Rattenmikrosomen. Eine andere Möglichkeit wäre deshalb der Einsatz anderer metabolisch kompetenter Zellen für die Genotoxizitätstestung. Obwohl primäre humane Hepatozyten aufgrund ihres metabolischen Profils das derzeitige in vitro-Referenzmodell für Arzneimittelmetabolismus- und CYP-Induktionsstudien sind [243], eignen sie sich wegen dem Verlust der Proliferationsfähigkeit in Kultur der adulten differenzierten Hepatozyten nicht für Genotoxizitätsuntersuchungen. Außerdem sind humane Hepatozyten nur begrenzt verfügbar und Spenderunterschiede können sowohl bei den humanen Hepatozyten als auch Chargenunterschiede bei den humanen Mikrosomen eine natürliche Variabilität bewirken [243], was die Standardisierung solcher Systeme zusätzlich erschwert. Die große Variabilität zwischen den verschiedenen Donoren wurde in dieser Arbeit innerhalb der vergleichenden Charkterisierungsstudien von HepG2 und humanen Hepatozyten bereits deutlich. Um das Problem der begrenzten Proliferation zu umgehen, entwickelte die Firma Medicyte zwei verschiedene Technologien, bei denen die Proliferationsfähigkeit primärer Zellen in vitro durch gezielte genetische Veränderung oder den Zusatz spezifischer rekombinanter Proteinfaktoren zum Zellkulturmedium wieder hergestellt wird [325]. Neben solchen primären Hepatozyten in Kombination mit der Medicyte Technologie wäre die Verwendung von HepaRG Zellen für die Entwicklung eines neuen Genotoxizitätstestsystems eine weitere Alternative. HepaRG ist eine neuartige Hepatomzelllinie, die einerseits die Fähigkeit zur Proliferation besitzt und andererseits nach Konfluenz einen hepatozytenähnlichen Differenzierungsstatus aufweist [243, 326]. HepaRG exprimieren eine Vielzahl an CYP-Enzymen (CYP1A2, 3A4, 7A1, 2D6 2E1), nukleären Faktoren (AhR, PXR, CAR, PPARα) und Phase II-Enzymen (UGT1A1, GSTA1, GSTA4) [243, 326]. Allerdings sind die Aktivitäten der CYP-Enzyme in der Regel geringer als in humanen Hepatozyten mit Ausnahme von CYP3A4 und 7A1 [326], was die Nutzung der Zelllinie per se für das Genotoxizitätsscreening möglicherweise einschränken könnte.
  • Abgesehen von der Testung weiterer Substanzen in HepG2-Zellen oder der Evaluierung der Eignung anderer zellulärer Systeme sollten künftig Studien gemacht werden, die die fehlende (P53-Studien)/schwache (Genexpressionsanalysen) Responsivität des Nitrosamins DEN in vitro erklären können. Um die Ursache abzuklären, könnte versucht werden in künftigen Studien Genexpressionsprofile nach einem siRNA-Knockdown des P53 aufzuzeichnen. Würde das Nitrosamin dennoch richtig klassifiziert werden, deutet das auf P53-unabhängige Mechanismen hin, welche die Nitrosamin-induzierte Genotoxizitätsantwort vermitteln. Des Weiteren könnte durch die Verwendung von HepG2-Zellen, die CYP2E1 und/oder CYP2A6 überexprimieren [327], herausgefunden werden, ob eine unzureichende metabolische Aktivierung durch das exogene MAS die Ursache für die schwache Antwort der Nitrosamin ist. Außerdem könnte man versuchen, die für die Detoxifizierung des Nitrosamins wichtigen Phase II-Enzyme zu blockieren und zu analysieren, ob sich die Genotoxizitätsantwort dadurch verstärken lässt. Allerdings wäre eine solche Blockade des Phase II-Metabolismus der Nitrosamin lediglich zur Ursachenforschung sinnvoll. Hingegen könnten die vorangehend erwähnten HepG2-Zellen mit Überexpression bestimmter CYP-Enzyme möglicherweise als zelluläres System für die Testung auf Gentoxizität eingesetzt werden.
  • 4.4 Tierschutzaspekte und Beitrag zur Risikobewertung
  • Das Leitbild der modernen Toxikologie ist zudem an der Entwicklung versuchstierfreier (in vitro) Methoden gemäß dem 3R-Prinzip ausgerichtet. Die derzeitigen in vitro Methoden ersetzen Tierversuche nicht vollständig, können jedoch langfristig dazu beitragen, die Anzahl von Tierversuchen zu reduzieren. Obwohl die heutigen in vitro Methoden ein Screening auf bestimmte Gefährdungseigenschaften der Testsubstanzen ermöglichen, bleibt die Ableitung von in vivo-Dosiswirkungsbeziehungen und NOELs (No observed effect level) eine der Hauptlimitationen für den vollständigen Ersatz der in vivo-Testung [328]. Problematisch für eine solche Extrapolation ist die Erfassung der Komplexizität und aller potenziellen Einflussfaktoren [328]. Eine besondere Herausforderung für die Etablierung neuer tierversuchsfreier Testmethoden ergab sich zudem, wie einleitend bereits beschrieben, mit dem in Kraft treten der neuen EU-Chemikaliengesetzgebung REACH (2007), welche durch die Sicherheitsprüfung von etwa 30.000 Alt-Chemikalien einen immensen Tierverbrauch fordern würde [16]. Die Testung auf mutagene Eigenschaften von Verbindungen ist dabei ein wesentlicher Bestandteil innerhalb des REACH-Programms.
  • Mit den beiden in dieser Arbeit vorgestellten in vitro-Testsystemen (P53 und das omicsbasierte Klassifikationsmodell) können Alt-Chemikalien im Sinne des REACH-Programms aber auch neue Chemikalien und Medikamente auf Genotoxizität getestet werden. Hervorzuheben ist, dass Folgestudien zur Interpretation der zum Teil widersprüchlichen Resultate der Standardbatterie gänzlich vermieden werden können, was dem 3R Prinzip besonders Rechnung trägt, da hier meist Studien an Tieren durchgeführt werden müssen. Des Weiteren kann das Leiden von Tieren während der Versuche erheblich minimiert werden, indem Substanzen mit stark (geno-)toxischem Potential schon im Vorfeld elimiert werden und nur die Substanzen mit negativen Ergebnissen in vitro in die Studien gelangen. Eine massive Einsparung von Versuchstieren ergibt sich durch die frühzeitige Eliminierung von gentoxischen Substanzen während der Medikamenten-/Chemikalienentwicklung für die Kanzerogenitätsstudien an Nagern. Für eine solche Lebenszeitstudie sind nach der OECD-Richtlinie 451 für jede Dosis-Gruppe und der gleichzeitigen Kontroll-Gruppe jeweils mindestens 50 Tiere beiderlei Geschlechts erforderlich (siehe Abschnitt 1.3.2) [91]. Unter Annahme von beispielsweise zwei verschiedenen Dosierungen in einer Kanzerogenitätsstudie könnten pro ausselektierter Substanz mindestens 600 Tiere eingespart werden. Zudem kann, wie vorangehend bereits erwähnt, das Leiden der Tiere durch die Präselektion deutlich reduziert werden.
  • Abgesehen von der Reduktion der Versuchstiere können die entwickelten Testsysteme einen nicht minder bedeutenden Beitrag für die Risikobewertung leisten. Die Messung einer Vielzahl von Endpunkten, wie es bei den globalen Profilierungen der Fall ist, liefert nicht nur wichtige Informationen zum Wirkmechanismus der gentoxischen Testsubstanzen, sondern kann durch die multiple Analyse auch zur Erhöhung der Sensitivität und Spezifität innerhalb des Screenings beitragen. Mithilfe von mechanistischen Studien können zudem neue Toxizitätssignalwege identifiziert und daraufhin angepasste in vitro-Testsysteme entwickelt werden, wie es in der Vision und Strategie des NRC für die Toxizitätstestung im 21. Jahrhundert gefordert wird [2]. Aufgrund der einleitend beschriebenen Problematik der Existenz/Abwesenheit von Schwellenwerten für krebserregende Verbindungen sind mechanistische Daten zusätzlich zu den klassischen Toxizitätsdaten für die Risikobewertung dieser Substanzen von enormer Bedeutung. Sie dienen dazu, eine konkrete Kategorisierung der Genotoxine vornehmen und möglicherweise einen Grenzwert definieren oder ausschließen zu können.
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  • Zusammenfassung
  • Die toxikologische Charakterisierung gentoxischer Verbindungen spielt sowohl in der Arzneimittelentwicklung als auch bei der Risikobewertung von Chemikalien eine bedeutende Rolle. Die in vitro-Testsysteme der derzeitigen Standardbatterie, insbesondere die Tests an Säugerzellen, sind hoch sensitiv, besitzen aber eine geringe Spezifität. Die hohe Rate an generierten falsch positiven Resultaten erschwert nicht nur die Interpretation der Ergebnisse, sondern auch die Extrapolation bezüglich der Gefährdung für den Menschen. Diese Schwierigkeiten der derzeitigen Teststrategie für gentoxische Substanzen, aber auch ökonomische und tierschutzbedingte Aspekte, indizieren die Entwicklung neuer spezifischer in vitro-Systeme.
  • Das Ziel dieser Arbeit war es ein neues genomicsbasiertes in vitro-Testsystem für die Identifizierung mutagener und promutagener Verbindungen zu entwickeln. Im ersten Teil der Arbeit wurden HepG2-Zellen nach Behandlung mit den mutagenen Testsubstanzen Etoposid (ETO), Actinomycin D (ACT) und Methylmethansulfonat (MMS) über 6 h, 24 h und 48 h mit Illumina HumanRef-8 BeadChip Arrays profiliert. Für die Testsubstanzen konnten 66 unidirektional regulierte Gene identifiziert werden, welche in Signalwege, wie P53-abhängige Apoptose, Chromatinumbauprozesse und oxidativen Stress, involviert waren.
  • Aufgrund der signifikanten P53-vermittelten DNA-Schadensantwort wurde im zweiten Teil der Arbeit die Bestimmung des Tumorsuppressors P53 als putativer Genotoxizitätsmarker evaluiert. P53 spielt als Transkriptionsfaktor eine Schlüsselrolle in der Regulation von Zellüberleben und Zelltod infolge von Stresssignalen, wie zum Beispiel nach einer Schädigung der DNA durch mutagene Verbindungen. Die Quantifizierung von aktiviertem P53 erfolgte im Kernextrakt von HepG2-Zellen nach Behandlung mit den mutagenen Substanzen für 24 h bzw. 48 h mit Hilfe eines ELISA-basierten Transkriptionsfaktorfunktionstests. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Induktion von P53 bei allen untersuchten Mutagenen.
  • Im nächsten Teil der Arbeit sollte das entwickelte Testsystem auf progenotoxische Substanzen erweitert werden. Die Testung von Promutagenen stellte eine besondere Herausforderung dar, da die benötigte metabolische Aktivierung in vitro nachgestellt werden muss. Deshalb wurden die HepG2-Zellen vor den P53- und Genexpressionsstudien in Bezug auf ihre fremdstoffmetabolisierende Kompetenz charakterisiert. Dabei wurden insgesamt 45 Gene, die funktionell in den xenobiotischen Metabolismus eingebunden sind, untersucht und die Aktivität ausgewählter Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYP), welche für die Metabolisierung von Prokanzerogenen von Bedeutung sind, bestimmt. Die Resultate zeigten, dass die verwendete Zelllinie über eine begrenzte metabolische Kapazität verfügt. Zur Ergänzung des zellulären Metabolismus wurde ein kombiniertes Zellkultursystem mit Rattenleber-S9-Fraktionen als System zur metabolischen Aktivierung (MAS) etabliert. Während Cyclophosphamid (CPA) nur in Anwesenheit von S9 einen Anstieg an aktiviertem P53 zeigte, konnte für 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) und Aflatoxin B1 (AFB1) auch ohne MAS eine Induktion von P53 nachgewiesen werden. Um die metabolische Aktivierung dieser beiden Substanzen durch die HepG2-Zellen selbst zu bestätigen, wurden spezifische CYP-Enzyminhibitionstests durchgeführt. Diese Studien ergaben, dass eine Inhibition von zellulärem CYP3A4 oder CYP1A/1B1 zu einer verminderten AFB1- bzw. DMBA-vermittelten P53-Induktion führt. Dies indiziert, dass HepG2 die Fähigkeit besitzen, diese Substanzen CYP1A/1B1/3A4-abhängig zu metabolisieren.
  • Nach den P53-Studien wurden globale Genexpressionsprofile mit Illumina BeadChips nach Behandlung der HepG2-Zellen mit den ausgewählten progenotoxischen Verbindungen (CPA, AFB 1, DMBA und Diethylnitrosamin (DEN)) angefertigt. Die statistische Analyse zeigte, dass für die progenotoxischen Verbindungen erst nach 48 h signifikante Veränderungen im Genexpressionsprofil detektierbar waren. Sowohl die zeitliche Verschiebung im Vergleich zu den genotoxischen Substanzen, als auch das Deregulationsprofil mit und ohne MAS korrelieren mit den vorangegangenen P53-Experimenten. CPA zeigte erneut ausschließlich in Anwesenheit des MAS signifikante Deregulationen der 88 Gene, welche als gemeinsam reguliert durch alle Testsubstanzen gefunden worden. Dagegen konnte für AFB1, DMBA und DEN bereits ohne MAS die gleiche Regulationstendenz wie mit MAS festgestellt werden.
  • Neben der Evaluierung von Gemeinsamkeiten in den Genexpressionssignaturen dieser Verbindungen lag der Hauptschwerpunkt auf der Erstellung eines computerbasierten Klassifikationsmodells, welches auch die mutagenen Verbindungen mit einem direkten Wirkmechanismus (ACT, ETO, MMS) einschließt. Für das Modell wurde ein Trainingsdatensatz aus den (pro-)genotoxischen Substanzen sowie den beiden Negativkontrollen THEO und MET zusammengestellt. DEN wurde als „unbekannte” Testsubstanz aus dem Datensatz ausgegliedert. Ein ANOVA-basiertes Ranking in Verbindung mit dem Support-Vektormaschinen(SVM)-Algorithmus mit dem Trainingsdatensatz ergab die beste Klassifikationsrate unter Verwendung der 91 top-rangierten Gene. Eine k-fache Kreuzvalidierung, welche anschließend zur Evaluierung der Prädiktivität des Klassifikationsmodells eingesetzt wurde, zeigte, dass alle als gentoxisch annotierten Substanzen auch korrekt eingeordnet worden. Mit dem erstellten Klassifikationsmodell wurde dann DEN als Testsubstanz untersucht. Das Nitrosamin wurde ohne die Zugabe von S9 als nicht-gentoxisch, in Anwesenheit eines metabolischen Aktivierungssystems hingegen als gentoxisch eingestuft. Insbesondere diese Daten bekräftigen die Verwendung von Genexpressionsmustern für das Screening genotoxischer Substanzen. DEN konnte in P53-Studien auch unter Zugabe von S9 keine signifikante Erhöhung an aktiviertem P53 bewirken, wurde aber anhand der Genexpressionsveränderungen nach metabolischer Aktivierung korrekt als gentoxisch eingestuft.
  • Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass (pro-)mutagene Verbindungen charakteristische Genexpressionsveränderungen in HepG2-Zellen induzieren. Die evaluierten 91 putativen Markergene können für die Identifizierung des genotoxischen Potentials unbekannter Substanzen herangezogen werden. Zudem konnte anhand der P53-Experimente gezeigt werden, dass mit Hilfe der Genexpressionsprofile neue Marker für genotoxische Substanzen entdeckt werden können, die ein schnelleres Screening ermöglichen.
  • 6 Anhang
  • Anhang 1: P53-Induktion durch gentoxische Verbindungen
  • Die HepG2-Zellen wurden täglich entweder mit den gentoxischen Substanzen Actinomycin D, Methylmethansulfonat und Etoposid sowie der Kontrollverbindung Theophyllin behandelt. Die P53-Induktion wurde 24 h und 48 h nach Beginn der ersten Behandlung mit dem TransAMTM Transkriptionsfaktortest (ActiveMotif) gemessen. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte ± Standardabweichung (Stabw) aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25. * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart), p-Wert < 0,05
    Testsubstanz Konzentration [μM] Zeitpunkt [ h ] P53-Induktion Stabw p-Wert
    Theophyllin 100 24 1,06 0,14 5,45E-01*
    48 1,11 0,18 4,05E-01*
    Actinomycin D 0,05 24 6,01 0,53 4,92E-05*
    0,25 5,80 1,34 8,89E-03*
    0,05 48 16,43 9,99 1,32E-01*
    0,25 22,10 5,08 4,82E-02*
    Methylmethansulfonat 500 24 2,33 0,67 1,78E-02*
    48 5,85 0,54 5,35E-03*
    Etoposid 0,5 24 2,63 0,28 1,18E-03*
    48 4,05 0,91 2,37E-02*
  • Anhang 2: Deregulationen von Genen der P53-Signalkaskade
  • Regulation von Genen der P53-Signalkaskade nach Exposition mit den genotoxischen Verbindungen Actinomycin D, Methylmethansulfonat und Etoposid in HepG2-Zellen. Die Genexpressionsveränderungen wurden mit Illumina HumanRef-8 BeadChip Arrays quantifiziert und die Deregulationswerte gegenüber der Lösungsmittelkontrolle (0,5% (v/v) DMSO) ermittelt. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen von 3 bis 25. Rot = hochregulierte Gene ≥ 1,5; Grün = herunterregulierte Gene ≤ –1,5. * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart), p-Wert < 0,05.
    Figure 02040001
    Figure 02050001
    Figure 02060001
    Figure 02070001
    Figure 02080001
    Figure 02090001
  • Anhang 3: Ermittelte Effizienzen der Gene der TLDA-Karte „Human DME”
  • Für die Ermittlung der Effizienzen wurde eine cDNA-Verdünnungsreihe (0,1 ng, 0,5 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng) von unbehandelten HepG2-Zellproben mittels TLDA-Technologie gemessen. Zur Auswertung wurden die Ct-Werte gegen den Logarithmus der cDNA-Konzentrationen aufgetragen und der Anstieg der Geraden ermittelt. Die reale Effizienz entspricht der Zehnerpotenz des negativen Kehrwertes des Geradenanstiegs.
    Gensymbol Effizienz Gensymbol Effizienz Gensymbol Effizienz
    Housekeeping-Gene Phase II Enzyme Transporter
    18S 1,95 GSTA1 1,97 ABCB11 (BSEP) 2,00
    B2M 1,90 GSTP1 1,89 ABCB1 (MDR1) 1,91
    PPIA 1,89 SULT1A1 1,88 ABCB4 (MDR2/3) 1,86
    Phase I Enzyme UGT1A9 2,17 ABCC1 (MRP1) 1,76
    CYP1A1 2,07 UGT1A6 2,00 ABCC2 (cMOAT, MRP2) 1,95
    CYP1A2 2,00 UGT2B7 1,88 ABCC3 (cMOAT2, MRP3) 1,88
    CYP2A6 2,00 Transkriptionsfaktoren SLC10A1 (NTCP) 3,36
    CYP2B6 2,00 AHR 1,94 SLC22A1 (OCT1) 2,16
    CYP2C18 2,00 HNF4A 2,04 SLCO1A2 (OATPA) 2,00
    CYP2C19 2,00 NR0B2 (SHP) 1,98 SLCO1B1 (LST1, OATP2) 2,00
    CYP2C8 2,00 NR1H2 (LXRB) 2,03 SLCO1B3 (LST3, OATP8) 1,89
    CYP2C9 2,00 NR1H3 (LXRA) 1,87 SLCO2B1 (OATPB) 2,00
    CYP2D6 1,57 NR1H4 (FXR) 1,98
    CYP2E1 2,00 NR1I2 (BXR, PXR) 1,79
    CYP3A4 2,00 NR1I3 (CAR) 2,00
    CYP3A5 1,69 NR2F2 (COUPTFB) 1,90
    CYP3A7 2,05 NR3C1 (GR) 1,88
  • Anhang 4: Basale Expression von Genen des Fremdstoffmetabolismus in HepG2 im Vergleich zu primären humanen Hepatozyten
  • Die Expression von Genen, welche für Enzyme, Transporter oder Transkriptionsfaktoren des Fremdstoffmetabolismus codieren, wurde mit der TLDA-Karte „Human DME” gemessen. Für den Vergleich der Basalexpression in HepG2 wurden die Daten der Lösungsmittelkontrolle (DMSO 0,1% (v/v)) der HepG2-Zellproben und von humanen Hepatozytenkulturen aus den Induktionsstudien nach täglicher Behandlung über 72 h herangezogen. Die Berechnung der Deregulationswerte erfolgte durch Bezug der über die ΔΔCt-Methode ermittelten Effizienz-korrigierten Ct-Werte normalisiert auf den Housekeeper PPIA der HepG2-Zellen auf die HH-Proben. Dabei wurden die Mittelwerte aus drei verschiedenen Experimenten für die HepG2-Zellen der Berechnung zugrunde gelegt und gegen die drei verschiedenen Donoren einzeln die relative Basalexpression berechnet. Ein Deregulationswert ≥ 1 zeigt eine stärkere Regulation des entsprechenden Gens in HepG2 und ein Wert ≤ –1 eine stärkere Deregulation in den Hepatozyten. Teil 1
    Gensymbol Donor 1 Donor 2 Donor 3
    Phase I Enzyme
    CYP1A1 1,82 3,15 2,67
    CYP1A2 –5023,03 –6441,24 –443773,04
    CYP2A6 –304,47 n. d. in HH D2 –1010,92
    CYP2B6 –450,70 –1193,05 –5259,95
    CYP2C18 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2
    CYP2C19 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2
    CYP2C8 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2
    CYP2C9 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2
    CYP2D6 39,66 13,89 144,63
    CYP2E1 –3911,77 –12511,28 –83300,91
    CYP3A4 –216724,17 –379796,29 –294350,64
    CYP3A5 –30,42 –3,05 –2,30
    CYP3A7 –194,85 –8,73 n. d. in HH D3
    Phase II Enzyme
    GSTA1 –29,01 –30,64 –50,57
    GSTP1 7,28 8,86 n. d. in HH D3
    SULT1A1-4 5,54 3,23 1,22
    UGT1A1/3-10 –3704,20 –3004,90 –81,73
    UGT1A6 –57667,40 –54143,61 –1118,91
    UGT2B7 –11,55 –14,78 32,13
    Transkriptionsfaktoren
    AHR 1,42 1,48 44,69
    HNF4A –1,38 –1,64 –1,45
    Teil 2
    Gen-symbol Donor 1 Donor 2 Donor 3
    Transkriptionsfaktoren
    NR0B2 (SHP) 8,56 4,32 7,60
    NR1H2 (LXRB) –10,13 –10,73 –1,69
    NR1H3 (LXRA) 6,53 7,18 23,90
    NR1H4 (FXR) –7,97 –4,85 –2,18
    NR1I2 (BXR, PXR) –2,82 –3,11 –3,79
    NR1I3 (CAR) –1411,04 –3108,03 –9345,02
    NR2F2 (COUPTFB) 1,49 2,14 n. d. in HH D3
    NR3C1 (GR) 1,31 1,79 9,67
    Transporter
    ABCB11 (BSEP) n. d. in HepG2 n. d. in HepG2 n. d. in HepG2
    ABCB1 (MDR1) –3,55 –1,93 2,11
    ABCB4 (MDR2/3) 3,30 3,79 19,77
    ABCC1 (MRP1) 507,81 2037,87 n. d. in HH D3
    ABCC2 (cMOAT, MRP2) –2,86 –2,04 –2,35
    ABCC3 (cMOAT2, MRP3) –11,16 –10,43 n. d. in HH D3
    SLC10A1 (NTCP) < –106 < –106 < –106
    SLC22A1 (OCTP1) –11629,29 –52564,12 –3001,75
    SLCO1A2 (OATPA) n. d. in HepG2 n. d. n. d. in HepG2
    SLCO1B1 (LST1, OATP2) –8732,40 –5937,92 –18475,25
    SLCO1B3 (LST3, OATP8) –26,89 –30,87 –152,20
    SLCO2B1 (OATPB) –81,75 –77,25 –6,15
  • Anhang 5: Expression von Genen des Fremdstoffmetabolismus in HepG2 nach Induktion
  • Die Expression von Genen, welche für Enzyme, Transporter oder Transkriptionsfaktoren des Fremdstoffmetabolismus codieren, wurde mit der TLDA-Karte „Human DME” in HepG2-Zellen nach Behandlung mit verschiedenen CYP-Induktoren gemessen. Die Zellen wurden täglich mit jeweils zwei verschiedenen Konzentrationen der Induktoren Phenobarbital, 3-Methylcholanthren und Rifampicin über 72 h behandelt. Die Tabelle zeigt die Mittelwerte der Deregulation (FC = Fold change) gegenüber der Lösungsmittelkontrolle ± Standardabweichung (Stabw). Die Deregulationswerte wurden mit der ΔΔCt-Methode bezogen auf den Housekeeper PPIA berechnet. * Statistische Signifikanz im Student's T-Test, p-Wert ≤ 0,05
    Figure 02150001
    Figure 02160001
  • Anhang 6: Expression von Genen des Fremdstoffmetabolismus in humanen Hepatozytenkulturen (HH) nach Induktion
  • Die Expression von Genen, welche für Enzyme, Transporter oder regulatorische Transkriptionsfaktoren des Fremdstoffmetabolismus codieren, wurde mit der TLDA-Karte „Human DME” in humanen Hepatozyten (Monolayerkulturen) von drei verschiedenen Donoren nach Behandlung über 72 h mit verschiedenen CYP-Induktoren (Phenobarbital, 3-Methylcholanthren und Rifampicin) gemessen. Die Daten sind interne bereits publizierte Daten [158]. Die Tabelle zeigt die Werte der Deregulation gegenüber der Lösungsmittelkontrolle, welche mit der ΔΔCt-Methode bezogen auf den Housekeeper PPIA berechnet wurden.
  • Figure 02180001
  • Figure 02190001
  • Anhang 7: P53-Induktion durch progenotoxische Verbindungen und Kontrollverbindungen.
  • Die HepG2-Zellen wurden entweder mit den nicht genotoxischen Substanzen Metformin, Theophyllin und Ketokonazol, dem genotoxischen Actinomycin D oder den progenotoxischen Verbindungen Cyclophosphamid, Diethylnitrosamin, Aflatoxin B1 und 7,12-Dimethylbenzl[a]anthracen in den angegebenen Konzentrationen (Konz.) behandelt. Die Behandlung mit den progenotoxischen Verbindungen erfolgte täglich für 6 h mit 18 h Erholungsphase in Gegenwart und Abwesenheit eines metabolischen Aktivierungssystems (MAS: Phenobarbital/β-Naphthoflavon-induzierter S9), wogegen mit den Referenzverbindungen täglich kontinuierlich behandelt wurde. Die P53-Induktion wurde 48 h nach Beginn der ersten Behandlung mit dem TransAMTM Transkriptionsfaktortest (ActiveMotif) gemessen. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte (FC = Fold change) ± Standardabweichung (Stabw) aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25. * Signifikanz im Studen's T-Test (zweiseitig, gepaart), p-Wert < 0,05
    Figure 02210001
  • Anhang 8: P53-Induktion durch Aflatoxin B1 und 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen in HepG2-Zellen nach Inhibition zellulärer CYP-Enzyme mit α-Naphthoflavon und Ketokonazol.
  • Die Zellen wurden mit Aflatoxin B1 und 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen in Kombination mit den Cytochrom-P450(CYP)-Inhibitoren α-Naphthoflavon (αNF) oder Ketokonazol (KETO) behandelt. Vor den Behandlungen mit den Prokanzerogenen wurden die Zellen mit dem jeweiligen Inhibitor für 30 min vorinkubiert. Die Behandlung mit Aflatoxin B1 und 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen mit und ohne Inhibitor wurde anschließend über 6 h durchgeführt. Danach wurden die Zellen gewaschen und das Behandlungsmedium durch ein Medium, das ausschließlich den Inhibitor oder das Lösungsmittel (DMSO 0,2% (v/v)) enthielt, ersetzt. Die Behandlungsprozedur wurde täglich wiederholt und die P53-Induktion 48 h nach Beginn der ersten Behandlung gemessen. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte (FC = Fold change) ± Standardabweichung (Stabw) aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25. * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart) gegenüber der Lösungsmittelkontrolle, p-Wert < 0,05. § Signifikanz der Prokanzerogenbehandlungen mit Inhibitor gegenüber den entsprechenden Behandlungen ohne Inhibitor zum Level α = 0,05 in einer ANOVA mit posthoc Tukey Test.
  • Figure 02230001
  • Anhang 9: Deregulationswerte und Statistik der putativen Markergene für genotoxische Verbindungen.
  • Die tabellarisch gelisteten Gene waren nach 48 h bei den drei getesteten gentoxischen Verbindungen Actinomycin D, Methylmethansulfonat und Etoposid signifikant (ANOVA p-Wert ≤ 0,01) ≥ 1,5-fach hoch- beziehungsweise herunterreguliert. Die Behandlung mit den Testsubstanzen in den aufgeführten Dosierungen erfolgte täglich, die Zellen wurden nach 6 h, 24 h und 48 h geerntet und die Genexpressionsveränderungen mit Illumina HumanRef-8 BeadChips quantifiziert. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte relativ zu den entsprechenden Lösungsmittelkontrollen aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25.
    RefSeq Symbol Funktion
    NM_006142.3 SFN DNA-Schadensantwort/Apoptose
    NM_004324.3 BAX
    NM_001924.2 GADD45A
    NM_002969.3 MAPK12
    NM_000700.1 ANXA1
    NM_001425.1 EMP3
    NM_001423.1 EMP1
    NM_001175.4 ARHGDIB
    NM_018494.3 LRDD
    NM_138720.1 HIST1H2BD Transkriptionelle Regulation/Chromatinumbau
    NM_001878.2 CRABP2
    NM_003548.2 HIST2H4
    NM_006037.2 HDAC4
    NM_002398.2 MEIS1
    NM_003140.1 SRY
    NM_005730.2 CTDSP2
    NM_021198.1 CTDSP1
    NM_018660.2 ZNF395
    NM_001018109.1 PIR
    NM_014943.3 ZHX2
    NM_201397.1 GPX1 Detoxifikation
    NM_005115.3 MVP
    NM_000593.5 TAP1
    NM_006404.3 PROCR Immunantwort
    NM_005931.2 MICB
    NM_022168.2 IFIH1
    NM_001680.3 FXYD2 Transport
    NM_000558.3 HBA1
    NM_000111.1 SLC26A3
    RefSeq Genname
    NM_006142.3 stratifin (SFN).
    NM_004324.3 BCL2-associated X protein (BAX), transcript variant beta.
    NM_001924.2 growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha (GADD45A).
    NM_002969.3 mitogen-activated protein kinase 12 (MAPK12).
    NM_000700.1 annexin A1 (ANXA1).
    NM_001425.1 epithelial membrane protein 3 (EMP3).
    NM_001423.1 epithelial membrane protein 1 (EMP1).
    NM_001175.4 Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta (ARHGDIB).
    NM_018494.3 leucine-rich repeats and death domain containing (LRDD), transcript variant 2.
    NM_138720.1 histone 1, H2bd (HIST1H2BD), transcript variant 2.
    NM_001878.2 cellular retinoic acid binding protein 2 (CRABP2).
    NM_003548.2 histone 2, H4 (HIST2H4).
    NM_006037.2 histone deacetylase 4 (HDAC4).
    NM_002398.2 Meis1, myeloid ecotropic viral integration site 1 homolog (mouse) (MEIS1).
    NM_003140.1 sex determining region Y (SRY).
    NM_005730.2 CTD (carboxy-terminal domain, RNA polymerase II, polypeptide A) small phosphatase 2 (CTDSP2).
    NM_021198.1 CTD (carboxy-terminal domain, RNA polymerase II, polypeptide A) small phosphatase 1 (CTDSP1), transcript variant 1.
    NM_018660.2 zinc finger protein 395 (ZNF395).
    NM_001018109.1 pirin (iron-binding nuclear protein) (PIR), transcript variant 2.
    NM_014943.3 zinc fingers and homeoboxes 2 (ZHX2).
    NM_201397.1 glutathione peroxidase 1 (GPX1), transcript variant 2.
    NM_005115.3 major vault protein (MVP), transcript variant 2.
    NM_000593.5 transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP) (TAP1).
    NM_006404.3 protein C receptor, endothelial (EPCR) (PROCR).
    NM_005931.2 MHC class I polypeptide-related sequence B (MICB).
    NM_022168.2 interferon induced with helicase C domain 1 (IFIH1).
    NM_001680.3 FXYD domain containing ion transport regulator 2 (FXYD2), transcript variant a.
    NM_000558.3 hemoglobin, alpha 1 (HBA1).
    NM_000111.1 solute carrier family 26, member 3 (SLC26A3).
    RefSeq Methylmethansulfonat
    500 μM 2 mM 500 μM
    6 h 24 h 48 h
    NM_006142.3 7,03 1,36 19,20 19,46
    NM_004324.3 1,09 1,22 1,81 2,89
    NM_001924.2 8,44 9,97 1,93 2,13
    NM_002969.3 –1,22 1,04 1,58 1,96
    NM_000700.1 1,01 –1,34 3,63 4,41
    NM_001425.1 –1,31 –1,02 2,06 5,60
    NM_001423.1 –1,57 –1,15 1,21 2,16
    NM_001175.4 1,44 1,59 2,14 2,23
    NM_018494.3 –1,03 1,39 1,37 1,86
    NM_138720.1 1,81 1,75 1,03 4,31
    NM_001878.2 1,49 3,16 2,57 2,81
    NM_003548.2 1,54 1,73 –1,08 2,53
    NM_006037.2 –1,23 –1,25 –2,24 –2,86
    NM_002398.2 –1,91 –1,20 –1,93 –2,90
    NM_003140.1 –1,14 –1,02 –1,33 –1,57
    NM_005730.2 –1,59 –1,93 –1,62 –2,45
    NM_021198.1 –3,12 –1,52 –2,21 –4,90
    NM_018660.2 –1,41 –1,19 –2,83 –5,06
    NM_001018109.1 –1,93 –1,97 –3,15 –5,45
    NM_014943.3 –1,13 –1,22 –1,00 –1,76
    NM_201397.1 1,11 1,34 1,44 1,86
    NM_005115.3 –1,03 1,63 1,67 3,95
    NM_000593.5 1,82 1,10 2,31 2,46
    NM_006404.3 –1,12 –1,10 1,66 2,88
    NM_005931.2 1,22 2,35 1,95 1,45
    NM_022168.2 1,04 1,01 –1,32 –1,47
    NM_001680.3 –1,06 –1,02 1,36 1,61
    NM_000558.3 1,89 18,98 2,49 2,69
    NM_000111.1 1,01 1,03 –2,12 –4,48
    RefSeq Etoposid
    500 nM
    6 h 24 h 48 h
    NM_006142.3 1,04 1,15 2,38
    NM_004324.3 –1,18 1,05 2,25
    NM_001924.2 1,07 1,45 2,10
    NM_002969.3 –1,04 1,23 1,58
    NM_000700.1 –1,03 1,13 2,44
    NM_001425.1 –1,13 1,19 2,22
    NM_001423.1 1,11 1,42 1,81
    NM_001175.4 –1,02 1,13 1,65
    NM_018494.3 –1,04 1,19 1,58
    NM_138720.1 –1,14 –1,05 1,96
    NM_001878.2 –1,03 1,06 1,67
    NM_003548.2 –1,09 –1,23 1,61
    NM_006037.2 –1,03 –1,15 –1,50
    NM_002398.2 1,01 –1,17 –1,51
    NM_003140.1 1,08 –1,23 –1,52
    NM_005730.2 1,03 –1,00 –1,59
    NM_021198.1 1,02 –1,23 –1,80
    NM_018660.2 1,05 –1,30 –1,73
    NM_001018109.1 –1,08 –1,27 –1,73
    NM_014943.3 1,11 –1,11 –1,83
    NM_201397.1 –1,05 1,20 1,83
    NM_005115.3 1,05 1,15 1,60
    NM_000593.5 1,19 1,24 1,54
    NM_006404.3 1,04 1,37 2,20
    NM_005931.2 1,07 1,28 1,67
    NM_022168.2 1,06 –1,13 –1,53
    NM_001680.3 –1,08 1,27 2,40
    NM_000558.3 –1,26 1,02 1,67
    NM_000111.1 1,03 –1,31 –2,16
    RefSeq Actinomycin D
    250 nM
    6 h 24 h 48 h
    NM_006142.3 1,12 1,85 4,17
    NM_004324.3 1,34 1,68 2,72
    NM_001924.2 –1,32 1,81 1,97
    NM_002969.3 1,47 2,44 3,72
    NM_000700.1 1,83 6,47 7,41
    NM_001425.1 1,75 3,15 5,71
    NM_001423.1 1,97 3,08 1,93
    NM_001175.4 1,79 1,86 1,86
    NM_018494.3 1,51 1,62 2,19
    NM_138720.1 1,39 1,83 2,01
    NM_001878.2 2,12 3,85 2,85
    NM_003548.2 1,16 2,30 3,21
    NM_006037.2 –1,65 –2,28 –2,14
    NM_002398.2 –2,27 –2,56 –2,52
    NM_003140.1 1,01 –1,45 –1,47
    NM_005730.2 –1,22 –2,05 –2,88
    NM_021198.1 –1,75 –2,44 –3,36
    NM_018660.2 1,32 –1,35 –2,56
    NM_001018109.1 1,52 –1,49 –1,78
    NM_014943.3 –1,27 –1,36 –2,25
    NM_201397.1 1,03 1,81 2,67
    NM_005115.3 1,83 1,77 2,42
    NM_000593.5 1,14 1,83 1,87
    NM_006404.3 1,64 2,36 2,61
    NM_005931.2 1,15 2,79 3,47
    NM_022168.2 –1,33 –1,91 –1,73
    NM_001680.3 1,16 1,40 1,56
    NM_000558.3 2,47 16,93 35,40
    NM_000111.1 1,14 –1,68 –3,38
    RefSeq Theophyllin
    100 μM
    6 h 24 h 48 h
    NM_006142.3 1,15 –1,01 1,26
    NM_004324.3 –1,14 –1,13 1,49
    NM_001924.2 1,01 –1,08 1,13
    NM_002969.3 –1,03 1,03 1,26
    NM_000700.1 –1,05 –1,08 1,03
    NM_001425.1 1,02 –1,19 1,15
    NM_001423.1 1,02 –1,13 –1,12
    NM_001175.4 1,05 1,06 1,06
    NM_018494.3 –1,11 –1,02 1,03
    NM_138720.1 –1,02 –1,21 1,10
    NM_001878.2 –1,04 –1,00 1,13
    NM_003548.2 –1,00 –1,10 1,07
    NM_006037.2 –1,02 1,03 –1,18
    NM_002398.2 –1,02 1,01 –1,11
    NM_003140.1 1,09 –1,04 –1,16
    NM_005730.2 1,03 1,13 –1,20
    NM_021198.1 –1,00 1,01 –1,32
    NM_018660.2 –1,05 1,07 –1,26
    NM_001018109.1 –1,05 –1,01 1,09
    NM_014943.3 1,02 1,23 –1,50
    NM_201397.1 –1,02 –1,05 1,18
    NM_005115.3 1,00 1,02 1,03
    NM_000593.5 1,06 1,04 1,00
    NM_006404.3 –1,03 1,06 1,10
    NM_005931.2 1,06 –1,07 1,05
    NM_022168.2 –1,05 –1,03 –1,06
    NM_001680.3 –1,05 –1,09 1,00
    NM_000558.3 –1,07 1,04 1,35
    NM_000111.1 1,07 –1,10 –1,45
    RefSeq ANOVA
    p-Wert BH-q-Wert
    NM_006142.3 4,95E-05 2,47E-03
    NM_004324.3 2,89E-07 1,03E-04
    NM_001924.2 1,23E-04 4,34E-03
    NM_002969.3 1,59E-04 5,15E-03
    NM_000700.1 3,08E-06 4,07E-04
    NM_001425.1 5,65E-06 5,93E-04
    NM_001423.1 1,39E-04 4,70E-03
    NM_001175.4 6,02E-08 3,75E-05
    NM_018494.3 2,32E-08 1,99E-05
    NM_138720.1 8,53E-05 3,45E-03
    NM_001878.2 1,18E-07 5,42E-05
    NM_003548.2 1,05E-04 3,92E-03
    NM_006037.2 1,05E-05 8,78E-04
    NM_002398.2 2,57E-08 2,11E-05
    NM_003140.1 4,13E-06 4,75E-04
    NM_005730.2 4,76E-08 3,27E-05
    NM_021198.1 2,23E-08 1,99E-05
    NM_018660.2 7,23E-05 3,12E-03
    NM_001018109.1 5,64E-05 2,64E-03
    NM_014943.3 1,04E-04 3,92E-03
    NM_201397.1 1,68E-07 7,04E-05
    NM_005115.3 1,08E-05 9,04E-04
    NM_000593.5 3,32E-08 2,44E-05
    NM_006404.3 1,29E-05 9,97E-04
    NM_005931.2 1,93E-07 7,64E-05
    NM_022168.2 2,11E-04 6,18E-03
    NM_001680.3 1,01E-05 8,62E-04
    NM_000558.3 9,24E-05 3,62E-03
    NM_000111.1 8,71E-05 3,48E-03
    RefSeq Symbol Funktion
    NM_022818.3 MAP1LC3B Zelladhäsion
    NM_000419.2 ITGA2B
    NM_003254.2 TIMP1
    NM_002658.2 PLAU
    NM_000094.2 COL7A1
    NM_022765.2 MICAL1
    NM_006000.1 TUBA1
    NM_021021.2 SNTB1
    NM_032866.3 CGNL1
    NM_003603.4 SORBS2
    NM_173344.1 ST3GAL1
    NM_001699.3 AXL Enzyme/Signaltransduktion
    NM_001824.2 CKM
    NM_000476.1 AK1
    NM_005281.2 GPR3
    NM_005980.2 S100P
    NM_005108.2 XYLB
    NM_000189.4 HK2
    NM_015277.2 NEDD4L
    NM_001807.2 CEL Metabolismus (Lipide, Aminosäuren)
    NM_021727.3 FADS3
    NM_016084.3 RASD1
    NM_006736.4 DNAJB2
    NM_006426.1 DPYSL4 Entwicklung
    NM_000266.1 NDP
    NM_014344.2 FJX1
    NM_012193.2 FZD4
    NM_199001.1 MGC59937 andere Funktionen
    NM_198445.1 FLJ45909
    NM_145263.1 SPATA18
    NM_016545.3 IER5
    NM_025092.1 ATHL1
    NM_052972.2 LRG1
    NM_207380.1 FLJ43339
    NM_173542.2 LOC196463
    NM_001013838.1 RLTPR
    NM_145865.1 ANKS4B
    RefSeq Genname
    NM_022818.3 microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta (MAP1LC3B).
    NM_000419.2 integrin, alpha 2b (platelet glycoprotein IIb of IIb/IIIa complex, antigen CD41B) (ITGA2B).
    NM_003254.2 TIMP metallopeptidase inhibitor 1 (TIMP1).
    NM_002658.2 plasminogen activator, urokinase (PLAU).
    NM_000094.2 collagen, type VII alpha 1 (epidermolysis bullosa, dystrophic, dominant and recessive) (COL7A1).
    NM_022765.2 microtubule associated monoxygenase, calponin and LIM domain containing 1 (MICAL1).
    NM_006000.1 tubulin, alpha 1 (testis specific) (TUBA1).
    NM_021021.2 syntrophin, beta 1 (dystrophin-associated protein A1, 59 kDa, basic component 1) (SNTB1).
    NM_032866.3 cingulin-like 1 (CGNL1).
    NM_003603.4 sorbin and SH3 domain containing 2 (SORBS2), transcript variant 1.
    NM_173344.1 ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1 (ST3GAL1), transcript variant 2.
    NM_001699.3 AXL receptor tyrosine kinase (AXL), transcript variant 2.
    NM_001824.2 creatine kinase, muscle (CKM).
    NM_000476.1 adenylate kinase 1 (AK1).
    NM_005281.2 G protein-coupled receptor 3 (GPR3).
    NM_005980.2 S100 calcium binding protein P (S100P).
    NM_005108.2 xylulokinase homolog (H. influenzae) (XYLB).
    NM_000189.4 hexokinase 2 (HK2).
    NM_015277.2 neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 4-like (NEDD4L).
    NM_001807.2 carboxyl ester lipase (bile salt-stimulated lipase) (CEL).
    NM_021727.3 fatty acid desaturase 3 (FADS3).
    NM_016084.3 RAS, dexamethasone-induced 1 (RASD1).
    NM_006736.4 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 2 (DNAJB2).
    NM_006426.1 dihydropyrimidinase-like 4 (DPYSL4).
    NM_000266.1 Norrie disease (pseudoglioma) (NDP).
    NM_014344.2 four jointed box 1 (Drosophila) (FJX1).
    NM_012193.2 frizzled homolog 4 (Drosophila) (FZD4).
    NM_199001.1 Similar to RIKEN cDNA 2310002J15 gene (MGC59937).
    NM_198445.1 FLJ45909 protein (FLJ45909).
    NM_145263.1 spermatogenesis associated 18 homolog (rat) (SPATA18).
    NM_016545.3 immediate early response 5 (IER5).
    NM_025092.1 ATH1, acid trehalase-like 1 (yeast) (ATHL1).
    NM_052972.2 leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1 (LRG1).
    NM_207380.1 FLJ43339 protein (FLJ43339).
    NM_173542.2 hypothetical protein LOC196463 (LOC196463).
    NM_001013838.1 RGD, leucine-rich repeat, tropomodulin and proline-rich containing protein (RLTPR).
    NM_145865.1 ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing 4B (ANKS4B).
    RefSeq Methylmethansulfonat
    500 μM 2 mM 500 μM
    6 h 24 h 48 h
    NM_022818.3 3,24 2,30 1,43 1,99
    NM_000419.2 1,48 1,72 1,16 1,50
    NM_003254.2 2,41 1,08 5,20 7,97
    NM_002658.2 1,08 1,80 1,35 1,47
    NM_000094.2 1,48 1,45 1,93 1,66
    NM_022765.2 1,27 1,60 2,39 3,39
    NM_006000.1 1,42 2,80 1,65 2,07
    NM_021021.2 –1,63 1,01 –4,19 –5,26
    NM_032866.3 –1,62 1,04 –3,96 –3,69
    NM_003603.4 –1,45 1,03 –3,03 –2,90
    NM_173344.1 1,00 1,21 –1,68 –1,56
    NM_001699.3 1,05 1,18 1,93 2,98
    NM_001824.2 1,08 1,10 1,24 2,08
    NM_000476.1 1,38 1,26 1,71 2,54
    NM_005281.2 1,78 2,09 2,73 2,48
    NM_005980.2 3,05 1,72 2,20 2,10
    NM_005108.2 –1,88 –1,24 –1,92 –3,27
    NM_000189.4 –1,42 –1,39 –1,40 –2,00
    NM_015277.2 –1,75 1,03 –3,76 –6,45
    NM_001807.2 1,46 1,73 2,78 4,51
    NM_021727.3 1,42 1,61 1,67 2,12
    NM_016084.3 3,58 12,45 5,47 5,47
    NM_006736.4 1,53 1,63 1,34 1,62
    NM_006426.1 1,15 1,17 2,70 2,91
    NM_000266.1 –1,46 –1,41 –1,63 –2,29
    NM_014344.2 –1,78 –2,30 –1,60 –2,62
    NM_012193.2 –3,04 –2,27 –5,15 –8,46
    NM_199001.1 1,25 1,14 3,06 9,58
    NM_198445.1 –1,10 1,32 3,22 6,49
    NM_145263.1 1,22 1,29 1,21 1,70
    NM_016545.3 2,49 6,12 2,14 2,20
    NM_025092.1 –1,03 1,70 1,48 1,64
    NM_052972.2 –1,15 –1,00 1,28 1,51
    NM_207380.1 1,03 1,94 2,13 4,50
    NM_173542.2 1,20 1,44 1,30 1,64
    NM_001013838.1 1,21 1,14 2,19 3,23
    NM_145865.1 –2,61 –1,83 –1,81 –2,25
    RefSeq Etoposid
    500 nM
    6 h 24 h 48 h
    NM_022818.3 –1,04 1,32 1,51
    NM_000419.2 1,01 1,31 2,01
    NM_003254.2 1,11 1,00 1,89
    NM_002658.2 1,07 1,37 1,84
    NM_000094.2 –1,04 1,03 1,82
    NM_022765.2 1,06 1,32 1,65
    NM_006000.1 –1,05 1,44 1,59
    NM_021021.2 1,01 –1,08 –1,67
    NM_032866.3 –1,01 –1,17 –1,71
    NM_003603.4 –1,03 –1,22 –1,73
    NM_173344.1 1,04 –1,40 –1,81
    NM_001699.3 –1,00 1,08 1,60
    NM_001824.2 –1,07 1,21 1,94
    NM_000476.1 1,05 1,07 1,91
    NM_005281.2 –1,08 1,60 2,51
    NM_005980.2 1,04 1,14 1,76
    NM_005108.2 –1,03 –1,18 –1,55
    NM_000189.4 1,01 –1,09 –1,68
    NM_015277.2 –1,03 –1,24 –1,85
    NM_001807.2 1,26 2,78 11,64
    NM_021727.3 –1,05 1,39 1,95
    NM_016084.3 –1,02 1,27 2,00
    NM_006736.4 –1,04 1,10 1,65
    NM_006426.1 1,03 2,12 5,65
    NM_000266.1 1,02 –1,18 –1,61
    NM_014344.2 1,00 –1,08 –1,68
    NM_012193.2 1,04 –1,24 –1,78
    NM_199001.1 1,01 1,79 4,36
    NM_198445.1 1,00 1,53 3,33
    NM_145263.1 1,19 1,54 2,04
    NM_016545.3 1,07 1,60 1,95
    NM_025092.1 –1,05 1,16 1,71
    NM_052972.2 –1,05 1,03 1,61
    NM_207380.1 1,06 1,08 1,55
    NM_173542.2 –1,00 1,06 1,54
    NM_001013838.1 –1,03 1,14 1,53
    NM_145865.1 1,08 –1,07 –1,51
    RefSeq Actinomycin D
    250 nM
    6 h 24 h 48 h
    NM_022818.3 1,42 3,03 2,83
    NM_000419.2 2,03 1,50 1,56
    NM_003254.2 1,19 1,97 4,35
    NM_002658.2 1,57 3,55 3,72
    NM_000094.2 1,91 3,09 3,79
    NM_022765.2 1,85 2,29 3,11
    NM_006000.1 1,61 2,11 2,88
    NM_021021.2 1,20 –2,12 –2,28
    NM_032866.3 1,32 –2,23 –2,53
    NM_003603.4 1,17 –1,81 –2,15
    NM_173344.1 –1,08 –1,95 –2,74
    NM_001699.3 1,98 2,99 3,32
    NM_001824.2 1,64 2,25 2,13
    NM_000476.1 1,71 1,96 2,22
    NM_005281.2 –1,01 2,99 5,22
    NM_005980.2 1,20 1,45 1,77
    NM_005108.2 1,37 –1,84 –2,29
    NM_000189.4 –1,08 –1,40 –1,67
    NM_015277.2 1,34 –1,28 –1,82
    NM_001807.2 1,85 2,17 2,84
    NM_021727.3 1,28 1,50 1,63
    NM_016084.3 –1,20 4,59 10,21
    NM_006736.4 –1,15 1,41 1,63
    NM_006426.1 1,41 1,71 1,66
    NM_000266.1 –1,42 –1,72 –2,13
    NM_014344.2 –2,07 –1,99 –2,46
    NM_012193.2 –4,64 –6,33 –7,02
    NM_199001.1 –1,23 1,27 1,66
    NM_198445.1 1,58 1,44 1,52
    NM_145263.1 1,86 1,91 1,96
    NM_016545.3 1,25 2,86 3,10
    NM_025092.1 1,81 3,12 3,87
    NM_052972.2 1,82 2,43 2,06
    NM_207380.1 1,14 1,42 2,37
    NM_173542.2 1,73 3,98 5,82
    NM_001013838.1 1,01 1,04 1,45
    NM_145865.1 –2,22 –1,93 –2,04
    RefSeq Theophyllin
    100 μM
    6 h 24 h 48 h
    NM_022818.3 –1,08 1,08 –1,07
    NM_000419.2 1,00 –1,08 –1,03
    NM_003254.2 1,20 1,16 1,26
    NM_002658.2 1,08 1,04 –1,04
    NM_000094.2 –1,12 1,02 –1,03
    NM_022765.2 1,03 –1,09 –1,06
    NM_006000.1 1,01 1,06 1,25
    NM_021021.2 1,01 –1,10 –1,13
    NM_032866.3 1,00 –1,00 –1,27
    NM_003603.4 –1,01 1,03 –1,12
    NM_173344.1 –1,10 –1,07 –1,19
    NM_001699.3 1,06 1,01 –1,10
    NM_001824.2 –1,02 –1,05 1,16
    NM_000476.1 1,01 –1,03 1,09
    NM_005281.2 –1,03 –1,08 1,21
    NM_005980.2 1,10 1,02 1,23
    NM_005108.2 –1,10 –1,09 –1,18
    NM_000189.4 1,02 –1,02 –1,14
    NM_015277.2 –1,07 1,11 –1,21
    NM_001807.2 –1,09 –1,16 –1,01
    NM_021727.3 –1,01 1,04 1,04
    NM_016084.3 1,15 1,14 1,16
    NM_006736.4 –1,07 –1,12 1,06
    NM_006426.1 –1,04 1,03 1,04
    NM_000266.1 –1,12 –1,12 –1,19
    NM_014344.2 –1,07 1,01 –1,14
    NM_012193.2 –1,01 1,07 –1,10
    NM_199001.1 –1,10 1,01 1,15
    NM_198445.1 1,10 1,15 1,02
    NM_145263.1 1,01 1,00 –1,06
    NM_016545.3 1,02 1,06 1,07
    NM_025092.1 –1,03 1,02 1,09
    NM_052972.2 1,03 –1,02 1,08
    NM_207380.1 –1,08 –1,06 1,10
    NM_173542.2 –1,04 –1,07 1,21
    NM_001013838.1 –1,04 –1,04 1,15
    NM_145865.1 –1,00 1,03 –1,29
    RefSeq ANOVA
    p-Wert BH-q-Wert
    NM_022818.3 1,03E-07 4,84E-05
    NM_000419.2 1,67E-06 2,77E-04
    NM_003254.2 7,76E-05 3,24E-03
    NM_002658.2 2,91E-06 3,89E-04
    NM_000094.2 4,50E-06 5,03E-04
    NM_022765.2 3,29E-10 3,38E-06
    NM_006000.1 8,01E-06 7,48E-04
    NM_021021.2 1,18E-04 4,22E-03
    NM_032866.3 1,08E-04 4,00E-03
    NM_003603.4 1,04E-06 2,29E-04
    NM_173344.1 3,59E-04 8,79E-03
    NM_001699.3 1,80E-06 2,87E-04
    NM_001824.2 2,65E-04 7,22E-03
    NM_000476.1 8,75E-08 4,62E-05
    NM_005281.2 1,63E-08 1,98E-05
    NM_005980.2 6,99E-06 6,82E-04
    NM_005108.2 3,01E-04 7,88E-03
    NM_000189.4 4,48E-06 5,03E-04
    NM_015277.2 3,81E-04 9,10E-03
    NM_001807.2 1,06E-08 1,49E-05
    NM_021727.3 3,22E-11 6,63E-07
    NM_016084.3 3,69E-06 4,47E-04
    NM_006736.4 2,91E-07 1,03E-04
    NM_006426.1 1,34E-06 2,66E-04
    NM_000266.1 1,09E-08 1,49E-05
    NM_014344.2 4,89E-09 1,26E-05
    NM_012193.2 5,51E-09 1,26E-05
    NM_199001.1 1,30E-04 4,49E-03
    NM_198445.1 3,83E-05 2,14E-03
    NM_145263.1 1,32E-09 6,77E-06
    NM_016545.3 2,69E-08 2,13E-05
    NM_025092.1 5,84E-06 6,07E-04
    NM_052972.2 3,49E-04 8,66E-03
    NM_207380.1 7,67E-05 3,23E-03
    NM_173542.2 5,25E-05 2,54E-03
    NM_001013838.1 1,14E-04 4,14E-03
    NM_145865.1 3,90E-08 2,77E-05
  • Anhang 10: Putative Markergene für progenotoxische Substanzen
  • Die Tabelle beinhaltet die Deregulationswerte der 88 Gene, die durch die progenotoxischen Verbindungen in HepG2-Zellen statistisch signifikant dereguliert waren. Die HepG2-Zellen wurden mit 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), Diethylnitrosamin, Cyclophosphamid und Aflatoxin B1 sowie den Kontrollen Theophyllin und Metformin für täglich 6 h mit 18 h Erholungszeit über insgesamt 48 h mit und ohne metabolisches Aktivierungssystem (MAS: Phenobarbital/β-Naphthoflavon-induzierter S9) behandelt. Die 88 Gene wurden aus Illumina-Microarraystudien mittels ANOVA (p-Wert < 0,01/BH-q-Wert < 0,3) mit anschließendem Filtern (Deregulationsgrenzwert 1,5) selektiert. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte relativ zu den entsprechenden Lösungsmittel-/S9-Kontrollen aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25.
    RefSeq Symbol Funktion
    NM_020375.1 C12orf5 Apoptose/(P53-vermittelte) DNA-Schadensantwort
    NM_033306.2 CASP4
    NM_078467.1 CDKN1A
    NM_002038.2 G1P3
    NM_007350.2 PHLDA1
    NM_198951.1 TGM2
    NM_033285.2 TP53INP1
    NM_198053.1 CD247 Immun-/Entzündungsantwort
    NM_001251.1 CD68
    NM_001477.1 GAGE12I
    NM_001474.1 GAGE4
    NM_006674.2 HCP5
    NM_006435.1 IFITM2
    NM_173343.1 IL1R2
    NM_001531.1 MR1
    NM_004688.1 NMI
    NM_206956.1 PRAME
    NM_006404.3 PROCR
    NM_000350.1 ABCA4 Transport
    NM_004070.2 CLCNKA
    NM_006580.2 CLDN16
    NM_152672.3 OSTalpha
    NM_016609.3 SLC22A17
    NM_021194.2 SLC30A1
    NM_001001850.1 STX19
    NM_053056.1 CCND1 Zellproliferation, Differenzierung, Wachstum und Entwicklung
    NM_001001390.1 CD44
    NM_001878.2 CRABP2
    NM_005618.2 DLL1
    NM_001423.1 EMP1
    NM_001454.2 FOXJ1
    NM_024333.1 FSD1
    NM_015714.2 G0S2
    NM_023002.1 HAPLN4
    NM_000558.3 HBA1
    NM_016257.2 HPCAL4
    NM_003641.2 IFITM1
    NM_001013398.1 IGFBP3
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    NM_002317.3 LOX
    NM_002423.3 MMP7
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    NM_080591.1 PTGS1
    NM_006105.3 RAPGEF3
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    NM_003975.2 SH2D2A
    NM_013452.2 VCX
    NM_016378.2 VCX2
    NM_001001888.1 VCX-C
    RefSeq Genname
    NM_020375.1 chromosome 12 open reading frame 5 (C12orf5)
    NM_033306.2 caspase 4, apoptosis-related cysteine peptidase (CASP4), transcript variant gamma
    NM_078467.1 cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) (CDKN1A), transcript variant 2
    NM_002038.2 interferon, alpha-inducible protein (clone IFI-6-16) (G1P3), transcript variant 1
    NM_007350.2 pleckstrin homology-like domain, family A, member 1 (PHLDA1)
    NM_198951.1 transglutaminase 2 (C polypeptide, protein-glutamine-gamma-glutamyltransferase) (TGM2), transcript variant 2
    NM_033285.2 tumor protein p53 inducible nuclear protein 1 (TP53INP1)
    NM_198053.1 CD247 molecule (CD247), transcript variant 1
    NM_001251.1 CD68 antigen (CD68)
    NM_001477.1 G antigen 12I (GAGE12I)
    NM_001474.1 G antigen 4 (GAGE4)
    NM_006674.2 HLA complex P5 (HCP5)
    NM_006435.1 interferon induced transmembrane protein 2 (1-8D) (IFITM2)
    NM_173343.1 interleukin 1 receptor, type II (IL1R2), transcript variant 2
    NM_001531.1 major histocompatibility complex, class I-related (MR1)
    NM_004688.1 N-myc (and STAT) interactor (NMI)
    NM_206956.1 preferentially expressed antigen in melanoma (PRAME), transcript variant 5
    NM_006404.3 protein C receptor, endothelial (EPCR) (PROCR)
    NM_000350.1 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 4 (ABCA4)
    NM_004070.2 chloride channel Ka (CLCNKA)
    NM_006580.2 claudin 16 (CLDN16)
    NM_152672.3 organic solute transporter alpha (OSTalpha)
    NM_016609.3 solute carrier family 22, member 17 (SLC22A17), transcript variant 2
    NM_021194.2 solute carrier family 30 (zinc transporter), member 1 (SLC30A1)
    NM_001001850.1 syntaxin 19 (STX19)
    NM_053056.1 cyclin D1 (PRAD1: parathyroid adenomatosis 1) (CCND1)
    NM_001001390.1 CD44 molecule (Indian blood group) (CD44), transcript variant 3
    NM_001878.2 cellular retinoic acid binding protein 2 (CRABP2)
    NM_005618.2 delta-like 1 (Drosophila) (DLL1)
    NM_001423.1 epithelial membrane protein 1 (EMP1)
    NM_001454.2 forkhead box J1 (FOXJ1)
    NM_024333.1 fibronectin type III and SPRY domain containing 1 (FSD1)
    NM_015714.2 G0/G1 switch 2 (G0S2)
    NM_023002.1 hyaluronan and proteoglycan link protein 4 (HAPLN4)
    NM_000558.3 hemoglobin, alpha 1 (HBA1)
    NM_016257.2 hippocalcin like 4 (HPCAL4)
    NM_003641.2 interferon induced transmembrane protein 1 (9–27) (IFITM1)
    NM_001013398.1 insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3), transcript variant 1
    NM_000422.1 keratin 17 (KRT17)
    NM_002317.3 lysyl oxidase (LOX)
    NM_002423.3 matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, uterine) (MMP7)
    NM_002514.2 nephroblastoma overexpressed gene (NOV)
    NM_013961.1 neuregulin 1 (NRG1), transcript variant GGF
    NM_002658.2 plasminogen activator, urokinase (PLAU)
    NM_080591.1 prostaglandin-endoperoxide synthase 1 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase) (PTGS1), transcript variant 2
    NM_006105.3 Rap guanine nucleotide exchange factor (GEF) 3 (RAPGEF3)
    NM_002961.2 S100 calcium binding protein A4 (S100A4), transcript variant 1
    NM_003975.2 SH2 domain protein 2A (SH2D2A)
    NM_013452.2 variable charge, X-linked (VCX)
    NM_016378.2 variable charge, X-linked 2 (VCX2)
    NM_001001888.1 variably charged X-C (VCX-C)
    RefSeq Aflatoxin B1
    48 h
    - - - +S9 +S9
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    RefSeq Cyclophosphamid
    48 h
    - - +S9 +S9
    25 μM 50 μM 25 μM 50 μM
    NM_020375.1 1,14 1,14 1,63 1,73
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    NM_002038.2 1,20 1,22 1,45 1,61
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    RefSeq Diethylnitrosamin
    48 h
    - +S9 +S9
    25 mM 50 mM 25 mM 50 mM
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    NM_013452.2 1,39 1,24 2,22 1,58
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    NM_001001888.1 1,14 1,19 1,47 1,16
    RefSeq DMBA Metformin
    48 h 48 h
    - - +S9 - +S9
    10 μM 75 μM 10 μM 1 mM
    NM_020375.1 1,09 1,22 1,72 1,01 1,01
    NM_033306.2 1,01 1,07 1,87 0,96 0,89
    NM_078467.1 1,36 1,50 3,18 1,02 0,95
    NM_002038.2 1,19 1,28 1,55 1,03 1,01
    NM_007350.2 1,25 1,25 1,53 1,10 1,00
    NM_198951.1 1,06 1,17 1,94 1,05 0,97
    NM_033285.2 1,09 1,05 1,54 1,05 0,88
    NM_198053.1 1,04 1,07 1,73 0,93 0,96
    NM_001251.1 0,98 1,04 1,91 1,04 0,86
    NM_001477.1 1,07 1,02 1,52 1,15 0,93
    NM_001474.1 0,99 1,03 1,58 1,01 0,90
    NM_006674.2 1,06 1,12 1,76 1,07 0,95
    NM_006435.1 0,97 1,04 1,71 1,01 0,98
    NM_173343.1 1,17 1,25 1,89 0,80 1,00
    NM_001531.1 1,18 1,20 2,01 1,09 0,95
    NM_004688.1 1,02 1,05 1,67 0,97 0,99
    NM_206956.1 1,06 1,04 1,70 1,02 1,04
    NM_006404.3 1,18 1,32 2,26 1,12 0,99
    NM_000350.1 1,23 1,24 1,71 1,12 0,94
    NM_004070.2 1,14 1,20 2,28 1,10 0,98
    NM_006580.2 1,37 1,67 1,44 1,14 0,94
    NM_152672.3 1,11 1,13 2,02 1,07 0,99
    NM_016609.3 1,13 1,19 1,74 1,21 0,92
    NM_021194.2 1,04 1,11 1,70 0,93 0,99
    NM_001001850.1 0,95 1,01 1,83 1,13 0,87
    NM_053056.1 1,20 1,37 1,46 1,10 0,91
    NM_001001390.1 1,22 1,54 2,08 1,07 0,90
    NM_001878.2 1,10 1,27 2,31 1,20 0,96
    NM_005618.2 1,11 1,08 1,66 1,05 0,98
    NM_001423.1 1,11 1,31 1,93 1,31 1,05
    NM_001454.2 1,02 1,16 0,78 1,45 0,94
    NM_024333.1 1,22 1,28 1,54 1,11 0,99
    NM_015714.2 0,88 0,64 1,02 0,44 0,99
    NM_023002.1 1,01 1,10 2,12 1,03 0,97
    NM_000558.3 1,04 1,04 1,48 1,04 1,07
    NM_016257.2 1,09 1,10 1,59 1,11 0,97
    NM_003641.2 1,16 1,24 2,07 1,10 1,02
    NM_001013398.1 0,97 1,14 1,41 1,29 0,86
    NM_000422.1 1,15 1,18 1,48 1,23 0,98
    NM_002317.3 1,15 1,35 1,88 1,22 0,92
    NM_002423.3 1,00 0,94 2,39 1,03 0,96
    NM_002514.2 1,18 1,37 1,92 1,32 0,97
    NM_013961.1 1,18 1,35 1,35 1,06 0,98
    NM_002658.2 1,29 1,53 2,13 1,32 0,94
    NM_080591.1 1,10 1,26 2,80 1,11 0,96
    NM_006105.3 1,35 1,55 1,36 1,00 0,92
    NM_002961.2 0,98 1,12 1,60 1,27 0,98
    NM_003975.2 1,30 1,35 1,78 1,09 0,95
    NM_013452.2 1,19 1,07 4,22 1,25 1,07
    NM_016378.2 1,19 1,01 2,52 1,16 0,90
    NM_001001888.1 1,09 1,06 2,35 1,07 0,92
    RefSeq Theophyllin
    48 h ANOVA
    - +S9
    100 μM P-Wert BH-q-Wert
    NM_020375.1 1,12 1,15 7,07E-03 2,54E-01
    NM_033306.2 0,95 1,04 3,02E-03 2,16E-01
    NM_078467.1 0,91 1,07 8,91E-03 2,70E-01
    NM_002038.2 0,92 0,95 8,02E-04 1,56E-01
    NM_007350.2 1,13 1,04 6,51E-03 2,47E-01
    NM_198951.1 0,94 1,01 1,09E-04 1,05E-01
    NM_033285.2 1,10 0,99 6,34E-03 2,47E-01
    NM_198053.1 0,89 1,01 2,11E-04 1,23E-01
    NM_001251.1 0,92 0,99 3,30E-03 2,17E-01
    NM_001477.1 1,01 1,08 3,73E-03 2,20E-01
    NM_001474.1 0,99 1,11 4,58E-03 2,29E-01
    NM_006674.2 1,02 1,02 1,70E-03 1,92E-01
    NM_006435.1 0,94 0,90 3,21E-03 2,17E-01
    NM_173343.1 1,03 1,03 2,82E-03 2,13E-01
    NM_001531.1 1,01 1,01 9,94E-03 2,74E-01
    NM_004688.1 1,02 1,06 3,26E-03 2,17E-01
    NM_206956.1 0,99 1,07 6,56E-03 2,47E-01
    NM_006404.3 1,06 1,01 2,10E-03 1,92E-01
    NM_000350.1 1,06 1,03 4,45E-03 2,27E-01
    NM_004070.2 1,03 1,03 3,84E-03 2,22E-01
    NM_006580.2 1,00 0,99 3,39E-03 2,17E-01
    NM_152672.3 1,01 1,19 2,21E-03 1,94E-01
    NM_016609.3 1,06 0,92 5,22E-03 2,38E-01
    NM_021194.2 1,06 1,10 7,91E-04 1,56E-01
    NM_001001850.1 1,05 1,00 6,47E-03 2,47E-01
    NM_053056.1 1,12 1,08 8,01E-03 2,63E-01
    NM_001001390.1 1,18 1,10 8,75E-04 1,57E-01
    NM_001878.2 0,99 1,00 2,43E-03 2,02E-01
    NM_005618.2 1,06 1,01 1,13E-03 1,71E-01
    NM_001423.1 1,28 1,04 2,62E-04 1,24E-01
    NM_001454.2 1,11 0,98 1,54E-03 1,87E-01
    NM_024333.1 1,03 1,07 8,28E-03 2,65E-01
    NM_015714.2 0,72 1,09 5,39E-03 2,38E-01
    NM_023002.1 1,04 1,13 3,93E-03 2,22E-01
    NM_000558.3 0,93 1,04 1,71E-03 1,92E-01
    NM_016257.2 0,98 0,91 1,71E-04 1,20E-01
    NM_003641.2 0,99 0,86 3,36E-03 2,17E-01
    NM_001013398.1 1,20 0,95 7,78E-04 1,56E-01
    NM_000422.1 1,02 0,97 2,22E-03 1,94E-01
    NM_002317.3 1,02 1,02 1,47E-03 1,84E-01
    NM_002423.3 1,01 1,07 3,13E-05 9,07E-02
    NM_002514.2 1,25 1,01 5,56E-03 2,39E-01
    NM_013961.1 1,02 1,02 1,21E-03 1,77E-01
    NM_002658.2 1,14 0,90 8,32E-03 2,65E-01
    NM_080591.1 1,09 1,07 8,45E-03 2,68E-01
    NM_006105.3 1,13 0,99 2,94E-03 2,14E-01
    NM_002961.2 1,18 1,12 7,24E-03 2,55E-01
    NM_003975.2 1,14 1,02 1,34E-03 1,84E-01
    NM_013452.2 0,95 1,14 3,34E-03 2,17E-01
    NM_016378.2 1,05 1,03 7,05E-04 1,53E-01
    NM_001001888.1 0,97 0,99 5,96E-04 1,44E-01
    RefSeq Symbol Funktion
    NM_020547.1 AMHR2 Signaltransduktion/Zellkommunikation
    NM_194284.1 CLDN23
    NM_000775.2 CYP2J2
    NM_001458.2 FLNC
    NM_013281.2 FLRT3
    NM_002068.1 GNA15
    NM_153840.2 GPR110
    NM_001013005.1 HERC6
    NM_003866.1 INPP4B
    NM_002928.2 RGS16
    NM_004657.4 SDPR
    NM_018421.2 TBC1D2
    NM_006086.2 TUBB3
    NM_178820.3 FBXO27 Entgiftung
    NM_024417.1 FDXR
    NM_003275.1 TMOD1
    NM_000505.2 F12 Metabolismus (Proteine, DNA)
    NM_002526.1 NT5E
    NM_173567.2 ABHD7 Unbekannte oder andere Funktionen
    NM_207380.1 C15orf52
    NM_015463.1 C2orf32
    NM_024046.2 CAMKV
    NM_016452.1 CAPN9
    NM_016452.1 CAPN9
    NM_001275.2 CHGA
    NM_001017436.1 CT45-4
    NM_153690.4 FAM43A
    NM_153756.1 FNDC5
    NM_021996.3 GBGT1
    NM_014905.2 GLS
    NM_138768.2 MYEOV
    NM_024938.2 PCNXL2
    NM_002638.2 PI3
    NM_012232.2 PTRF
    NM_001017430.1 RBM3
    NM_080388.1 S100A16
    NM_181598.2 SPG3A
    RefSeq Genname
    NM_020547.1 anti-Mullerian hormone receptor, type II (AMHR2)
    NM_194284.1 claudin 23 (CLDN23)
    NM_000775.2 cytochrome P450, family 2, subfamily J, polypeptide 2 (CYP2J2)
    NM_001458.2 filamin C, gamma (actin binding protein 280) (FLNC)
    NM_013281.2 fibronectin leucine rich transmembrane protein 3 (FLRT3), transcript variant 1
    NM_002068.1 guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 15 (Gq class) (GNA15)
    NM_153840.2 G protein-coupled receptor 110 (GPR110), transcript variant 1
    NM_001013005.1 hect domain and RLD 6 (HERC6), transcript variant 4
    NM_003866.1 inositol polyphosphate-4-phosphatase, type II, 105 kDa (INPP4B)
    NM_002928.2 regulator of G-protein signalling 16 (RGS 16)
    NM_004657.4 serum deprivation response (phosphatidylserine binding protein) (SDPR)
    NM_018421.2 TBC1 domain family, member 2 (TBC1D2)
    NM_006086.2 tubulin, beta 3 (TUBB3)
    NM_178820.3 F-box protein 27 (FBXO27)
    NM_024417.1 ferredoxin reductase (FDXR), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1
    NM_003275.1 tropomodulin 1 (TMOD1)
    NM_000505.2 coagulation factor XII (Hageman factor) (F12)
    NM_002526.1 5'-nucleotidase, ecto (CD73) (NT5E)
    NM_173567.2 abhydrolase domain containing 7 (ABHD7)
    NM_207380.1 chromosome 15 open reading frame 52 (C15orf52)
    NM_015463.1 chromosome 2 open reading frame 32 (C2orf32)
    NM_024046.2 CaM kinase-like vesicle-associated (CAMKV)
    NM_016452.1 calpain 9 (CAPN9), transcript variant 2
    NM_016452.1 calpain 9 (CAPN9), transcript variant 2
    NM_001275.2 chromogranin A (parathyroid secretory protein 1) (CHGA)
    NM_001017436.1 cancer/testis antigen CT45-4 (CT45-4)
    NM_153690.4 family with sequence similarity 43, member A (FAM43A)
    NM_153756.1 fibronectin type III domain containing 5 (FNDC5)
    NM_021996.3 globoside alpha-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 1 (GBGT1)
    NM_014905.2 glutaminase (GLS)
    NM_138768.2 myeloma overexpressed (in a subset of t(11; 14) positive multiple myelomas) (MYEOV)
    NM_024938.2 pecanex-like 2 (Drosophila) (PCNXL2), transcript variant 2
    NM_002638.2 peptidase inhibitor 3, skin-derived (SKALP) (PI3)
    NM_012232.2 polymerase I and transcript release factor (PTRF)
    NM_001017430.1 RNA binding motif (RNP1, RRM) protein 3 (RBM3), transcript variant 2
    NM_080388.1 S100 calcium binding protein A16 (S100A16)
    NM_181598.2 spastic paraplegia 3A (autosomal dominant) (SPG3A), transcript variant 2
    RefSeq Aflatoxin B1
    48 h
    - - - +S9 +S9
    0,5 μM 1 μM 10 μM 0,5 μM 1 μM
    NM_020547.1 1,03 0,97 1,19 1,30 1,48
    NM_194284.1 1,03 1,19 1,29 1,35 1,55
    NM_000775.2 1,09 1,26 1,23 1,39 1,51
    NM_001458.2 1,17 1,12 1,44 1,32 1,55
    NM_013281.2 1,10 1,24 1,25 1,37 1,48
    NM_002068.1 1,04 1,12 1,30 1,20 1,26
    NM_153840.2 1,17 1,31 1,55 1,33 1,56
    NM_001013005.1 1,06 1,18 1,27 1,29 1,40
    NM_003866.1 0,93 1,02 1,18 1,42 1,68
    NM_002928.2 0,93 1,24 1,42 2,11 3,26
    NM_004657.4 1,23 1,36 1,41 1,36 1,57
    NM_018421.2 0,96 1,10 1,31 1,29 1,45
    NM_006086.2 1,12 1,16 1,07 1,15 1,42
    NM_178820.3 1,13 1,25 1,27 1,27 1,41
    NM_024417.1 1,11 1,38 1,53 1,35 1,52
    NM_003275.1 1,00 1,10 1,28 1,51 1,57
    NM_000505.2 1,05 1,03 1,04 1,37 1,58
    NM_002526.1 1,18 1,21 1,26 1,29 1,43
    NM_173567.2 1,13 1,17 1,21 1,32 1,48
    NM_207380.1 1,08 1,17 1,22 1,16 1,36
    NM_015463.1 1,09 1,23 1,17 1,31 1,41
    NM_024046.2 1,06 1,05 1,18 1,34 1,36
    NM_016452.1 0,64 0,61 0,64 1,27 1,15
    NM_016452.1 0,54 0,55 0,64 1,37 1,21
    NM_001275.2 0,85 0,85 1,11 1,44 1,44
    NM_001017436.1 1,02 0,95 1,09 1,11 1,27
    NM_153690.4 0,79 0,87 0,76 1,26 1,61
    NM_153756.1 1,16 1,23 1,36 1,45 1,64
    NM_021996.3 0,99 1,07 1,12 1,13 1,28
    NM_014905.2 1,09 1,36 1,40 1,33 1,39
    NM_138768.2 1,12 1,23 1,88 2,20 2,34
    NM_024938.2 0,94 1,03 1,19 1,55 1,80
    NM_002638.2 1,03 1,06 1,43 1,32 1,73
    NM_012232.2 1,08 1,28 1,28 1,22 1,32
    NM_001017430.1 0,99 1,00 0,97 0,99 0,87
    NM_080388.1 1,32 1,42 1,62 1,32 1,61
    NM_181598.2 1,00 1,23 1,24 1,29 1,38
    RefSeq Cyclophosphamid
    48 h
    - - +S9 +S9
    25 μM 50 μM 25 μM 50 μM
    NM_020547.1 0,98 0,98 2,04 1,90
    NM_194284.1 1,10 1,07 1,67 1,57
    NM_000775.2 1,08 1,08 1,77 1,58
    NM_001458.2 1,15 1,15 1,61 1,56
    NM_013281.2 1,02 1,03 1,42 1,35
    NM_002068.1 0,94 0,94 1,68 1,67
    NM_153840.2 1,03 1,04 1,81 1,85
    NM_001013005.1 0,98 1,03 1,85 1,74
    NM_003866.1 1,05 1,03 1,90 1,87
    NM_002928.2 0,89 1,02 2,72 2,22
    NM_004657.4 1,30 1,23 2,00 1,86
    NM_018421.2 1,14 1,04 2,34 1,98
    NM_006086.2 1,07 1,15 1,48 1,66
    NM_178820.3 1,10 1,08 1,72 1,57
    NM_024417.1 0,95 1,07 1,69 1,67
    NM_003275.1 1,02 1,08 1,71 1,56
    NM_000505.2 1,12 1,14 1,72 1,51
    NM_002526.1 1,12 1,05 1,96 1,81
    NM_173567.2 1,15 1,00 1,76 1,68
    NM_207380.1 1,01 1,20 1,51 1,49
    NM_015463.1 1,18 1,12 1,88 1,77
    NM_024046.2 1,05 1,02 1,86 1,88
    NM_016452.1 0,79 0,76 0,99 0,56
    NM_016452.1 0,76 0,75 1,05 0,56
    NM_001275.2 0,97 0,93 1,85 1,42
    NM_001017436.1 0,98 1,06 1,72 1,75
    NM_153690.4 0,93 0,99 1,73 1,62
    NM_153756.1 1,06 1,06 1,76 1,69
    NM_021996.3 0,99 1,10 1,68 1,61
    NM_014905.2 1,10 1,04 1,76 1,94
    NM_138768.2 1,26 1,12 3,50 3,32
    NM_024938.2 1,03 1,02 2,27 2,25
    NM_002638.2 0,94 0,99 4,23 4,69
    NM_012232.2 1,19 1,08 1,38 1,29
    NM_001017430.1 0,94 0,89 0,72 0,55
    NM_080388.1 1,18 1,03 2,02 1,76
    NM_181598.2 1,03 1,04 1,52 1,51
    RefSeq Diethylnitrosamin
    48 h
    - - +S9 +S9
    25 mM 50 mM 25 mM 50 mM
    NM_020547.1 0,93 0,85 1,19 1,04
    NM_194284.1 1,17 1,05 1,32 1,37
    NM_000775.2 1,26 1,12 1,30 1,29
    NM_001458.2 1,42 1,38 1,39 1,29
    NM_013281.2 1,05 1,09 1,54 1,61
    NM_002068.1 1,03 1,08 1,45 1,44
    NM_153840.2 1,10 1,11 1,23 1,25
    NM_001013005.1 1,03 1,04 1,28 1,17
    NM_003866.1 1,07 0,97 1,54 1,43
    NM_002928.2 0,64 0,69 1,32 1,28
    NM_004657.4 1,37 1,41 1,42 1,61
    NM_018421.2 1,00 0,79 1,15 1,32
    NM_006086.2 1,33 1,42 1,45 1,52
    NM_178820.3 1,21 0,97 1,61 1,52
    NM_024417.1 1,03 0,87 1,40 1,39
    NM_003275.1 1,03 1,02 1,16 1,29
    NM_000505.2 1,31 1,27 1,50 1,47
    NM_002526.1 1,16 1,02 1,17 1,33
    NM_173567.2 1,20 1,04 1,30 1,26
    NM_207380.1 1,09 1,25 1,37 1,60
    NM_015463.1 1,11 1,06 1,71 1,66
    NM_024046.2 1,18 1,22 1,67 1,70
    NM_016452.1 0,55 0,37 0,66 0,59
    NM_016452.1 0,46 0,29 0,70 0,58
    NM_001275.2 0,85 0,90 0,65 0,73
    NM_001017436.1 1,18 1,14 1,10 0,95
    NM_153690.4 0,63 0,60 1,01 1,15
    NM_153756.1 1,35 1,27 1,50 1,47
    NM_021996.3 1,10 1,21 1,50 1,51
    NM_014905.2 1,22 1,23 1,33 1,29
    NM_138768.2 1,22 1,16 1,99 2,34
    NM_024938.2 1,08 1,01 1,13 1,27
    NM_002638.2 1,20 2,42 3,73 4,19
    NM_012232.2 1,30 1,32 1,54 1,56
    NM_001017430.1 0,64 0,54 0,45 0,47
    NM_080388.1 1,32 1,34 1,89 2,30
    NM_181598.2 0,96 0,94 1,24 1,37
    RefSeq DMBA Metformin
    48 h 48 h
    - - +S9 - +S9
    10 μM 75 μM 10 μM 1 mM
    NM_020547.1 1,06 1,03 1,93 1,02 1,04
    NM_194284.1 1,15 1,21 1,58 1,04 0,96
    NM_000775.2 1,20 1,23 1,68 1,03 0,91
    NM_001458.2 1,37 1,34 1,83 1,02 0,88
    NM_013281.2 1,03 1,14 1,59 1,05 0,91
    NM_002068.1 1,08 1,04 1,87 1,04 1,03
    NM_153840.2 1,13 1,25 1,75 1,09 1,07
    NM_001013005.1 0,98 1,04 1,66 1,03 0,99
    NM_003866.1 1,04 1,10 1,60 0,93 1,03
    NM_002928.2 1,45 1,27 3,47 1,12 0,83
    NM_004657.4 1,59 1,74 1,80 1,10 0,97
    NM_018421.2 0,99 1,06 1,70 1,03 0,89
    NM_006086.2 1,11 1,15 1,53 1,01 1,10
    NM_178820.3 1,21 1,36 1,54 1,10 0,88
    NM_024417.1 1,14 1,25 1,54 1,03 0,84
    NM_003275.1 1,15 1,15 1,40 0,96 0,99
    NM_000505.2 0,97 1,19 1,61 1,08 1,00
    NM_002526.1 1,16 1,22 1,53 1,07 0,97
    NM_173567.2 1,09 1,19 1,73 1,03 0,98
    NM_207380.1 1,18 1,26 1,62 1,08 0,91
    NM_015463.1 1,08 1,17 1,76 1,20 0,94
    NM_024046.2 1,06 1,12 1,63 0,98 0,94
    NM_016452.1 1,07 1,07 1,25 0,71 0,99
    NM_016452.1 1,01 1,05 1,28 0,65 1,05
    NM_001275.2 1,24 1,22 1,51 0,87 0,82
    NM_001017436.1 1,01 0,98 1,75 0,99 0,95
    NM_153690.4 0,95 0,86 1,75 0,90 1,06
    NM_153756.1 1,09 1,18 1,93 1,15 0,93
    NM_021996.3 1,09 1,08 1,69 1,13 0,94
    NM_014905.2 1,13 1,34 1,91 1,12 0,85
    NM_138768.2 1,42 1,59 2,09 1,05 0,97
    NM_024938.2 1,07 1,04 1,95 1,01 0,95
    NM_002638.2 1,22 1,28 2,42 0,93 0,85
    NM_012232.2 1,11 1,25 1,56 1,13 0,94
    NM_001017430.1 0,89 0,92 0,81 0,94 0,89
    NM_080388.1 1,14 1,21 1,87 1,18 0,99
    NM_181598.2 1,04 1,04 1,58 1,06 0,93
    RefSeq Theophyllin
    48 h ANOVA
    - +S9
    100 μM P-Wert BH-q-Wert
    NM_020547.1 1,02 1,02 1,17E-03 1,74E-01
    NM_194284.1 1,06 1,07 8,38E-03 2,66E-01
    NM_000775.2 1,03 1,03 5,95E-04 1,44E-01
    NM_001458.2 1,08 0,82 5,98E-04 1,44E-01
    NM_013281.2 1,11 0,93 4,96E-04 1,44E-01
    NM_002068.1 0,99 0,98 1,90E-03 1,92E-01
    NM_153840.2 1,07 1,03 7,73E-03 2,61E-01
    NM_001013005.1 1,05 0,99 1,95E-03 1,92E-01
    NM_003866.1 0,99 1,06 5,84E-03 2,41E-01
    NM_002928.2 1,00 1,01 1,05E-03 1,71E-01
    NM_004657.4 1,14 1,09 2,34E-04 1,23E-01
    NM_018421.2 1,07 0,99 8,11E-03 2,64E-01
    NM_006086.2 1,01 1,26 8,03E-03 2,63E-01
    NM_178820.3 1,11 0,97 6,77E-03 2,51E-01
    NM_024417.1 1,01 0,97 9,36E-03 2,73E-01
    NM_003275.1 1,00 0,97 2,93E-03 2,14E-01
    NM_000505.2 0,96 0,99 2,71E-03 2,08E-01
    NM_002526.1 1,06 1,01 9,07E-04 1,60E-01
    NM_173567.2 1,14 1,09 3,73E-03 2,20E-01
    NM_207380.1 1,00 0,93 6,07E-03 2,44E-01
    NM_015463.1 1,10 0,96 1,34E-04 1,13E-01
    NM_024046.2 1,04 1,00 7,13E-06 4,01E-02
    NM_016452.1 0,98 1,03 7,16E-03 2,54E-01
    NM_016452.1 0,94 1,03 9,15E-03 2,72E-01
    NM_001275.2 0,87 0,88 8,20E-04 1,57E-01
    NM_001017436.1 0,94 0,94 7,74E-04 1,56E-01
    NM_153690.4 0,97 1,35 8,36E-04 1,57E-01
    NM_153756.1 1,07 0,93 2,44E-04 1,23E-01
    NM_021996.3 1,03 1,01 1,22E-03 1,78E-01
    NM_014905.2 1,09 0,90 1,89E-03 1,92E-01
    NM_138768.2 1,04 1,08 3,69E-03 2,20E-01
    NM_024938.2 0,92 0,99 4,83E-04 1,44E-01
    NM_002638.2 1,01 0,82 1,46E-03 1,84E-01
    NM_012232.2 1,16 1,06 5,68E-03 2,39E-01
    NM_001017430.1 1,01 1,03 6,37E-05 1,04E-01
    NM_080388.1 1,11 1,02 4,74E-03 2,31E-01
    NM_181598.2 1,01 1,05 9,78E-03 2,74E-01
  • Anhang 11: Gene des Klassifikationsmodells für mutagene und promutagene Substanzen
  • Die Tabelle beinhaltet die Deregulationswerte und Rankingstatistik der 91 putativen Markergene für die getesteten gentoxischen und progenotoxischen Verbindungen (Klassifikationsmodell). Die HepG2-Zellen wurden mit 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), Diethylnitrosamin, Cyclophosphamid und Aflatoxin B1 sowie den Kontrollen Theophyllin und Metformin für täglich 6 h mit 18 h Erholungszeit über insgesamt 48 h mit und ohne metabolisches Aktivierungssystem (MAS: Phenobarbital/β-Naphthoflavoninduzierter S9) behandelt. Dagegen erfolgte die Behandlung mit den direkt genotoxischen Verbindungen kontinuierlich über 24 h und 48 h bei täglichem Wechsel des Substanzmediums. Die 91 Gene wurden mithilfe eines Ranking-Verfahrens auf Basis einer ANOVA für die Ermittlung der Rangfolgen in Kombination mit dem Supportvektormaschinenalgorithmus als Klassifizierungsmethode ermittelt. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte der Genregulationen relativ zu den entsprechenden Lösungsmittel-/S9-Kontrollen aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25.
    • 1Versuchsteil progenotoxische Verbindungen, 2Versuchsteil genotoxische Verbindungen, 3Rangnummer des ANOVA-Rankings, 4Generelle Regulationstendenz in den (pro-)genotoxischen Proben.
    RefSeq Symbol Funktion
    NM_016545.3 IER5 Apoptose/(P53-vermittelte) DNA Schadensantwort
    NM_003811.2 TNFSF9
    NM_020965.2 MAGI3
    NM_015367.2 BCL2L13
    NM_002307.1 LGALS7
    NM_001007234.1 ERCC8
    NM_002528.4 NTHL1
    NM_078467.1 CDKN1A
    NM_003820.2 TNFRSF14
    NM_006404.3 PROCR Immun-/Entzündungsantwort
    NM_001531.1 MR1
    NM_004843.2 IL27RA
    NM_005101.1 ISG15
    NM_019080.1 NDFIP2
    NM_000593.5 TAP1
    NM_004321.4 KIF1A Transport
    NM_004858.1 SLC4A8
    NM_033316.2 MFI2
    NM_017585.2 SLC2A6
    NM_020348.1 CNNM1
    NM_005125.1 CCS
    NM_173854.4 SLC41A1
    NM_004518.2 KCNQ2
    NM_015894.2 STMN3 Proliferation, Gewebeumbau, Differenzierung, Entwicklung, Wachstum
    NM_022370.2 ROBO3
    NM_021783.2 EDA2R
    NM_002658.2 PLAU
    NM_002517.2 NPAS1
    NM_001423.1 EMP1
    NM_001458.2 FLNC
    NM_033328.2 CAPZA3
    NM_017805.2 RASIP1
    NM_006622.1 PLK2
    NM_018092.3 NETO2
    NM_145263.1 SPATA18
    NM_013961.1 NRG1
    NM_001175.4 ARHGDIB
    NM_005562.1 LAMC2
    NM_001878.2 CRABP2
    NM_015032.1 PDS5B
    NM_004838.2 HOMER3
    NM_001425.1 EMP3
    NM_032352.3 BRMS1L
    NM_006000.1 TUBA4A
    NM_006426.1 DPYSL4
    NM_014398.2 LAMP3
    RefSeq Genname
    NM_016545.3 immediate early response 5 (IER5)
    NM_003811.2 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 9 (TNFSF9)
    NM_020965.2 membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 3 (MAGI3), transcript variant 1
    NM_015367.2 BCL2-like 13 (apoptosis facilitator) (BCL2L13), nuclear gene encoding mitochondrial protein
    NM_002307.1 lectin, galactoside-binding, soluble, 7 (galectin 7) (LGALS7)
    NM_001007234.1 excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 8 (ERCC8), transcript variant 3
    NM_002528.4 nth endonuclease III-like 1 (E. coli) (NTHL1)
    NM_078467.1 cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) (CDKN1A), transcript variant 2
    NM_003820.2 tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 (herpesvirus entry mediator) (TNFRSF14)
    NM_006404.3 protein C receptor, endothelial (EPCR) (PROCR)
    NM_001531.1 major histocompatibility complex, class I-related (MR1)
    NM_004843.2 interleukin 27 receptor, alpha (IL27RA)
    NM_005101.1 ISG15 ubiquitin-like modifier (ISG15)
    NM_019080.1 Nedd4 family interacting protein 2 (NDFIP2)
    NM_000593.5 transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP) (TAP1)
    NM_004321.4 kinesin family member 1A (KIF1A)
    NM_004858.1 solute carrier family 4, sodium bicarbonate cotransporter, member 8 (SLC4A8)
    NM_033316.2 antigen p97 (melanoma associated) identified by monoclonal antibodies 133.2 and 96.5 (MFI2), transcript variant 2
    NM_017585.2 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 6 (SLC2A6)
    NM_020348.1 cyclin M1 (CNNM1)
    NM_005125.1 copper chaperone for superoxide dismutase (CCS)
    NM_173854.4 solute carrier family 41, member 1 (SLC41A1)
    NM_004518.2 potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily, member 2 (KCNQ2), transcript variant 3
    NM_015894.2 stathmin-like 3 (STMN3)
    NM_022370.2 roundabout, axon guidance receptor, homolog 3 (Drosophila) (ROBO3)
    NM_021783.2 ectodysplasin A2 receptor (EDA2R)
    NM_002658.2 plasminogen activator, urokinase (PLAU)
    NM_002517.2 neuronal PAS domain protein 1 (NPAS1)
    NM_001423.1 epithelial membrane protein 1 (EMP1)
    NM_001458.2 filamin C, gamma (actin binding protein 280) (FLNC)
    NM_033328.2 capping protein (actin filament) muscle Z-line, alpha 3 (CAPZA3)
    NM_017805.2 Ras interacting protein 1 (RASIP1)
    NM_006622.1 polo-like kinase 2 (Drosophila) (PLK2)
    NM_018092.3 neuropilin (NRP) and tolloid(TLL)-like 2 (NETO2)
    NM_145263.1 spermatogenesis associated 18 homolog (rat) (SPATA18)
    NM_013961.1 neuregulin 1 (NRG1), transcript variant GGF
    NM_001175.4 Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) beta (ARHGDIB)
    NM_005562.1 laminin, gamma 2 (LAMC2), transcript variant 1
    NM_001878.2 cellular retinoic acid binding protein 2 (CRABP2)
    NM_015032.1 PDS5, regulator of cohesion maintenance, homolog B (S. cerevisiae) (PDS5B)
    NM_004838.2 homer homolog 3 (Drosophila) (HOMER3)
    NM_001425.1 epithelial membrane protein 3 (EMP3)
    NM_032352.3 breast cancer metastasis-suppressor 1-like (BRMS1L)
    NM_006000.1 tubulin, alpha 4a (TUBA4A)
    NM_006426.1 dihydropyrimidinase-like 4 (DPYSL4)
    NM_014398.2 lysosomal-associated membrane protein 3 (LAMP3)
    RefSeq Cyclophosphamid1
    48 h
    - - +S9 +S9
    25 μM 50 μM 25 μM 50 μM
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    RefSeq Aflatoxin B1 1
    48 h
    - - - +S9 +S9
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    NM_014398.2 1,03 1,15 1,17 1,11 1,06
    RefSeq DMBA1
    48 h
    - - +S9
    10 μM 75 μM 10 μM
    NM_016545.3 1,30 1,26 1,83
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    NM_001878.2 1,10 1,27 2,31
    NM_015032.1 –1,03 1,00 –1,21
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    NM_014398.2 1,07 1,08 1,22
    RefSeq Diethylnitrosamin1
    48 h
    - - +S9 +S9
    25 mM 50 mM 25 mM 50 mM
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    NM_078467.1 –1,19 –1,48 1,95 2,20
    NM_003820.2 1,16 –1,03 1,34 1,34
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    RefSeq Metformin1 Theophyllin1 DMSO1
    48 h 48 h 48 h
    - +S9 - +S9 +S9
    1 mM 100 μM 0,2%
    NM_016545.3 –1,04 1,05 1,04 1,16 1,10
    NM_003811.2 1,02 –1,05 1,05 –1,05 1,18
    NM_020965.2 –1,00 1,02 –1,02 1,00 1,02
    NM_015367.2 –1,03 –1,14 1,02 –1,02 –1,02
    NM_002307.1 1,09 1,05 –1,01 1,09 –1,01
    NM_001007234.1 1,01 –1,15 1,00 –1,12 1,01
    NM_002528.4 1,09 –1,07 1,06 –1,00 1,17
    NM_078467.1 1,02 –1,05 –1,10 1,07 –1,17
    NM_003820.2 1,11 –1,15 1,03 1,08 –1,20
    NM_006404.3 1,12 –1,01 1,06 1,01 1,17
    NM_001531.1 1,09 –1,05 1,01 1,01 1,01
    NM_004843.2 1,06 –1,06 1,01 –1,02 –1,10
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    NM_001458.2 1,02 –1,13 1,08 –1,23 1,32
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    NM_017805.2 1,01 1,02 –1,04 –1,07 –1,07
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    NM_013961.1 1,06 –1,02 1,02 1,02 1,23
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    NM_001878.2 1,20 –1,04 –1,01 –1,00 1,43
    NM_015032.1 –1,03 –1,03 1,03 –1,02 –1,05
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    NM_001425.1 1,15 1,03 1,09 1,08 1,17
    NM_032352.3 1,00 –1,10 1,11 1,05 –1,18
    NM_006000.1 1,02 –1,09 1,03 1,07 1,43
    NM_006426.1 1,05 –1,06 1,03 1,03 1,09
    NM_014398.2 1,11 1,03 –1,01 –1,04 –1,11
    RefSeq Theophyllin2 MMS2 Actinomycin D2
    24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h
    - - -
    100 μM 500 μM 250 nM
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    NM_001007234.1 –1,02 –1,01 –1,43 –1,19 –1,26 –1,10
    NM_002528.4 –1,04 1,27 –1,41 –1,59 –1,64 –1,53
    NM_078467.1 1,03 –1,04 7,38 9,30 –1,29 –1,15
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    NM_005101.1 –1,15 1,27 2,10 3,22 1,30 1,30
    NM_019080.1 1,03 –1,14 1,27 1,34 1,39 1,30
    NM_000593.5 1,04 1,00 2,30 2,45 1,85 1,90
    NM_004321.4 –1,04 1,08 1,57 1,67 1,92 1,34
    NM_004858.1 –1,01 –1,06 –1,16 –1,26 –1,12 –1,13
    NM_033316.2 1,01 –1,06 1,06 1,04 1,26 1,20
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    NM_004518.2 1,04 1,01 –1,02 –1,06 –1,04 –1,12
    NM_015894.2 1,02 1,09 1,58 1,44 1,60 1,65
    NM_022370.2 –1,04 1,08 1,24 1,13 1,26 1,23
    NM_021783.2 1,08 1,04 1,23 1,50 1,03 1,10
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    NM_145263.1 –1,00 –1,07 1,20 1,69 1,91 1,95
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    NM_006426.1 1,02 1,04 2,68 2,89 1,71 1,65
    NM_014398.2 –1,08 –1,03 1,52 1,35 1,29 1,12
    RefSeq Etoposid2
    24 h 48 h
    -
    500 nM Rang3 Regulation4
    NM_016545.3 1,60 1,95 2 hoch
    NM_003811.2 1,10 1,46 19 hoch
    NM_020965.2 –1,05 –1,02 21 herunter
    NM_015367.2 1,19 1,15 25 hoch
    NM_002307.1 1,21 2,76 29 hoch
    NM_001007234.1 –1,16 –1,31 51 herunter
    NM_002528.4 –1,19 –1,32 60 herunter
    NM_078467.1 3,09 6,89 66 hoch
    NM_003820.2 1,25 1,71 68 hoch
    NM_006404.3 1,37 2,20 4 hoch
    NM_001531.1 1,20 1,87 18 hoch
    NM_004843.2 1,08 1,20 22 hoch
    NM_005101.1 1,01 2,01 48 hoch
    NM_019080.1 1,06 1,01 84 hoch
    NM_000593.5 1,24 1,54 87 hoch
    NM_004321.4 1,24 1,90 11 hoch
    NM_004858.1 –1,07 –1,13 46 herunter
    NM_033316.2 1,15 1,32 49 hoch
    NM_017585.2 1,13 1,57 56 hoch
    NM_020348.1 –1,11 –1,13 61 hoch
    NM_005125.1 1,18 1,51 64 hoch
    NM_173854.4 1,09 1,15 85 hoch
    NM_004518.2 –1,00 –1,07 90 hoch
    NM_015894.2 1,11 1,45 7 hoch
    NM_022370.2 1,14 1,51 9 hoch
    NM_021783.2 1,16 1,43 10 hoch
    NM_002658.2 1,37 1,84 14 hoch
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    NM_001423.1 1,42 1,81 17 hoch
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    NM_033328.2 –1,06 –1,05 26 herunter
    NM_017805.2 1,00 1,14 28 hoch
    NM_006622.1 1,32 1,59 35 hoch
    NM_018092.3 1,08 1,37 36 hoch
    NM_145263.1 1,54 2,04 37 hoch
    NM_013961.1 1,28 1,25 40 hoch
    NM_001175.4 1,13 1,65 41 hoch
    NM_005562.1 1,17 1,36 53 hoch
    NM_001878.2 1,06 1,67 54 hoch
    NM_015032.1 –1,02 –1,23 63 herunter
    NM_004838.2 1,26 1,30 65 hoch
    NM_001425.1 1,19 2,22 71 hoch
    NM_032352.3 1,14 1,33 73 hoch
    NM_006000.1 1,44 1,58 76 hoch
    NM_006426.1 2,12 5,64 77 hoch
    NM_014398.2 1,06 1,13 78 hoch
    RefSeq Symbol Funktion
    NM_013267.2 GLS2 Protein-, Cholestrol-, Lipid- und DNA-Metabolismus
    NM_021727.3 FADS3
    NM_006730.2 DNASE1L1
    NM_007171.2 POMT1
    NM_014905.2 GLS
    NM_017811.3 UBE2R2
    NM_030794.1 TDRD3
    NM_199162.1 ADPRHL1
    NM_033625.1 RPL34
    NM_001030004.1 HNF4A
    NM_003124.3 SPR
    NM_015528.1 RNF167
    NM_017750.2 RETSAT
    NM_152490.1 B3GALNT2
    NM_024592.1 SRD5A2L
    NM_001008216.1 GALE
    NM_001807.2 CEL
    NM_182796.1 MAT2B
    NM_015654.3 NAT9
    NM_000419.2 ITGA2B G-Protein- und Hormon-vermittelte Signaltransduktion G-Protein und Hormon-vermittelte Signaltransduktion
    NM_014422.2 PIB5PA
    NM_001699.3 AXL
    NM_003272.1 GPR137B
    NM_000675.3 ADORA2A
    NM_001003809.1 DLGAP1
    NM_198150.1 ARSK
    NM_006270.2 RRAS
    NM_005881.1 BCKDK
    NM_001505.1 GPR30
    NM_015257.1 TMEM194 andere oder unbekennte Funktionen
    NM_016086.2 STYXL1
    NM_006818.3 MLLT11
    NM_017664.2 ANKRD10
    NM_018045.4 BSDC1
    NM_003603.4 SORBS2
    NM_152499.1 CCDC24
    NM_018962.1 DSCR6
    NM_004099.4 STOM
    NM_019118.2 C1ORF91
    NM_138340.3 ABHD3
    NM_017565.2 FAM20A
    NM_022753.2 S100PBP
    NM_182507.1 LOC144501
    NM_003112.3 SP4
    NM_152363.2 ANKRD41
    RefSeq Genname
    NM_013267.2 glutaminase 2 (liver, mitochondrial) (GLS2), nuclear gene encoding mitochondrial protein
    NM_021727.3 fatty acid desaturase 3 (FADS3)
    NM_006730.2 deoxyribonuclease I-like 1 (DNASE1L1), transcript variant 1
    NM_007171.2 protein-O-mannosyltransferase 1 (POMT1)
    NM_014905.2 glutaminase (GLS)
    NM_017811.3 ubiquitin-conjugating enzyme E2R 2 (UBE2R2)
    NM_030794.1 tudor domain containing 3 (TDRD3)
    NM_199162.1 ADP-ribosylhydrolase like 1 (ADPRHL1), transcript variant 2
    NM_033625.1 ribosomal protein L34 (RPL34), transcript variant 2
    NM_001030004.1 hepatocyte nuclear factor 4, alpha (HNF4A), transcript variant 6
    NM_003124.3 sepiapterin reductase (7,8-dihydrobiopterin:NADP + oxidoreductase) (SPR)
    NM_015528.1 ring finger protein 167 (RNF167)
    NM_017750.2 retinol saturase (all-trans-retinol 13,14-reductase) (RETSAT)
    NM_152490.1 beta-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase 2 (B3GALNT2)
    NM_024592.1 steroid 5 alpha-reductase 2-like (SRD5A2L)
    NM_001008216.1 UDP-galactose-4-epimerase (GALE), transcript variant 2
    NM_001807.2 carboxyl ester lipase (bile salt-stimulated lipase) (CEL)
    NM_182796.1 methionine adenosyltransferase II, beta (MAT2B), transcript variant 2
    NM_015654.3 N-acetyltransferase 9 (GCN5-related, putative) (NAT9)
    NM_000419.2 integrin, alpha 2b (platelet glycoprotein IIb of IIb/IIIa complex, antigen CD41B) (ITGA2B)
    NM_014422.2 phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate 5-phosphatase, A (PIB5PA), transcript variant 1
    NM_001699.3 AXL receptor tyrosine kinase (AXL), transcript variant 2
    NM_003272.1 G protein-coupled receptor 137B (GPR137B)
    NM_000675.3 adenosine A2a receptor (ADORA2A)
    NM_001003809.1 discs, large (Drosophila) homolog-associated protein 1 (DLGAP1), transcript variant beta
    NM_198150.1 arylsulfatase K (ARSK)
    NM_006270.2 related RAS viral (r-ras) oncogene homolog (RRAS)
    NM_005881.1 branched chain ketoacid dehydrogenase kinase (BCKDK)
    NM_001505.1 G protein-coupled receptor 30 (GPR30), transcript variant 2
    NM_015257.1 transmembrane protein 194 (TMEM194)
    NM_016086.2 serine/threonine/tyrosine interacting-like 1 (STYXL1)
    NM_006818.3 myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 11 (MLLT11)
    NM_017664.2 ankyrin repeat domain 10 (ANKRD10)
    NM_018045.4 BSD domain containing 1 (BSDC1)
    NM_003603.4 sorbin and SH3 domain containing 2 (SORBS2), transcript variant 1
    NM_152499.1 coiled-coil domain containing 24 (CCDC24)
    NM_018962.1 Down syndrome critical region gene 6 (DSCR6)
    NM_004099.4 stomatin (STOM), transcript variant 1
    NM_019118.2 chromosome 1 open reading frame 91 (C1orf91)
    NM_138340.3 abhydrolase domain containing 3 (ABHD3)
    NM_017565.2 family with sequence similarity 20, member A (FAM20A)
    NM_022753.2 S100P binding protein (S100PBP), transcript variant 1
    NM_182507.1 hypothetical protein LOC144501 (LOC144501)
    NM_003112.3 Sp4 transcription factor (SP4)
    NM_152363.2 ankyrin repeat domain 41 (ANKRD41)
    RefSeq Cyclophosphamid1
    48 h
    - - +S9 +S9
    25 μM 50 μM 25 μM 50 μM
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    NM_003112.3 1,20 1,03 –1,12 –1,32
    NM_152363.2 1,06 1,01 –1,10 –1,13
    RefSeq Aflatoxin B1 1
    48 h
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    48 h
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    RefSeq Metformin1 Theophyllin1 DMSO1
    48 h 48 h 48 h
    - +S9 - +S9 +S9
    1 mM 100 μM 0,2%
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    RefSeq Theophyllin2 MMS2 Actinomycin D2
    24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h
    - - -
    100 μM 500 μM 250 nM
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    NM_021727.3 1,04 1,04 1,67 2,10 1,49 1,62
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    NM_007171.2 –1,01 –1,00 1,20 1,33 1,72 1,51
    NM_014905.2 –1,11 –1,06 1,44 2,08 1,42 1,03
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    NM_030794.1 –1,01 –1,03 –1,12 –1,18 –1,20 –1,17
    NM_199162.1 –1,03 1,01 1,03 1,24 1,22 1,10
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    NM_001030004.1 1,16 1,08 –1,54 –1,44 –1,08 –1,16
    NM_003124.3 1,01 1,08 1,66 1,60 1,37 1,29
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    NM_017750.2 1,08 –1,07 1,83 1,39 2,61 1,90
    NM_152490.1 –1,01 1,09 1,35 1,45 1,26 1,48
    NM_024592.1 1,10 1,01 –1,26 –1,27 –1,01 –1,04
    NM_001008216.1 –1,03 1,09 –1,11 –1,08 –1,07 –1,03
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    NM_003272.1 –1,02 –1,03 1,33 1,55 2,09 1,96
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    NM_006270.2 –1,13 1,19 1,02 1,38 1,88 2,18
    NM_005881.1 –1,06 –1,02 1,34 1,33 1,29 1,40
    NM_001505.1 –1,05 1,03 –1,46 –1,18 –1,36 –1,21
    NM_015257.1 1,03 1,02 1,45 1,16 1,24 1,16
    NM_016086.2 1,07 1,00 1,18 1,21 1,45 1,26
    NM_006818.3 –1,14 –1,07 1,42 1,73 1,55 1,42
    NM_017664.2 1,00 –1,11 –1,39 –1,39 1,00 –1,17
    NM_018045.4 1,03 –1,07 1,44 1,53 1,72 1,14
    NM_003603.4 –1,01 1,06 –1,10 1,02 –1,06 1,00
    NM_152499.1 –1,06 1,04 1,02 1,25 1,24 1,36
    NM_018962.1 –1,07 1,04 1,30 –1,02 1,92 1,77
    NM_004099.4 1,06 –1,14 3,61 2,84 2,10 1,51
    NM_019118.2 –1,07 –1,12 1,51 1,90 1,25 1,39
    NM_138340.3 1,01 1,05 1,49 1,24 2,56 2,07
    NM_017565.2 1,14 –1,01 –1,51 –1,55 –1,27 –1,25
    NM_022753.2 –1,02 1,03 –1,14 –1,08 –1,19 –1,19
    NM_182507.1 1,04 –1,05 2,12 1,56 1,32 1,69
    NM_003112.3 1,10 –1,02 –1,27 –1,30 –1,44 –1,30
    NM_152363.2 1,04 1,02 –1,00 –1,01 –1,05 –1,11
    RefSeq Etoposid2
    24h 48h
    -
    500 nM Rang3 Regulation4
    NM_013267.2 1,36 1,81 1 hoch
    NM_021727.3 1,39 1,95 6 hoch
    NM_006730.2 1,08 1,27 20 hoch
    NM_007171.2 1,06 1,21 23 hoch
    NM_014905.2 1,15 1,38 30 hoch
    NM_017811.3 –1,06 –1,10 32 herunter
    NM_030794.1 –1,10 –1,39 33 herunter
    NM_199162.1 1,04 1,24 42 hoch
    NM_033625.1 1,21 1,31 43 hoch
    NM_001030004.1 –1,14 –1,18 57 herunter
    NM_003124.3 1,07 1,04 59 hoch
    NM_015528.1 1,04 1,13 62 hoch
    NM_017750.2 1,34 1,58 67 hoch
    NM_152490.1 1,03 1,17 70 hoch
    NM_024592.1 –1,04 –1,25 72 hoch
    NM_001008216.1 –1,05 –1,06 79 hoch
    NM_001807.2 2,77 11,61 80 hoch
    NM_182796.1 –1,05 –1,02 82 hoch
    NM_015654.3 1,12 1,32 86 hoch
    NM_000419.2 1,31 2,00 5 hoch
    NM_014422.2 1,19 1,40 8 hoch
    NM_001699.3 1,08 1,59 16 hoch
    NM_003272.1 1,17 1,33 31 hoch
    NM_000675.3 –1,25 –1,33 34 herunter
    NM_001003809.1 1,04 1,07 50 hoch
    NM_198150.1 –1,14 –1,08 69 herunter
    NM_006270.2 1,09 1,70 75 hoch
    NM_005881.1 1,06 1,20 81 hoch
    NM_001505.1 –1,06 –1,14 83 herunter
    NM_015257.1 1,25 1,19 3 hoch
    NM_016086.2 1,24 1,35 12 hoch
    NM_006818.3 1,06 1,21 13 hoch
    NM_017664.2 –1,25 –1,62 27 herunter
    NM_018045.4 1,10 1,09 38 hoch
    NM_003603.4 1,02 –1,02 39 herunter
    NM_152499.1 1,09 1,34 44 hoch
    NM_018962.1 1,18 1,79 45 hoch
    NM_004099.4 1,48 2,02 47 hoch
    NM_019118.2 1,14 1,16 52 hoch
    NM_138340.3 1,23 1,22 55 hoch
    NM_017565.2 –1,06 –1,25 58 herunter
    NM_022753.2 –1,09 –1,09 74 herunter
    NM_182507.1 1,39 1,93 88 hoch
    NM_003112.3 –1,02 –1,22 89 herunter
    NM_152363.2 –1,04 –1,10 91 hoch
  • Anhang 12: Abbildungen
  • : Übersicht über den Arbeitsablauf zur Integration von Omics-Technologien in die toxikologische Praxis. [Abb. modifiziert nach 7]
  • : Stufenmodell der chemischen Kanzerogenese. [Abb. modifiziert nach 22]
  • : Angriffspunkte für die Bildung kovalenter Bindungen zwischen Elektrophilen, Nukleophilen und DNA-Basen. HE = hartes Elektrophil, WE = Weiches Elektrophil, N = Nukleophil. [Abb. modifiziert nach 1, 24]
  • : Mechanismus der DNA-Alkylierung durch Methylmethansulfonat (MMS). MMS alkyliert Guanosin der DNA am N7 oder N3 und führt zur Entstehung von Methylguanosin [31, 32]. Die Methylierung des Guanosin begünstigt die Spaltung der N-glykosidischen Bindung durch ein nukleophiles Reagenz und kann somit zu AP-Läsionen führen [32].
  • : Struktur des Actinomycin D und Interkalation in GC-reiche Regionen der DNA. Actinomycin D besteht aus zwei Peptidlactonringsystemen, welche über eine Phenoxazineinheit miteinander verbunden sind. Die rechte Abbildung zeigt ein Kugel-Stab-Modell der DNA komplexiert mit zwei Actinomycin D-Molekülen (gelb und grün) mit Blick von der kleinen Furche. Der Phenoxazonring bindet zwischen den beiden GpC-Einheiten, so dass die zyklischen Pentapeptiddomänen in der kleinen Furche liegen. [Abb. modifiziert nach 33]
  • : Struktur und Wirkungsmechanismus von Etoposid (ETO). Das Glycosidderivat ETO hemmt den katalytischen Zyklus von Typ II-Topoisomerasen nachdem die DNA bereits aufgespalten, aber noch nicht wieder ligiert ist. Dadurch generiert ETO einen DNA-Schaden und führt zur Beeinträchtigung von Transkription und DNA-Replikation. [Abb. modifiziert nach 41]
  • : Feinbau der Leber. A Querschnitt durch ein Leberläppchen. Das Blut fließt von der Peripherie über die Sinusoide in die Zentralvene (Pfeil violett), während die Galle in umgekehrter Richtung fließt (Pfeil grün). Legende: 1 Äste der Vena portae, 2 Äste der Arteria hepatica, 3 Gallengang, 4 Grenzplatte, 5 Zentralvene, 6 Leberbalken, 7 Sinusoide. B Vergrößerter Ausschnitt eines Leberbalkenabschnittes mit umgebenden Sinusoiden. Legende: 1 Itozellen mit Fettvakuolen, 2 sinusoidaler Raum, 3 Disse'scher Raum, 4 Gallenkanälchen, 5 Hepatozyt, 6 Tight Junction, 7 Kupffer-Zellen, 8 Endothel [47].
  • : Cytochrom-P450 Mechanismus. (I) Bindung des Substrats im aktiven Zentrum des Enzyms (orange). Anschließend wird das Eisen der Hämgruppe im Enzym durch Übertragung eines Elektrons, welches vom NADPH stammt, von der Ferri-(Fe3+) zur Ferroform (Fe2+) reduziert (II). Nach der Bindung von molekularem Sauerstoff an die Hämgruppe (III) folgt die Aufnahme eines zweiten Elektrons (IV) und daraufhin die Spaltung der O-O-Bindung unter Freisetzung von Wasser (V). (VI) Das verbleibende Sauerstoffatom bildet ein hochreaktives Fe = O–, welches zur Abspaltung eines Wasserstoffatoms aus dem Substrat führt. Das entstandene instabile Substratradikal übernimmt dann die Eisen-gebundene OH-Gruppe. Das Eisenatom liegt nach dieser Reaktion wieder in der Ferriform vor. [Abb. modifiziert nach 54]
  • : Cytochrom-P450-abhängige Metabolisierung von 7,12-Dimethylbenz[a]-anthracen (DMBA). [Abb. modifiziert nach 59]
  • : Metabolische Aktivierung und DNA-Reaktivität des Aflatoxin B1. [Abb. modifiziert nach 52]
  • : Metabolische Aktivierung von Cyclophosphamid (CPA) und Mechanismus der DNA-Schädigung durch das Senfgas(Lost)-Zwischenprodukt. [Abb. modifiziert nach 56, 65]
  • : Metabolische Aktivierung des Prokanzerogens Diethylnitrosamin (DEN) und DNA-Reaktivität des gebildeten Carbeniumions. [Abb. modifiziert nach 70, 71]
  • : Rückmutationstest in Bakterien zur Mutagenitätstestung. Für die Testung werden zwei verschiedene Salmonella Bakterienkulturen, welche die Fähigkeit zur Histidinsynthese verloren haben, angesetzt. Die Testprobe bekommt zusätzlich zum Rattenleberextrakt zur metabolischen Aktivierung die mutagene Testsubstanz zugesetzt. Zur Kontrollprobe werden ausschließlich der Rattenleberextrakt und das Lösungsmittel der Substanz zugegeben. Beide Probenansätze werden anschließend auf einem Histidin-Minimalgar ausplattiert und über einen definierten Zeitraum von 2–3 Tagen bei 37°C inkubiert. Nur Bakterien, welche eine Rückmutation im Histidingen erfahren und somit selbst wieder die essentielle Aminosäure Histidin produzieren, können auf dem Minimalagar wachsen. Nach der Inkubationsphase wird die Kolonienzahl zwischen der Testplatte und der Kontrollplatte verglichen. Während die Kontrolle nur einige spontane rückmutierte Kolonien zeigt, kann bei der mutagenen Testsubstanz ein Anstieg in der Kolonienzahl verzeichnet werden. Die Kolonienzahl korreliert dabei mit der verwendeten Konzentration der mutagenen Testsubstanz. [Abb. modifiziert nach 78]
  • : Problematik der Dosis-Extrapolation von Daten aus Kanzerogenitätsstudien an Nagern. Aufgrund des experimentellen Designs, lässt sich der reale Kurvenverlauf im Niedrigdosisbereich (grau), der für die menschliche Exposition relevant ist, nicht ermitteln. Die Grafik zeigt verschiedene mögliche Kurvenverläufe für die Extrapolation der Daten. [Abb. modifiziert nach 1]
  • : Vorschlag zur Vorgehensweise für die Risikobewertung und Kategorisierung von Kanzerogenen. Das gezeigte Flussdiagramm ist ein Vorschlag zur modernen Risikobewertung von Streffer et al. (2004). Nach dieser „neuen” Vorgehensweise werden Kanzerogene in vier verschiedene Gruppen unterteilt und in Abhängigkeit von der Gruppenzuordnung entweder nach dem klassischen NOAEL-Prinzip oder mittels numerischer Risikoabschätzung bewertet. Abkürzungen: Linear-No-Threshold (LNT), No Observed Adverse Effect Level (NOAEL). [Abb. modifiziert nach 120, 122]
  • : Das Lab-on-a-Chip-Prinzip. Die Abbildung zeigt einen RNA Nano Lab-Chip (A) und seinen inneren Aufbau mit dem Kanalsystem (B). Das Messprinzip (C) basiert auf einer elektrophoretischen Auftrennung der Proben und dem Nachweis mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes. [Abb. modifiziert nach 145, 146, 147]
  • : Elektropherogramme von Gesamt-RNA (C), cRNA (D), cDNA (E) und den zugehörigen RNA-Leitern (A/B) aufgenommen mit dem Agilent Bioanalyzer.
  • : RNA Integritätskategorien. Die Abbildung zeigt die verschiedenen RNA-Integritätskategorien von 1 (vollständig degradiert) bis 10 (intakt) mit den entsprechenden Beispielelektropherogrammen. Mit abnehmender Qualität kommt es zu einer Verschiebung zu kürzeren Fragmentgrößen. [Abb. modifiziert nach 150]
  • : TaqManTM low density arrays und das TaqManTM PCR-Prinzip. Die Abbildung zeigt schematisch die Reaktion, welche in den Mikrowells einer TLDA-Karte stattfindet: I Anlagerung der beiden PCR Primer (Forward und Reverse) und der sequenz-spezifischen TaqManTM-Sonde an die spezifische Target-cDNA der Probe. II Primerverlängerung durch die Taq DNA-Polymerase (gelb) unter Hydrolyse der fluorogenen Sonde. III Synthese des PCR Produktes und Separation von Reporter und Quencher. Das detektierte Fluoreszenzsignal wächst in Anhängigkeit der freigesetzten Reportermoleküle an. [Abb. modifiziert nach 155, 156]
  • : Aufbau (A) und Herstellungsverfahren (B) der Illumina Sentrix® BeadChips. [Abb. modifiziert nach 159, 161]
  • : Probenvorbereitung und Hybridisierung der Illumina BeadChips.
  • : Dealkylierung von 7-Ethoxyresorufin durch CYP1A.
  • : Reaktionsschema des CYP450 GloTM-Tests für die Bestimmung der CYP3A4-Aktivität in Zellen. [Abb. modifiziert nach 169]
  • : Luciferase-Nachweisreaktion des CellTiter-Glo® Tests zur Bestimmung der Zellviabilität. [Abb. modifiziert nach 170]
  • : Prinzip des TransAMTM P53 ELISA. [Abb. modifiziert nach 174]
  • : Prinzip der Supportvektormaschinen. (A) Die Daten des Eingaberaums werden für die Trennung entsprechend hochdimensional verarbeitet in einem Funktionsraum dargestellt. (B) Drei Stützvektoren (grün) bestimmen die Lage und Breite der separierenden Hyperebene. [Abb. modifiziert nach 196]
  • : Selektion der informativsten Gene für die Klassfikation mittels Ranking. [Abb. modifiziert nach 198]
  • : Hauptkomponentenanalyse (PCA) des globalen Datensatzes aus den Microarrayexperimenten mit gentoxischen Verbindungen. Die PCA zeigt den Datensatz im dreidimensionalen Raum aufgetrennt nach drei Haupteigenschaften innerhalb der Genregulationen des Datensatzes. Für die Illumina-Microarrayanalysen wurden HepG2-Zellen mit den gentoxischen Substanzen Methylmethansulfonat (MMS), Etoposid (ETO) und Actinomycin D (ACT) behandelt. DMSO (0,5% v/v) diente als Lösungsmittelkontrolle und Theophyllin (THEO) als Negativsubstanz. Die verwendeten Behandlungskonzentrationen lagen bei 500 μM (niedrige Dosis = nd) und 2 mM (hohe Dosis = hd) für MMS, 500 nM für ETO, 250 nM für ACT und 100 μM für THEO. Die Behandlung erfolgte täglich und die Zellen wurden nach 6 h, 24 h und 48 h geerntet bevor die Genexpressionsänderungen quantifiziert worden. Die Rohdaten wurden vor der Hauptkomponentenanalyse mit der LOWESS-Regression normalisiert. [Abb. modifiziert nach Genedata's Expressionist® Analyst, Basel/Schweiz]
  • : Gen-Funktions-Darstellung der putativen Markergene für gentoxische Verbindungen in HepG2-Zellen. Die Darstellung zeigt die Genregulation und Funktion der Gene, welche nach 48 h bei den getesteten genotoxischen Verbindungen Actinomycin D (ACT), Methylmethansulfonat (MMS) und Etoposid (ETO) signifikant (ANOVA p-/BH-q-Wert < 0,01) mehr als 1,5-fach hoch-(rot) bzw. herunterreguliert (grün) waren. Die verwendeten Behandlungskonzentrationen lagen für ETO bei 500 nM, für MMS bei 500 μM (niedrige Dosis = nd) und 2 mM (hohe Dosis = hd) und für ACT bei 250 nM. 100 μM Theophyllin (THEO) diente als Negativkontrolle. Die Behandlung erfolgte täglich über 6 h, 24 h und 48 h bevor die Genexpressionsveränderungen mittels Illumina-Microarrays untersucht worden. [Abb. modifiziert nach Genedata's Expressionist® Analyst, Basel/Schweiz]
  • : P53-Induktion in HepG2-Zellen nach Behandlung mit genotoxischen Verbindungen und Kontrollverbindungen. Die HepG2-Zellen wurden täglich entweder mit den genotoxischen Substanzen Actinomycin D (ACT), Methylmethansulfonat (MMS) und Etoposid (ETO) sowie der Kontrollverbindung Theophyllin (THEO) behandelt. Die P53-Induktion wurde 24 h (hellgrau) und 48 h (dunkelgrau) nach Beginn der ersten Behandlung mit dem TransAMTM P53 Transkriptionsfaktortest (ActiveMotif) gemessen. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25 (siehe Anhang 1). * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart), p-Wert < 0,05
  • : Potentielle Mechanismen der P53-Induktion durch genotoxische Verbindungen. Die Akkumulation von P53 infolge eines Methylmethansulfonat(MMS)-induzierten DNA-Schadens führt wahrscheinlich über Komponenten der Basenexzisionsreparatur (BER) bzw. über die Inhibition von des P53-Inhibitors APAK durch ATM- und Checkpoint-Kinasen, welche durch die Schädigung aktiviert werden. Der zuletzt genannte Mechanismus wird neben der Topoisomerase II (TOPO2)-Inhibition auch für die Etoposid(ETO)-vermittelte P53-Induktion postuliert. Die P53-Anreicherung durch Actinomycin D (ACT) wird hingegen vorwiegend über die Inhibition der RNA-Polymerase II realisiert. Zusätzlich spielt wahrscheinlich auch die Inhibition der TOPO2 sowie die Expression einer nicht-funktionellen Mdm2-Variante für die P53-Aktivierung eine Rolle. Die Pfeile indizieren die Regulation der entsprechenden Gene in den Illumina-Microarraystudien (rot = Hochregulation ≥ 1,5 und grün = Herunterregulation ≤ –1,5) (siehe Anhang 2).
  • : Basale Expression von Genen des Fremdstoffmetabolismus in HepG2 im Vergleich zu humanen Hepatozyten (HH). Die Expression von Genen, involviert in verschiedene Phasen des Fremdstoffmetabolismus, wurde mit TaqManTM low density arrays gemessen. (A) Regulation der Gene in HepG2 bezogen auf die Expression in HH. Als Bezugsgen für die Berechnung der Deregulationswerte wurde der Housekeeper PPIA verwendet. Zum Vergleich wurden interne bereits publizierte HH-Daten herangezogen [158, 224]. Hochregulierte Gene in HepG2 gegenüber HH (≥ 10) sind in rot und geringer regulierte Gene (≤ –10) in grün dargestellt. (B) Genregulation in HH von Genen, welche bei HepG2 nicht detektiert (n. d.) werden konnten. Die Expressionswerte für die HH ähnlich oder etwas schwächer als das Referenzgen PPIA sind mit ++ (dunkelgrün) gekennzeichnet. Hingegen bedeutet + (hellgrün) eine schwächere Expression gegenüber dem Referenzgen. Die Expressionswerte sind in Anhang 4 zusammengestellt. [Abb. modifiziert nach Genedata's Expressionist® Analyst, Genedata AG, Basel/Schweiz]
  • : Expression von Genen des Fremdstoffmetabolismus in HepG2 und humanen Hepatozyten (HH) nach Behandlung mit verschiedenen Induktoren. Die Expression von Genen, involviert in verschiedene Phasen des Fremdstoffmetabolismus, wurde mittels TLDA-Karten gemessen. Die HepG2-Zellen und HH der Donoren (D) 1–3 wurden mit verschiedenen Konzentrationen der Induktoren Phenobarbital (PB), 3-Methylcholanthren (3-MC) und Rifampicin (RIF) täglich über 72 h behandelt. Die HH-Daten für den Vergleich stammen von Kollagen-Monolayerkulturen und sind interne bereits publizierte Daten [158, 224]. Hochregulierte Gene (≥ 1,5-fach) sind in rot und herunterregulierte Gene (≤ –1,5-fach) in grün dargestellt. Die Deregulationswerte sind in Anhang 5 (HepG2-Zellen) und Anhang 6 (HH) zusammengestellt. [Abb. modifiziert nach Genedata's Expressionist® Analyst, Genedata AG, Basel/Schweiz]
  • : Induktion der CYP1A-Aktivität durch 3-Methylcholanthren (3-MC). Die CYP1A-Aktivität wurde nach täglicher Behandlung der HepG2-Zellen mit dem CYP1A-Induktor 3-MC über 72 h mit dem EROD-Test bestimmt. Bei diesem Test wird der Umsatz des CYP1A-Substrates Ethoxyresorufin zeitabhängig gemessen wurde. Die Aktivitätswerte wurden auf die Zellviabilität normalisiert und anschließend die Induktion gegenüber der Kontrolle ermittelt. Die Mittelwerte ± Standardabweichung der biologischen Replikate wurden für die verwendeten Konzentrationen des 3-MC aufgetragen. * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart), p-Wert < 0,05
  • : Induktion der CYP3A4-Aktivität durch Rifampicin (RIF) in HepG2. Die Zellen wurden täglich über einen Zeitraum von 72 h mit dem Induktor behandelt. Die Messung der CYP3A4-Aktivität erfolgte anschließend mit dem CYP3A4-GloTM-Test von Promega. Die Aktivitätswerte wurden auf die Zellviabilität normalisiert und anschließend die Induktion gegenüber der Lösungsmittelkontrolle ermittelt. Die Mittelwerte ± Standardabweichung der biologischen Replikate wurden gegen die verwendeten Induktorkonzentrationen aufgetragen. * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart), p-Wert < 0,05.
  • : Zellviabilitätsuntersuchungen in HepG2-Zellen mit verschiedenen progenotoxischen Verbindungen. Die HepG2-Zellen wurden für die Experimente mit verschiedenen Konzentrationen der progenotoxischen Substanzen Cyclophosphamid (CPA) (A), Aflatoxin B1 (AFB1) (B), 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) (C) oder Diethylnitrosamin (DEN) (D) mit und ohne metabolisches Aktivierungssystem (MAS: Phenobarbital/β-Naphthoflavoninduzierter S9) täglich für 6 h behandelt. Die Zellviabilität wurde 48 h nach Beginn der ersten Behandlung mit dem CellTiter-Glo®-Test von Promega bestimmt. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte ± Standardabweichung in % gegenüber der DMSO-Kontrolle aus vier verschiedenen technischen Replikaten.
  • : P53-Induktion in HepG2-Zellen durch Kontrollverbindungen. Die HepG2-Zellen wurden täglich entweder mit den nicht-genotoxischen Substanzen Metformin (MET), Theophyllin (THEO) und Ketokonazol (KETO) oder dem genotoxischen Actinomycin D (ACT) behandelt. Die P53-Induktion wurde 48 h nach Beginn der ersten Behandlung mit dem TransAMTM P53 Transkriptionsfaktortest (ActiveMotif) gemessen. Für die Positivkontrolle Actinomycin konnte ein starker signifikanter Anstieg an aktivem P53-Protein gegenüber der Lösungsmittelkontrolle (0,2% DMSO) verzeichnet werden. Hingegen zeigten alle anderen nicht-genotoxischen Testsubstanzen keine P53-Aktivierung. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25 (siehe Anhang 7). * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart), p-Wert < 0,05
  • : P53-Induktion in HepG2-Zellen nach Behandlung mit Cyclophosphamid (CPA) (A), Diethylnitrosamin (DEN) (B), Aflatoxin B1 (AFB1) (C), und 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) (D). Die HepG2-Zellen wurden mit den progenotoxischen Substanzen mit (dunkelgraue Balken) und ohne (hellgraue Balken) metabolisches Aktivierungssystem (MAS: Phenobarbital/β-Naphthoflavon-induzierter S9) täglich für 6 h behandelt. Die P53-Induktion wurde 48 h nach Beginn der ersten Behandlung bestimmt. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25 (siehe Anhang 7). * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart), p-Wert < 0,05
  • : HepG2-Zellviabilität nach Behandlung mit den Cytochrom-P450-(CYP)-Inhibitoren α-Naphthoflavon (α-NF) und Ketokonazol (KETO). Die Zellen wurden für die Experimente mit den CYP-Inhibitoren α-NF und KETO täglich über 48 h behandelt. Die Messung der Zellviabilität erfolgte luminometrisch mit dem CellTiter-Glo®-Test von Promega. Die Mittelwerte der Zellviabilität ± Standardabweichung wurden aus den vier technischen Replikaten ermittelt und sind prozentual zur Lösungsmittelkontrolle (0,2% DMSO) dargestellt.
  • : P53-Induktion in HepG2-Zellen nach Behandlung mit Aflatoxin B1 (AFB1) und 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) in Kombination mit verschiedenen Cytochrom-P450(CYP)-Inhibitoren. Die Zellen wurden mit AFB 1 (A) oder DMBA (B) in Kombination mit den CYP-Inhibitoren α-Naphthoflavon (α-NF) oder Ketokonazol (KETO) behandelt. Vor den Behandlungen mit den Prokanzerogenen wurden die Zellen mit dem jeweiligen Inhibitor für 30 min vorinkubiert. Die Behandlung mit AFB1 und DMBA mit und ohne Inhibitor wurde anschließend über 6 h durchgeführt. Danach wurden die Zellen gewaschen und das Behandlungsmedium durch ein Medium, das ausschließlich den Inhibitor oder das Lösungsmittel (DMSO 0,2%) enthielt, ersetzt. Die Behandlungsprozedur wurde täglich wiederholt und die P53-Induktion 48 h nach Beginn der ersten Behandlung gemessen. Die dargestellten Daten sind die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei verschiedenen Experimenten mit Zellpassagen zwischen 3 und 25 (siehe Anhang 8). * Signifikanz im Student's T-Test (zweiseitig, gepaart) gegenüber der Lösungsmittelkontrolle, p-Wert < 0,05. § Signifikanz der Behandlungen AFB1/DMBA mit Inhibitor gegenüber der entsprechenden Behandlung mit den Prokanzerogenen ohne Inhibitor zum Level α = 0,05 in einer ANOVA mit posthoc Tukey Test.
  • : Hauptkomponentenanalyse des globalen Genexpressionsdatensatzes mit progenotoxischen Verbindungen. Die HepG2-Zellen wurden mit den progenotoxischen Verbindungen 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen, Diethylnitrosamin, Cyclophosphamid und Aflatoxin B1 sowie Theophyllin und Metformin als Kontrollen für 24 h und 48 h mit und ohne metabolisches Aktivierungssystem (MAS: Phenobarbital/β-Naphthoflavon-induzierter Rattenleber S9) behandelt. Die Experimente wurden mit drei verschiedenen Zellpassagen wiederholt und die Genexpressionsveränderungen mit Illumina Human Ref-8 BeadChip Arrays erfasst. Die Daten wurden vor der Hauptkomponentenanalyse auf einen gemeinsamen Median von 100 (Intensitätswert) normalisiert. Dargestellt ist der Einfluss der verschiedenen Zellpassagen (A), Behandlungszeiten (B) und des metabolischen Aktivierungssystems (C) auf die Datenverteilung. (D) Zeit- und MAS-abhängige Datenverteilung nach Pointwise Division(PWD)-Normalisierung, d. h. der einzelnen Proben auf die jeweilige S9-/DMSO-Kontrolle des gleichen Experimentes/der gleichen Zellpassage. [Abb. Modifiziert nach Genedata, Basel/Schweiz]
  • : Charakteristische Genregulationen der progenotoxischen Verbindungen und Einteilung dieser Gene in verschiedene Funktionskategorien. Die HepG2-Zellen wurden mit 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), Diethylnitrosamin (DEN), Cyclophosphamid (CPA) und Aflatoxin B1 (AFB1) sowie den Kontrollen Theophyllin (THEO) und Metformin (MET) für 48 h mit und ohne metabolisches Aktivierungssystem (β-Naphthoflavon/Phenobarbital-induzierter S9) behandelt. Die Experimente wurden mit drei verschiedenen Zellpassagen unabhängig voneinander wiederholt und die Genexpressionsveränderungen mit Illumina Human Ref-8 BeadChip Arrays quantifiziert. (A) HeatMap der relativen Expressionswerte von 88 Genen aus einer ANOVA (p-Wert < 0,01/BH-q-Wert < 0,3) mit anschließendem Filtern (Deregulationsgrenzwert 1,5 in mindestens 40% der Proben mit einer positiven genotoxischen Antwort) ermittelt gegenüber den jeweiligen Lösungsmittelkontrollen +/–S9. Hochregulierte Gene sind in rot (≥ 1,5-fach) und herunterregulierte Gene in grün (≤ –1,5-fach) dargestellt. Die Einteilung des Regulationsbalkens entspricht einer logarithmischen Skalierung. (B) Einordnung der Gene nach Funktionen mit Hilfe der Datenbanken von MetaCoreTM (GeneGo, St. Joseph/USA) und ToxWiz (Cambridge Cell Networks, Cambridge/UK). (C) Deregulierte Gene, welche direkt mit der Funktion des P53-Transkriptionsfaktors assoziiert werden und tabellarische Zusammenstellung von deregulierten Gene innerhalb der gesamten P53-Signalkaskade. Die Regulationsbalken zeigen die Deregulationswerte in den verschiedenen Behandlungen in der analogen Reihenfolge wie in der HeatMap-Beschriftung. [Abb. modifiziert nach Genedata's Expressionist® Analyst (A) und ToxWiz (C)]
  • : Hauptkomponentenanalyse des globalen Datensatzes der Trainingsproben. Für die Hauptkomponentenanalyse wurden speziell selektierte Proben der Genexpressionsdatensätze genotoxischer und progenotoxischer Verbindungen herangezogen: Repräsentativ für die genotoxischen Verbindungen wurden die Proben Actinomycin D (ACT, 250 nM), Methylmethansulfonat (MMS, 2 mM) und Etoposid (ETO 500 nM) zu den Behandlungszeitpunkte 24 h und 48 h verwendet. Hingegen wurde von den progenotoxischen Proben nur der 48 h-Zeitpunkt von 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA, 10 μM +/– S9 und 75 μM – S9), Cyclophosphamid (CPA, 25 μM und 50 μM +/– S9) und Aflatoxin B1 (AFB1, 0,5 μM und 1 μM +/– S9 und 10 μM – S9) mit einbezogen. Dabei wurden jedoch CPA – S9 sowie AFB1 0,5 μM – S9 und DMBA 10 μM – S9 aufgrund der extrem schwachen Genexpressionsantwort als nicht-genotoxisch eingestuft. Theophyllin (THEO), Metformin (MET) und die S9-Kontrolle wurden ebenfalls der Kontrollgruppe (nicht-genotoxisch) zugeordnet. Die Illumina-Daten wurden vor der Hauptkomponentenanalyse Median normalisiert und die Mittelwerte der Deregulationswerte für die drei verschiedenen Zellpassagen der einzelnen Behandlungsgruppen gegen die jeweiligen Kontrollgruppen gebildet. Für die statistische Datenanalyse wurde die Software Expressionist® Analyst von Genedata (Basel/Schweiz) verwendet. (A) Hauptkomponentenanalyse mit der gesamten Trainingsgruppe. (B) Die Hauptkomponentenanalyse ohne die Proben ACT und MMS zeigt, dass eine Separation (grüne imaginäre Trennlinie) zwischen gentoxischen und nicht-genotoxischen Proben im dreidimensionalen Raum möglich ist.
  • : Ranking mit dem Trainingsdatensatz zur Evaluierung eines zweckmäßigen Klassifikationsalgorithmus und der am besten geeigneten Gene für die Substanzklassifizierung. Für das Ranking wurde eine Trainingsgruppe mit speziell selektierten Proben der Genexpressionsdatensätze genotoxischer und progenotoxische Verbindungen herangezogen: Repräsentativ für die gentoxischen Verbindungen wurden die Proben Actinomycin D, Methylmethansulfonat und Etoposid zu den Behandlungszeitpunkte 24 h und 48 h verwendet. Hingegen wurde von den progenotoxischen Proben nur der 48 h-Zeitpunkt von 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), Cyclophosphamid (CPA) und Aflatoxin B1 (AFB1) mit einbezogen. Dabei wurden jedoch CPA – S9 sowie AFB1 0,5 μM – S9 und DMBA 10 μM – S9 aufgrund der extrem schwachen Genexpressionsantwort als nicht-genotoxisch eingestuft. Theophyllin, Metformin und die S9-Kontrolle wurden ebenfalls der Kontrollgruppe (nicht-genotoxisch) zugeordnet. Als Rankingmethode wurde die ANOVA verwendet und diese in Kombination mit drei verschiedenen Klassifikationsalgorithmen (Support Vector Machine (SVM, blau), K Neorest Neighbours (KNN, grün) und Sparse Linear Discriminant Analysis (rot)) getestet. Für die SVM-Methode wurde ein linearer Kernel und ein Penalty-Faktor von 10 gewählt. Bei der KNN-Methode wurde als Distanzmaß eine positive Korrelation und ein k = 4 festgelegt. Zur Berechnung der Missklassifikationsrate in Abhängigkeit von der Anzahl der einbezogenen Gene wurde eine k-fache Kreuzvalidierung (k = 10, 50 Wiederholungen) herangezogen. Die besten Missklassifikationsraten konnten mit Hilfe der SVM-Methode generiert werden, wobei die niedrigste Rate von 4,7% unter Verwendung von 91 Genen erzielt wurde. Das Ranking wurde mit Hilfe der Software Expressionist® Analyst von Genedata (Basel/Schweiz) durchgeführt.
  • : Kreuzvalidierung zur Ermittlung der Prädiktivität des SVM-Klassifikators. Zur Beurteilung der Prädiktivität des SVM-Klassifikators wurde mit dem Trainingsdatensatz, bestehend aus speziell selektierten Proben der Genexpressionsdatensätze gentoxischer und progenotoxische Verbindungen, eine Kreuzvalidierung unter Verwendung aller 24,500 Transkripte bzw. 18,600 Gene (A) oder der 91 höchstrangierten Gene aus dem Ranking (B) durchgeführt. Für die Erstellung des Klassifikators wurden die Illumina-Expressionsdaten Median normalisiert und die Mittelwerte der Deregulationswerte für die drei verschiedenen Zellpassagen der einzelnen Behandlungsgruppen gegen die jeweiligen Kontrollgruppen gebildet. Auf Basis der auf diesem Weg erhaltenen relativen Deregulationswerte wurde mit dem Support-Vektormaschinenalgorithmus (linearer Kernel, Penalty-Faktor von 10) ein Klassifikator berechnet und mit einer k-fachen Kreuzvalidierung (k = 10, 50 Wiederholungen) die Missklassifikationsrate in Abhängigkeit von der Anzahl der einbezogenen Gene bestimmt. Unter Verwendung des globalen Datensatzes lag die Missklassifikationsrate bei 8,2% (A), während sie für die Erstellung des Klassifikators mit den 91 toprangierten Genen aus dem Ranking bei nur 0,25% lag (B). [Abb. modifiziert nach Expressionist® Analyst von Genedata, Basel/Schweiz]
  • : Klassifizierung von Diethylnitrosamin (DEN). Klassifizierung von Diethylnitrosamin (DEN) als „unbekannte” Testsubstanz mit dem Klassifikator, der mit den 91 höchstrangierten Genen aus dem Ranking auf Basis eines Supportvektormaschinenalgorithmus erstellt wurde. [Abb. modifiziert nach Expressionist® Analyst von Genedata, Basel/Schweiz]
  • : Deregulierte Gene in HepG2 nach Exposition mit Diethylnitrosamin (DEN). Nach Behandlung der HepG2-Zellen mit DEN in den Dosierungen 25 mM (ND = niedrige Dosis) und 50 mM (HD = hohe Dosis) über 24 h und 48 h konnten mittels ANOVA (BH-q-Wert < 0,01) und einem anschließendem Filtern (Deregulationsgrenzwert von 1,5-fach in mindestens 40% der 48 h-DEN-Behandlungen) 145 Gene selektiert werden. (A) 88 Gene waren hoch- und 57 (B) herunterreguliert. Zur metabolischen Aktivierung wurde Phenobarbital/β-Naphthoflavon-induzierter Ratten-S9 eingesetzt. Die Farbskala beinhaltet die Gene mit einer Deregulation ≥ 1,5-fach (rot), ≥ 1,3-fach (orange), ≤ –1,5-fach (dunkelgrün), ≤ –1,3-fach (hellgrün).
  • : Gen-Funktions-Darstellung der putativen Markergene für gentoxische und progenotoxische Verbindungen in HepG2-Zellen. Die Darstellung zeigt die Genregulation gegenüber den entsprechenden Lösungsmittel-/S9-Kontrollen und Funktion der 91 putativen Markergene, welche mit Hilfe des Rankings ermittelt worden. Der Farbbalken indiziert in blau die nicht-gentoxischen Proben und in grau die gentoxischen Proben des Klassifikationsmodells. Hochregulierte Gene (≥ 1,5-fach) sind in rot und herunterregulierte Gene (≤ –1,5-fach) in grün dargestellt. Die Analyse der Illumina-Microarraydaten erfolgte mit der Software Expressionist® Analyst von Genedata (Basel/Schweiz). Legende: Theophyllin (THEO), Metformin (MET), Actinomycin D (ACT), Methylmethansulfonat (MMS), Etoposid (ETO), Aflatoxin B1 (AFB1), 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), Cyclophosphamid (CPA), Diethylnitrosamin (DEN).
  • : Ausgewählte Netzwerke der Modulation der DNA-Schadensantwort durch die (pro-)genotoxischen Testsubstanzen. (A) Wechselwirkung der genotoxischen (ACT, ETO und MMS) und progenotoxischen Testsubstanzen (AFB 1, DMBA, DEN, CPA) mit den verschiedenen Komponenten der DNA-Schadensantwort. (B) Regulatorisches Netzwerk der durch SP-Transkriptionsfaktoren vermittelten DNA-Schadensantwort. Die hervorgehobenen Komponenten zeigen die Gene aus den Illumina-Microarrayanalysen in HepG2-Zellen mit den dazugehörigen generellen Regulationstendenzen aus dem Klassifikationsmodell. Rot = hochreguliert, grün = herunterreguliert. Legende: Actinomycin D (ACT), Methylmethansulfonat (MMS), Etoposid (ETO), Aflatoxin B1 (AFB1), 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA), Cyclophosphamid (CPA), Diethylnitrosamin (DEN). [Abb. modifiziert nach Cambridge Cell Network's ToxWiz, Cambridge/UK]

Claims (16)

  1. Verfahren zum Testen von Verbindungen auf genotoxisches und/oder progenotoxisches Potential mit den folgenden Schritten: (a) Bereitstellen eines zellulären Systems, das mindestens zur Expression der Gene GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R und KIF1A befähigt ist, wobei das System aus der Gruppe von Einzelzellen, Zellkulturen, Geweben, Organen und Säugetieren oder einer Probe davon ausgewählt ist, (b) Inkubieren mindestens eines Teils des Systems mit zu testenden Verbindungen, und (c) Nachweisen des genotoxisches und/oder progenotoxisches Potential durch Genexpressionsanalyse, indem die Expression dieser Gene im System mit der Genexpression in einem Kontrollsystem verglichen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) das System mindestens zur Expression von Genen des Ranges 1 bis 32 nach Tabelle Anhang 11 befähigt ist, vorzugsweise mindestens sämtlicher 91 Gene der Tabelle Anhang 11.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei zusätzlich in Schritt (a) das System zur Expression von mindestens drei Genen der Tabelle Anhang 9 und/oder zur Expression von mindestens einem Gen der Tabelle Anhang 10 befähigt ist, vorzugsweise von mindestens einem Gen der Tabelle 3.3, wobei jeweils das zusätzliche Gen oder die zusätzlichen Gene unterschiedlich zu denen der Tabelle Anhang 11 ist/sind, und in Schritt (c) die Expression des zusätzlichen Gens oder der zusätzlichen Gene mit der Genexpression im Kontrollsystem verglichen wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei in Schritt (a) das bereitgestellte System zur Expression sämtlicher Gene der Tabellen Anhang 9, 10 und/oder 11 befähigt ist, vorzugsweise sämtlicher 91 Gene der Tabelle Anhang 11 und zusätzlich sämtlicher davon unterschiedlichen Gene der Tabellen Anhang 9 und 10.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei in Schritt (c) der Vergleich der Gene GADD45A, MAPK12 und NTHL1 im System mit der Genexpression im Kontrollsystem ausgeschlossen ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in Schritt (c) die Genexpression mit einer Intensität oder Änderung eines Signals korreliert wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in Schritt (c) das Potential durch Hochregulieren oder Herunterregulieren der Genexpression nach Tabelle Anhang 11 im Vergleich zu einer Negativkontrolle oder Positivkontrolle, oder eine ungefähr identische Genexpression im Vergleich zur Positivkontrolle, als vorhanden nachgewiesen wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei in Schritt (c) das vorhandene Potential durch differentielle Genexpressionsanalyse mit der Negativkontrolle nachgewiesen wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei in Schritt (c) die Genexpression durch Chip-Hybridierung und/oder PCR analysiert wird, vorzugsweise multiplex qPCR.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei in Schritt (a) HepG2-Zellen bereitgestellt werden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zum Testen einer therapeutischen Verbindung für einen genotoxizitätsabhängigen pathologischen Zustand, wobei in Schritt (a) ein Säugetier, vorzugsweise ein Laborsäugetier, bereitgestellt wird, in Schritt (b) die zu testende Verbindung dem Säugetier verabreicht wird, und in Schritt (c) eine therapeutische Wirkung anhand des genotoxischen Potentials in einer biologischen Probe, die dem Säugetier zu entnehmen ist, im Vergleich zu einem Kontrollsäugetier nachgewiesen wird.
  12. Verfahren zur Verlaufskontrolle physiologischer und/oder pathologischer Zustände, die durch Deregulation von Proliferation-, Differenzierungs- und/oder Zellteilungsprozessen und/oder Schadensreparatur hervorgerufen, vermittelt und/oder verbreitet werden, wobei eine wirksame Menge mindestens einer genotoxischen und/oder progenotoxischen Verbindung oder ihrer physiologisch unbedenklichen Salze einem Säugetier verabreicht wird, das eine solche Verlaufskontrolle benötigt, und mindestens die Expression der Gene GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R und KIF1A in einer biologischen Probe, die dem Säugetier zu entnehmen ist, bestimmt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Zustand aus der Gruppe von Krebs, Tumoren, Metastasen und Störungen der Angiogenese ausgewählt ist.
  14. Array zum Testen von Verbindungen auf genotoxisches und/oder progenotoxisches Potential umfassend Nukleinsäuresonden, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an die Markergene GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R und KIF1A oder Teile davon befähigt sind.
  15. Array zum Testen von Verbindungen auf genotoxisches Potential umfassend Nukleinsäuresonden, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an die Markergene der Tabelle Anhang 9 oder Teile davon befähigt sind.
  16. Array zum Testen von Verbindungen auf progenotoxisches Potential umfassend Nukleinsäuresonden, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an die Markergene der Tabelle Anhang 10 oder Teile davon befähigt sind.
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