CN102959090A - 用于表征和鉴别遗传毒性化合物的基因表达分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于筛选具有(前)遗传毒性活性的化合物的方法，所述方法包括：提供能够表达至少一组11个确定基因的细胞系统，与要筛选的化合物一起温育所述系统的至少一部分，并将所述系统中所述基因的表达与对照细胞系统中的基因表达相对比，从而检测出(前)遗传毒性活性。本发明的另一个主题涉及用于监测生理学和/或病理学状况的方法，所述状况由增殖、分化和/或损伤修复的遗传失调造成、介导和/或传播，所述方法包括：给需要这种处理的哺乳动物施用有效量的至少一种(前)遗传毒性化合物，并测定取自所述哺乳动物的生物样品中的11个确定基因的表达。本发明也涉及用于筛选具有(前)遗传毒性活性的化合物的阵列，所述阵列包含核酸探针，所述核酸探针在严谨条件下与表1、图1a+b和/或图2a+b的标记基因特异性地杂交。

Description

用于表征和鉴别遗传毒性化合物的基因表达分析
本发明涉及用于筛选具有(前)遗传毒性活性的化合物的方法，所述方法包括：提供能够表达至少一组11个确定基因的细胞系统，与要筛选的化合物一起孵育所述系统的至少一部分，并将所述系统中所述基因的表达与对照细胞系统中的基因表达相对比，从而检测出(前)遗传毒性活性。本发明的另一个主题涉及用于监测生理学和/或病理学状况的方法，所述状况由增殖、分化和/或损伤修复的遗传失调造成、介导和/或传播，所述方法包括：给需要这种处理的哺乳动物施用有效量的至少一种单一的(前)遗传毒性化合物，并在取自所述哺乳动物的生物样品中测定11个确定基因的表达。本发明也涉及用于筛选具有(前)遗传毒性活性的化合物的阵列，所述阵列包含核酸探针，所述核酸探针在严谨条件下与表1、图1a+b和/或图2a+b的标记基因特异性地杂交。
遗传毒性试验是药物开发内的标准试验策略的一个重要部分，并用于化学物质的风险评价。为了反映各种不同的遗传毒性作用机制，标准试验涉及在体外和/或在体内进行的在细菌中的致突变性和对哺乳动物细胞的染色体损伤性质的一系列评估。
近年来，机制研究已经获得重大关注—特别是在遗传毒性物质和致癌物质的现代风险评估的范围内，以及就在EU REACH管理计划内的化学表征而言。整合生物的“-组学”技术不同于单端点测量的经典的简化者方案，其通过记录给定系统的所有组分来产生细胞机制的全面观察。
在过去的几年中，公开了将毒理基因组学(TXG)应用于遗传毒性和致癌性评价的最早研究，并在大鼠中证实了不同的遗传毒性的致肝癌物的重叠的基因表达谱，它们不同于非遗传毒性的致肝癌物的重叠的基因表达谱，借助于从充分描述的致肝癌物的数据构建的分类模型，可以以75-88%的准确度将未知的物质正确地分类(Ellinger-Ziegelbauer等人, 2008, Mutat. Res. 637, 23-39)。在2006年，始创了癌基因组学（carcinoGENOMICS）计划，以开发对啮齿动物致癌力性寿命生物测定的体外替代方案。
尽管是非常灵敏的，哺乳动物细胞试验受到它们的低特异性的限制，所述低特异性会产生高假阳性率，后者又会使结果解释复杂化。假阳性结果会使人类危险推断复杂化(Kirkland等人, 2005, Mutat. Res. 584, 1-256; Kirkland等人, 2006, Mutat. Res. 608, 29-42)，并开始费力的体外和/或体内随访检查，这鼓励新的体外工具的开发。降低假阳性率的努力体现在，新的ICH S2 (R1)指南的开发，以及在标准试验中考虑最有效的试验组合。所述困难现在迫使开发新的体外工具。
因此，形成本发明的基础的技术问题是，提供一种用于筛选化合物的方法，所述方法可有效地鉴别并表征所述化合物的遗传毒性和/或前遗传毒性性质。本发明的另一个问题是，提供一种用于检测遗传毒性和/或前遗传毒性活性的阵列，所述阵列使得遗传毒性依赖性疾病的简单且快速的监测成为可能。
本发明通过提供一种用于筛选具有遗传毒性和/或前遗传毒性活性的化合物的方法，解决了所述问题，所述方法包括下述步骤：
（a）提供细胞系统或其样品，它们能够至少表达基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A，其中所述系统选自：单一细胞、细胞培养物、组织、器官和哺乳动物或其样品，
（b）与要筛选的化合物一起孵育所述系统的至少一部分，和
（c）通过基因表达分析，检测遗传毒性和/或前遗传毒性活性，其中将所述系统中所述基因的表达与对照细胞系统中的基因表达进行对比。
发明人已经令人惊讶地证实，前述组的至少11个基因与遗传毒性相关。结果，前述多个标记基因代表新的遗传毒性靶基因，它们本身和它们的基因产物分别是非常适用于区分遗传毒性阶段的靶标。作为差异表达分析的结果，选择重要的基因(underlying genes)。鉴别出的基因并非必然地如目前已知地通过它们整体的功能或位置相关联，但是不可排除，这样的关联出现在该组的单个成员或多个成员之间。作为替代，通过相对于未处理的细胞的明显差异来表征所有基因，所述差异表现为上调(upregulation)或抑制。所述基因已经在现有技术中通过序列和其它特征进行了描述，但是缺少与遗传毒性的联系，无论是单独地，还是在本发明定义的组合中。为了最大限度的实验可靠性，可以使用所述11个标记基因或根据表1的补充性的标记基因。所述基因可以以另一种方式命名，但是通过登录号来容易地指定，所述登录号是普遍接受的，并固定在众多的数据库（诸如GenBank、SwissProt等等）中。
发明人已经意外地鉴别出了调节与(前)遗传毒性试验化合物、特别是遗传毒性化合物诱导的DNA损伤有关的过程的特征基因。提供了DNA损伤应答网络的全面概述(图7)。尽管STAT1、SP1和P53本身不是在基因表达水平受到调节，靶基因调节指示对遗传毒物处理应答的这些转录调节剂的活化。这些转录因子的活性借助于蛋白磷酸化而受到重要调节，所述蛋白磷酸化可以由多种信号诱导，包括一般的细胞应激、DNA损伤或干扰素。
P53应答于遗传毒性和前遗传毒性试验化合物而显著升高。遗传毒性实验化合物ETO、MMS和ACT的机制会导致p53活化和p53信号传递应答的介导(图8)。诱导p53抑制的ACT的剂量与mRNA合成抑制所需的剂量相关。此外，在高ACT剂量时相对罕见的DNA链断裂率指示，拓扑异构酶抑制对于p53积累而言是次要的。p53活化的机制可以视作ACT阻断的RNA聚合酶II (POLR2)或与该聚合酶的转录因子有关的感觉功能(sensory function)。观察到ACT对拓扑异构酶II (TOPO2)和RNA聚合酶II的下调(downregulation)(图8)。另外，mdm2功能的缺失，以及APAK的活化(ATM和P53相关的KZNF蛋白，一种新近发现的p53调节剂)，提示ACT、MMS的作用，以及推测的ETO介导的p53诱导的作用。新的p53积累的mdm2相关的机制，通过ACT对截短的mdm2剪接变体（mdm2+108）的诱导来介导，所述变体缺少关键的p53调节结构域。因而，p53-mdm2反馈调节被扰乱，这会造成p53的大量增加。没有发现APAK应答于遗传毒性实验化合物而在基因表达水平受到调节。除了P53活化机制以外，发现P53应答会介导多个基因的上调。发现所有直接作用的遗传毒性试验化合物会强烈地上调BAX，所述BAX编码线粒体渗透性促进蛋白，并参与细胞凋亡诱导(图7和8)。此外，发现AP内切核酸酶2 (APEX2)在24 h和48 h MMS处理以后被上调，β-聚合酶(POLB)在暴露于MMS 48 h以后被上调。提示两种蛋白会在烷基化的DNA碱基（源自诸如MMS等试剂的暴露）的碱基切除修复中介导p53功能。所有遗传毒性的试验物质还会显著地上调GADD45α(图7和8)。GADD45α会通过CDK1/细胞周期蛋白B抑制来触发细胞周期停滞，并如下介导DNA修复：识别被修饰的DNA区域，并通过使DNA-组蛋白相互作用失稳(destabilization)来促进受损位置的可达性。2种其它的P53调节的基因的表达应答于(前)遗传毒性实验化合物14-3-3-σ(人分层蛋白, SFN)和CDKN1A (p21)的处理而增加。两种蛋白产物会应答于DNA损伤而引起细胞周期停滞。14-3-3-σ会阻止cdc25（cdk1的主动去磷酸化所需的一种蛋白磷酸酶）的入核转运，并因而在非抑制性条件下阻止细胞周期进展。除了在G2检查点处的调节功能以外，14-3-3-σ以及p21会在G1期中引起细胞周期停滞。
除了P53以外，STAT1 (信号转导和转录活化蛋白1)也已经被认为具有肿瘤抑制物特征和关于在遗传毒性应激以后促进细胞周期停滞和细胞凋亡的诱导功能。假定的机制通过ATM-NBS1-SMC1和ATM-Chk2-Cdc25信号传递级联而进行，从而导致DNA损伤以后的DNA合成的有效抑制。此外，认为STAT1和P53之间的直接相互作用会以共调节方式调节P53依赖性的转录效应和细胞凋亡。另外，已经将STAT1描述为p53抑制剂mdm2的负调节剂。STAT1的直接靶标是细胞凋亡和细胞周期调节基因（诸如Fas、Fas配体）和Cdk抑制剂p21和p27。在发现的91个基因中，鉴别出3个STAT1靶基因应答于下述(前)遗传毒物暴露而上调：IL27RA (白介素27受体, α；也命名为TCCR/ WSX1)、ISG15 (干扰素刺激的基因15 kDa)和TAP1 (转运蛋白1, ATP-结合盒, 亚家族B) (图7)。IL27（即IL27R的配体）在免疫应答抑制、1型T辅助细胞分化以及抗血管生成性质和抗增殖(抗肿瘤)性质中起作用。TAP1是TAP/ MDR家族的转运蛋白，其负责加载MHC I类分子用于抗原呈递。TAP1在肿瘤细胞中的下调与恶性转化有关，其通过阻止针对恶化细胞(degenerative cell)的免疫反应。ISG15的调节异常也与肿瘤诱导有关。
在目前发现的91个基因的生物分析过程中，突显了另一种转录调节剂，即含有锌-半胱氨酸-组氨酸基序的SP1 (图7)。已经报道，SP1参与多种过程，例如，细胞周期调节、激素活化、细胞凋亡和血管生成，且被许多不同的细胞周期调节剂（包括CDK4、Rad51、E2-DP1、p21或Stat3）活化。此外，已经证实，在DNA损伤以后，SP1可以通过损伤感知激酶DNA-PK和ATM的磷酸化而活化。此外，SP1的功能性似乎强烈地依赖于细胞的P53状态，因为以前的出版物已经显示，在P53存在的情况下，排它地触发SP1诱导的细胞凋亡性细胞死亡。但是，除了促细胞凋亡特征以外，还已经提议，SP1具有生长刺激特性。SP1的一种靶标是c-Myc，后者刺激细胞周期进展，并因此在致癌中起重要作用。发现ACT、ETO和MMS会下调MYC。EGR1 (早期生长应答1，SP1调节网络的另一种转录因子)也失调，但是，观察到MMS、DEN、AFB1和CPA的上调。因此，没有将MYC和EGR1归入91个假定的标记基因中。已经将EGR1诱导与DNA损伤化合物的影响相关联，EGR1会促进P53活化，并通过上调肿瘤抑制物PTEN来抑制PI3K/Akt信号传递途径。假定EGR1和HOMER3 (homer同系物3)的间接相互作用是通过CEBPB (CCAAT/增强子结合蛋白, β)。在微阵列研究中发现，(前)遗传毒性的试验物质会上调HOMER3。另外，在该研究中发现RhoGDI2 (Rho GDP解离抑制剂(GDI)β, ARHGDIB)、受体酪氨酸激酶AXL和神经调节蛋白1 (NRG1)受到上调。尽管GDI (GDP解离抑制剂)是半胱天冬酶的靶标并因此参与程序化的细胞死亡，AXL和NRG1通常发挥由Akt (蛋白激酶B, v-akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因)介导的生长刺激功能。相比而言，还已经描述了NRG1的生长抑制性的作用模式，这取决于细胞的环境。AKT1 mRNA本身不受差异调节，这提示NRG1和AXL对(前)遗传毒物做出应答的另一种机制。
在91个顶级评分的基因中，IER5 (立即早期应答5)、EMP 3 (上皮膜蛋白3)、EMP1 (上皮膜蛋白1)、CRABP2 (细胞视黄酸结合蛋白2)、PROCR (蛋白C受体, 内皮/ EPCR)和PLAU (纤溶酶原活化剂, 尿激酶)在样品中一致地被上调，被注解为遗传毒性的(表3/ 图7)。近年来，已经发现了应答于电离辐射的IER5和PROCR诱导。此外，在Hela细胞中的siRNA介导的IER5抑制会增强辐射诱导的G2/M停滞。EMP1也显示出细胞周期调节特性（通过延长G1期和缩短S期），且已经被发现在不同的肿瘤中过表达。EMP1的瞬时表达会导致细胞增殖的特异性抑制，并在NIH3T3细胞过表达EMP1以后观察到细胞凋亡样表型。EMP3，即周围22-kDa髓磷脂蛋白家族(PMP22或TMP基因家族)的另一个成员，可能在细胞通信和增殖中起作用。EMP3向缺陷型肿瘤细胞中的重新引入(reintroduction)，会抑制肿瘤生长和集落形成，这提示EMP3的肿瘤抑制作用。此外，可以在HepG2细胞中证实EMP3的细胞保护特性。CRABP2编码小型15-kDa蛋白，该蛋白含有用于视黄酸(RA)结合的脂质运载蛋白结构域。因此，CRABP2对于RA的核转运而言是重要的，所述RA在结合视黄酸受体(RAR)以后调节参与发育、胚胎发生、分化和细胞凋亡的基因的转录。假定CRABP2会介导RAR信号传递途径的抗增殖作用。与前述的基因不同，PROCR和PLAU优选地刺激细胞存活。PROCR（即一个MHC I家族成员）通常发挥抗炎和抗凝血特性。PLAU的细胞生长促进活性，可能通过PLAU与uPAR结合以后对MAPK (p38)信号传递的活化来实现。认为PLAU具有抗细胞凋亡的功能，这是通过激活RAS-ERK和PI3K-Akt信号传递。此外，已经在PLAU介导的细胞凋亡抑制内建立了Bcl2-家族成员和Fas (TNF/死亡受体)信号传递之间的功能联系。
分析上面讨论的91个顶级评分的基因和有关的分子，证实了应答于HepG2细胞向(前)遗传毒物的暴露而对细胞死亡和存活的复杂调节。主要受影响的过程包括：细胞周期调节、细胞增殖和细胞凋亡。被发现受到差异调节的基因可以主要指定为促细胞凋亡功能和抗增殖功能。数据表明，应答于试验化合物诱导的DNA损伤而诱导细胞周期停滞和程序化的细胞死亡。
遗传毒性与不同基因的联系，被用于诱变剂和前诱变剂的体外检测，所述诱变剂和前诱变剂能够干扰增殖、分化或损伤修复中的信号传递。建立化合物特异性的基因表达谱（其基于根据表1的多个基因），在建立遗传毒性作用机制中具有意外的益处，并因此支持对新的化合物的潜在危害或益处的评价，所述评价会补充经典的筛选方法。这意味着，作为本方法的基础的创造性原理包括：探测可以在核酸水平或在蛋白水平检测到的确定的基因或其基因产物，其中所述核酸水平是优选的，更优选mRNA。关于它的绝对量和相对量以及对特定细胞类型的特异性，选择基因产物。
一般而言，“基因”是在基因组上的能够被转录成RNA的区域，所述RNA或具有调节功能、催化功能，和/或编码蛋白。基因通常具有内含子和外显子，它们可以进行组织，以生成不同的RNA剪接变体，所述变体编码成熟蛋白的替代形式。“基因”包括代表或不代表功能结构域的基因片段。
本文使用的“多个基因”是指一组鉴别的或分离的基因，所述基因的表达水平在不同的组织、细胞中或在不同的状况或生物状态下有所不同。所述不同的状况可以由暴露于特定试剂造成，所述特定试剂可以是外源的或内源的，包括激素、受体配体、化学化合物等等。多个基因的表达会表现出特定模式。也就是说，在不同的状况，或暴露于或不暴露于特定内源或外源试剂的情况下，所述多个基因中的每个基因差异地表达。每个基因的差异表达的程度或水平可以具有多种变化，且可以根据本发明定性地和/或定量地测定。本文使用的“基因表达谱”是指在不同的水平差异表达的多个基因，它们构成“模式(pattern)”或“谱(profile)”。本文使用的术语“表达谱”、“谱”、“表达模式”、“模式”和“基因表达模式”可互换地使用。
术语“基因产物”是指，如下从所述基因的底物形成的分子：通过生化反应、化学反应或物理反应，诸如DNA合成、转录、剪接、翻译、片段化或甲基化。本发明的优选的基因产物是RNA，特别是mRNA和cRNA、cDNA和蛋白。
本文使用的“具有遗传毒性活性的化合物”也称作“诱变剂”，是物理或化学剂：其会造成生物体的遗传物质（通常是DNA）的变化，并因此增加突变频率至超过天然背景水平。技术人员已知，例如，诱变剂的生物效应之一是，促进癌的发展。诱变剂的其它生物效应也有充分的记录和讨论。突变造成的核酸序列的变化包括：核苷酸碱基对的置换，和DNA序列中一个或更多个核苷酸的插入和缺失。
在第一步(a)中，提供细胞系统。所述细胞系统被定义为任意受试者，条件是，所述受试者包含细胞。因此，所述细胞系统可以选自单一细胞、细胞培养物、组织、器官和哺乳动物。细胞系统的范围也包括这些生物实体的某些部分，即组织、器官和哺乳动物的样品。应当理解，前述次序的每个细胞系统可以代表各个下述系统的样品。
具体地，所述细胞样品在体内或原位地取自待测的哺乳动物。所述细胞样品的取出遵循良好的医学实践。生物样品可以取自任意种类的生物物种，但是所述样品特别地取自人、大鼠或小鼠，更优选地人。
在本发明中，所述细胞系统也可以包含生物体液，其中体液样品优选地包括血液、血清、血浆、唾液或尿。还优选的是，通过活组织检查来收集组织样品，特别是取自疾病部位附近。所述生物样品可以源自任意组织，包括子宫、垂体、肝、脑、结肠、乳房、脂肪组织等。在优选的实施方案中,所述生物样品取自肾、垂体和子宫。可以纯化所述样品，以除去干扰杂质，诸如氢键形成的抑制剂。
所述细胞样品是指任意类型的原代细胞或遗传工程改造的细胞，无论是处于分离状态、在培养物中，还是作为细胞系，条件是，它们能够表达至少基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A。应当理解，在定义和保护的范围内，包括具有相同功能的变体、突变体、部分或同源基因序列。原始序列和它的衍生物之间的改变程度必然地受到诱变剂对改变的基因表达的要求的限制。优选地，同源性为至少85%。可能的改变包括至少一个核苷酸的缺失、插入、置换、修饰和添加，或与另一种核酸的融合。工程改造的细胞能够表达这些基因，这通过用携带这些基因或其部分的适当载体进行转染来实现。优选地，所述重组细胞是真核来源的。
在本发明的一个更优选的实施方案中，在所述筛选方法的步骤(a)中提供HepG2细胞。使用的S9的剂量对实验结果具有影响，尽管在细胞毒性评价中是阴性的。应当指出，所述剂量与在调节的标准遗传毒性试验中使用的剂量相当。显著地S9调节的基因不同于由(前)遗传毒性剂诱导的那些，通过与适当对照的对比，可以调节S9-效应。在任何情况下，具有足够的内在代谢活性的细胞系统当然是适当的，但是目前不存在用于遗传毒性评价的这种在代谢上能胜任的细胞系统。原代肝细胞是药物代谢和CYP诱导/ 抑制体外研究的目前的黄金标准。尽管成年人分化的肝细胞缺乏增殖能力（这使得它们成为就遗传毒性研究而言不合适的模型），并且它们也在培养过程中表现出在形态学以及蛋白和基因表达方面的显著变化，人肝细胞的有限可用性和经常显著的供体/批次变异性（其使这种系统的标准化变得复杂）。HepG2细胞的一个重要优点是它们的人分子特征。例如，表达特定靶标（诸如拓扑异构酶和真核修复酶），并阻止遗传毒性的高估，并因此促进假阳性的减少。
将所述细胞样品保藏，诸如冷冻，培养特定时段，或立即进行步骤(b)。在与要筛选的化合物一起孵育它之前，将所述细胞样品分成多份。提供至少2份；一份用于筛选，而另一份用作对照。优选地，用于筛选的份数超过对照份数。通常，对多份进行高通量筛选。
所述化合物由能够与靶分子相互作用的生物和/或化学结构组成。在本文中，基因组学信号传递的任意组分应当视作“靶分子”，这不限于：选择的基因本身，或其调节蛋白或基因产物，或包含所述基因或其基因产物的信号转导途径的组分。结果，化合物的特定相互作用可以涉及仅仅的靶向或细胞功能的改变的诱导，或它可以甚至同时包括两种作用。
在本发明方法中的要筛选的化合物没有任何限制。具体地，所述化合物选自：核酸、肽、碳水化合物、聚合物、具有50-1.000 Da的分子量的小分子和蛋白。这些化合物经常可在文库中得到。优选地，在所述细胞样品的单独份内，孵育单一化合物。但是，也可能通过一份中孵育至少2种化合物而研究化合物的合作效应。在没有所述化合物存在的情况下，同时孵育另一份细胞。
术语“孵育”是指，使所述化合物与所述细胞接触特定时段，所述时段取决于化合物和/或靶标的类型。所述孵育过程也取决于各种其它参数，例如细胞类型和检测的灵敏度，所述参数的优化遵循本领域技术人员已知的常规操作。孵育操作可以在没有诱变剂的化学转化下实现，或可以涉及前诱变剂的代谢转化。加入化学溶液和/或施加物理操作（例如热冲击），可以提高样品中的靶结构的可达性(accesibility)。作为孵育的结果，形成特定的孵育产物。
在步骤(c)中，通过测定表1确定的至少11个基因（所述系统能够表达这些基因）的表达模式，间接地鉴别在本发明意义上的有效化合物。所述测定在指定的时刻进行，且与实验开始时的信号强度和阳性/阴性对照相关联。如在下面的微阵列的实施例所述，对照系统不与化合物一起孵育(阴性对照)，或对照系统与没有遗传毒性活性的标准化合物一起孵育(阴性对照)，或与具有(前)遗传毒性活性的标准化合物一起孵育(阳性对照)。通过表达的变化，揭示活性。优选地，将在经过诱变剂暴露的细胞中表达或抑制的基因，与在没有暴露于诱变剂的细胞中表达或抑制的基因进行对比。在每种处理之前进行逐对对比。逐对对比是，给定的基因在给定的处理条件下的表达数据与该基因在第二种处理条件下的表达数据的对比。在已知的和商购可得的程序的辅助下，使用适当的统计技术，进行所述对比。
本发明的一个更优选的方面是，如果与阴性或阳性对照系统相比，在所述系统中的基因表达被上调或下调，或者，如果在所述系统和阳性对照系统中的基因表达基本上相同，那么在步骤(c)中检测到现有活性。本发明的一个更优选的方面是，通过与阴性对照系统的差异基因表达分析，在步骤(c)中检测到现有活性。适用于监测核苷酸序列的基因表达、测定和变体分析的试验是本领域技术人员已知的，或可以容易地设计为常规内容。根据本发明的试验可以是适用于检测和/或定量基因表达的任意试验。选择的标记可以用于建立具有更高通量的筛选工具，例如，高容量成像(HCI)或基因表达集合(例如基于实时PCR的TaqMan™低密度阵列或在Luminex上的bDNA测定)。两种技术都允许组合几个选择的端点，在某种程度上保留了生物复杂性和分子相互作用。具体地，HCI会提供组合经典的遗传毒性端点(例如微核诱导)和细胞标记分析(同时采集细胞生存力/细胞毒性)的可能性。细胞生存力是遗传毒性试验要考虑的一项重要参数，因为在标准试验中可以通过细胞毒性在其它间产生假阳性。对于测量分子标记（诸如P53）而言，这也适用。尽管p53对DNA损伤非常灵敏地做出反应，营养物剥夺(nutrient deprivation)和低氧也可以诱导活化。类似地，已知STAT1会被高渗应激、升高的葡萄糖水平、低氧或活性氧种类活化。在剂量选择中考虑细胞毒性，与多端点测量一起，可以防止或减少假阳性。从非遗传毒性的化合物MET和THEO，管理单独的(前)遗传毒性基因调节。
许多不同类型的试验是已知的，其实例如下所述，包括通过核苷酸阵列和核苷酸过滤器进行分析。根据本领域也众所周知的操作，调节杂交条件(温度、时间和浓度)。优选地，应用芯片杂交和/或PCR用于测定基因表达。在另一个优选的实施方案中，本发明的试验涉及使用高密度寡核苷酸阵列。在另一个优选的实施方案中，通过多重qPCR、更优选地低密度TaqMan阵列或分支DNA试验(branched DNA assays)，进行所述分析。其它固体支持物和微阵列是技术人员已知的和商购可得的。
结果，本发明涉及一种用于预测具有遗传毒性活性的化合物的细胞效应的方法，所述方法包括：从要评价的细胞制备核酸样品，使所述核酸样品与微阵列接触，检测与所述微阵列杂交的核酸，和将在步骤(c)中测得的结果与使用从对照细胞制备的核酸样品测得的结果进行对比。
在本发明的一个优选实施方案中，将RNA、cRNA、cDNA和/或蛋白检测为基因产物，更优选地mRNA、cRNA和/或cDNA。例如，通过技术人员已知的方法，诸如通过Trizol (Invitrogen)，随后进行重新纯化，例如通过Rneasy柱(Qiagen)，从这样的细胞制备总RNA。
根据本领域众所周知的方法并使用可检测的标记，使用所述总RNA来制备标记的靶标。例如，可以用生物素标记所述RNA，以形成cRNA靶标用于试验中。接着，使用提取的mRNA作为模板，使用逆转录酶(例如，SuperScript逆转录酶; GibcoBRL)和标记的dNTP (例如，Cy3-dUTP和Cy5-dUTP; Amersham Pharmacia Biotech)来制备cDNA，并制备反映了在要评价的细胞内表达的基因的量的cDNA样品。这会造成标记的cDNA被包括在cDNA样品中。在这里，荧光标记或放射性标记可以用作标记。将以此方式制备的cDNA样品以它的单链变性形式应用于下述的微阵列，并使在所述cDNA样品中包括的cDNA与固定化在基板上的基因杂交。
“原位杂交”是一种用于测定样品中的基因的存在或拷贝数的方法，例如，荧光原位杂交(FISH)。通常，原位杂交包括下述主要步骤：(1)固定要分析的组织或生物结构；(2)对所述生物结构进行预杂交处理，以增加靶核酸的可达性，并减少非特异性的结合；(3)使核酸混合物与在所述生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后洗涤，以除去在所述杂交中未结合的核酸片段；和(5)检测杂交的核酸片段。在这样的应用中使用的探针通常用例如放射性同位素或荧光报告物标记。优选的探针具有足够的长度，例如，约50、100或200个核苷酸(nt)至约1000或更多个核苷酸，以实现在严谨条件下与靶核酸的特异性杂交。在这里，与cDNA的杂交可以如下实现：优选地在50-80℃孵育10-20小时，更优选地在约65℃孵育10-20小时。
本文使用的术语“微阵列”是指这样的核苷酸阵列：其可以用于检测生物分子，例如测量基因表达。“阵列”、“载玻片”和“(DNA)芯片”在本公开内容中可互换地使用。微阵列通常包括基板（例如由载物玻璃片、有机硅等等制成）和作为阵列固定化在该基板上的DNA片段。使用该微阵列，可以如下检测在样品中含有的DNA：通过使它们与固定化在所述基板上的DNA片段杂交。由于在样品内的DNA被放射性地标记或荧光地标记，使用放射成像扫描仪、荧光成像扫描仪等等的检测是可行的。在全世界的研究和生产设施，制备了多种阵列，其中的一些是商购可得的。例如，存在2种主要类型的核苷酸阵列，它们的差别在于，将核酸材料放置在阵列基质上的方式：斑点阵列和原位合成的阵列。最广泛地使用的寡核苷酸阵列之一是，由Affymetrix, Inc.生产的GeneChip。所述寡核苷酸探针具有10-50个核苷酸(nt)、优选地15-30个核苷酸、更优选地20-25个核苷酸的长度。它们在计算机环境中（in-silico）在阵列基质上合成。这些阵列倾向于实现高密度，例如超过40,000个基因/cm2。另一方面，斑点阵列倾向于具有更低的密度，但是所述探针（通常是部分的cDNA分子）通常远远长于25个核苷酸。一类代表性的斑点cDNA阵列是由Incyte Genomics生产的LifeArray。将预合成的和扩增的cDNA序列附着于这些类型的阵列的基质上。
在一个实施方案中，所述阵列是矩阵，其中每个位置代表由基因编码的产物（例如蛋白或RNA）的离散结合位点，且其中存在所有基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A的产物的结合位点，或存在根据表1和任选的图1a+b和/或图2a+b的大部分或几乎所有基因的产物的结合位点。在一个实施方案中，“结合位点”(在下文中称作“位点”)是特定同源cDNA可以与其特异性杂交的核酸或核酸类似物。结合位点的核酸或类似物可以是，例如合成的寡聚体、全长cDNA、小于全长的cDNA或基因片段。优选地，所述微阵列具有特定基因的结合位点，所述特定基因与目标基因表达调节剂的作用有关或在目标生物途径中。优选地，在所述基板上固定超过一个DNA片段，所述片段能够在严谨条件下与特定基因或其部分杂交，所述特定基因选自确定组的11个基因、根据表1和任选的图1a+b和/或图2a+b的额外基因。要固定化在基板上的DNA片段可以含有所述基因的全部或部分。本文使用的术语“基因的部分”是指，与至少10个核苷酸、优选至少25个核苷酸、更优选50个核苷酸、最优选300个核苷酸、非常优选500个核苷酸相当的基因部分和核苷酸序列。
又优选地，在微阵列的基板上固定基因，所述基因不论是否存在具有致诱变活性的化学物质而组成型表达(在下文中称作阴性对照基因等等)。可以如下校正根据本发明的基因的表达水平：将阴性对照基因固定在基板上，并将阴性对照基因的表达水平校正至恒定值。因而，可以确定地检测根据表1和任选的图1a+b和/或图2a+b的基因的表达水平的变化。通过选择几个阴性对照基因，和/或使得具有不同的表达水平，可以进一步提高准确度。
将核酸或类似物附着在固体支持物或基板（这些术语在本文中可互换地使用）上，且所述基板可以由玻璃、塑料(例如聚丙烯或尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维素或其它材料制成。当将DNA片段和阴性对照基因固定化在基板上时，可以使用常规已知的技术。例如，可以用聚阳离子（诸如聚赖氨酸）处理基板表面，通过它们在基板表面上的电荷静电地结合DNA片段。此外，可以使用将DNA片段的5'-末端共价地结合到基板上的技术。或者，可以生产在其表面上具有接头的基板，并在DNA片段的末端处引入可以与所述接头形成共价键的官能团。通过在所述接头和所述官能团之间形成共价键而固定化DNA片段。将核酸附着于表面上的一种优选方法是，通过在玻璃板上印刷。
最后，检测与在微阵列上的DNA片段杂交的cDNA。在杂交的cDNA被荧光地标记的情况下，用例如荧光激光显微镜和CCD照相机来检测荧光，并用计算机分析荧光强度。类似地，在杂交的cDNA被放射性标记的情况下，可以使用RI图像扫描仪进行检测，然后可以用计算机分析辐射强度。
在所述筛选方法的另一个实施方案中，在步骤(c)中可以另外精化诱变活性和/或前诱变活性的检测。为此目的，如下测定基因表达：检测由基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A、或者表1的所有基因编码的各自的基因产物，并将信号的量或信号的变化与系统中的基因表达相关联。与各种浓度的鉴别的内分泌活性化合物一起孵育本发明的细胞系统。在有诱变化合物存在的情况下观察到的发射的信号的量或信号的变化，指示由所述化合物引起的基因表达的变化。然后可以将所述变化与样品中的诱变剂浓度相关联，即能够实现匹配浓度的计量读数的校正曲线。优选地，如果使用UV/VIS显色或发光，所述校正曲线是基于Lambert-Beer方程式。通过将样品中的基因产物的浓度与用和/或未用诱变剂处理过的细胞的已知基因产物浓度水平进行对比，诊断化合物的遗传毒性。应当理解，已知的浓度是统计上证实的，因此分别代表特定水平或范围。还已经通过本发明的靶基因的差异表达分析来计算基因表达的方向和强度，所以特定因子的独特上调或下调已经被认为如下所述，这形成生物标记选择的基础。不同于未刺激的细胞的基因产物浓度水平的任意测量浓度，指示受测细胞样品的异常，而在与未刺激的细胞的浓度水平相当的基因产物浓度，则化合物不可归类为诱变剂。优选地，测量比未刺激的细胞的基因产物浓度水平更高的浓度，用于检测遗传毒性。使用该方法，发明人证实了对亚微摩尔或甚至纳摩尔浓度的灵敏度。校准图揭示，所述方法可以应用于跨几个量级的动态范围。
根据本发明的一个优选的实施方案，“聚合酶链式反应”或“PCR”是一种用于测量基因拷贝数的基于扩增的试验。在这样的试验中，对应的核酸序列在扩增反应中充当模板。在定量扩增中，扩增产物的量与原始样品中的模板的量成比例。与适当对照的对比会提供基因拷贝数的量度，所述基因与根据上面讨论的原理使用的特定探针相对应。
提供了实时定量PCR的详细方案，例如，针对RNA。生物样品中“mRNA的水平”是指，从细胞或生物样品中存在的给定基因转录的mRNA的量。在本发明中有用地测量的生物样品(例如细胞或细胞培养物)的生物状态的一个方面是它的转录状态。生物样品的转录状态包括：在给定的条件集合下，细胞中的组分RNA物质（特别是mRNA）的身份和丰度。优选地，测量生物样品中的所有组分RNA物质中的大部分，但是至少测量足够的部分，以表征目标化合物的作用。
基于要扩增的位点侧翼的区域的核苷酸序列信息，设计引物。所述引物可以设计成，扩增长度为100-200碱基对的区域。核酸扩增方法包括、但是并不具体地限于：PCR，优选地实时PCR。通过本文所述的其它方法，也可以定量mRNA的水平。
在如上所述使用要分析的生物样品和引物进行核酸的扩增反应以后，检查所述核酸是否被扩增。为了便利扩增的核酸的检测，可以预先标记引物。适用的荧光标记的实例包括：由Applied Biosystems生产的FAMTM、TETTM、HEXTM、TAMRATM和ROXTM。在这些情况下，可以标记引物的5’-末端或3’-末端，优选地5’-末端。或者，可以在PCR过程中，使用标记的核苷酸来标记核酸，或者甚至在PCR结束以后。通过通用目的的发光测定装置，测量光发射。
使用TaqMan探针的“实时定量PCR”方法也是本领域众所周知的。因此，基于TaqMan的试验可以用于定量多核苷酸。基于TaqMan的试验使用发荧光的寡核苷酸探针，所述探针含有5'-荧光染料和3'-猝灭剂。所述探针会与PCR产物杂交，但是其自身由于在3'-末端处的阻滞剂而不能延伸。当在随后的循环中扩增PCR产物时，聚合酶（例如，AmpliTaq）的5'-核酸酶活性导致TaqMan探针的切割。该切割会分离开5'-荧光染料和3'-猝灭剂，从而导致荧光的增加（作为扩增的函数）。
通过对反应液进行电泳，诸如可以通过毛细管电泳进行的单链构象多态性(SSCP)分析，也可以检查扩增的核酸片段的存在与否。但是，其它电泳方法，例如凝胶电泳，也是适用的，且是本领域技术人员众所周知的。
因此，本发明涉及通过如上所述的试验来评估或测量基因表达的调节。这样的调节是指，基因表达的诱导或抑制。通常，基因表达的调节可以由内源或外源因子或试剂造成。通过本领域技术人员已知的任意方式，可以测量给定的化合物的作用。例如，通过PCR、RNA印迹法、引物延伸、差异展示技术等，可以测量表达水平。表达的诱导(即上调)是指，特定基因的表达水平的任何可观察的或可测量的增加，无论是定性地还是定量地。与此相反，表达的抑制(即下调)是指，特定基因的表达水平的任何可观察的或可测量的降低，无论是定性地还是定量地。使用能够测量生物样品中的RNA转录物的任意技术，可以测量表达水平。这些技术的实例包括，以上所讨论的PCR、TaqMan、引物延伸、差异展示和核苷酸阵列以及其它。本发明的另一个实施方案是，在调节的情况下，基因产物浓度分别超过或低于对照系统中的基因产物浓度的至少2倍，优选至少10倍，更优选至少25倍，最优选至少40倍。
尽管本发明的生物标记集合表现出允许在所述筛选方法范围内使用仅11个标记基因的灵敏度，优选地，使用不止这些标记基因来检测遗传毒性。根据图3，排序表明，使用11或32个基因，会得到低误分类率。所述误分类率低于10% (分别地，11个基因为7.1%，32个基因为7.12% )。在表1中给出了基因排序。因此，当同时考虑基因在给定排序中的次序时，可以应用任意多个基因。换而言之，从11个基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A（给它们分配排序1-11）开始，如下扩展所述基因集合：优选地添加排序12的另一个基因，更优选地然后添加排序13的另一个基因，以此类推，最多至91个基因。在本发明的一个最优选的实施方案中，在步骤(a)中提供的细胞系统因此能够表达表1的至少排序1-32的基因，非常优选地整个91个基因集合。因此，在步骤(c)中，最优选地将表1的至少32个基因（非常优选地整个91个基因集合）的表达与对照系统中的基因表达进行对比。发明人已经解释，通过覆盖比少数基因报告物试验更宽的遗传毒性应答谱，分析多个诱变剂应答基因会增加筛选稳定性并降低差错率。
在本发明的筛选方法的步骤(a)中，除了表达选自根据表1的组的基因以外，所述细胞系统或其样品优选地能够表达图1a+b的至少3个基因和/或图2a+b的至少一个基因，其中所述额外的基因不同于表1中的那些基因。更优选表2的至少一个不同的基因。此外，在步骤(c)中，将所述额外的基因的表达与对照系统中的基因表达相对比。
在根据本发明的步骤(a)的另一个最优选的实施方案中，提供的系统能够表达表1、图1a+b和/或图2a+b的所有基因，非常优选地表1的所有91个基因，极端优选地额外地图1a+b和2 a+b的所有不同的基因。
在本发明的另一个实施方案中，在步骤(c)中排除，将基因GADD45A、MAPK12和NTHL1在所述系统中的基因表达与在对照系统中的基因表达相对比。
如果在步骤(a)中所述细胞系统或其样品能够表达表1的多个基因和/或额外地能够表达图1a+b和/或2 a+b的多个基因，而且在步骤(c)中将表1、图1a+b和/或图2a+b的多个基因的表达模式与对照系统中的表达模式相对比，那么可以化合物特异性地表征遗传毒性。具体地，通过多个基因的关联和/或改变的调节的量级，测定表达模式。本发明的筛选方法不仅评价具有遗传毒性活性的化学物质对待评价的细胞的影响，而且可以指示该影响的细节。通过单个地评价分类的基因的表达水平，可能区分具有遗传毒性活性的化学物质如何影响待评价细胞。
本发明也教导了所述筛选方法的一个实施方案，其中在步骤(a)中，提供哺乳动物，优选地实验哺乳动物，在步骤(b)中，将待筛选的化合物施用给所述哺乳动物，且在步骤(c)中，与表现出非遗传毒性效应的哺乳动物相比，检测取自所述哺乳动物的生物样品的遗传毒性和/或前遗传毒性活性的水平，其中水平的差异指示所述化合物具有遗传毒性介导的病理学状况的治疗效果的增加的可能性。如果具有治疗效果，将所述定性水平整合进步骤(c)中。“治疗效果”在某种程度上减轻疾病的一种或更多种症状，或使与所述疾病或病理学状况有关或是其成因的一个或更多个生理学或生化参数部分地或完全地恢复正常状态。另外，表述“治疗有效量”是指这样的量：与尚未接受该量的对应受试者相比，该量具有下述后果：疾病、综合症、病症、疾患、障碍或副作用的改善的治疗、愈合、预防或消除，或者，疾病、疾患或障碍的进展的减轻。表述“治疗有效量”也包括可有效地增加正常生理功能的量。几种化合物的测试，使得选择最适合用于治疗哺乳动物受试者的化合物成为可能。有利地，关于它们的体外数据，为特定细胞预先调节选择的化合物的体内剂量率(in vivo dose rate)。因此，显著地增强治疗效果。
本发明也涉及一种用于监测生理学和/或病理学状况的方法，所述状况由增殖、分化和/或损伤修复的失调造成、介导和/或传播，其中将有效量的至少一种遗传毒性的或前遗传毒性的化合物或其生理上可接受的盐施用于需要这种处理的哺乳动物，并在取自所述哺乳动物的生物样品中测定至少基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A的表达。所述化合物优选地通过如上所述的本发明的筛选方法得到。因而，本说明书关于所述筛选方法的先前教导是有效的，且没有限制地适用于监测方法（如果方便的话）。
上述的多个基因的鉴别会提供用于评估状态、状况或治疗的进展的高效工具。具体地，可以在事件（诸如外科手术、治疗方案的开始或治疗方案的结束）之前在患者中鉴别多个基因，以提供基线结果。然后该基线可以与在这种事件过程中或之后使用相同方法得到的结果进行对比。该信息可以用于诊断和预后目的。
本发明的监测方法可以用于人医学和兽医学中。所述哺乳动物优选地是实验动物和/或非人生物体。在本文中，所述化合物可以在疾病发作之前或之后施用1次或数次，作为治疗。术语“有效量”或“有效剂量”或“剂量”在本文中可互换地使用，并表示这样的药物化合物的量：其对疾病或病理学状况具有预防上或治疗上有关的作用，即其在组织、系统、动物或人中造成例如研究人员或医师寻求或希望的生物或医学应答。
前述用于本发明的药物产品具体地用于治疗性处理。将监测视作一类处理，其中优选地以特定间隔施用所述化合物，例如为了增强应答和完全根除遗传毒性介导的疾病的病原体和/或症状。可以施用相同的化合物或不同的化合物。所述药物也可以用于减少发生疾病的可能性，或甚至预先阻止由遗传毒性影响引起的与增殖、分化和/或损伤修复有关的那些疾病的起始，或治疗出现的且持续中的症状。在本发明意义上，如果受试者具有前述生理学或病理学状况的任何先决条件，诸如家族倾向、遗传缺陷或以前患过的疾病，预防性处理是建议的。本发明关注的疾病优选地是癌症、肿瘤、转移和/或血管生成障碍。
所述根据本发明的化合物可以以它们的最终的非盐形式使用。另一方面，本发明也包括这些化合物以它们的药学上可接受的盐的形式的应用，所述盐可以通过本领域已知的操作从各种有机和无机酸和碱衍生出。表述“药学上可接受的盐”和“生理上可接受的盐”在本文中可互换地使用，在本发明中用于表示这样的活性成分：其包含处于它的盐之一的形式的根据本发明的化合物，特别是当该盐形式与活性成分的游离形式或以前使用的活性成分的任意其它盐形式相比会赋予所述活性成分改进的药代动力学特性时。活性成分的药学上可接受的盐形式还可以首次为该活性成分提供以前不曾具有的希望的药代动力学特性，且可以甚至对该活性成分的药效动力学具有积极影响（就它在体内的治疗效果而言）。
本发明的主题也是基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A作为用于筛选具有遗传毒性和/或前遗传毒性活性的化合物的标记基因的用途。本说明书关于所述筛选方法的先前教导是有效的，且没有限制地适用于所述用途（如果方便的话）。
本发明的另一个主题是，与由表1的基因编码的至少一种基因产物特异性地相互作用的物质用于检测遗传毒性或前遗传毒性活性的用途。本文使用的术语“特异性物质”包括这样的分子：其与选择的基因所编码的至少一种基因产物具有高亲和力，以便确保可靠的结合。所述物质优选地对基因产物的某些部分是特异性的。这样的部分代表对足以表达特定功能（即提供用于识别的结构决定簇）的那些区域的限制。所有截短必然地受到保留独特识别的要求的限制。但是，所述基因产物部分可以非常小。优选地，所述物质是单特异性的，以便确保与选择的单一靶标的排它性的且直接的相互作用。
通过在携带所述基因序列的核酸序列或由所述基因表达的氨基酸序列的一级、二级和/或三级结构水平与物质的特异性相互作用，可以实现根据本发明的基因产物或其部分的识别。遗传信息的编码功能有利于一级结构识别。与此相反，三维结构被认为主要用于蛋白识别。在本发明范围内，术语“识别”是指但不限于特异性物质和靶标之间的任意类型的相互作用，特别是共价或非共价结合或关联，诸如共价键、疏水/亲水相互作用、范德华力、离子对、氢键、配体-受体相互作用、表位和抗体结合位点之间的相互作用、核苷酸碱基配对等等。这样的关联也可以包括其它分子（诸如肽、蛋白或其它核苷酸序列）的存在。
特异性物质由能够以下述方式与靶分子相互作用的生物和/或化学结构组成：所述方式使得识别、结合和相互作用变得可能。具体地，所述物质选自：核酸、肽、碳水化合物、聚合物、具有50-1,000 Da的分子量的小分子、和蛋白，优选核酸。特异性物质表达足够的灵敏度和特异性，以便确保可靠的检测。
所述蛋白或肽优选地选自：抗体、细胞因子、脂质运载蛋白、受体、凝集素、亲和素、脂蛋白、糖蛋白、寡肽、肽配体和肽激素。更优选地，抗体用作特异性物质。
术语“核酸”是指单链的或双链的DNA或RNA的天然的或合成的聚合物，或者包括合成的、非天然的或修饰的核苷酸，所述核苷酸可以掺入DNA或RNA聚合物中。每个核苷酸由糖部分、磷酸盐部分以及或嘌呤或嘧啶残基组成。所述核酸优选地是单链或双链DNA或RNA、引物、反义寡核苷酸、核酶、DNA酶、适配体(aptamers)和/或siRNA，或它们的部分。所述核酸可以任选地修饰成硫代磷酸酯DNA、锁定核酸(locked nucleic acid, LNA)、肽核酸(PNA)或spiegelmer。
本发明的一个优选主题是，核酸探针用于检测遗传毒性和/或前遗传毒性活性的用途，所述核酸探针在严谨条件下与下述物质特异性杂交：基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A，或优选地由所述基因编码的基因产物，或它们各自的部分。“核酸探针”是这样的核酸：其能够通过一类或更多类化学键（通常通过经由氢键形成的互补碱基配对）与靶核酸或互补序列结合。本文使用的探针可以包括天然的(即A、G、C或T)或修饰的碱基(例如7-脱氮鸟苷、肌苷等)。另外，探针中的碱基可以通过除了磷酸二酯键以外的键相连，只要它不会干扰杂交即可。本领域技术人员会理解，取决于杂交条件的严谨性，探针可以结合这样的靶序列：所述靶序列缺少与探针序列的完全互补性。优选地用同位素（例如生色团、发光团或色原体）直接地标记探针，或用生物素（链菌亲和素复合物可以在以后与其结合）间接地标记探针。通过测定探针的存在与否，可以检测目标靶基因的存在与否。要用作遗传毒性特异性的物质的特别优选的核酸探针是寡核苷酸探针。
可以标记特异性物质，在这样做时，所述标记取决于它们的固有特征和要应用的检测方法。就特定的孵育产物的检测而言，应用的方法取决于要监测的特定的孵育产物，且是技术人员众所周知的。根据本发明的合适的检测方法的实例是：荧光、发光、VIS显色、放射性发射、电化学过程、磁性或质谱法。
标记方法没有特别限制，只要可容易地检测出标记即可。“标记的核酸或寡核苷酸探针”是这样的核酸或探针：其共价地（通过接头或化学键）或非共价地（通过离子相互作用、范德华相互作用、静电相互作用、疏水相互作用或氢键）与标记结合，使得通过检测与所述核酸或探针结合的标记的存在，可以检测出所述核酸或探针的存在。在本发明的一个优选实施方案中，用下述物质标记核酸：地高辛配基（digoxigenin）、生物素、化学发光物质、荧光染料、磁性珠子、金属珠子、胶体颗粒、高电子密度试剂、酶（它们都是本领域众所周知的），或放射性同位素。用于标记本发明范围内的核酸的优选同位素是3H、14C、32P、33P、35S或125I，更优选32P、33P或125I。
本发明的另一个主题涉及一种基因芯片，所述芯片包含根据本文的任意表或图的多个基因的确定组合。具体地，本发明可以实践为包含核酸探针的阵列，所述核酸探针能够在严谨条件下与下述物质特异性地杂交：基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A，或优选地由所述基因编码的基因产物，或它们各自的部分。本发明也可以实践为包含核酸探针的阵列，所述核酸探针能够在严谨条件下与下述物质特异性地杂交：图1a+b和/或图2a+b的基因，或由所述基因编码的基因产物，或它们各自的部分。可以特别地设计两种阵列，以实施本发明的用于筛选具有遗传毒性和/或前遗传毒性活性的化合物的方法。本发明的阵列可以包括这样的物品：所述物品包含如何实践本发明方法的书面说明书，或指导用户获取书面说明书。本说明书关于所述筛选方法的先前教导被认为是有效的，且没有限制地适用于所述试剂盒（如果方便的话）。
在本发明的范围内，首次提供了一种用于筛选具有遗传毒性活性的化合物的方法，所述方法应用选自表1基因的至少11个基因的独特基因表达模式。本发明教导了与遗传毒性有关的标记基因子集的特征性表达指纹图谱。统计数据分析甚至揭示，91个基因最能代表(前)遗传毒性应答。几个过程受到差异调节，诸如细胞分化，和转录调节剂STAT1、SP1和P53的应激和DNA损伤应答的复杂的相互作用的调节。评价的基因集合有利地用于预测N-亚硝基二乙胺(DEN)在它的代谢活化以后的遗传毒性特征。DEN可以借助于它的基因组谱正确地分类为非遗传毒性的（没有S9）和遗传毒性的（在MAS存在的情况下）。所述数据表明，与单端点检测相比，体外机制绘图是一种用于预测遗传毒性的高效工具。
本发明的结果证实，(前)诱变化合物会在HepG2细胞中诱导特征性的基因表达模式。这样的基于基因组学的方案在将来可以额外地应用于遗传毒性的现有标准试验集合，这有助于处理得自不同的体外试验的含糊结果。机制绘图在解释这样的数据的过程中是有益的，且机制研究是会促进遗传毒性化合物的分类的高效工具。此外，机制数据会提高遗传毒性化合物的化学表征和风险评估。在药物开发过程中将基因组绘谱应用于早期筛选，有助于将不同的分子排序，并在开发早期突显具有遗传毒性特征的化合物，这会通过阻止在体内的随访检查来节省成本和动物。发现的91个假定的标记基因可以在将来用于表征未知化合物的遗传毒性潜力。差异表达的基因的分析，特别适用于更高通量的测试系统。因而，可以鉴别出具有未知作用模式的化学剂，并预测它们的产生遗传毒性效应的潜力。所述检测方法以及衍生出的本发明的监测方法，可以以简单且快速的方式实现。另外，可以节省成本地生产适当的阵列。
当在体外筛选化合物和监测生理学或病理学状况时，将表1、图1a+b和图2a+b的基因用作生物标记，用于检测和表征遗传毒性。由所述基因编码的靶向基因产物对遗传毒性活性和它们驱动的医学障碍是高度特异性的。所有物质探针的特征在于：高亲和力、特异性和稳定性，以及低生产成本和方便操作。这些特征形成可再现的作用（其中包括交叉反应性的缺乏）和与它们的匹配靶结构的可靠且安全的相互作用的基础。
在本文中引用的所有参考文献都通过引用并入本发明的公开内容中。
应当理解，本发明不限于本文描述的具体的方法、特异性物质、用途和阵列，这些这些物质可以变化。还应当理解，在本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，无意限制本发明的范围，所述范围仅由所附权利要求书限定。另外，如在本文（包括所附的权利要求书）中所使用的，单数形式诸如“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括它们的对应复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。因而，例如，对“一种物质”的提及包括一种或几种不同的物质，对“一种方法”的提及包括对本领域普通技术人员已知的等效步骤和方法的提及，诸如此类。除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
在说明书中详细描述了本发明的必需的技术。没有详细描述的其它技术对应于本领域技术人员众所周知的已知标准方法，或所述技术更详细地描述在引用的参考文献、专利申请或标准文献中。尽管与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可以用于实践或测试本发明，下面描述了合适的实施例。下述实施例作为例证而不是作为限制来提供。在所述实施例内，使用不含有污染活性的标准试剂和缓冲剂(每当实用时)。特别地解释实施例，使得它们不限于明确地证实的特征组合，但是，如果能够解决本发明的技术问题，例证的特征可以无限制地再次组合。
在本文中使用下述缩写：
环磷酰胺(CPA)；黄曲霉毒素B1 (AFB1)；7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)；N-亚硝基二乙胺(DEN)；放线菌素D (ACT)；依托泊苷(ETO)；甲磺酸甲酯(MMS)；茶碱(THEO)；二甲双胍(MET)；代谢活化系统(MAS)，细胞色素P450单加氧酶(CYP)；没有(w/o)。
该研究的目的是，评价总体基因表达绘谱用于在体外表征和鉴别诱变剂和前诱变剂的适合性。在用3种众所周知的诱变的化合物、3种前诱变的化合物以及2种非遗传毒性的参照化合物处理24或48小时的时段以后，使用Illumina BeadChip阵列来定量基因表达变化。具体而言，使用Illumina HumanRef-8 BeadChip阵列，在处理24 h和48 h以后，产生诱变的化合物(依托泊苷/ ETO、放线菌素D/ ACT和甲磺酸甲酯/ MMS)、前诱变的化合物(环磷酰胺/ CPA、7,12-二甲基苯并[a]蒽/ DMBA和黄曲霉毒素B1/ AFB1)和非遗传毒性的(二甲双胍/MET和茶碱/THEO)试验化合物在HepG2细胞中的基因表达谱。就前诱变剂测试而言，与β-萘黄酮/ 苯巴比妥诱导的大鼠肝S9匀浆物级分（作为代谢活化系统(MAS)）组合地处理HepG2细胞，以补充其较差的代谢能力。以前公开了使用的细胞培养物/ MAS系统以及研究的化合物的众所周知的遗传毒性特征的全面概述(参见Boehme等人, 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281)。关于试验化合物，将选择特别注意力给予选择具有不同遗传毒性机制的化合物。此外，使用的前诱变剂会通过各种细胞色素-P450单加氧酶(CYP)而代谢地活化。在鉴别前述试验化合物的共同基因表达谱以后，然后使用所述谱来预测N-亚硝基二乙胺(DEN)的遗传毒性。
• 化学试剂和细胞培养基补充物
放线菌素D (得自链霉菌属, 纯度≥95%), 7,12-二甲基苯并[a]蒽(纯度≥95%), 依托泊苷(纯度≥98%), 甲磺酸甲酯(液体, 99%), 茶碱(纯度≥99%), 1,1-二甲基双胍盐酸盐(二甲双胍, 纯度≥97%), N-亚硝基二乙胺(液体), β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸还原的四钠盐水合物(NADPH)和青霉素/链霉素溶液购自Sigma-Aldrich (Taufkirchen, 德国)。环磷酰胺(一水合物, 纯度≥97%)购自Calbiochem (Darmstadt, 德国)，黄曲霉毒素B1购自Acros Organics (Geel, 比利时)。DMEM/F12、庆大霉素和丙酮酸钠购自Invitrogen Corp. (Karlsruhe, 德国)。胎牛血清(FBS)购自Hyclone (订货号CH30160, 批号CRJ0454, Perbio Science, Bonn, 德国)。β-萘黄酮/ 苯巴比妥诱导的大鼠肝S9 (订货号R1081.S9, 批号0710507)购自Tebu-bio (Offenbach, 德国)。磷酸二氢钠一水合物、磷酸氢二钠七水合物、氯化镁和氯化钾购自Merck KGaA (Darmstadt, 德国)。
• 细胞培养物
在培养瓶中，在37℃和5% CO2下，将HepG2细胞(订货号HB-8065, 批号3129867, ATCC, Manassas, 美国)常规地维持在含有L-谷氨酰胺和15 mM Hepes的DMEM/F12中，所述Hepes补充了10% (v/v) FBS、1% (v/v)青霉素(10 kU/ml)/ 链霉素(10 mg/ml)溶液、0.1% (v/v)庆大霉素(50 mg/ml)和1 mM丙酮酸钠。根据实验，将适当数目的细胞接种到平板上，并在处理之前，在37℃和5% CO2培养细胞24 h。使用在第4-20代的细胞，进行所有实验至少3次。
• 细胞处理和剂量选择
将细胞接种到6-孔板上(1.5 x 106细胞/孔)，并放置24 h进行附着，然后用不同的直接作用的或前遗传毒性的化合物以及非遗传毒性的茶碱和二甲双胍进行处理。DMSO 0.5% (v/v)用作含有直接作用的遗传毒物的实验的媒介对照，而对于前遗传毒物则仅使用0.2% (v/v) DMSO，以避免干扰代谢活化系统。根据以前的细胞毒性和P53蛋白活化研究(Boehme等人, 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281)，选择实验化合物的剂量。在继续直接作用的遗传毒物的每天处理计划的同时，当使用前诱变剂+ S9肝匀浆物混合物时，处理细胞仅6 h以限制S9级分的细胞毒性。在6 h处理期之后，进行培养基洗涤步骤和18 h恢复期。在18 h恢复期以后，根据上面的描述，重复处理。前诱变剂的处理培养基由每孔的300µl S9混合物和700µl培养基组成。S9混合物含有下述组分和浓度：在预混合物中的8 mM MgCl2、32.8 mM KCl、12 mM NADPH、124 mM磷酸盐缓冲液和2500 pmol/ml CYP内容物，这相当于2.4 mM MgCl2、9.8 mM KCl、3.6 mM NADPH、37.2 mM磷酸盐缓冲液和750 pmol/ml CYP的处理培养基中的终浓度。
• RNA提取
在处理期以后，用PBS (Gibco Invitrogen, Karlsruhe, 德国)冲洗细胞，收获，并按照生产商的描述，使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, 德国)（包括QIAshredder旋转柱操作和在柱上的无RNA酶的DNA酶消化）提取总RNA。用40µl无RNA酶的水洗脱RNA。使用NanoDrop®分光光度计(Kisker, Steinfurt, 德国)和2100 Agilent Bio-Analyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, 德国)，进行RNA质量控制和定量。仅使用具有在1.9至2.1之间的A260/A280质量比且没有峰降解证据(18s/28s)的RNA。
• cRNA合成和Illumina全基因组芯片杂交
使用Illumina Sentrix®HumanRef-8 V2 BeadChip阵列(Illumina Inc., San Diego, CA, 美国)，进行基因表达分析，所述阵列允许分析约23,000种转录物。使用Theonyx Liquid Performer (Aviso GmbH, Greiz, 德国)和MessageAmp™II aRNA扩增试剂盒(Ambion, Darmstadt, 德国)，在自动化的操作中进行生物素标记的cRNA的合成，其中根据Illumina的要求进行几项改进，以优化方法(Zidek等人, 2007, Toxicol Sci 99, 289-302)。作为柱净化的替代，使用基于珠子的Agencourt®RNAclean™系统(Beckman Coulter, Krefeld, 德国)，以纯化cDNA和cRNA。通过分光光度计法(NanoDrop®)，测量cRNA量，并使用2100 Agilent Bio-Analyzer进行质量评估。
在湿化条件下，在Hybridization Cartridge中，将750纳克扩增的生物素化的cRNA在58℃杂交到Illumina Sentrix®BeadChip上持续20 h (分子杂交仪, Illumina Inc., San Diego, CA, 美国)。然后洗涤芯片，用1µg/ml链菌亲和素缀合的Cy3 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, 英国)染色10分钟，最后根据提供的方案通过离心进行干燥。使用Illumina®BeadArray读数器(Illumina, Inc., San Diego, CA, 美国)，在532 nm和0.8µm分辨率，通过共聚焦激光扫描进行荧光检测。
• 统计数据分析
基于以前的研究所述的不同的对照珠参数(Boehme等人, 2009, Toxicol. Appl. Pharmacol. 236, 85-96)，使用Illumina®BeadStudio软件来压缩原始数据，并进一步确保阵列质量。此后，将数据上载进Genedata的Expressionist®Analyst软件(Genedata AG, Basel, 瑞士)中，用于数据归一化和统计分析。使用Lowess (Locally Weighted Linear Regression，局部加权直线回归)（对于诱变剂实验）和100的中值信号强度（对于前诱变剂研究）将数据归一化，以补偿样品和阵列之间的非生物差异(系统变异)。在归一化以后，分别针对含有和不含S9的对应的媒介对照样品，计算每种单一化合物处理的调节倍数。必须转化成相对值，以实现得自不同研究的数据的可比性。
为了鉴别代表待测化合物的共同诱变作用模式的特征性基因，使用了由(前)遗传毒性组以及茶碱和二甲双胍（作为非遗传毒性的化合物）组成的训练数据集。使用DEN作为“未知的”试验化合物，并因此从训练集中排除。使用用于组分离的ANOVA进行基因排序，随后进行用于分类器计算的支持向量机(SVM)算法，鉴别出最有预测性的基因。通过k倍交叉验证(k=10, 重复50次)来评价预测性，然后使用从所述训练集构建的分类器来预测DEN的毒性。
为了研究化合物特异性的、差异表达的基因(S9和DEN效应)，分别通过Student氏T-检验或方差分析(ANOVA)，将基因表达谱单个地与媒介对照(用于评价S9效应)和参照化合物(用于评价DEN效应)进行对比。除了p-值以外，使用BH-q-值(Benjamini和Hochberg假发现率)作为显著性量度(Benjamini和Hochberg, 1995, J.R. Statist. Soc. 57, 289-300)。
在统计分析以后，使用得自GeneGo (Metacore™)、Ingenuity (IPA®)和Cambridge Cell Networks (ToxWiz)的数据库和途径分析工具，在生物/功能背景下解释数据。按照MIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment，关于微阵列实验的最小限度信息)推荐，记录所有数据，包括详细的实验/数据分析描述，且可作为补充信息得到。
表1列出了为遗传毒性和前遗传毒性实验化合物鉴别出的91个假定标记基因的失调值和排序统计(分类模型)。在有和没有代谢活化系统(ß-萘黄酮/ 苯巴比妥诱导的S9)存在的情况下，每天用7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)、二乙基亚硝胺(DEN)、环磷酰胺(CPA)和黄曲霉毒素B1 (AFB1)以及作为对照的茶碱(THEO)和二甲双胍(MET)处理HepG2细胞6 h，随后恢复18 h，总时段为48 h。与前遗传毒性处理不同，使细胞连续地暴露于直接作用的遗传毒物24 h和48 h的时段。每天抽吸含有试验化合物的细胞培养基，并用新鲜的处理培养基替换。使用用于组分离的ANOVA进行基因排序，随后进行用于分类器计算的支持向量机(SVM)算法，鉴别出91个顶级评分的基因。在本表中列出的数据代表相对于对应的媒介/S9对照的基因调节的平均值，所述数据得自3个不同的实验，使用第3-25代的细胞。1实验部分前遗传毒性化合物，2实验部分遗传毒性化合物，3ANOVA排序统计的排序号，4在(前)遗传毒性样品中的一般调节趋势。
表2列出了选择的基因的失调值，所述基因表现出应答于(前)遗传毒性模型化合物处理的一致的调节。该表含有从基于Illumina微阵列数据的分类模型得到的选定基因的失调值。在用(前)遗传毒性模型化合物处理48 h以后，所有8个基因在HepG2细胞中被显著地诱导(在至少80%的应答的样品组阳性的遗传毒性样品中，FC≥1.5倍(以橙色显色))。在本表中列出的数据代表相对于对应的媒介/S9对照的基因调节的平均值，所述数据得自3个不同的实验，使用第3-25代的细胞。图注：放线菌素D (ACT)，甲磺酸甲酯(MMS)，依托泊苷(ETO)，黄曲霉毒素B1 (AFB1)，7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)，环磷酰胺(CPA)，二乙基亚硝胺(DEN)。*通过Student氏t-检验测得的显著性，p-值< 0.05。
表3列出了用于评价共同的遗传毒性反应的实验样品的分类。类别分配是基于化合物类别以及P53和单一化合物的基因表达分析。# 由于显著的P53活化和与媒介对照相比显著的基因表达变化，样品被分类为遗传毒性的。正如以前所述显示的(Boehme等人, 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281)，没有MAS的阳性应答是由HepG2细胞的代谢能力造成。
图1a+b显示了用遗传毒性化合物处理过的HepG2细胞中的假定标记基因的基因-功能热图(gene-function-heatmap)。应答于放线菌素D (ACT)、甲磺酸甲酯(MMS)和依托泊苷(ETO)的48 h处理，显著地(ANOVA p-/ BH-q-值< 0.01)增加(红色)或减少(绿色)失调了超过1.5倍的基因的基因调节和功能。处理浓度是：500 nM的ETO、500µM (nd = 低剂量)和2 mM (hd = 高剂量)的MMS以及250 nM的ACT。在100µM剂量的茶碱(THEO)用作阴性对照。每天处理细胞6 h、24 h和48 h的时段，然后使用Illumina微阵列进行基因表达分析[已经根据Genedata的Expressionist®Analyst, Basel/Switzerland修改了图]。
图2a+b显示了前遗传毒性化合物的特征性基因调节和这些基因的功能分类。在有和没有代谢活化系统(ß-萘黄酮/ 苯巴比妥诱导的S9)存在的情况下，每天用7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)、二乙基亚硝胺(DEN)、环磷酰胺(CPA)和黄曲霉毒素B1 (AFB1)以及作为对照的茶碱(THEO)和二甲双胍(MET)处理HepG2细胞，持续共48 h的时段。用不同细胞代重复实验3次，随后使用Illumina HumanRef-8 BeadChip阵列进行基因表达定量。(A) 表现出88个基因相对于媒介对照的相对表达值的热图。借助于与过滤方案相组合的ANOVA (p-值< 0.01/ BH-q-值< 0.3)，鉴别出基因，所述过滤方案在至少40%的样品中应用1.5倍的失调截止值，它们表现出阳性遗传毒性反应。上调的基因(≥1.5倍)显示为红色，下调的基因显示为绿色(≤-1.5倍)。调节条(regulation bar)进行对数缩放。(B)使用MetaCore™(GeneGo, St. Joseph/ 美国)和ToxWiz (Cambridge Cell Networks, Cambridge/ 英国)数据库，对基因的功能分类。(C)与P53直接相关的失调的基因被显示为网络主题etwork objects)。下表总结了参与整个P53信号传递级联中的基因。调节条指示得自不同处理的基因表达值，它们与热图(A)的标题类似地排序[已经根据Genedata的Expressionist®Analyst (A)和ToxWiz (C)修改了图]。
图3显示了训练数据集的基因排序，以评价方便的分类算法，并鉴别最适用于化合物分类的基因。为了构建模型，从(前)遗传毒性组构建出训练数据集：选择放线菌素D、甲磺酸甲酯和依托泊苷24 h和48 h处理作为直接作用的遗传毒物的代表。与此相比，排它地使用前遗传毒素7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)、二乙基亚硝胺(DEN)、环磷酰胺(CPA)和黄曲霉毒素B1 (AFB1)的48 h处理。但是，由于缺少或极弱的基因表达应答，CPA -S9以及AFB1 0.5 μM -S9和DMBA 10 μM -S9被分类为非遗传毒性的。茶碱(THEO)、二甲双胍(MET)和S9对照也与非遗传毒素一起分组。使用ANOVA作为与3种不同的分类算法相组合的基因排序方法：支持向量机(SVM)显示为蓝色，K最近邻(KNN)用绿色图显示，Sparse线性判别分析用红色线显示。使用线性的Kernel和10的罚分因子作为SVM方法的参数。运行KNN，以阳性关联作为距离量度，并将k设定为4。通过k倍交叉验证(k=10, 50次重复)评价预测性。SVM揭示最低误分类率，其不依赖于分类器计算所用的基因的数目。使用91个顶级评分的基因，实现了4.7%的最低误分类率。使用得自Genedata (Basel/ 瑞士)的软件包Expressionist®Analyst，进行基因排序。
图4 (A)显示了得自前遗传毒性的和非遗传毒性的试验化合物的全基因组表达数据的主要组分分析(PCA)。在对数据进行PCA之前，在中值信号强度上归一化Illumina表达数据。在聚簇分离(cluster seperation)中最重要的效应物是处理时间(圆圈：24 h，菱形：48 h)和使用的代谢活化系统(MAS/大鼠肝S9：黑色符号；没有MAS：白色符号)。图(B)显示了应答于S9暴露而在HepG2细胞中差异地(在24和/或48h处理以后，ANOVA p-/BH-q-值< 0.05，和变化倍数≥1.5/ ≤-1.5)调节的基因的实例和对应的基因功能。
图5 (A/I和B/I)显示了得自(前)遗传毒性的(黑色符号)和非遗传毒性的(白色符号)训练样品(关于组分配的详细信息由表3提供)的全基因组表达数据的PCA。显示的数据是相对于适当的媒介/ 媒介-S9对照计算的相对值。尽管PCA A/I含有所有的遗传毒性的和前遗传毒性的试验样品，B/I代表3个分离组分的坐标原点附近的簇的放大图。虚线指示(前)遗传毒性的和非遗传毒性的样品之间的想像分离器(imaginary seperator)。与分析A/I和B/I（它们包含遗传毒性的24 h和48 h数据，但是仅包含前遗传毒性实验化合物的48 h数据）相比，A/II和B/II显示了在用(前)遗传毒物和非遗传毒物处理24 h以后的对应数据。在PCA B/II内的样品的随机组合，会在该早期时间点显示对照/ 非遗传毒物之间的重叠的、仍然很大程度上类似的谱。
图6 a-d显示了在用各种(前)遗传毒性的(黄色条)和非遗传毒性的(蓝色条)化合物处理24h和/或48 h以后，在HepG2细胞中差异调节的基因的基因功能谱展示。使用Illumina阵列，分析对实验化合物的应答。使用用于组分离的ANOVA进行基因排序，随后进行用于分类器计算的支持向量机算法，将在热图中显示的91个基因鉴别为最有预测性的。使用该基因集合，通过k倍交叉验证(k=10，重复50次)评价的误分类率仅占0.25%。还给出了DEN的91个基因的基因表达调节，所述DEN不是训练集的一部分。颜色标尺对应着基因表达的变化倍数：上调的基因显示为红色，下调的基因显示为绿色，未受调节的基因显示为黑色。
图7显示了在DNA损伤应答内的基因的假定调节和相互作用。箭头分别指示一般调节趋势：上调(↑)和下调(↓)。尽管在(前)遗传毒性实验化合物的91个特征基因下可以发现没有括弧地显示的基因，被括弧包围的基因仅被一些实验化合物调节超过1.5倍。已知标有下划线的基因由关键转录介质STAT1、P53或SP1控制，它们借助于Illumina基因表达绘谱实验中的靶基因调节而鉴别出。
图8显示了遗传毒性试验化合物的P53诱导和信号传递的潜在机制。据提示，在甲磺酸甲酯(MMS)诱导的DNA损伤以后的P53积累是由碱基切除修复(BER)的组分和通过ATM对P53抑制剂APAK的抑制以及DNA损伤以后活化的检查点激酶(checkpoint kinase)介导。假定后一种机制负责依托泊苷(ETO)诱导的P53诱导以及拓扑异构酶II (TOPO2)抑制特征。相比而言，RNA聚合酶II的抑制似乎主要负责放线菌素D (ACT)的P53积累。此外，TOPO2的抑制以及无功能的mdm2变体(Mdm2*)的表达，也可以在ACT的P53活化中起作用。箭头指示在Illumina微阵列中的基因的调节趋势(↑/ ↓= 上调/下调的诱导倍数≥1.5倍)。
图9 a+b显示了N-亚硝基二乙胺(DEN)的基因表达谱。(A)通过与SVM算法相组合的基因排序，使用从训练集计算出的91个基因-分类器，将DEN分类为遗传毒性的（含有S9）和非遗传毒性的（没有外部代谢活化系统）。(B)显著失调的基因(在至少40%的48 h DEN样品中，ANOVA p-值/BH-q-值< 0.01，且变化倍数超过1.5倍)，所述基因在功能上参与对DEN诱导的DNA毒性的应答。
实施例1：影响总基因表达的参数
在本发明中，研究了众所周知的遗传毒性的、前遗传毒性的和非遗传毒性的化合物的基因表达模式。最初，借助于主成分分析法(principal component analysis, PCA)，鉴别影响基因表达的参数。PCA揭示了代谢活化系统对使用的实验化合物的基因表达的时间的效应和显著效应(图4A)，而不同的生物重复(细胞代)对总数据分布没有分离影响。S9诱导的基因表达分析揭示，在24 h和/或48 h处理以后，164个基因显著地失调了超过1.5倍(在两个时间点相对于DMSO对照的ANOVA，p-/ BH-q-值< 0.05)。发现这些基因中的150个被下调，14个被上调。77%的下调的基因在24 h和48 h以后表现出类似的调节。发现S9暴露以后差异调节的基因参与诸如下述过程：如维生素/CoA、叶酸、脂肪酸/脂质和核苷酸代谢、以及蛋白水解、细胞粘附、对细胞应激/氧化应激的应答和调节发育/ 细胞增殖的基因(图4B)。
实施例2：(前)遗传毒性的和非遗传毒性的化合物的基因表达模式
MAS对基因表达谱的实质影响是一项挑战，因为掩蔽了任何特异性物质效应。因此，将数据转化成相对于它们在相同细胞代中的媒介/ 媒介-S9对照的相对值，以使它们独立于实验，并用S9介导的效应来调节所述物质介导的效应。图5表明，这类校正会突出物质效应，现在将遗传毒性的和非遗传毒性的化合物聚簇分离。由于用ACT和MMS处理以后显著的基因表达变化，聚簇分离难以完全分辨(图5A/I)。但是，如果从PCA (放大)中排除ACT和MMS，可以看到遗传毒性的化合物类别与非遗传毒性的化合物类别的清楚分离(图5B/I)。相比而言，在24 h处理以后，不会看到前遗传毒性化合物的清楚分离(图5A/II和5B/II)。单一化合物的统计分析(相对于适当的媒介对照的配对双尾T-检验(paired teo-tailed T-Tests))证实了在24 h以后的该阴性应答。此外，CPA（没有S9）、AFB1 0.5µM（没有S9）和DMBA 10µM（没有S9）都分别仅造成极弱的或没有造成统计上显著的基因表达变化。因此，这些样品与MET和THEO一起被归类为非遗传毒性的。一般而言，用于进一步分析的化合物分类是基于下述的组合：化合物类别、P53 (Boehme等人, 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281)和得自单一化合物分析的基因表达评估，如表3所示。
在图1a+b和图2a+b中，已经分别进行了对应的化合物类别的数据分析，即图1a+b涉及具有直接作用模式的遗传毒性化合物，而图2a+b涉及在代谢活化以后有效的前遗传毒性化合物。在图6 a-d和表1中，已经用图1a+b和图2a+b的2个数据集建立了分类模型。由于2类(不论直接地还是间接地起作用)都是遗传毒性的，将它们分配至一组，与对照化合物进行对比。DEN在P53活化方面是阴性的，因此从数据集中排除，并因此使用没有DEN的训练数据集来构建分子分类器(molecular classifier)，以鉴别(前)遗传毒性化合物的最有预测性的基因。在基于SVM算法的分类器测定方法以后进行的基于ANOVA的基因排序，揭示了使用91个顶级评分的基因的最佳预测性。这些基因的调节和功能分类显示在图6 a-d内的功能-热图视图(function-heat-map view)中。所述结果确证了先前实验对遗传毒性的和非遗传毒性的样品的组分配。没有MAS的CPA没有差异地调节91个基因，而在S9存在的情况下，可以观察到显著的上调和下调。此外，尽管与对照相比，最低剂量的AFB1（0.5µM，没有S9）没有改变91个基因的基因表达，更高的剂量或较低剂量的S9的加入会导致在选择的基因的表达内的改变的应答。观察到DMBA的类似的基因调节谱，因而与其它试验化合物的遗传毒性应答相比，在75µM（没有S9）的基因表达变化相对较弱。此外，ETO的应答在24 h以后也较弱，但是在48 h处理以后更强。因此，DMBA（75µM，没有S9）和ETO (24 h以后)是用于预测的限制性化合物，仅当使用91个顶级评分的基因时会正确地预测，但是如果使用所有基因则不会正确地预测，因为与失调的基因相比，无差异地调节的基因的背景极高。通过测定91个基因中的11个的调节和91个基因中的32个的调节，验证了所述结果(图3)。
实施例3：N-亚硝基二乙胺的基于基因组学的分类
借助于发现最能预测(前)遗传毒性试验化合物的91个基因，评价了DEN的基因表达应答。与以前的P53活化实验（其中没有建立可再现的阳性应答）相比，借助于基因表达分析，在S9存在的情况下，将DEN被正确地预测为遗传毒性的(图9A)。这促使我们进一步分析DEN-特异性的基因表达。统计分析(针对非遗传毒性的化合物MET和THEO的ANOVA，p-值/ BH-q-值< 0.01)揭示了88个上调的和57个下调的基因，它们在超过40%的48 h DEN样品中超过至少1.5倍的失调截止值。将截止标准导向至48 h样品，因为在24 h处理时缺少应答或弱应答，正如关于其它实验化合物所提及的。鉴别的一般毒理学途径，清楚地反映了在细胞暴露于DEN以后的细胞应激情形和遗传毒性应答(图9B)。尤其地，对于后者，将许多途径鉴别为与存在的其它试验化合物类似，所述途径介导细胞凋亡、细胞周期检查点/停滞和DNA修复以及直接参与P53信号传递的基因以及其它。此外，如果对比DEN诱导的基因（包括得自单一分析的145个基因以及91个假定的标记基因）的调节模式，在没有S9加入的情况下可以检测到类似的调节，尽管在S9存在的情况下的表达值经常更高。因而，所述数据提示，以前在更多剂量的DEN和MAS，不充分的代谢活化或解毒，这会导致增加的遗传毒性效应。HepG2细胞自身的代谢活化是相当不可能的，因为以前已经证实，HepG2细胞不能充分地表达CYP2A6和CYP2E1 (Boehme等人, 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281)，它们二者代表将DEN转化成最终的遗传毒性代谢物的主要酶。显然，外来MAS的加入仅会部分地活化DEN，但是，尽管借助于基因表达分析记录了弱变化，推测对于引起稳定的、可检测的P53应答，活化不是足够有效的，或解毒不是显著的。
实际上，在文献中已经多次描述了筛选亚硝胺的困难。尽管该化合物类别在体内的DNA反应性和致癌性是普遍接受的(大多数亚硝胺是归类为潜在人致癌原的IARC第2A和2B组)，不同的体外试验经常仅会揭示弱的或甚至阴性的结果。尽管经常用缺乏CYP2E1活性来解释在细胞系中用亚硝胺筛选的困难，所述研究没有将受限的I期代谢视作主要原因。在使用CYP感受态的原代肝细胞，仅在非常高的浓度(10-32 mM)，在碱性洗脱/ UDS试验中证实了DEN的阳性应答。此外，测试了β-萘黄酮/ 苯巴比妥诱导的S9，以及异烟肼(CYP2E1)诱导的微粒体。细胞毒性和P53活化研究揭示，在两种MAS之间没有差异，这提示丢失应答的另一个原因。HepG2细胞实际上的确具有II期代谢能力。亚硝胺的II期生物转化通过与谷胱甘肽、氨基酸、硫酸或葡萄糖醛酸苷的缀合来进行。硝基胺（nitroamine）与葡萄糖醛酸苷的一种典型缀合反应是由UDP葡糖醛酸基转移酶(UGT)催化。尽管在HepG2细胞中的基础表达较弱，利福平或3-甲基胆蒽(3-methylcholanthren)可以诱导选择的UGT1A酶。此外，已经证实ATP转运蛋白MRP1和MRP2被部分地诱导，且可能参与亚硝胺的排泄。除了II期代谢以外，重氮鎓离子(diazonium ion)的不稳定特性也可以引起在体外的有争论的结果。
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Claims (15)

1.用于筛选具有遗传毒性和/或前遗传毒性活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
（a）提供细胞系统或其样品，它们能够表达至少基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A，其中所述系统选自：单一细胞、细胞培养物、组织、器官和哺乳动物或其样品，
（b）与要筛选的化合物一起孵育所述系统的至少一部分，和
（c）通过基因表达分析，检测遗传毒性和/或前遗传毒性活性，其中将所述系统中所述基因的表达与对照细胞系统中的基因表达进行对比。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述系统能够表达至少表1的排序1-32的基因，优选地至少表1的所有91个基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中额外地，在步骤(a)中，所述系统能够表达图1a+b的至少3个基因和/或图2a+b的至少一个基因，优选地表2的至少一个基因，其中所述额外的一个或多个基因不同于表1中的那些基因，并且在步骤(c)中，将所述额外的一个或多个基因的表达与对照系统中的基因表达相对比。
4.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(a)中，提供的系统能够表达表1、图1a+b和/或图2a+b的所有基因，优选地表1的所有91个基因，以及额外地图1a+b和2a+b的所有不同的基因。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中排除，将所述系统中基因GADD45A、MAPK12和NTHL1的基因表达与对照系统中的基因表达相对比。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，所述基因表达与信号的量或信号的变化相关联。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中，如果与阴性或阳性对照系统相比，所述系统中的基因表达被上调或下调，或者，如果所述系统和阳性对照系统中的基因表达基本上相同，那么检测到现有活性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(c)中，通过与阴性对照系统的差异基因表达分析，优选地通过芯片杂交和/或PCR、更优选多重qPCR，检测现有活性。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中在步骤(a)中，提供哺乳动物，优选实验哺乳动物，在步骤(b)中，将待筛选的化合物施用于所述哺乳动物，并且在步骤(c)中，与表现出非遗传毒性效应的哺乳动物相比，检测取自所述哺乳动物的生物样品的遗传毒性和/或前遗传毒性活性的水平，其中水平的差异指示所述化合物具有对于遗传毒性介导的病理学状况的治疗效果的增加的可能性。
10.用于监测生理学和/或病理学状况的方法，所述状况由增殖、分化和/或损伤修复的失调造成、介导和/或传播，其中将有效量的至少一种遗传毒性的或前遗传毒性的化合物或其生理上可接受的盐施用于需要这种处理的哺乳动物，并在取自所述哺乳动物的生物样品中测定至少基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A的表达。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述状况选自：癌症、肿瘤、转移和血管生成障碍。
12.基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A作为用于筛选具有遗传毒性和/或前遗传毒性活性的化合物的标记基因的用途。
13.核酸探针用于检测遗传毒性和/或前遗传毒性活性的用途，所述核酸探针在严谨条件下与下述物质特异性地杂交：基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A，或由所述基因编码的基因产物，或它们各自的部分。
14.用于筛选具有遗传毒性和/或前遗传毒性活性的化合物的阵列，所述阵列包含核酸探针，所述核酸探针能够在严谨条件下与下述物质特异性地杂交：基因GLS2、IER5、TMEM194、PROCR、ITGA2B、FADS3、STMN3、PIB5PA、ROBO3、EDA2R和KIF1A，或由所述基因编码的基因产物，或它们各自的部分。
15.用于筛选具有遗传毒性和/或前遗传毒性活性的化合物的阵列，所述阵列包含核酸探针，所述核酸探针能够在严谨条件下与下述物质特异性地杂交：图1a+b和/或图2a+b的基因，或由所述基因编码的基因产物，或它们各自的部分。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112602153A (zh) * 2018-08-30 2021-04-02 生命科技股份有限公司 用于对pcr测定进行基因分型的机器学习系统

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150140123A1 (en) * 2012-06-13 2015-05-21 Merck Patent Gmbh Protein expression analyses for identifying genotoxic compounds
US10071109B2 (en) 2013-11-06 2018-09-11 Molecular Templates, Inc. Predictive biomarker for hypoxia-activated prodrug therapy
EP4194853A1 (en) * 2016-12-28 2023-06-14 National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition Characteristic analysis method and classification of pharmaceutical components by using transcriptomes

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2798392B1 (fr) * 1999-09-13 2005-07-15 Exonhit Therapeutics Sa Marqueurs genetiques de la toxicite, preparation et utilisations
JP4290438B2 (ja) * 2003-02-21 2009-07-08 ダイキン工業株式会社 Ｄｎａマイクロアレイ法を用いる毒性物質の同定方法
JP4573876B2 (ja) * 2004-11-24 2010-11-04 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 遺伝毒性を判定するための方法
JP2008541696A (ja) * 2005-04-27 2008-11-27 エミリーム インコーポレイテッド 毒物を評価するための新規な方法およびデバイス
JP4841279B2 (ja) * 2006-03-23 2011-12-21 一般財団法人 化学物質評価研究機構 被検物質の発がん性予測方法
PT2406371T (pt) * 2009-03-13 2018-10-18 Allergan Inc Células úteis para ensaios de atividade de sérotipos da toxina botulínica baseados na imunologia

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELLINGER-ZIEGELBAUER ET AL.: "Prediction of a carcinogenic potential of rat hepatocarcinogens using toxicogenomics analysis of short-term in vivo studies", 《MUTAT RES》 *
ELLINGER-ZIEGELBAUER H ET AL: "Application of toxicogenomics to study mechanisms of genotoxicity and carcinogenicity", 《TOXICOL LETT》 *
LE F ET AL.: "Characterization of DNA reactive and non-DNA reactive anticancer drugs by gene expression profiling", 《MUTAT RES》 *
THYBAUD V ET AL.: "Application of toxicogenomics to genetic toxicology risk assessment", 《ENVIRON MOL MUTAGEN》 *
VINKEN M ET AL.: "The carcinogenomics project:critical selection of model compounds for the development of omics-based in vitro carcinogenicity screening assays", 《MUTAT RES》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112602153A (zh) * 2018-08-30 2021-04-02 生命科技股份有限公司 用于对pcr测定进行基因分型的机器学习系统

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