ES2526977T3 - Análisis de la expresión de genes para la caracterización e identificación de compuestos genotóxicos - Google Patents

Análisis de la expresión de genes para la caracterización e identificación de compuestos genotóxicos Download PDF

Info

Publication number
ES2526977T3
ES2526977T3 ES11724556.3T ES11724556T ES2526977T3 ES 2526977 T3 ES2526977 T3 ES 2526977T3 ES 11724556 T ES11724556 T ES 11724556T ES 2526977 T3 ES2526977 T3 ES 2526977T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
genes
genotoxic
expression
panel
pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11724556.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Stefan Mueller
Philip Hewitt
Kathleen Boehme
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2526977T3 publication Critical patent/ES2526977T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Método para someter a ensayo un compuesto para actividad genotóxica y/o pro-genotóxica, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto dicho compuesto a ser sometido a ensayo con un sistema celular de ensayo que exprese al menos un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, en donde el sistema se selecciona del grupo de células únicas, cultivos celulares, tejidos, órganos y mamíferos no humanos; y (b) detectar y cuantificar la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo, en donde la expresión génica se correlaciona con una cantidad de señal o cambio en la señal, y comparar la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo con la expresión de dicho panel de genes en un sistema de control celular negativo, en donde una regulación por incremento de la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo, comparada con la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de control, indica que dicho compuesto tiene actividad genotóxica y/o pro-genotóxica.

Description

Análisis de la expresión de genes para la caracterización e identificación de compuestos genotóxicos
La presente invención hace referencia a un método para el cribado de compuestos con actividad (pro-)genotóxica, proporcionando un sistema celular que es capaz de expresar al menos un panel de 11 genes definidos, incubando al menos una parte del sistema con compuestos a ser cribados, y comparando la expresión de los genes en el sistema con la expresión de genes en un sistema celular de control, detectando de este modo la actividad (pro-)genotóxica. Otro objeto de la invención está relacionado con un método para la monitorización de condiciones fisiológicas y/o patológicas, que están causadas, se encuentran mediadas o se propagan por la desregulación genética de la proliferación, diferenciación y/o reparación de daños, mediante la administración de una cantidad efectiva de al menos un único compuesto (pro-)genotóxico a un mamífero en necesidad de tal tratamiento, y la determinación de una expresión de 11 genes definidos en una muestra biológica tomada del mamífero. La invención hace referencia además a matrices para el cribado de compuestos con actividad (pro-)genotóxica que comprenden sondas de ácido nucleico que hibridizan de manera específica bajo condiciones rigurosas con los genes marcadores de la Tabla 1, Figura 1, Figura 1a+b y/o Figura 2 a+b.
Los ensayos de genotoxicidad son una parte importante de la estrategia de ensayos estándar dentro del desarrollo farmacéutico y para la evaluación de riesgos de sustancias químicas. Para reflejar diversos mecanismos de acción genotóxicos, los ensayos estándar implican batería de pruebas de la mutagenicidad en las bacterias y de las propiedades del daño cromosómico a células de mamíferos in vitro y/o in vivo.
Recientemente, las investigaciones de mecanismos han ganado interés de manera significativa -en particular dentro del alcance actual de la evaluación de riesgos de sustancias genotóxicas y carcinógenas, y para la caracterización química dentro del programa de regulación REACH de la UE. Las tecnologías “ómicas” de la biología integrativa se encuentran opuestas al enfoque clásico, reduccionista de las medidas de criterio de valoración único, mediante la generación de una visión de conjunto de los mecanismos celulares a través del registro de todos los componentes en un sistema dado.
En los últimos años, se han publicado los primeros estudios que aplican la Toxicogenómica (TXG) para la evaluación de la genotoxicidad y la carcinogenicidad, y han demostrado firmas de la expresión de genes solapados para diferentes hepatocarcinógenos genotóxicos en ratas que eran distintos a los de hepatocarcinógenos no genotóxicos, y fue posible clasificar correctamente sustancias desconocidas con una precisión del 75-88% mediante un modelo de clasificación construido a partir de datos de hepatocarcinógenos bien descritos (Ellinger-Ziegelbauer et al., 2008, Mutat. Res. 637, 23-39). En 2006, se creó el proyecto carcinoGENÓMICA para desarrollar alternativas a los bioensayos de la carcinogenicidad en el ciclo de vida de roedores in vitro.
A pesar de ser altamente sensibles, los ensayos con células de mamíferos están limitados por su baja especificidad, lo que produce una elevada tasa de falsos positivos y que a su vez complica la interpretación de los resultados. Los resultados de falsos positivos complican la extrapolación del peligro para humanos e inicia una serie de laboriosos ensayos de seguimiento in vitro y/o in vivo lo que fomenta el desarrollo de nuevas herramientas in vitro.
Los esfuerzos para reducir la tasa de falsos positivos se ven reflejados en el desarrollo de una nueva guía ICH S2 (R1), y la consideración de las combinaciones de ensayos más efectivos de los ensayos estándar. Las dificultades están forzando ahora el desarrollo de nuevas herramientas in vitro.
Por lo tanto, el problema técnico que forma la base de la presente invención es proporcionar un método para el cribado de compuestos, que permitan de manera efectiva la identificación y caracterización de sus propiedades genotóxicas y/o pro-genotóxicas. Es otro problema de la presente invención proporcionar una matriz para la detección de actividad genotóxica y/o pro-genotóxica, que haga posible una monitorización sencilla y rápida de enfermedades dependientes de genotoxicidad.
La presente invención resuelve el problema proporcionando un método para el cribado de compuestos con actividad genotóxica o pro-genotóxica que comprende las etapas de:
(a)
proporcionar un sistema celular o una muestra del mismo capaz de expresar al menos los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, en donde el sistema se selecciona del grupo de células únicas, cultivos celulares, tejidos, órganos y mamíferos o una muestra de los mismos,
(b)
incubar al menos una parte del sistema con compuestos a ser cribados, y
(c)
detectar la actividad genotóxica y/o pro-genotóxica mediante análisis de la expresión de genes, en donde la expresión de dichos genes en el sistema se compara con la expresión de genes en un sistema celular de control.
Sorprendentemente, se ha demostrado por parte de los inventores que el mencionado grupo de al menos 11 genes está correlacionado con la genotoxicidad. Consecuentemente, la mencionada pluralidad de genes marcadores representa nuevos genes diana de genotoxicidad, los cuales, tanto ellos mismos como sus productos génicos, respectivamente, son dianas perfectamente adecuadas para la diferenciación de la etapa de genotoxicidad. Los genes subyacentes se seleccionan como resultado de un análisis de expresión diferencial. Los genes identificados no se asocian, inevitablemente, mediante función o localización en su entidad tal como se conoce actualmente, pero no se excluye que aparezcan tales relaciones entre un único miembro o más miembros del grupo. En lugar de ello, todos los genes se caracterizan por una diferencia distintiva con las células no tratadas, lo que se muestra bien mediante una regulación por incremento o mediante represión. Los genes ya se encuentran descritos en el estado del arte mediante secuencias y otras características, pero careciendo de una conexión con la genotoxicidad, ya sea en solitario o en la combinación definida de la invención. Cualquiera de los 11 genes marcadores o genes marcadores suplementarios de acuerdo a la tabla 1 pueden ser utilizados para la mayor fiabilidad del ensayo. Los genes pueden ser nombrados de otra manera, pero se asignan fácilmente mediante su número de accesión, que es en general aceptado y se encuentra fijado en numerosas bases de datos, tales como la GenBank, SwissProt y similares.
Los inventores han identificado, de forma inesperada, procesos de regulación de genes característicos relacionados con el daño al ADN inducido por los compuestos de ensayo (pro-)genotóxicos, en particular compuestos genotóxicos. Se proporciona una visión general exhaustiva de la red de respuesta al daño en el ADN (Figura 7). Aunque STAT1, SP1 y P53 no se regulan por sí mismos a nivel de la expresión génica, la regulación de genes diana indicó una activación de estos moduladores de la transcripción en respuesta al tratamiento con genotóxicos. La actividad de estos factores de transcripción se regula de forma crucial mediante la fosforilación de proteínas que puede ser inducida por múltiples señales, que incluyen estrés celular en general, daño del ADN o interferones.
P53 se eleva de manera significativa en respuesta a los compuestos de ensayo genotóxicos y pro-genotóxicos. El mecanismo de los compuestos de ensayo genotóxicos ETO, MMS, y ACT conduce a la activación de p53 y a la mediación de la respuesta a la señalización de p53 (Figura 8). La dosis de ACT que induce la inhibición de p53 está en correlación con las dosis necesitadas para la inhibición de la síntesis del ARNm. Más aún, la relativamente poco frecuente tasa de roturas de la cadena de ADN a dosis elevadas de ACT indicó que la inhibición de la topoisomerasa es de importancia secundaria para la acumulación de p53. El mecanismo de activación de p53 puede ser visto como una función sensorial de la ARN polimerasa II bloqueada por ACT (POLR2) o con factores de transcripción asociados de estas polimerasa. Se observó una regulación por disminución de la topoisomerasa II (TOPO2) y de la ARN polimerasa II por parte de ACT (Figura 8). Además, la carencia de la función mdm2, además de la activación de APAK (proteína KZNF asociada a ATM y P53) – un regulador de p53 descubierto recientemente -, sugiere un papel para la inducción de p53 mediada por ACT, MMS y presumiblemente también para la mediada por ETO. Un nuevo mecanismo relacionado con mdm2 de la acumulación de p53 está mediado a través de la inducción de una variante de corte y empalme de mdm2 truncada por parte ACT, mdm2+108, que carece del dominio regulador de p53 crítico. Por tanto, la retro-regulación de mdm2-p53 se verá alterada causando un masivo aumento en p53. No se observó que APAK estuviera regulada a nivel de la expresión génica en respuesta a los compuestos de ensayo genotóxicos. Además de los mecanismos de activación de P53, se observó que diversos genes fueron regulados por incremento, mediados por la respuesta a P53. Se observó que BAX, que codifica una proteína promotora de la permeabilidad mitocondrial y que está implicada en la inducción a la apoptosis, fueron fuertemente regulados por incremento mediante todos los compuestos de ensayo genotóxicos de actuación directa /Figuras 7 y 8). Más aún, se observó que la AP endonucleasa de tipo 2 (APEX2) fue regulada por incremento tras 24 h y 48 h de tratamiento con MMS, y la β polimerasa (POLB) tras 48 h de exposición a MMS. Se sugiere que ambas proteínas median en las funciones de p53 dentro de la reparación por escisión de bases de las bases de ADN alquiladas, que se originan a partir de la exposición a agentes tales como MMS. GADD45α fue notablemente regulada por incremento por todas las sustancias de ensayo genotóxicas (Figura 7 y 8). GADD45α desencadena la detención del ciclo celular mediante la inhibición del complejo Ciclina B/CDK1 y es mediador en la reparación del ADN mediante el reconocimiento de áreas de ADN modificado, y facilitando la accesibilidad de las posiciones dañadas mediante la desestabilización de las interacciones ADN-histona. La expresión de otros dos genes regulados por P53 se vio aumentada en respuesta al tratamiento con los compuestos de ensayo (pro-)genotóxicos: 14-3-3-σ (Estratifina, SFN) y CDKN1A (p21). Ambos productos proteicos provocan la detención del ciclo celular en respuesta al daño en el ADN. 14-3-3-σ evita la importación nuclear de cdc25, una proteína fosfatasa que es necesaria para la desfosforilación activa de cdk1 y por tanto, la progresión del ciclo celular bajo condiciones no inhibidoras. Además de las funciones reguladoras en el punto de control G2, 14-3-3-σ además de p21 provocan la detención del ciclo celular durante la fase G1.
Aparte de P53, también se ha atribuido a STAT1 (transductor de señal y activador de transcripción 1) el tener características supresoras de tumores y funciones inductoras con respecto a promover la detención del ciclo celular y la apoptosis después del estrés genotóxico. El mecanismo postulado se desarrolla a través de las cascadas de señalización de ATM-NBS1-SMC1 y ATM-Chk2-Cdc25, conduciendo a una eficiente inhibición de la síntesis de ADN tras el daño en el ADN. Más aún, se cree que la interacción entre STAT1 y P53 modula los efectos de la transcripción dependiente de P53 y la apoptosis de manera co-reguladora. Además, se ha descrito a STAT1 como un regulador negativo del inhibidor de p53 mdm2. Las dianas directas de STAT1 son los genes reguladores del ciclo celular y la apoptosis tales como Fas, ligando Fas y los inhibidores de Cdk p21 y p27. Entre los 91 genes
descubiertos, se identificó que tres genes diana de STAT1 fueron regulados por incremento en respuesta a la exposición a (pro-)genotóxicos: IL27RA (receptor de Interleucina 27, alfa; también denominado TCCR/ WSX1), ISG15 (gen 15 kDa estimulado por interferón) y TAP1 (transportador 1, casete de unión a ATP, sub-familia B) (Figura 7). La IL27, el ligando del IL27R, presenta funcionalidades en la supresión de la respuesta inmune, en la diferenciación de linfocitos T colaboradores de tipo 1, además de propiedades anti-angiogénicas y anti-proliferativas (anti-tumorales). El TAP1 es un transportador de la familia TAP/ MDR, responsable de la carga de moléculas MHC de tipo I para la presentación al antígeno. La regulación por disminución de TAP1 en células tumorales está asociada a la transformación maligna al evitar la reacción inmune contra células degenerativas. La desregulación de ISG15 se encuentra también unida a la estimulación tumoral.
Otro regulador de la transcripción, el SP1 que contiene el motivo zinc-cisteína-histidina, se puso de relieve durante el análisis biológico de 91 genes encontrados actualmente (Figura 7). Se ha informado de que el SP1 está implicado en una variedad de procesos, por ejemplo, regulación del ciclo celular, activación hormonal, apoptosis, y angiogénesis, y es activado mediante muchos reguladores del ciclo celular, que incluyen CDK4, Rad51, E2-DP1, p21 o Stat3. Más aún, se ha demostrado que el SP1 puede ser activado tras el daño en el ADN mediante fosforilación por parte de las quinasas detectoras de daño ADN-PK y ATM. Más aún, la funcionalidad de SP1 parece ser fuertemente dependiente del estado P53 de la célula, ya que se ha demostrado en anteriores publicaciones que la muerte celular apoptótica inducida por SP1 se desencadena exclusivamente en presencia de P53. Sin embargo, además de características apoptóticas, se ha propuesto que el SP1 posee propiedades estimuladoras del crecimiento. Una diana del SP1 es c-Myc, que estimula la progresión del ciclo celular y por lo tanto, juega un importante papel en la carcinogénesis. Se observó que el MYC es regulado por disminución por ACT, ETO y MMS. La EGR1 (respuesta a crecimiento temprano 1), un factor de transcripción adicional de la red reguladora del SP1, se vio también desregulada, sin embargo, se observó incremento regulado para MMS, DEN, AFB1 y CPA. Por lo tanto, MYC y EGR1 no se asignaron a los 91 genes marcadores putativos. La inducción de EGR1 ha sido asociada con la influencia de los compuestos que dañan el ADN y la EGR1 facilita la activación de P53 además de inhibir la vía de señalización PI3K/Akt mediante el incremento regulado del supresor tumoral PTEN. Se postula una interacción indirecta de EGR1 y HOMER3 (homólogo de homer 3) a través de CEBPB (proteína de unión al potenciador /CCAAT, beta). Se observó que HOMER3 fue regulado por incremento mediante las sustancias de ensayo (pro)genotóxicas en el estudio de micromatriz. Además, se observó que RhoGDI2 (Rho GDP inhibidor de la disociación (GDI) beta, ARHGDIB), el receptor tirosina quinasa AXL y la Neuregulina 1 (NRG1) fueron reguladas por incremento en este estudio. Mientras que los GDI (inhibidores de la disociación de GDP) son dianas de las caspasas y por lo tanto, están implicados en la muerte celular programada, AXl y NRG1 ejercen generalmente funciones estimuladoras del crecimiento mediante Akt (proteína quinasa B, oncogén viral de timoma murino vakt). En contraste, se ha descrito un modo de acción inhibidor del crecimiento también para NRG1, dependiendo de la situación celular. El propio ARNm de AKT1 no se vio regulado diferencialmente, lo que sugiere otro mecanismo por el cual NRG1 y AXL respondieron a los (pro-)genotóxicos.
Entre los 91 genes mejor valorados, IER5 (respuesta temprana inmediata 5), EMP 3 (proteína de la membrana epitelial 3), EMP1 (proteína de membrana epitelial 1), CRABP2 (proteína de unión al ácido retinoico celular 2), PROCR (receptor de la proteína C, endotelial/ EPCR) y PLAU (activador del plasminógeno, uroquinasa) fueron sistemáticamente regulados por incremento entre los ejemplos anotados como genotóxicos (Tabla 3/ Figura 7). Recientemente, se ha descubierto la inducción de IER5 PROCR en respuesta a la radiación ionizante. Más aún, la supresión de IER5 mediada por ARNip (ARN pequeño de interferencia), en células Hela aumentó la detención de G2/M inducida por radiación. La EMP1 reveló además propiedades reguladoras del ciclo celular mediante la prolongación de la fase G1 y la reducción de la fase S, y se ha observado que se encuentra sobre expresada en diferentes tumores. La expresión transitoria de EMP1 condujo a la inhibición específica de la proliferación celular y se observó un fenotipo similar a la apoptosis tras la sobre expresión de EMP1 en células NIH3T3. Es probable que la EMP3, otro miembro de la familia de las proteínas mielínicas periférica de 22-kDa (familia génica PMP22 o TMP), cumpla una función en la comunicación y proliferación celular. La reintroducción de EMP3 en las células tumorales deficientes inhibió el crecimiento tumoral y la formación de colonias, lo que sugiere funciones supresoras de tumores de la EMP3. Más aún, las propiedades citoprotectoras de EMP3 pudieron demostrarse en células HepG2. CRABP2 codifica una proteína pequeña de 15-kDa que contiene un dominio de lipocalina para la unión al ácido retinoico (AR). Por lo tanto, CRABP2 es importante para la translocación nuclear del AR, la cual regula la transcripción de genes implicada en el desarrollo, embriogénesis, diferenciación y apoptosis tras la unión al receptor del ácido retinoico (RAR). Se realizan hipótesis sobre que CRABP2 media en los efectos anti proliferativos de la vía de señalización de RAR. En contraste con los genes mencionados anteriormente, PROCR y PLAU estimulan preferentemente la supervivencia celular. PROCR, un miembro de la familia MHC I, ejerce habitualmente propiedades anti-inflamatorias y anti-coagulantes. Las actividades promotoras del crecimiento celular de PLAU se realizan probablemente mediante la activación de la señalización MAPK (p38) tras la unión de PLAU a uPAR. Se cree que PLAU presenta funciones anti-apoptóticas mediante la activación de la señalización RAS-ERK y PI3K-Akt. Más aún, se aborda un enlace funcional entre los miembros de la familia Bcl2 y la señalización de Fas (TNF/ receptor de muerte) dentro de la supresión de la apoptosis mediada por PLAU.
El análisis de los 91 genes mejor valorase y las moléculas asociadas tratados anteriormente, demuestra la compleja regulación de la muerte y supervivencia celular en respuesta a la exposición de células HepG2 con (pro
)genotóxicos. Los procesos principalmente afectados comprenden la regulación del ciclo celular, la proliferación celular y la apoptosis. Los genes que se observó que eran regulados diferencialmente pudieron asignarse, predominantemente, a funciones pro-apoptóticas y anti-proliferativas. Los datos indican una inducción de la detención del ciclo celular y la muerte celular programada en respuesta al daño en el ADN inducido por los compuestos de ensayo.
El enlace de la genotoxicidad a distintos genes se utiliza para la detección in vitro de mutágenos y pro-mutágenos, que son capaces de interferir con la señalización en la proliferación, diferenciación o reparación de daño. Construir un perfil de expresión génica específico al compuesto, que esté basado en la pluralidad de genes de acuerdo con la Tabla 1, es de un beneficio inesperado a la hora de establecer un mecanismo de acción genotóxico y, por lo tanto, respalda la evaluación de peligros o beneficios potenciales de los compuestos novedosos complementarios a los métodos de cribado clásicos. Eso significa que el principio inventivo que es la base del presente método comprende la prospección de los genes definidos o de los productos génicos de los mismos que puedan ser detectados a nivel del ácido nucleico o bien a nivel proteico, en donde se prefiere el nivel del ácido nucleico, más preferiblemente el ARNm. El producto génico se elige con respecto a tanto su cantidad absoluta como relativa, además de la especificidad para un determinado tipo de célula.
En general, “un gen” es una región en el genoma que es capaz de ser transcrita al ARN que o bien tiene una función reguladora, o una función catalítica y/o codifica una proteína. Un gen posee habitualmente intrones y exones, que pueden organizarse para producir diferentes variantes de corte y empalme de ARN que codifican versiones alternativas de una proteína madura. El término “gen” contempla fragmentos de genes que pueden o no representar un dominio funcional.
La expresión una “pluralidad de genes” tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a un grupo de genes identificados o aislados cuyos niveles de expresión varían en diferentes tejidos, células o bajo diferentes condiciones o estados biológicos. Las diferentes condiciones pueden ser causadas por la exposición a cierto(s) agente(s) – ya sean exógenos o endógenos – que incluyen hormonas, ligandos receptores, compuestos químicos o similares. La expresión de una pluralidad de genes demuestra ciertos patrones. Es decir, cada gen en la pluralidad se expresa de manera diferente en diferentes condiciones, con o sin exposición a ciertos agentes endógenos o exógenos. El grado o nivel de expresión diferencial de cada gen puede variar en la pluralidad y puede ser determinado cualitativamente y/o cuantitativamente según la presente invención. Un perfil de expresión génica, tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a una pluralidad de genes que se expresan de manera diferente a niveles diferentes, lo que constituye un “patrón” o un “perfil”. Tal como se utiliza en el presente documento los términos “perfil de expresión”, “perfil”, “patrón de expresión”, “patrón”, “perfil de expresión génica” y “patrón de expresión génica” se utilizan indistintamente.
El término “producto génico” denota moléculas que se forman a partir del sustrato de dichos genes mediante reacciones bioquímicas, químicas o físicas, tales como la síntesis de ADN, la transcripción, el corte y empalme, traducción, fragmentación o metilación. Los productos génicos preferidos de la invención son el ARN, particularmente el ARNm y ARNc, el ADNc y las proteínas.
Tal como se utiliza en el presente documento, un “compuesto con actividad genotóxica”, también denominado “mutágeno”, es un agente físico o químico que cambia el material genético, habitualmente el ADN, de un organismo y de ese modo aumenta la frecuencia de mutaciones por encima del nivel basal natural. El experto en el arte sabría que, por ejemplo, uno de los efectos biológicos de los mutágenos es promover el desarrollo del cáncer. Otros efectos biológicos de los mutágenos se encuentran bien documentados y debatidos. Los cambios en las secuencias de ácido nucleico mediante mutaciones comprenden la sustitución de los pares de bases e inserciones y deleciones de uno o más nucleótidos en las secuencias de ADN.
En la primera etapa (a), se proporciona un sistema celular. Se define que el sistema celular es cualquier sujeto a condición de que dicho sujeto comprenda células. Por lo tanto, el sistema celular puede ser seleccionado del grupo de células únicas, cultivos celulares, tejidos, órganos y mamíferos. El alcance del sistema celular comprende además partes de tales entidades biológicas, es decir, muestras de tejidos, órganos y mamíferos. Debe entenderse que cada sistema celular en el orden mencionado anteriormente podría representar una muestra del siguiente sistema respectivo.
En particular, la muestra celular se toma in vivo o in situ de un mamífero que va a ser sometido a ensayo. La toma de la muestra celular cumple con una práctica médica adecuada. Las muestras biológicas pueden tomarse de cualquier tipo de especie biológica, pero la muestra se toma especialmente de un humano, rata o ratón, más preferiblemente de un humano.
En la presente invención, el sistema celular puede comprender además un fluido biológico, en donde la muestra de fluido biológico consiste en sangre, suero, plasma, saliva u orina. Se prefiere además obtener una muestra de tejido mediante biopsia, en especial tomada cerca de la localización de la dolencia. Las muestras biológicas pueden originarse a partir de un tejido, incluyendo útero, glándula pituitaria, hígado, cerebro, colon, pecho, tejido adiposo,
etc. En modos de realización preferidos, las muestras biológicas son del riñón, glándula pituitaria y el útero. La muestra puede ser purificada para eliminar sustancias perturbadoras, tales como inhibidores para la formación de enlaces de hidrógeno.
La expresión referida a muestra celular hace referencia a cualquier tipo de células primarias o células modificadas por ingeniería genética, ya sea en su estado aislado, en cultivos celulares o como línea celular, siempre que sean capaces de expresar al menos los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A. Debe entenderse que variantes, mutantes, partes o secuencias génicas homólogas que tengan la misma función se incluyen en el alcance de la definición, además de bajo su protección. El grado de modificación entre la secuencia original y sus derivados se encuentra inevitablemente limitado por los requerimientos de la expresión génica modificada por parte de los mutágenos. Preferiblemente, la homología asciende a, al menos, un 85%. Las posibles modificaciones comprenden la deleción, inserción, sustitución, modificación y adición de al menos un nucleótido, o la fusión con otro ácido nucleico. Las células modificadas por ingeniería genética son capaces de expresar estos genes mediante transfección con vectores apropiados albergándolos a ellos o a partes de los mismos. Preferiblemente, las células recombinantes son de origen eucariota.
En un modo de realización de mayor preferencia de la presente invención, se proporcionan células HepG2 en la etapa (a) del método de cribado. La dosis de S9 utilizada ejerce una influencia en el resultado del experimento, a pesar de ser negativa en evaluaciones de citotoxicidad. Debe señalarse que la dosis es comparable con la dosis utilizada dentro de los ensayos de genotoxicidad estándar reglamentarios. Los genes regulados con S9 de manera significativa, difieren de aquellos inducidos por los agentes (pro-)genotóxicos, y el efecto de S9 se puede ajustar mediante su comparación con los controles apropiados. En cualquier caso, un sistema celular que tenga suficiente actividad metabólica intrínseca sería ciertamente apropiado, pero actualmente no existe un sistema celular metabólicamente competente de ese tipo para la evaluación de genotoxicidad. Los hepatocitos primarios son el estándar de oro actual para el metabolismo de los fármacos y los estudios de inducción/ inhibición de CYP in vitro.A pesar de que los hepatocitos adultos diferenciados carecen de competencia en la proliferación, lo que los convierte en un modelo inadecuado para las investigaciones de genotoxicidad, y además muestran cambios significativos en su morfología, además de expresión de genes y proteínas durante su cultivo, a pesar de la disponibilidad limitada de los hepatocitos humanos y a menudo una variabilidad donante/lote marcada lo que complica la estandarización de tales sistemas, una ventaja fundamental de las células HepG2 son sus características moleculares humanas. Por ejemplo, dianas específicas tales como las topoimerasas y las enzimas de reparación eucariotas se expresan y evitan la sobreestimación de la genotoxicidad y, por lo tanto, contribuyen a una reducción de falsos positivos.
La muestra celular se almacena, por ejemplo congelada, se cultiva durante un periodo determinado o se somete inmediatamente a la etapa (b). Antes de incubarla con los compuestos que van a ser cribados, la muestra celular se divide en múltiples partes. Se proporcionan al menos dos partes; una se utiliza para el cribado mientras que la otra se utiliza como control. Preferiblemente, la cantidad de partes para el cribado supera a la cantidad de partes de control. Habitualmente, varias partes se someten a un cribado de alto rendimiento.
Los compuestos se componen de estructuras biológicas y/o químicas capaces de interactuar con una molécula diana. En el presente documento, cualquier componente de señalización genómica debe ser considerado como una “molécula diana”, lo que no está limitado a los propios genes seleccionados, o a una proteína reguladora o producto génico de los mismos, o un componente de una vía de transducción de señales que comprenda dicho gen o productos génicos del mismo. Consecuentemente, la interacción específica de compuestos puede implicar el simple establecimiento de dianas o bien la inducción de alteraciones en la función celular, o puede incluso incluir ambos efectos de forma simultánea.
Los compuestos que van a ser cribados en el método inventivo no están restringidos de manera alguna. En particular, los compuestos se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos, péptidos, carbohidratos, polímeros, moléculas pequeñas que tienen un peso molecular entre 50 y 1.000 Da y proteínas. Estos compuestos se encuentran disponibles a menudo en genotecas. Se prefiere incubar un único compuesto dentro de una parte definida de la muestra celular. Sin embargo, también es posible investigar el efecto cooperativo de los compuestos incubando al menos dos compuestos dentro de una parte. Una parte adicional de células se incuba simultáneamente en ausencia de compuestos.
El término “incubación” indica la puesta en contacto de los compuestos con las células para un periodo definido, que depende del tipo de compuestos y/o diana. El proceso de incubación también depende de diversos parámetros distintos, por ejemplo el tipo de célula y la sensibilidad de detección, cuya optimización sigue los procedimientos de rutina conocidos por los expertos en el arte. El procedimiento de incubación puede ser realizado sin una conversión química de mutágenos, o puede implicar una conversión metabólica de pro-mutágenos. Añadir soluciones químicas y/o aplicar procedimientos físicos, por ejemplo impacto de calor, puede mejorar la accesibilidad de las estructuras diana en la muestra. Los productos específicos de incubación se forman como resultado de la incubación.
En la etapa (c), la identificación de los compuestos efectivos en el significado de la invención se realiza de manera indirecta determinando el patrón de expresión de al menos los 11 genes definidos de la Tabla 1, que el sistema es
capaz de expresar. La determinación se realiza en un momento específico y se correlaciona con la fuerza de la señal al comienzo del experimento y con el control positivo/negativo. O el sistema de control no se incuba con los compuestos (control negativo), o bien el sistema de control se incuba con un compuesto estándar que no tiene actividad genotóxica (control negativo) o con un compuesto estándar que tiene actividad (pro-)genotóxica (control positivo), tal como se explica en el ejemplo de micromatriz más adelante. La actividad se revela mediante un cambio en la expresión. Preferiblemente, los genes expresados o reprimidos en células con exposición a mutágenos se comparan con los genes expresados o reprimidos en células que no fueron expuestas a mutágenos. Se realizan comparaciones por pares entre cada uno de los tratamientos. Una comparación por pares hace referencia a los datos de expresión para un gen determinado bajo una determinada condición de tratamiento en comparación a los datos de expresión para este gen bajo una segunda condición de tratamiento. La comparación se realiza utilizando una técnica estadística adecuada con la ayuda de programas disponibles comercialmente.
Es un aspecto de mayor preferencia de la invención que la actividad existente se detecta en la etapa (c) si la expresión de genes se ve regulada por incremento o regulada por disminución en el sistema, en comparación con un sistema de control negativo o positivo, o si la expresión de genes es sustancialmente idéntica en el sistema y en un sistema de control positivo. Es un aspecto de mayor preferencia en la presente invención que la actividad existente se detecta en la etapa (c) mediante análisis diferencial de la expresión de genes con el sistema de control negativo. Los ensayos adecuados para la monitorización de la expresión de genes, la determinación y el análisis de variantes de las secuencias de nucleótidos son conocidos por los expertos en el arte o pueden ser fácilmente designados como una cuestión de rutina. El ensayo de acuerdo con la invención puede ser cualquier ensayo adecuado para detectar y/o cuantificar la expresión de genes. Los marcadores seleccionados pueden ser utilizados para establecer herramientas de cribado con un rendimiento más elevado, por ejemplo, Imagen de Alto Contenido (HIC, por sus siglas en inglés) o un panel de expresión de genes (por ejemplo, matrices de baja densidad TaqMan™ basadas en PCR en tiempo real o ensayos de ADN ramificado en Luminex). Ambas tecnologías permiten la combinación de diversos criterios de valoración seleccionados, preservando hasta cierto punto la complejidad biológica y las interacciones moleculares. En especial la HCI ofrece la posibilidad de combinar los criterios de valoración genotóxicos clásicos (por ejemplo, inducción de micronúcleos) y el análisis de marcadores celulares con la adquisición simultánea de viabilidad/ citotoxicidad celular. La viabilidad celular es un parámetro importante a considerar para el ensayo de genotoxicidad porque se pueden generar falsos positivos en ensayos estándar entre otros cosas a través de la citotoxicidad. Lo mismo es válido para la medición de marcadores moleculares, tales como P53. Aunque P53 reacciona de manera extremadamente sensible al daño en el ADN, la privación de nutrientes y la hipoxia podría además inducir a la activación. De manera similar, se conoce que STAT1 es activado por estrés hiperosmótico, niveles elevados de glucosa, hipoxia o especies de oxígeno reactivo. La consideración de citotoxicidad para la selección de dosis, junto con múltiples mediciones de los criterios de valoración puede evitar o reducir los falsos positivos. Las regulaciones (pro-)genotóxicas separadas se controlaron a partir de los compuestos no genotóxicos MET y THEO.
Se conocen muchos tipos de ensayo, ejemplos de los cuales se explican más adelante, que incluyen análisis mediante matrices de nucleótidos y filtros de nucleótidos. Las condiciones de hibridación (temperatura, tiempo, y concentraciones) se ajustan de acuerdo a procedimientos también bien conocidos en el arte. Se prefiere aplicar hibridación con chip y/o PCR para la determinación de la expresión génica. En otro modo de realización preferido, el ensayo de la invención implica el uso de una matriz de oligonucleótidos de alta densidad. En aún otro modo de realización preferido, el análisis se realiza mediante PCR cuantitativa o qPCR (por sus siglas en inglés) multiplex, de manera más preferida mediante matrices TaqMan de baja densidad o ensayos con ADN ramificado. Son conocidos otros soportes sólidos y micromatrices y se encuentran disponibles comercialmente para el experto en el arte.
Consecuentemente, la presente invención hace referencia a un método para la predicción del efecto celular de un compuesto que presenta actividad genotóxica mediante la preparación de una muestra de ácido nucleico a partir de una célula a ser evaluada, poniendo en contacto la muestra de ácido nucleico con una micromatriz, detectando un ácido nucleico que hibrida con la micromatriz, y comparando un resultado detectado en la etapa (c) con un resultado detectado utilizando una muestra de ácido nucleico preparado a partir de una célula de control.
En un modo de realización preferido de la presente invención, se detecta ARN, ARNc, ADNc y/o proteínas como los productos génicos, más preferiblemente ARNm, ARNc y/o ADNc. Por ejemplo, el ARn total de tales células se prepara mediante métodos conocidos para el experto en el arte, tales como Trizol (Invitrogen) seguido por una posterior re-purificación, por ejemplo mediante columnas Rneasy (Qiagen).
El ARN total se utiliza para generar una diana marcada de acuerdo a métodos, y utilizando marcadores detectables, bien conocidos en el arte. Por ejemplo, el ARN puede ser marcado con biotina para formar una diana de ARNc para su uso en un ensayo. A continuación, con el ARNm extraído como un modelo, los ADNc se producen utilizando transcriptasa inversa (por ejemplo, Transcriptasa inversaSuperScript; GibcoBRL) y dNTP marcado (por ejemplo, Cy3-dUTP y Cy5-dTUP; Amersham Pharmacia Biotech), y se prepara una muestra de ADNc que refleja la cantidad de genes expresados dentro de las células a ser evaluadas. Esto causa que el ADNc marcado sea incluido en la muestra de ADNc. Aquí, se puede utilizar como marcador un marcador fluorescente o bien un radiomarcador. La muestra de ADNc preparada de esta manera se aplica a la micromatriz mencionada más adelante es su forma
desnaturalizada de cadena única, y los ADNc incluidos en la muestra de ADNc se hibridizan con los genes inmovilizados en la placa basal.
La “hibridación In situ” es una metodología para determinar la presencia de o el número de copia de un gen en una muestra, por ejemplo, hibridación in situ con fluorescencia (FISH, por sus siglas en inglés). En general, la hibridación in situ comprende las siguientes etapas más importantes: (1) fijación del tejido o estructura biológica a ser analizada;
(2) tratamiento de pre-hibridación de la estructura biológica para aumentar la accesibilidad de ácido nucleico diana, y para reducir la unión no específica; (3) hibridación de la mezcla de ácidos nucleicos con el ácido nucleico en la estructura biológica o tejido; (4) lavados posteriores a la hibridación para eliminar fragmentos de ácido nucleico que no se han enlazado en la hibridación; y (5) detección de los fragmentos de ácido nucleico hibridados. Las sondas utilizadas en tales aplicaciones se marcan de manera habitual, por ejemplo, con radioisótopos o indicadores fluorescentes. Las sondas preferidas son suficientemente largas, de aproximadamente 50, 100 o 200 nucleótidos (nt) hasta aproximadamente 1000 o más nucleótidos, para permitir la hibridación específica con el(los) ácido(s) nucleico(s) diana bajo condiciones rigurosas. Aquí, puede lograrse la hibridación con el ADNc, preferiblemente mediante incubación a 50 hasta 80ºC durante 10 a 20 horas, más preferiblemente a aproximadamente 65ºC durante 10 a 20 horas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “micromatriz” hace referencia a matrices de nucleótidos que pueden ser utilizadas para detectar biomoléculas, por ejemplo para medir la expresión génica. “Matriz”, “placa” y “chip (ADN)” se utilizan de forma indistinta en la presente descripción. Una micromatriz habitualmente comprende una placa basal, por ejemplo, hecha de cristal, silicio o similar, y los fragmentos de ADN se inmovilizan a modo de matriz sobre esta paca basal. Con esta micromatriz, los ADN contenidos en una muestra pueden ser detectados mediante la hibridación de los mismos con los fragmentos de ADN inmovilizados en la placa basal. Debido a que el ADN dentro de la muestra está radiomarcado o marcado con fluorescencia, es posible la detección con un escáner de radioimagen, con escáner de imágenes de fluorescencia, o similares. Se realizan diversos tipos de matrices en instalaciones dedicadas a la investigación y a la fabricación en todo el mundo, algunas de las cuales se encuentran disponibles comercialmente. Existen, por ejemplo, dos tipos principales de matrices de nucleótidos que difieren de la manera en la que los materiales del ácido nucleico se colocan en sobre el sustrato de la matriz: matrices de dos colores (spotted) y matrices sintetizadas in situ. Una de las matrices de oligonucleótidos más ampliamente utilizadas es el GeneChip realizada por Affymetrix, Inc. Las sondas de oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 50 nucleótidos (nt), preferiblemente de 15 a 30 nt, más preferiblemente de 20 a 25 nt. Se sintetizan in-silico sobre el sustrato de la matriz. Estas matrices tienden a alcanzar altas densidades, por ejemplo más de 40.000 genes por cm 2. Las matrices de dos colores, por otro lado, tienden a tener densidades inferiores, pero las sondas, habitualmente moléculas de ADNc parciales, suelen ser mucho mayores de 25 nucleótidos. Un tipo representativo de matriz de ADNc de dos colores es LfeArray realizada por Incyte Genomics. Las secuencias de ADNc amplificado y pre-sintetizado se unen al sustrato de estos tipos de matrices.
En un modo de realización, la matriz es una matriz en la que cada posición representa un sitio de unión específico para un producto codificado por un gen, por ejemplo una proteína o ARN, y en el que los sitios de unión están presentes para los productos de todos los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, o la mayoría o casi todos los genes de acuerdo con la Tabla 1, y opcionalmente la Figura 1 a+b y/o la Figura 2 a+b. En una realización, el “sitio de unión” (de aquí en adelante el “sitio”), es un ácido nucleico o un análogo de un ácido nucleico con el que un ADNc afín en particular puede hibridar. El ácido nucleico o análogo del sitio de unión puede ser, por ejemplo, un oligómero sintético, un ADNc de longitud completa, un ADNc de menor longitud que la completa o un fragmento de un gen. Preferiblemente, la micromatriz tiene sitios de unión para genes relevantes a la acción del agente de modulación de la expresión génica de interés o en una vía biológica de interés. Resulta preferible que más de un fragmento de ADN, que sea capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas con un gen o partes del mismo según se selecciona del grupo definido de 11 genes, genes adicionales de acuerdo con la Tabla 1 y opcionalmente la Figura 1 a+b y/o la Figura 2 a+b, sean inmovilizados sobre la placa basal. El fragmento de ADN a ser inmovilizado sobre la placa basal puede contener la totalidad o una parte de los genes. El término “partes de un gen” utilizado en el presente documento significa una parte del gen y una secuencia de nucleótidos equivalente al menos a 10 nt, preferiblemente al menos a 25 nt, más preferiblemente 50 nt, de mayor preferencia 300 nt, sumamente preferido 500 nt.
Se prefiere adicionalmente que los genes que expresan de manera constitutiva independientemente de la presencia
o ausencia de sustancias químicas con actividad mutagénica (de aquí en adelante denominados genes de control negativo y similares), sean inmovilizados sobre las placas basales de la micromatriz. El nivel de expresión de los genes de acuerdo a la invención puede ser corregido mediante la inmovilización de genes de control negativo sobre la placa basal, y la corrección del nivel de expresión de los genes de control negativo hasta un valor constante. Por tanto, los cambios en el nivel de expresión de los genes de acuerdo con la Tabla 1 y opcionalmente la Figura 1 a+b y/o la Figura 2 a+b puede ser detectado con certeza. La precisión puede ser aumentada adicionalmente eligiendo diversos genes de control negativo y/o aquellos que tengan diferentes niveles de expresión.
El ácido nucleico o análogo se unen a un soporte sólido o placa basal, términos que se utilizan de forma indistinta en el presente documento, y que pueden estar realizados en cristal, plástico (por ejemplo, polipropileno o nailon),
poliacrilamida, nitrocelulosa u otros materiales. Cuando los fragmentos de ADN y los genes de control negativo están inmovilizados en las placas basales, se puede utilizar una técnica convencionalmente conocida. Por ejemplo, la superficie de la placa basal puede ser tratada con policationes tales como polilisinas para unirse electroestáticamente a los fragmentos de ADN a través de sus cargas en la superficie de la placa basal. Más aún, pueden utilizarse técnicas para unir de forma covalente el extremo 5’ de los fragmentos de ADN a la placa basal. De manera alternativa, puede producirse una placa basal que tenga conectores en su superficie, y se introducen grupos funcionales que pueden formar enlaces covalentes con los conectores en el extremo de los fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN se inmovilizan formando un enlace covalente entre el conector y el grupo funcional. Un método preferido para unir los ácidos nucleicos a una superficie es mediante la impresión sobre placas de cristal.
Finalmente, se detectan los ADNc que hibridaron con los fragmentos de ADN en la micromatriz. En casos en los que los ADNc hibridados están marcados con fluorescencia, dicha fluorescencia se detecta con, por ejemplo, un microscopio láser de fluorescencia y una cámara CCD, y la intensidad de la fluorescencia se analiza con un ordenador. De forma similar, en casos en los que los ADNc hibridados están radiomarcados, la detección puede llevarse a cabo utilizando un escáner de imagen IR y la intensidad de la radiación puede ser analizada con un ordenador.
En otro modo de realización del método de cribado, la detección de actividad mutagénica y/o pro-mutagénica puede ser adicionalmente refinada en la etapa (c). Para este propósito, la expresión génica se determina mediante la detección de un producto génico respectivo codificado por los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, o todos los genes de la Tabla 1 y correlacionando una cantidad de señal o un cambio en la señal con la expresión génica en el sistema. El sistema celular de la invención se incuba con diversas concentraciones de un compuesto activo endocrino identificado. La cantidad de señal emitida o de cambio en la señal observada en la presencia del compuesto mutagénico es indicativo del cambio en la expresión génica experimentada por el compuesto. El cambio puede entonces relacionarse con la concentración del mutágeno en la muestra, es decir, la curva de calibración permite la lectura de medición de una concentración coincidente. Preferiblemente, la curva de calibración está basada en la ecuación de Lambert-Beer si se utiliza la coloración o luminiscencia UV/VIS. La genotoxicidad de los compuestos se diagnostica mediante comparación de la concentración del producto génico en la muestra con niveles de concentración del producto génico conocido de las células tratadas y/o no con mutágenos. Debe entenderse que las concentraciones conocidas están probadas estadísticamente, representando por lo tanto un cierto nivel o rango, respectivamente. La dirección y fuerza de la expresión génica se ha descifrado mediante el análisis diferencial de la expresión de los genes diana de la invención, de tal manera que se ha reconocido una regulación por incremento o bien una regulación por disminución con un cierto factor, según se explica más adelante, lo que forma la base de la selección de biomarcadores. Cualquier concentración medida, que difiera del nivel de concentración del producto génico de las células no estimuladas, indica una anomalía de la muestra de células sometida a ensayo, mientras que un compuesto no puede ser clasificado como mutágeno a una concentración del producto génico que sea comparable al nivel de concentración de células no estimuladas. Se prefiere medir las concentraciones que sean más elevadas que el nivel de concentración del producto génico de células no estimuladas, para detectar genotoxicidad. Utilizando este método, los inventores demostraron sensibilidad a las concentraciones submicromolares o incluso nanomolares. El gráfico de calibración revela que el método puede ser aplicado en un rango dinámico que se extiende sobre un par de magnitud.
De acuerdo a un modo de realización preferido de la invención, la “Reacción en cadena de la Polimerasa” o “PCR” es un ensayo basado en amplificación utilizado para medir el número de copia del gen. En tales ensayos, las secuencias de ácido nucleico correspondientes actúan como un modelo en una reacción de amplificación. En una amplificación cuantificación, la cantidad del producto amplificación será proporcional a la cantidad del modelo en la muestra original. La comparación con controles apropiados proporciona una medida del número de copia del gen, correspondiente a la sonda específica, de acuerdo al principio discutido anteriormente.
Se proporcionan los protocolos detallados para la PCR cuantitativa en tiempo real, por ejemplo, para el ARN. El “nivel de ARNm” en una muestra biológica hace referencia a la cantidad de ARNm transcrito a partir de un gen determinado que está presente en una célula o muestra biológica. Un aspecto del estado biológico de una muestra biológica (por ejemplo una célula o cultivo celular), medido de manera provechosa en la presente invención, es su estado transcripcional. El estado transcripcional de una muestra biológica incluye las identidades y abundancias de las especies de ARN constituyentes, especialmente los ARNm, en la célula bajo un determinado conjunto de condiciones determinadas. Preferiblemente, se mide una fracción sustancial de todas las especies constituyentes de ARN en la muestra biológica, pero al menos se mide una fracción suficiente para caracterizar la acción de un compuesto de interés.
Los cebadores se diseñan en base a la información de la secuencia de nucleótidos de la región que flanquea el sitio amplificado. Los cebadores pueden estar designados para amplificar una región de 100 a 200 pares de base en longitud. El método de amplificación del ácido nucleico incluye, pero no está particularmente limitado a, una PCR, preferiblemente una PCR en tiempo real. El nivel de ARNm puede además ser cuantificado mediante otros métodos descritos en el presente documento.
Después de realizar la reacción de amplificación de un ácido nucleico utilizando la muestra biológica a ser analizada y los cebadores según se ha descrito anteriormente, se comprueba si el ácido nucleico está amplificado o no. Para facilitar la detección de un ácido nucleico amplificado, un cebador puede ser marcado de antemano. Ejemplos de marcadores fluorescentes aplicables incluyen FAM™, TET™, HEX™, TAMRA™ y ROX™ fabricados por Applied Biosystems. En estos casos, el extremo 5’ o el extremo 3’ de un cebador puede estar marcado, preferiblemente el extremo 5’. De manera alternativa, el ácido nucleico puede marcarse durante la PCR utilizando nucleótidos marcados, o incluso después de que se complete la PCR. La emisión de luz se mide mediante un dispositivo de determinación de luminiscencia de uso general.
Son bien conocidos en el arte métodos de “PCR en tiempo real” que utilizan sondas TaqMan. Por lo tanto, se puede aplicar un ensayo basado en TaqMan para cuantificar polinucleótidos. Los ensayos basados en TaqMan utilizan una sonda de oligonucleótidos fluorogénicos que contiene un colorante fluorescente en el 5’ y un agente de enfriamiento rápido en el 3’. La sonda hibrida con un producto de PCR, pero no puede en sí mismo ser extendido debido a un agente de bloqueo en el extremo 3’. Cuando el producto de PCR es amplificado en ciclos posteriores, la actividad de la nucleasa 5’ de la polimerasa, por ejemplo, AmpliTaq, da como resultado el corte de la sonda Taqman. Este corte separa el colorante fluorescente 5’ y el agente de enfriamiento rápido 3’, resultando por tanto en un aumento en la fluorescencia en función de la amplificación.
La presencia o ausencia de un fragmento de ácido nucleico amplificado puede además ser comprobado sometiendo una solución de reacción a electroforesis, por ejemplo para un análisis de polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP, por sus siglas en inglés), que puede ser realizado mediante electroforesis capilar. Sin embargo, otros métodos de electroforesis, por ejemplo la electroforesis en gel, también se pueden aplicar y son bien conocidos por los expertos en el arte.
Por lo tanto, la presente invención hace referencia a la evaluación o medición de modulaciones de la expresión génica mediante los ensayos conformes a lo indicado anteriormente. Tal modulación hace referencia a la inducción o inhibición de la expresión de un gen. Habitualmente, la modulación de la expresión génica puede ser causada por factores o agentes endógenos o exógenos. El efecto de un compuesto determinado puede medirse mediante cualquier medio conocido por los expertos en el arte. Por ejemplo, los niveles de expresión pueden medirse mediante PCR, análisis de transferencia Northern (Northern blotting), Extensión de Cebadores, técnicas de Expresión Diferencial, etc. La inducción de la expresión (es decir, incremento regulado), hace referencia a cualquier aumento observable o mensurable en los niveles de expresión de un gen en particular, ya sea cualitativa o cuantitativamente. Al contrario de ello, la inhibición de la expresión (es decir, disminución regulada), hace referencia a cualquier disminución observable o mensurable en los niveles de expresión de un gen en particular, ya sea cualitativa o cuantitativamente. La medición de los niveles de expresión puede ser realizada utilizando cualquier técnica que sea capaz de medir los transcritos de ARN en una muestra biológica. Ejemplos de estas técnicas incluyen, tal como se ha tratado anteriormente, PCR, TaqMan, Extensión de Cebadores, extensión Diferencial y matrices de nucleótidos, entre otras cosas. Es otro modo de realización de la presente invención que, en caso de modulación, la concentración del producto génico exceda o bien se quede por debajo, respectivamente, al menos el doble de la concentración del producto génico en el sistema de control, preferiblemente al menos 10 veces, más preferiblemente al menos 25 veces, de mayor preferencia al menos 40 veces.
Aunque el panel de biomarcadores de la invención muestra una sensibilidad que permite el uso de únicamente 11 genes marcadores en el alcance del método de cribado, se prefiere aplicar mayor número que estos genes marcadores para detectar genotoxicidad. De acuerdo a la Figura 3, la clasificación muestra que se obtienen bajas tasas de clasificación errónea utilizando 11 o 32 genes. Las tasas representan valores inferiores al 10% (7,1% para 11 genes y 7,12% para 32 genes, respectivamente). La clasificación de genes se proporciona en la Tabla 1. Por consiguiente, cualquier pluralidad de genes puede ser aplicada teniendo en cuenta el orden de genes en la clasificación dada. En otras palabras, comenzando con los 11 genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, a los que se asigna la clasificación 1 a 11, el panel de genes puede extenderse preferiblemente mediante otro gen que se clasifique 12, más preferiblemente a continuación por otro gen que se clasifique 13, etc., hasta 91 genes. En un modo de realización de mayor preferencia de la invención, el sistema celular proporcionado en la etapa (a) es, por lo tanto, capaz de expresar al menos los genes de la clasificación de 1 a 32 de la Tabla 1, de forma sumamente preferida el panel de 91 genes al completo. Por lo tanto, la expresión de, al menos, 32 genes de la Tabla 1 se compara más preferiblemente con la expresión génica en el sistema de control en la etapa (c), de forma sumamente preferible el panel de 91 genes al completo. Los inventores han ilustrado que analizar los genes que responden a múltiples mutágenos aumenta la estabilidad del cribado y reduce la tasa de errores, cubriendo un espectro más amplio de las respuestas genotóxicas que el de los ensayos con genes indicadores de baja diversidad.
Además de la expresión de genes, que se seleccionan del grupo de acuerdo a la Tabla 1, el sistema celular o la muestra del mismo es preferiblemente capaz de expresar al menos tres genes de la Figura 1 a+b y/o al menos un único gen de la Figura 2 a+b, en donde el gen o los genes adicionales son diferentes de los genes de la tabla 1, en la etapa (a) del método de cribado de la invención. De mayor preferencia es al menos un único gen diferente de la
Tabla 2. Adicionalmente, en la etapa (c) la expresión del gen o genes adicionales se compara con la expresión génica en el sistema de control.
En otro modo de realización de mayor preferencia de la etapa (a) de acuerdo a la invención, el sistema proporcionado es capaz de expresar todos los genes de la Tabla 1, la Figura 1 a+b y/o la Figura 2 a+b, de forma sumamente preferible todos los 91 genes de la Tabla 1, y de manera muy sumamente preferible además todos los genes de la Figura 1 a+b a 2+b.
En otro modo de realización de la invención, está excluido en la etapa (c) que la expresión de los genes GADD45A, MAPK12 y NTHL1 en el sistema se compare con la expresión génica en el sistema de control.
Si en la etapa (a) el sistema celular o la muestra del mismo es capaz de expresar múltiples genes de la Tabla 1 y/o adicionalmente capaz de expresar múltiples genes de la Figura 1 a+b y/o 2 a+b, y además en la etapa (c) un patrón de expresión de múltiples genes de la Tabla 1, Figura 1 a+b y/o Figura 2 a+b, se compara con el patrón de expresión en el sistema de control, la genotoxicidad puede ser caracterizada de forma específica al compuesto. En particular, el patrón de expresión se determina mediante una correlación de los múltiples genes y/o una magnitud de regulación alterada. El método de cribado de la presente invención no evalúa únicamente el efecto de sustancias químicas con actividad genotóxica en las células a ser evaluadas, sino que además puede indicar los detalles de este efecto. Mediante la evaluación individual del nivel de expresión de genes categorizados, es posible distinguir cómo las sustancias químicas con actividad genotóxica afectan a las células a ser evaluadas.
La invención describe además un modo de realización del método de cribado, en donde en la etapa (a) se proporciona un mamífero, preferiblemente un mamífero de laboratorio, en la etapa (b) el compuesto a ser cribado se administra al mamífero, y en la etapa (c) se detecta un nivel de actividad genotóxica o pro-genotóxica en una muestra biológica tomada del mamífero en comparación con el mamífero que no muestra efectos genotóxicos, en donde una diferencia en el nivel indica una probabilidad aumentada de que dicho compuesto tenga un efecto terapéutico para una condición patológica mediada por genotoxicidad. Con el efecto terapéutico, el nivel cualitativo se incorpora en la etapa (c). Un “efecto terapéutico” libera hasta cierto grado uno o más síntomas de una enfermedad o devuelve a la normalidad, ya sea parcial o completamente, uno o más parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados con o que son la causa de la enfermedad o de las condiciones patológicas. Además, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” indica una cantidad que, comparada con un sujeto correspondiente que no haya recibido esta cantidad, presente la siguiente consecuencia: tratamiento mejorado, alivio, prevención o eliminación de una enfermedad, síndrome, condición, dolencia, trastorno o efectos secundarios, o también la reducción en el avance de una enfermedad, dolencia o trastorno. La expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” también abarca las cantidades que son efectivas para aumentar la función fisiológica normal. El ensayo de diversos compuestos hace posible la selección de aquél compuesto que sea más adecuado para el tratamiento del individuo mamífero. La tasa de dosis in vivo del compuesto elegido es ajustada previamente, de manera ventajosa, a las células específicas con respecto a sus datos in vitro. Por lo tanto, la eficacia terapéutica se ve notablemente aumentada.
La invención también hace referencia a un método para la monitorización de las condiciones fisiológicas y/o patológicas, que está causadas, mediadas y/o propagadas por la desregulación de la proliferación, diferenciación y/o reparación de daño, en donde una cantidad efectiva de al menos un compuesto genotóxico o pro-genotóxico, o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, se administra a un mamífero en necesidad de tal tratamiento, y la expresión de al menos los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A se determina en una muestra biológica tomada del mamífero. El compuesto se obtiene preferiblemente mediante el método de cribado de la invención según se ha indicado anteriormente. Por tanto, el contenido previo de la presente especificación con respecto al método de cribado es válido y aplicable sin restricciones al método de monitorización, si fuera oportuno.
La identificación de la pluralidad de los genes descritos anteriormente proporciona una herramienta poderosa para evaluar la progresión de un estado, condición o tratamiento. De manera específica, una pluralidad de genes puede ser identificada en un paciente previamente a un evento, tal como una cirugía, el comienzo de un régimen terapéutico, o la finalización de un régimen terapéutico, para proporcionar un resultado de línea de referencia. Esta línea de referencia puede ser comparada entonces con el resultado obtenido utilizando métodos idénticos bien durante o después de tal evento. Esta información puede ser utilizada tanto para fines de diagnóstico como para fines de pronóstico.
El método de monitorización de la invención puede ser empleado en medicina humana y veterinaria. El mamífero es preferiblemente una animal de laboratorio y/o un organismo humano. En el presente documento, los compuestos pueden ser administrados antes o tras la aparición de una enfermedad una o diversas veces, actuando como terapia. Los términos “cantidad efectiva” o “dosis efectiva” o “dosis” se utilizan indistintamente en el presente documento e indican una cantidad del compuesto farmacéutico que tiene un efecto profiláctica o terapéuticamente relevante sobre una enfermedad o condición patológica, es decir que causa en un tejido, sistema, animal o humano
una respuesta biológica o médica que es buscada o deseada, por ejemplo, por parte de un investigador o un facultativo.
Los productos médicos del uso de la invención mencionados anteriormente se utilizan en particular para el tratamiento terapéutico. La monitorización se considera un tipo de tratamiento, en donde los compuestos se administran preferiblemente en distintos intervalos, por ejemplo, para potenciar la respuesta y erradicar los patógenos o síntomas de la enfermedad mediada por patógenos completamente. Se puede aplicar el compuesto idéntico o compuestos diferentes. El medicamento puede además ser utilizado para reducir la probabilidad de desarrollar una enfermedad o incluso prevenir de antemano la iniciación de aquellas enfermedades que están asociadas a la proliferación, diferenciación y/o reparación de daño debido a un impacto genotóxico, o para tratar los síntomas que surjan y que sea continuados. En el contexto de la invención, se aconseja el tratamiento profiláctico si el sujeto posee cualquier condición previa para las anteriores condiciones fisiológicas o patológicas, tales como una predisposición familiar, un defecto genético, o una enfermedad por la que se haya pasado anteriormente. Las enfermedades en lo que se refiere a la invención son preferiblemente cáncer, tumores, metástasis y/o trastornos de angiogénesis.
Dichos compuestos de acuerdo a la invención pueden ser utilizados en su forma final no salina. Por otro lado, la presente invención además abarca el uso de estos compuestos en la forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, que pueden derivarse a partir de diversos ácidos orgánicos e inorgánicos y bases mediante procedimientos conocidos en el arte. Las expresiones “sal farmacéuticamente aceptable” y “sal fisiológicamente aceptable”, que se utilizan indistintamente en el presente documento, en la presente relación se entienden que significan un ingrediente activo que comprende un compuesto de acuerdo a la invención en la forma de una de sus sales, en particular si esta forma salina imparte propiedades farmacocinéticas mejoradas al ingrediente activo en comparación con la forma libre del ingrediente activo o cualquier otra forma salina del ingrediente activo utilizada anteriormente. La forma salina farmacéuticamente aceptable del ingrediente activo puede además proporcionar este ingrediente activo por primera vez con una propiedad farmacocinética deseada que no tenía antes y puede incluso tener una influencia positiva en la farmacodinámica de este ingrediente activo con respecto a su eficacia terapéutica en el cuerpo.
Objeto de la invención es también el uso de los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A como genes marcadores para el cribado de compuestos con actividad genotóxica y/o pro-genotóxica. El contenido previo de la presente especificación con respecto al método de cribado es válido y aplicable sin restricciones al método de monitorización, si fuera oportuno.
Es aún otro objeto de la presente invención utilizar sustancias que interactúan específicamente con al menos un producto génico codificado por un gen de la Tabla 1 para detectar la actividad genotóxica o pro-genotóxica. El término “sustancias específicas” tal como se utiliza en el presente documento comprende moléculas con una elevada afinidad a al menos un producto génico codificado por los genes seleccionados, para asegurar una unión fiable. Las sustancias son preferiblemente específicas a partes del producto génico. Tales partes representan una restricción a aquellas regiones que son suficientes para la expresión de una función específica, es decir la provisión de un determinante estructural para el reconocimiento. Todos los truncamientos están inevitablemente limitados por el requerimiento de preservar el reconocimiento único. Sin embargo, las partes de los productos génicos pueden ser muy pequeñas. Preferiblemente, las sustancias son mono-específicas para garantizar una interacción exclusiva y dirigida con la única diana elegida.
El reconocimiento del producto génico o partes del mismo, de acuerdo con la invención puede ser realizado mediante una interacción específica con las sustancias en el nivel primario, secundario y/o terciario de la estructura de una secuencia de ácidos nucleicos que lleva la secuencia génica o una secuencia de aminoácidos expresada por el gen. La función codificante de la información genética favorece el reconocimiento de la estructura primaria. Por el contrario, la estructura tridimensional va a ser considerada principalmente para el reconocimiento de proteínas. En el contexto de la presente invención, el término “reconocimiento” – sin estar limitado al mismo – hace referencia a cualquier tipo de interacción entre las sustancias específicas y la diana, en particular unión o asociación covalente o no covalente, tal como un enlace covalente, interacciones hidrofóbicas/ hidrofílicas, fuerzas de van der Waals, pares de iones, enlaces de hidrógeno, interacciones ligando-receptor, interacciones entre el sitio de unión del anticuerpo y del epítopo, apareamiento de bases de nucleótidos, y similares. Tal asociación puede además abarcar la presencia de otras moléculas tales como péptidos, proteínas u otras secuencias de nucleótidos.
Las sustancias específicas están compuestas de estructuras químicas y/o biológicas capaces de interactuar con la molécula diana de tal manera que hace posible un reconocimiento, la unión y la interacción. En particular, las sustancias se seleccionan del grupo de ácidos nucleicos, péptidos, carbohidratos, polímeros, pequeñas moléculas que tengan un peso molecular entre 50 y 1.000 Da y proteínas, preferiblemente ácidos nucleicos. Las sustancias específicas expresan una sensibilidad y especificidad suficiente para asegurar una detección fiable.
Las proteínas o péptidos se seleccionan, preferiblemente, del grupo que consiste en anticuerpos, citocinas, lipocalinas, receptores, lectinas, avidinas, lipoproteínas, glicoproteínas, oligopéptidos, ligandos peptídicos y hormonas peptídicas. Más preferiblemente, los anticuerpos se utilizan como sustancias específicas.
El término “ácido nucleico” hace referencia a un polímero sintético o natural de ADN o ARN de cadena simple o doble que incluye, de manera alternativa, nucleótidos sintéticos, no naturales o modificados, que pueden ser incorporados en polímeros de ADN o ARN. Cada nucleótido consiste en una fracción de azúcar, una fracción de fosfato, y un residuo de purina o bien de pirimidina. Los ácidos nucleicos son, de manera preferente, ADN o ARN de cadena doble o sencilla, cebadores, oligonucleótidos antisentido, ribosomas, enzimas de ADN, aptómeros y/o ARNip
o ARN interferente pequeño, o partes de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden modificarse de manera opcional como ADN fosforotioato, ácido nucleico bloqueado (LNA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico peptídico (PNA, por sus siglas en inglés) o spiegelmer.
Es un objeto preferido de la presente invención utilizar sondas de ácido nucleico que hibridan bajo condiciones rigurosas con los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, o preferiblemente los productos génicos codificados por dichos genes, o respectivas partes de los mismos, para detectar actividad genotóxica y/o pro-genotóxica. Una “sonda de ácido nucleico” es un ácido nucleico capaz de unirse a un ácido nucleico diana o secuencia complementaria mediante uno o más tipos de enlace químico, habitualmente mediante apareamiento de bases complementario mediante la formación de enlaces de hidrógeno. Tal como se utiliza en el presente documento, una sonda puede incluir bases naturales (es decir, A, G, C, o T) o modificadas (por ejemplo, 7-deazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases en una sonda pueden estar unidas mediante un ligamiento distinto de un enlace fosfodiéster, siempre que no interfiera con la hibridación. Debe entenderse por parte de cualquier experto en el arte que las sondas pueden unir secuencias diana que carezcan de complementariedad completa con la secuencia de la sonda, dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Las sondas son, preferiblemente, directamente marcadas con isótopos, por ejemplo cromóforos, luminóforos o cromógenos, o indirectamente marcadas con biotina a la que se puede unir más tarde un complejo de estreptavidina. Mediante el ensayo de la presencia o ausencia de la sonda, se puede detectar la presencia o ausencia de un gene de interés diana. Las sondas de ácido nucleico preferidas en particular para ser utilizadas como sustancias específicas para genotoxicidad son las sondas de nucleótidos.
Las sustancias específicas pueden ser marcadas, al hacerlo el marcado depende de sus características inherentes y en el método de detección a ser aplicado. Para la detección de productos de incubación específicos, los métodos aplicados dependen de los productos de incubación específicos a ser monitorizados y son bien conocidos para los expertos en el arte. Ejemplos de métodos de detección adecuados de acuerdo a la presente invención son la fluorescencia, luminiscencia, coloración VIS, emisión radiactiva, procesos electroquímicos, magnetismo o espectrometría de masas.
Un método de marcado no se encuentra particularmente limitado, siempre y cuando un marcador sea detectado fácilmente. Un “ácido nucleico o sonda de oligonucleótidos marcado” es uno que está enlazado, ya sea de manera covalente a través de un conector o un enlace químico, o de manera no covalente a través de interacciones iónicas, de van der Waals, electrostáticas, hidrofóbicas o enlaces de hidrógeno, a un marcador, de tal manera que la presencia del ácido nucleico o sonda pueda ser detectada mediante la detección de la presencia del marcador enlazado al ácido nucleico o sonda. En un modo de realización preferido de la presente invención, los ácidos nucleicos están marcados con digoxigenina, biotina, sustancias quimioluminiscentes, colorantes fluorescentes, perlas magnéticas, perlas metálicas, partículas coloidales, reactivos densos en electrones, enzimas; todos ellos son bien conocidos en el arte, o con isótopos radiactivos. Los isótopos preferidos para marcar los ácidos nucleicos en el alcance de la invención son 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, o 125I, de manera más preferida 32P, 33P, o 125I.
Aún otro objeto de la invención hace referencia a una matriz génica que comprende las combinaciones definidas de las pluralidades génicas de acuerdo con cualquier Tabla o Figura en el presente documento. En particular, la invención puede ser llevada a la práctica como una matriz que comprende sondas de ácido nucleico que son capaces de hibridar específicamente bajo condiciones rigurosas con los genes GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, o preferiblemente productos génicos codificados por dichos genes, o partes respectivas de los mismos. La invención puede además ser llevada a la práctica como una matriz que comprende sondas de ácidos nucleicos que son capaces de hibridar de manera específica bajo condiciones rigurosas con los genes de la Figura 1 a+b y/o Figura 2 a+b o productos génicos codificados por dichos genes o partes respectivas de los mismos. Ambas matrices están particularmente diseñadas para realizar el método de la invención para el cribado de compuestos con actividad genotóxica y/o pro-genotóxica. Las matrices de la invención pueden incluir un artículo que comprende instrucciones escritas o dirige al usuario hacia instrucciones escritas sobre cómo llevar a la práctica el método de la invención. El contenido previo de la presente especificación con respecto al método de cribado se considera válido y aplicable sin restricciones al kit, si fuera oportuno.
En el alcance de la presente invención, se proporciona por primera vez un método para el cribado de compuestos con actividad genotóxica, que aplica patrones de expresión génica única de la menos 11 genes seleccionados del grupo que comprende los genes de la Tabla 1. La presente invención describe las huellas de expresión
características de un subconjunto de genes marcadores que están asociados con la genotoxicidad. El análisis de datos estadísticos reveló incluso 91 genes que son los más representativos para la respuesta (pro-)genotóxica. Diversos procesos tales como la diferenciación celular y la regulación interactiva compleja del estrés y la respuesta al daño en el ADN mediante los moduladores de transcripción STAT1, SP1 y P53, se regulan diferencialmente. El conjunto de genes evaluado se utilizó de manera ventajosa para predecir las características de la Nnitrosodietilamina (DEN, por sus siglas en inglés) después de su activación metabólica. La DEN podría ser clasificada correctamente como no-genotóxica sin S9 y genotóxica en presencia de MAS mediante su firma genómica. Los datos respaldan que el perfil del mecanismo in vitro es una herramienta poderosa en comparación con las detecciones de un único criterio de valoración para predecir la genotoxicidad.
Los resultados de la presente invención demuestran que los compuestos (pro-)mutagénicos inducen patrones de expresión génica característicos en células HepG2. Un enfoque tal basado en la genómica puede ser aplicado en el futuro, además de la actual batería de ensayos estándar para la genotoxicidad, ayudando a manejar los resultados equívocos de los diferentes ensayos in vitro. Realizar el perfil del mecanismo resulta beneficioso durante la interpretación de tales datos, y las investigaciones del mecanismo son una herramienta poderosa que facilita la clasificación de los compuestos genotóxicos. Además, los datos del mecanismo mejorarán la caracterización química y la evaluación de riesgos para los compuestos genotóxicos. Aplicar la realización del perfil genotóxico al cribado precoz durante el desarrollo farmacéutico ayuda a clasificar diferentes moléculas y a poner de relieve los compuestos con características genotóxicas en una etapa precoz del desarrollo, ahorrando costes y animales evitando ensayos de seguimiento in vivo. Los 91 genes marcadores putativos encontrados pueden ser utilizados en el futuro para la caracterización del potencial genotóxico de compuestos desconocidos. El análisis de los genes expresados diferencialmente es particularmente adecuado para sistemas de más alto rendimiento. Por tanto, pueden identificarse sustancias químicas con un modo de acción desconocido y predecir su potencial para ejercer efectos genotóxicos. El método de detección además del método de monitorización de la invención resultante, pueden ser realizados de manera simple y rápida. Además, la matriz apropiada se produce de manera económicamente rentable.
Cuando se realiza el cribado de compuestos in vitro y se monitorizan las condiciones fisiológicas y patológicas, los genes de la Tabla 1, la Figura 1 a+b y la Figura 2 a+b se califican como biomarcadores para detectar y caracterizar la genotoxicidad. Los productos génicos diana codificados por dichos genes son sumamente específicos para la actividad genotóxica y los trastornos médicos derivados de la misma. Todas las sondas de las sustancias se caracterizan por una elevada afinidad, especificidad y estabilidad además de bajos costes de fabricación y una manipulación práctica. Estas características forman la base para una acción reproducible, en donde se incluye la ausencia de reactividad cruzada, y para una interacción fiable y segura con sus estructuras diana coincidentes.
Todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan a modo de referencia en la revelación de la invención.
Debe entenderse que la presente invención no se encuentra limitada a los métodos en particular, sustancias específicas, usos y matrices descritos en el presente documento, ya que tal materia puede variar. Debe entenderse además, que la terminología utilizada en la presente patente tiene el propósito de describir únicamente modos de realización en particular, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que únicamente se define por las reivindicaciones adjuntas. Tal como se utiliza en la presente patente, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular de palabras tales como “uno/a”, “un”, y “el/la” incluyen sus correspondientes referentes en plural a menos que el contexto claramente indique algo diferente. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una sustancia” incluye una única o varias sustancias diferentes, y la referencia a “un método” incluye referencia a etapas equivalentes y métodos conocidos para un experto en el arte, y así sucesivamente. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente patente tienen el mismo significado que habitualmente se entiende por parte del experto en el arte al que la presente invención pertenece.
Las técnicas que son esenciales de acuerdo a la invención se describen en detalle en la especificación. Otras técnicas que no se describen en detalle corresponden a métodos estándar conocidos, que son bien conocidos para un experto en el arte, o las técnicas se describen en más detalle en referencias citadas, solicitudes de patente o publicaciones estándar. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente patente pueden ser utilizados en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen a continuación ejemplos adecuados. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no de forma limitativa. Dentro de los ejemplos, se utilizan reactivos estándar y tampones que están libres de actividades contaminantes (cuando sea práctico). Los ejemplos han de interpretarse particularmente tal como que no están limitados a las combinaciones de características demostradas explícitamente, sino que las características ejemplificadas pueden combinarse sin restricciones nuevamente si el problema técnico de la invención se resuelve.
Las siguientes abreviaturas se utilizan en el presente documento:
ciclofosfamida (CPA); aflatoxina B1 (AFB1); 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA); N-nitrosodietilamina (DEN); actinomicina D (ACT); etopósido (ETO); metanosulfonato de metilo (MMS); teofilina (THEO, por sus siglas en inglés);
metformina (MET); sistema de activación metabólica (MAS, por sus siglas en inglés), citocromo P450 monooxigenasa (CYP); sin (s)
La finalidad de este estudio era evaluar la idoneidad de la realización del perfil de expresión génica global para la caracterización e identificación de mutágenos y pro-mutágenos in vitro. Se utilizaron matrices BeadChip de Illumina para cuantificar los cambios en la expresión génica después del tratamiento con tres mutagénicos bien conocidos, tres pro-mutagénicos además de dos compuestos no genotóxicos de referencia durante un periodo de 24 o 48 horas. En detalle, los perfiles de expresión génica de compuestos de ensayo mutagénicos (etopósido/ETO, actinomicina D/ ACT y metanosulfonato de metilo/ MMS), pro-mutagénicos (ciclofosfamida/ CPA, 7,12dimetilbenzo[a]antraceno/ DMBA, y aflatoxina B1/ AFB1) y no-genotóxicos (metformina/MET y teofilina/THEO), se geneeraron en células HepG2 después de 24 h y 48 h de tratamiento utilizando matrices HumanRef-8 BeadChip de Illumina. Para los ensayos pro-mutágenos, se trataron células HepG2 en combinación con fracciones S9 de hígado de rata homogeneizadas inducidas por β-naftoflavona/ fenobarbital como un sistema de activación metabólica (MAS), complementando su pobre capacidad metabólica. Un resumen exhaustivo del sistema de cultivo celular/ MAS utilizado y las características genotóxicas bien conocidas de los compuestos estudiados se publicó anteriormente (resumido en Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281). Con respecto a la selección de compuestos de ensayo, se prestó especial atención para elegir compuestos que tuvieran diferentes mecanismos de genotoxicidad. Más aún, los pro-mutágenos utilizados se activan metabólicamente mediante diversas citocromo-P450 monooxigenasas (CYPs). Después de la identificación de una firma de expresión génica común para los anteriores compuestos de ensayo, la firma se utilizó a continuación para predecir la genotoxicidad de la Nnitrosodietilamina (DEN).
●
Complementos de sustancias químicas y medios de cultivo celular
La actinomicina D (de la especie Streptomyces sp., pureza ≥ 95%), 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (pureza ≥ 95%), etopósido (pureza ≥ 98%), metanosulfonato de metilo (líquido, 99%), teofilina (pureza ≥ 99%), 1,1-dimetilbiguanida clorhidrato (metformina, pureza ≥ 97%), N-nitrosodietilamina (líquido), β-Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato, forma reducida, hidrato de sal tetrasódica, (NADPH) y la solución penicilina/estreptomicina fueron adquiridas de Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemania). La ciclofosfamida (monohidrato, pureza ≥ 97%) era de Calbiochem (Darmstadt, Alemania) y aflatoxina B1 de Acros Organics (Geel, Bélgica). DMEM/F12, gentamicina y piruvato de sodio fueron obtenidos de Invitrogen Corp. (Karlsruhe, Alemania). Suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés) se pidió a Hyclone (Nº de pedido CH30160, Lot No. CRJ0454, Perbio Science, Bonn, Alemania). El S9 de hígado de rata inducido con β-naftoflavona/ fenobarbital (Nº de pedido R1081.S9, Lot No. 0710507), fue adquirido de Tebu-bio (Offenbach, Alemania). El fosfato de sodio monobásico monohidratado, fosfato de sodio dibásico heptahidratado, cloruro de magnesio, y cloruro potásico fueron obtenidos de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania).
•
Cultivo celular
Se mantuvieron de forma rutinaria células HepG2 (Nº de pedido HB-8065, Lot. 3129867, ATCC, Manassas, USA) en DMEM/F12 con L-Glutamina y 15 mM de Hepes complementado con 10% (v/v) de FBS, 1% (v/v) de solución de penicilina (10 kU/ml)/ estreptomicina (10 mg/ml), 0,1% (v/v) de gentamicina (50 mg/ml), y 1 mM de piruvato de sodio a 37ºC y 5% de CO2 en matraces de cultivo. Dependiendo del experimento, un número apropiado de células se sembraron en placas y las células se cultivaron a 37ºC y CO2 al 5% durante 24 h antes del tratamiento. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces con células de los pases 4-20.
●
Tratamiento de las células y selección de la dosis
Se sembraron células en placas de 6 pocillos (1,5 x 106 células/pocillo) y se dejaron 24 h para su adherencia y a continuación se trataron con diferentes compuestos de acción directa o pro-genotóxicos además de con teofilina y metformina, que son no genotóxicos. El DMSO al 0,5% (v/v) se utilizó como vehículo de control para los experimentos con genotóxicos de acción directa, mientras que sólo se utilizó un 0,2% (v/v) de DMSO para los progenotóxicos para evitar interferencias con el sistema de activación metabólica. Las dosis de los compuestos de ensayo fueron elegidas de acuerdo con la citotoxicidad previa y los estudios de activación de la proteína P53 (Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281). Mientras que el esquema de tratamiento diario para los genotóxicos de acción directa fue continuo, las células fueron tratadas durante 6 h únicamente cuando la mezcla de pro-mutágenos más el homogeneizado de hígado S9 fue utilizada para limitar la citotoxicidad de la fracción S9. Al periodo de tratamiento de 6 h le siguió una etapa de lavado con medio de cultivo y un periodo de recuperación de 18
h. Después del periodo de recuperación de 18 h el tratamiento se repitió de acuerdo a la descripción anterior. El medio de tratamiento para pro-mutágenos consistía en una mezcla de S9 de 300 µl y 700 µl de medio de cultivo por pocillo. La mezcla de S9 contenía los siguientes componentes y concentraciones: 8 mM de MgCl2, 32,8 mM de KCI, 12 mM de NADPH, 124 mM de tampón de fosfato, y un contenido de 2500 pmol/ml de CYP correspondiente a 2,4 mM de MgCl2, 9,8 mM de KCI, 3,6 mM de NADPH, 37,2 mM de tampón de fosfato, y 750 pmol/ml de CYP como concentraciones finales en el medio tratamiento.
●
Extracción de ARN
Después del periodo de tratamiento, las células se enjuagaron con PBS (Gibco Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se cultivaron y el ARN total fue extraído utilizando el mini kit RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania), tal como se describe por el fabricante, que incluye el procedimiento con columna de centrifugado QIAshredder y digestión en columna de ADNasa libre de ARNasa. El ARN se eluyó con 40 µl de agua libre de ARNasa. El control de calidad y la cuantificación del ARN se determinó utilizando un espectrómetro NanoDrop® (Kisker, Steinfurt, Alemania), y un Bioanalizador Agilent (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). Sólo se utilizó el ARN con un relación de calidad A260/A280 entre 1,9 y 2,1 y ninguna evidencia de pico de degradación (18s/28s).
●
Síntesis de ARNc e hibridación completa del chip genómico de Illumina
El análisis de la expresión génica se ejecutó utilizando matrices HumanRef-8 V2 BeadChip Sentrix® de Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, USA), que permiten el análisis de ~ 23.000 transcritos. La síntesis del ARNc marcado con biotina se realizó en un procedimiento automático utilizando Theonyx Liquid Performer (Aviso GmbH, Greiz, Alemania) y el kit de amplificación de ARNa MessageAmp™ II ((Ambion, Darmstadt, Alemania) con diversas modificaciones solicitadas por Illumina para optimizar el proceso (Zidek et al., 2007, Toxicol Sci 99, 289-302). En lugar de depuración en columna, se aplicó un sistema basado en perlas Agencourt® RNAclean™ (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania) para purificar el ADNc y el ARNc. La cantidad de ARNc se midió de manera espectrofotométrica (NanoDrop®) y el Bio-analizador Agilent 2100 fue utilizado para la evaluación de la cualidad.
Setecientos cincuenta nanogramos de ARNc biotinilado amplificado se hibridaron en el BeadChip Sentrix® de Illumina en un cartucho de hibridación bajo condiciones de humedad durante 20 h a 58ºC (horno de hibridación, Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Los chips se lavaron a continuación, se sometieron a tinción durante 10 minutos con 1µg/ml de Cy3 conjugado con estreptavidina (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK), y finalmente se secaron mediante centrifugación de acuerdo al protocolo proporcionado. La detección de fluorescencia se llevó a cabo mediante láser confocal de barrido con el lector BeadArray Illumina® (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) a una resolución de 532 nm y 0,8 µm.
● Análisis de datos estadísticos
El software BeadStudio Illumina® se utilizó para condensar los datos brutos y además para asegurar la calidad de la matriz basado en diferentes parámetros de las perlas de control tal como se describe para un estudio previo (Boehme et al., 2009, Toxicol. Appl. Pharmacol. 236, 85-96). Posteriormente, los datos fueron cargados en el software Genedata’s Expressionist® Analyst (Genedata AG, Basilea, Suiza), para la normalización de datos y el análisis estadístico. Los datos se normalizaron utilizando regresión local o Lowess (del inglés Locally Weighted Linear Regression), para experimentos con mutágenos y sobre una intensidad de señal mediana de 100 para estudios de mutágenos para contrarrestar las diferencias no biológicas (variación sistemática) entre las muestras y las matrices. Después de la normalización se calculó el número de veces de eventos de regulaciones para el tratamiento con cada compuesto individual contra las correspondientes muestras de vehículo de control con y sin S9, respectivamente. La transformación a valores relativos fue imperativa para lograr la comparabilidad de los datos de diferentes estudios.
Para la identificación de los genes característicos, que representan el modo de acción mutagénico común de los compuestos sometidos a ensayo, se utilizó un conjunto datos de entrenamiento que constituían el grupo (pro)genotóxico y la teofilina y metformina como compuestos no genotóxicos. DEN se utilizó como un compuesto de ensayo “desconocido” y por lo tanto, se excluyó del grupo de entrenamiento. Los genes más predictivos se identificaron mediante clasificación génica con un ANOVA para la separación del grupo, seguido del algoritmo de máquinas de soporte vectorial (SVM, por sus siglas en inglés) para el cálculo clasificador. El valor predictivo fue evaluado mediante una validación cruzada de k-veces (k=10, repetición 50 veces) y el clasificador construido a partir del grupo de entrenamiento se utilizó a continuación para predecir la toxicidad de DEN.
Para la investigación de los genes expresados diferencialmente específicos al compuesto (efectos de S9 y DEN), los perfiles de la expresión de genes se compararon individualmente con el vehículo de control (para la evaluación de los efectos de S9) y con los compuestos de referencia (para la evaluación de los efectos de DEN), mediante la prueba T de Student o análisis de varianza (ANOVA), respectivamente. Los valores BH-q (tasa de falsos descubrimientos de Benjamini y Hochberg) se utilizaron como una medida de significación además del valor p (Benjamini y Hochberg, 1995, J.R. Statist. Soc. 57, 289-300).
Siguiendo el análisis estadístico, los datos fueron interpretados en un contexto biológico/ funcional utilizando bases de datos y herramientas de análisis vías de GeneGo (Metacore™), Ingenuity (IPA®), y Cambridge Cell Networks (ToxWiz). Todos los datos se grabaron de conformidad a las recomendaciones MIAME (Minimal Information About a Microarray Experiment, Mínima información sobre el experimento de micromatrices), que incluye descripciones de análisis experimentales/ de datos y están disponibles como información complementaria.
La Tabla 1 detalla los valores de desregulación y las estadísticas de clasificación de los 91 genes marcadores putativos identificados para los compuestos de ensayo genotóxicos y pro-genotóxicos (modelo de clasificación). Se trataron células HepG2 con 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA), dietilnitrosamina (DEN), ciclofosfamida (CPA) y aflatoxina B1 (AFB1), además de con teofilina (THEO) y metformina (MET) como controles, a diario durante 6 h seguido de 18 h de recuperación durante un periodo total de 48 h en presencia y ausencia de un sistema de activación metabólica (S9 inducido con β-naftoflavona/ fenobarbita). En contraste con los tratamientos progenotóxicos, las células fueron expuestas de forma continua a genotóxicos de acción directa durante un periodo de 24 h y 48 h. Los medios de cultivo celular que contenían el compuesto de ensayo fueron aspirados y reemplazados cada día por medios de tratamiento frescos. Los 91 genes con la máxima valoración fueron identificados mediante clasificación génica con ANOVA para la separación del grupo, seguido del algoritmo de máquinas de soporte vectorial (SVM) para el cálculo clasificador. Los datos detallados en la actual tabla representan valores de media de las regulaciones de genes en relación a los correspondientes controles del vehículo/S9 de los tres diferentes experimentos con pases celulares que se sitúan en un rango de 3 a 25. 1Compuestos pro-genotóxicos de la parte experimental, 2Compuestos genotóxicos de la parte experimental, 3Número de clasificación de la estadística de clasificación ANOVA, 4Tendencia de regulación general en muestras (pro-)genotóxicas.
La Tabla 2 detalla los valores de desregulación de los genes seleccionados, que mostraron regulaciones consistentes en respuesta al tratamiento con compuestos modelo (pro-)genotóxicos. La tabla contiene los valores de desregulación de los genes seleccionados del modelo de clasificación basado en datos de micromatriz Illumina. Todos los ocho genes fueron inducidos de manera significativa (FC ≥ 1,5 veces (mostrado en naranja) en al menos 80% de muestra genotóxicas positivas del grupo de muestras de respuesta), en células HepG2 después de 48 h de tratamiento con compuestos modelo (pro-)genotóxicos. Los datos detallados en la tabla representan valores de media de las regulaciones de genes en relación a los correspondientes controles del vehículo/S9 de los tres diferentes experimentos con pases celulares que se sitúan en un rango de 3 a 25. Leyenda: actinomicina D (ACT), metanosulfonato de metilo (MMS), etopósido (ETO), aflatoxina B1 (AFB1), 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA), ciclofosfamida (CPA), dietilnitrosamina (DEN). *Significación determinada mediante la prueba T de Student, valor p < 0,05.
La Tabla 3 detalla la categorización de las muestras de ensayo para la evaluación de la respuesta genotóxica común. La asignación de clases se basó en la clase de compuesto además de en P53 y el análisis de la expresión génica de compuestos únicos. Las muestras fueron categorizadas como genotóxicas debido a la activación significativa de P53 y los cambios marcados en la expresión génica, en comparación con los vehículos de control. La respuesta positiva sin un MAS está causada por la competencia metabólica de células HepG2 tal como se ha mostrado previamente (Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281).
La Figura 1 a+b muestra el mapa de calor (heat map) de la función génica de los genes marcadores putativos en células HepG2 tratadas con compuestos genotóxicos. Las regulaciones y funciones génicas de los genes que se desregularon de manera significativa (ANOVA valor p-/ BH-q < 0.01) en más de 1,5 veces por incremento (rojo) o disminución (verde) en respuesta a 48 h de tratamiento con actinomicina D (ACT), metanosulfonato de metilo (MMS) y etopósido (ETO). Las concentraciones de los tratamientos fueron 500 nM para ETO, 500 µM (nd = dosis baja) y 2 mM (hd = dosis alta) para MMS, además de 250 nM para ACT. La teofilina (THEO) a una dosis de 100 µM se utilizó como control negativo. Las células fueron tratadas a diario durante un periodo de 6 h, 24 h y 48 a continuación del análisis de la expresión génica, utilizando micromatrices Illumina [la figura ha sido modificada de acuerdo a Genedata’s Expressionist® Analyst, Basilea/ Suiza].
La Figura 2 a+b muestra las regulaciones de genes características de los compuestos pro-genotóxicos y la categorización funcional de estos genes. Se trataron células HepG2 con 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA), dietilnitrosamina (DEN), ciclofosfamida (CPA) y aflatoxina B1 (AFB1), además de teofilina (THEO) y metformina (MET) como controles diariamente durante un periodo total de 48 h, en presencia y ausencia de un sistema de activación metabólica (S9 inducido con β-naftoflavona/ fenobarbital). Los experimentos se repitieron tres veces con diferentes pases celulares seguidos de la cuantificación de la expresión génica utilizando matrices HumanRef-8 V2 BeadChip de Illumina. (A) El mapa de calor muestra valores de expresión relativos de los 88 genes que hacen referencia a los vehículos de control. Los genes fueron identificados mediante ANOVA (valor p < 0,01/ valor BH-q < 0,03) en combinación con una aproximación de filtrado que aplica un corte en la desregulación de 1,5 veces en al menos un 40% de las muestras, que mostraron una respuesta genotóxica positiva. Los genes regulados por incremento (≥ 1,5 veces) se muestran en rojo y los genes regulados por disminución en verde (≤ -1,5 veces). La barra de regulación se encuentra a escala logarítmica. (B) Categorización funcional de genes utilizando las bases de datos MetaCore™ (GeneGo, St. Joseph/ USA) y ToxWiz (Cambridge Cell Networks, Cambridge/ UK). (C) Los genes desregulados directamente asociados con P53 se muestran como objetos en representación tipo network. La tabla más adelante resume los genes implicados en la cascada de señales de P53 completa. Las barras de regulación indican valores de la expresión génica de diferentes tratamientos ordenados análogamente a la cabecera del mapa de calor (A) [la figura ha sido modificada de acuerdo a Genedata’s Expressionist® Analyst (A) y ToxWiz (C)].
La Figura 3 muestra la clasificación de genes con el conjunto de datos de entrenamiento para evaluar un algoritmo de clasificación conveniente e identificar los genes más apropiados para la clasificación de compuestos. Para
construir el modelo, se construyó un conjunto de datos de entrenamiento a partir del grupo (pro-)genotóxico: se eligieron los tratamientos con actinomicina D, metanosulfonato de metilo y etopósido a las 24 h y 48 h como representativos de los genotóxicos de acción directa. En contraste con esto, se utilizaron exclusivamente tratamientos de 48 de las pro-genotoxinas 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno (DMBA), dietilnitrosamina (DEN), ciclofosfamida (CPA) y aflatoxina B1 (AFB1). Sin embargo, se categorizaron CPA -S9 además de AFB1 0,5 µM -S9 y DMBA 10 µM -S9 como no genotóxicos debido a la carencia o a la extremadamente débil respuesta de expresión génica. La teofilina (THEO), metformina (MET) y los controles de S9 se agruparon también junto con las nogenotoxinas. Se aplicó un ANOVA como método de clasificación génica en combinación con tres diferentes logaritmos de clasificación: máquinas de soporte vectorial (SVM) se muestra en azul, método K Nearest Neighbors (KNN) se presenta mediante el gráfico de color verde y el Análisis discriminante lineal de datos Sparese por la línea roja. Se utilizaron un kernel lineal y un factor de penalización de 10 como parámetros para el método SVM. Se ejecutó el KNN con una correlación positiva como medida de distancia y el valor k se estableció en 4. La previsibilidad se evaluó mediante una validación cruzada de k-veces (k=10, 50 repeticiones). El SVM reveló las tasas de clasificación errónea en dependencia del número de genes utilizados para el cálculo clasificador. Se logró una tasa de clasificación errónea mínima de 4,7% con los 91 genes de máxima valoración. La clasificación de los genes se llevó a cabo utilizando el paquete de Software Expressionist® Analyst de Genedata (Basilea/ Suiza).
La Figura 4 (A) muestra el análisis de componentes principales (ACP) de todos los datos de la expresión genómica de los compuestos de ensayo pro-genotóxicos y no genotóxicos. Los datos de expresión Illumina se normalizaron sobre una intensidad de señal mediana antes de someter los datos a un ACP. Los efectores más importantes utilizados en la separación de una agrupación fueron el tiempo de tratamiento (círculos: 24 h, rombos: 48 h) y el sistema de activación metabólica (MAS/ S9 de hígado de rata: símbolos negros; sin MAS: símbolos blancos). La Figura (B) muestra ejemplos de genes regulados diferencialmente en células HepG2 en respuesta a la exposición de S9 (ANOVA valor de p-/BH-q < 0,05 y número de veces de eventos de cambio ≥ 1,5/ ≤ -1,5 después de tratamientos de 24 y/o 48 h) y funciones génicas correspondientes.
La Figura 5 (A/I y B/I) muestra ACPs de todos los datos de le expresión génica de las muestras de entrenamiento (pro-)genotóxicas (símbolos negros) y no genotóxicas (símbolos blancos), (se proporciona información detallada sobre la asignación de grupos en la tabla 3). Los datos mostrados son valores relativos calculados contra los vehículos/ vehículo-s9 de control. Mientras que el ACP A/I contiene todas las muestras de ensayo genotóxicas y progenotóxicas, B/I representa un zoom en el grupo cerca del origen de la coordinada de los tres componentes de separación. La línea de puntos indica una separación imaginaria entre las muestras (pro-)genotóxicas y no genotóxicas. En comparación con los análisis A/I y B/I, que comprenden datos de 24 h y 48 h de los compuestos de ensayo genotóxicos, pero datos de 48 h de los pro-genotóxicos únicamente, A/II y B/II muestran los datos correspondientes después de 24 h de tratamiento con (pro-)genotóxicos y no genotóxicos. El conjunto aleatorio de muestras dentro del ACP B/II ilustra el solapamiento, aún perfiles bastantes similares entre controles/ no genotóxicos en este punto primero en el tiempo.
La Figura 6 a-d muestra la representación del perfil de la función génica de genes regulados de manera diferencial en células HepG2 después del tratamiento con diversos compuestos (pro-)genotóxicos (barra amarilla) y no genotóxicos (barra zaul) durante 24 y/o 48 h. Las respuestas a los compuestos de ensayo fueron analizadas utilizando matrices Illumina. Los 91 genes, que se muestran en el mapa de calor, fueron identificados como los más predictivos mediante clasificación génica con ANOVA para la separación de grupo, seguida del algoritmo de máquinas de soporte vectorial (SVM) para el cálculo clasificador. La tasa de clasificación errónea, que fue evaluada mediante una validación cruzada de k-veces (k=10, repeticiones 50 veces), solo representa el 0,25% utilizando este grupo de genes. Las regulaciones de la expresión génica de los 91 genes también se proporcionan para DEN, que no formaba parte del grupo de entrenamiento. La escala de color corresponde al número de veces de un evento de cambio en la expresión génica: los genes regulados por incremento se muestran en rojo, los genes regulados por disminución en verde, y los genes no regulados en negro.
La Figura 7 muestra la regulación e interacción putativa de los genes dentro de la respuesta al daño en el ADN. Las flechas indican la tendencia de regulación general, regulación por incremento (↑) y por disminución (↓), respectivamente. Mientras que los genes representados sin paréntesis pueden ser encontrados bajo los 91 genes característicos para los compuestos de ensayo (pro-)genotóxicos, los genes entre paréntesis fueron regulados más de 1,5 veces únicamente por algunos de los compuestos de ensayo. Se sabe que los genes subrayados están controlados por los mediadores clave de la transcripción STAT1, P53, o SP1, que fueron identificados mediante regulaciones de los genes diana en los experimentos de realización de perfiles de la expresión génica con Illumina.
La Figura 8 muestra los mecanismos potenciales de la inducción y la señalización de P53 mediante los compuestos de ensayo genotóxicos. Se sugiere que la acumulación de P53 a continuación del daño en el ADN inducido por metanosulfonato de metilo (MMS) está mediada por los componentes de la reparación por escisión de bases (BER, por sus siglas en inglés), y la inhibición del inhibidor de P53 APAK mediante ATM y quinasas del punto de control de ciclo celular activadas tras el daño en el ADN. Este último mecanismo se postula como responsable de la inducción de P53 inducida por etopósido (ETO), además de las características inhibidoras de la topoimerasa II (TOPO2). En contraste, la inhibición de la ARN polimerasa II parecía ser principalmente responsable de la acumulación de P53
por actinomicina D (ACT). Más aún, la inhibición de TOPO2, además de la expresión de una variante de mdm2 no duncional (Mdm2*), puede además cumplir una función en la activación de P53 por parte de ACT. Las flechas indican la tendencia de regulación de los genes en las micromatrices Illumina (↑/ ↓= regulación por incremento-/por disminución por un número de veces de evento de inducción ≥ 1,5 veces).
La Figura 9 a+b muestra el patrón de expresión génica de N-nitrosodietilamina (DEN). (A) Clasificación de DEN como genotóxico con S9 y no genotóxico sin un sistema de activación metabólica externo, utilizando el clasificador de los 91 genes calculado a partir del grupo de entrenamiento mediante la clasificación génica combinada con el algoritmo SVM. (B) Genes desregulados de manera significativa (ANOVA valor p/valor BH-q < 0,01 y número de veces de eventos de cambio mayor de 1,5 veces, en al menos un 40% de las muestras de DEN de 48 h), implicó funcionalmente la respuesta a la toxicidad del ADN inducida por DEN.
Ejemplo 1: Parámetros que influencian la expresión génica global
En la presente invención, se investigaron los patrones de la expresión génica de compuestos genotóxicos, progenotóxicos y no genotóxicos bien conocidos. Inicialmente, los parámetros que influencian la expresión génica fueron identificados mediante análisis de componentes principales (ACP). El ACP reveló un efecto de tiempo y un marcado efecto del sistema de activación metabólica sobre la expresión génica de los compuestos de ensayo (Figura 4A), mientras que las réplicas biológicas (pases celulares) no tuvieron influencia alguna sobre la distribución global de datos. El análisis de la expresión génica inducida por S9 reveló 164 genes desregulados de forma significativa más de 1,5 veces tras 24 h y/o 48 h de tratamiento (ANOVA de ambos puntos de tiempo contra los DMSO de control, valor p-/BH-q < 0,05). Se observó que ciento cincuenta de estos genes se regularon por disminución y 14 por incremento. El setenta y siete por ciento de los genes regulados por disminución mostraron regulaciones similares tras 24 h y 48 h. Los genes que se observaron se regularon de manera diferencial tras la exposición a S9 estaban implicados en procesos tales como el metabolismo de vitaminas/CoA, ácido fólico, ácidos/lípidos grasos y nucleótidos, además de en la proteólisis, adhesión celular, la respuesta al estrés celular/oxidativo, y desarrollo de la regulación génica/ proliferación celular (Figura 4B).
Ejemplo 2: Patrones de expresión génica de compuestos (pro-)genotóxicos y genotóxicos
La influencia sustancial del MAS en las firmas de expresión génica fue un desafío porque cualquier efecto de una sustancia específica estaba enmascarado. Por lo tanto, los datos fueron convertidos a valores relativos a modo de referencia para su vehículo/ vehículo S9 de control en el mismo pase celular para hacerlos independientes del experimento y ajustar el efecto mediado por la sustancia por el mediado por S9. La Figura 5 muestra que este tipo de corrección presenta el efecto de la sustancia y los compuestos genotóxicos y no genotóxicos están ahora agrupados por separado. Debido a los cambios en la expresión génica marcada después del tratamiento con ACT y MMS, la separación del grupo fue difícil de resolver totalmente (Figura 5A/I). Sin embargo, si se excluían ACT y MMS del ACP (en primer plano) la clara separación de las clases de compuestos genotóxicos de los no genotóxicos se hacía visible (Figura 5B/I). En contraste, no era visible separación alguna para los compuestos pro-genotóxicos después de 24 h de tratamiento (Figuras 5A/II y 5/BII). El análisis estadístico de compuestos únicos (Pruebas T pareadas bilaterales contra los vehículos de control adecuados), confirmaron esta respuesta negativa después de 24
h. Más aún, CPA sin S9, AFB1 0,5 µM sin S9 y DMBA 10 µM sin S9, todos causaron únicamente cambios en la expresión génica extremadamente débiles o no significativos estadísticamente, respectivamente. Por lo tanto, estas muestras fueron categorizadas como no genotóxicas junto con MET y THEO. En general, la clasificación de compuestos para su análisis adicional se basó en una combinación de evaluación de la clase de compuestos, P53 (Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281) y la expresión génica a partir del análisis de un único compuesto según se detalla en la Tabla 3.
En la Figura 1 a+b y la Figura 2 a+b, el análisis de datos ha sido realizado por separado para la correspondiente clase de compuestos, es decir, la Figura 1 a+b hace referencia a los compuestos genotóxicos que tienen un modo de acción directa, mientras que la Figura 2 a+b hace referencia a compuestos pro-genotóxicos que son efectivos después de la activación metabólica. En la Figura 6 a-d y la Tabla 1, se ha establecido un modelo de clasificación con ambos conjuntos de datos de la Figura 1 a+b y la Figura 2 a+b. Ya que ambas clases (ya actúen directa o indirectamente) son genotóxicas, se les asignó a un único grupo y se compararon con compuestos de control. DEN fue negativo en con respecto a la activación de P53 y fue por lo tanto excluido del conjunto de datos y por tanto, el conjunto de datos de entrenamiento sin DEN se utilizó para construir un clasificador molecular para identificar los genes más predictivos para compuestos (pro-)genotóxicos. Una clasificación de genes basada en ANOVA a continuación de un método de determinación de clasificador basado en un algoritmo SVM, reveló la mejor previsibilidad utilizando los 91 genes de máxima valoración. Las regulaciones de estos genes y la categorización funcional se muestran en la Figura 6 a-d en una vista de un mapa de calor de funciones. Los resultados corroboran la asignación del grupo de muestras genotóxicas y no genotóxicas de los experimentos previos. CPA sin MAS no regularon de manera diferencial los 91 genes, mientras que con S9 pudo observarse una marcada regulación por incremento y por disminución. Más aún, mientras que la dosis más baja de AFB1 (0,5 µM) sin S9 no cambió la expresión génica de los 91 genes en comparación con el control, dosis más elevadas o la adición de S9 a dosis más bajas condujo a una respuesta alterada dentro de la expresión de los genes seleccionados. Un perfil de regulación
génica similar se observó para DMBA, por la que los cambios de expresión génica a 75 µM sin S9 fueron relativamente débiles en comparación con la respuesta genotóxica de los otros compuestos de ensayo. Más aún, la respuesta de ETO fue también débil tras 24 h, pero más fuerte después de 48 h de tratamiento. DMBA (75 µM) sin S9 y ETO (después de 24 h) fueron de este modo compuestos de restricción para la predicción, y solo se les predijo correctamente cuando se utilizaron los 91 genes de valoración máxima, pero no si se utilizaban todos los genes, porque la base de los genes regulados de manera no diferencial era extremadamente elevada en comparación con los genes desregulados. Los resultados fueron verificados mediante la determinación de la regulación de 11 de los 91 genes y 32 de los 91 genes (Figura 3).
Ejemplo 3: Clasificación de N-nitrosodietilamina basada en la genómica
Con la ayuda de los 91 genes que se descubrió eran los más predictivos para los compuestos de ensayo (pro)genotóxicos, se evaluó la respuesta de expresión génica de DEN. En contraste con los experimentos de activación de P53 previos, donde no se pudo establecer una respuesta positiva reproducible, DEN se predijo correctamente como genotóxico en presencia de S9 mediante el análisis de la expresión génica (Figura 9A). Esto nos empujó a analizar en más detalle la expresión génica específica de DEN. El análisis estadístico (ANOVA contra los compuestos no genotóxicos MET y THEO, valor p/ valor BH-q < 0,01) reveló 88 genes regulados por incremento y 57 por disminución, que se encontraban por encima del corte de desregulación de al menos 1,5 veces en más del 40% de las muestras de DEN de 48 h. Los criterios de corte se orientaron a las muestras de 48 h debido a la carencia de respuesta o a la respuesta débil en tratamientos de 24 h, tal como se ha mencionado para los otros compuestos de ensayo. Las vías toxicológicas generales identificadas, reflejaban claramente la situación de estrés celular y la respuesta genotóxica tras la exposición de las células a DEN (Figura 9B). Especialmente para la última, muchas vías que son mediadoras en – entre otros – la apoptosis, puntos de control/ detección del ciclo celular, y reparación del daño en el ADN además de los genes implicados directamente en la señalización de P53, fueron identificadas como similares a los otros compuestos de ensayo presentes. Más aún, si el patrón de regulación de los genes inducidos con DEN, que comprenden los 145 genes del análisis único además de los 91 genes marcadores putativos, es comparado, podría detectarse una regulación similar sin la adición de S9 aunque los valores de expresión fueron a menudo más elevados en presencia de S9. Por tanto, los datos sugieren una activación o desintoxicación metabólica insuficiente, lo que conduce a un efecto genotóxico aumentado, ya a dosis inferiores de DEN con el MAS. La activación metabólica mediante las propias células HepG2 no expresa suficientemente CYP2A6 y CYP2E1 (Boehme et al., 2010, Toxicol. Lett. 198, 272-281), representando las principales enzimas que convierten DEN en el metabolito genotóxico principal. Aparentemente, la adición de un MAS externo activa DEN únicamente de forma parcial, sin embargo, mientras que los cambios débiles fueron grabados mediante el análisis de la expresión génica, la activación no es presumiblemente suficiente, o la desintoxicación demasiado pronunciad para provocar una respuesta de P53 estable, detectable.
De hecho, la dificultad del cribado de nitrosaminas ha sido descrita en diversas ocasiones en la literatura. Aunque la reactividad del ADN y la carcinogenicidad in vivo es generalmente aceptada para este tipo de compuesto (la mayoría de nitrosaminas son del grupo IARC 2A y 2B clasificado como carcinógenos potenciales), diferentes ensayos in vitro revelan únicamente a menudo resultados débiles o incluso negativos. Mientras que las dificultades de cribado con nitrosaminas en las líneas celulares fueron explicadas a menudo por una carencia de actividad de CYP2E1, el estudio no es partidario del metabolismo con fase I restringida como la razón principal. Se demostró una respuesta positiva para DEN en ensayo de elución alcalina/UDS utilizando hepatocitos primarios competentes para CYP, únicamente a concentraciones muy elevadas (10-32 mM). Más aún, se sometió a prueba S9 inducido con βnaftoflavona/ fenobarbital, pero además microsomas inducidos con isionazida (CYP2E1). Los estudios de citotoxicidad y activación de P53 no revelaron diferencia alguna entre ambos MAS, lo que sugiere otra causa de la respuesta ausente. Las células HepG2 tienen de hecho capacidad metabólica en fase II. La biotransformación de fase II de las nitrosaminas tiene lugar mediante conjugación con glutatión, aminoácidos, ácido sulfúrico o glucurónidos. Una reacción de conjugación habitual de las nitrosaminas con glucurónidos es catalizada mediante UDP glucuronosiltransferasas (UGTs). Aunque la expresión basal fue débil en células HepG2, las enzimas seleccionadas UGT1A pudieron ser inducidas por rifampicina o 3-metilcolantreno. Más aún, se ha mostrado que los transportadores ATP MRP1 y MRP2 son parcialmente inducidos y están probablemente implicados en la excreción de nitrosaminas. Además del metabolismo en fase II, el carácter volátil del ion de diazonio puede ser responsable de resultados controvertidos in vitro.
Tabla 3
Muestra de ensayo
Dosis Tiempo MAS (+) con S9 (-) sin S9 Clase de compuesto Categorización P53 (+) FC≥1,5/FC≥1, 5 y Valor p≤0,05
metanosulfonato
500 µM 24h - Genotóxico genotóxico +/+
de metilo
500 µM 48h - Genotóxico genotóxico +/+
250 nM 24h -Genotóxico genotóxico +/+
actinomicina D
250 nM 48h -Genotóxico genotóxico +/+
500 nM 24h -Genotóxico genotóxico +/+
etopósido
500 nM 48h -Genotóxico genotóxico +/+
25 µM 48h -Pro-genotóxico no-genotóxico -/
25 µM 48h + Pro-genotóxico genotóxico +/+
ciclofosfamida
50 µM 48h -Pro-genotóxico no-genotóxico -/
50 µM
48h + Pro-genotóxico genotóxico +/+
0,5 µM
48h - Pro-genotóxico no-genotóxico -/
0,5 µM
48h + Pro-genotóxico genotóxico +/
aflatoxina B1
1 µM 48h - Pro-genotóxico genotóxico# +/+
1 µM
48h + Pro-genotóxico genotóxico +/+
10 µM
48h - Pro-genotóxico genotóxico# +/+
10 µM 48h -Pro-genotóxico no-genotóxico +/+
7,12
10 µM 48h + Pro-genotóxico genotóxico +/
dimetilbenzo[a]antraceno
75 µM
48h - Pro-genotóxico genotóxico# +/+
100 µM
24h - No-genotóxico no-genotóxico -/
teofilina
100 µM 48h - No-genotóxico no-genotóxico -/
100 µM
48h + No-genotóxico no-genotóxico -/
1 mM 48h + No-genotóxico no-genotóxico -/
metformina
1 mM 48h -No-genotóxico no-genotóxico -/
0,2% S9 de control 48h + No-genotóxico no-genotóxico -/-DMSO

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para someter a ensayo un compuesto para actividad genotóxica y/o pro-genotóxica, que comprende las etapas de:
    (a)
    poner en contacto dicho compuesto a ser sometido a ensayo con un sistema celular de ensayo que exprese al menos un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, en donde el sistema se selecciona del grupo de células únicas, cultivos celulares, tejidos, órganos y mamíferos no humanos; y
    (b)
    detectar y cuantificar la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo, en donde la expresión génica se correlaciona con una cantidad de señal o cambio en la señal, y comparar la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo con la expresión de dicho panel de genes en un sistema de control celular negativo, en donde una regulación por incremento de la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de ensayo, comparada con la expresión de dicho panel de genes en dicho sistema de control, indica que dicho compuesto tiene actividad genotóxica y/o pro-genotóxica.
  2. 2.
    Método según la reivindicación 1, en donde en la etapa (a) dicho compuesto a ser sometido a ensayo se administra a un mamífero no humano, y en la etapa (b) la expresión de dicho panel de genes en una muestra biológica tomada del mamífero no humano, es comparada con la expresión de dicho panel de genes en una muestra biológica tomada de un mamífero no humano que no muestra efectos genotóxicos, en donde dicha regulación por incremento indica una probabilidad aumentada de que dicho compuesto tenga un efecto terapéutico para una condición patológica mediada por genotoxicidad.
  3. 3.
    Método para la monitorización de la probabilidad de respuesta a un tratamiento contra el cáncer, tumores, metástasis o trastornos de angiogénesis, que son causados, mediados y/o propagados por la desregulación de la proliferación, diferenciación y/o reparación de daño, en donde los niveles de expresión de al menos un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, se determinan en una muestra biológica tomada de un mamífero en necesidad de tal tratamiento con al menos un compuesto genotóxico o pro-genotóxico, o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, que se administró a dicho mamífero, en donde un nivel de regulación por incremento indica una probabilidad aumentada de que dicho mamífero responda al tratamiento con dicho compuesto.
  4. 4.
    Uso de un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, como genes marcadores para someter a ensayo un compuesto para actividad genotóxica y/o pro-genotóxica.
  5. 5.
    Uso de sondas de ácido nucleico que hibridan específicamente bajo condiciones rigurosas con un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, o productos génicos codificados por dicho panel de genes, o respectivas partes de los mismos, para detectar y cuantificar la expresión de dicho panel de genes, que es representativo para una respuesta genotóxica y/o pro-genotóxica en un sistema celular.
  6. 6.
    Matriz para someter a ensayo un compuesto para actividad genotóxica y/o pro-genotóxica, que comprende sondas de ácido nucleico que hibridan específicamente bajo condiciones rigurosas con un panel de genes, que son GLS2, IER5, TMEM194, PROCR, ITGA2B, FADS3, STMN3, PIB5PA, ROBO3, EDA2R y KIF1A, o productos génicos codificados por dicho panel de genes, o respectivas partes del mismo.
ES11724556.3T 2010-06-24 2011-06-03 Análisis de la expresión de genes para la caracterización e identificación de compuestos genotóxicos Active ES2526977T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010024898A DE102010024898B4 (de) 2010-06-24 2010-06-24 Genexpressionsanalysen zur Charakterisierung und Identifizierung genotoxischer Verbindungen
DE102010024898 2010-06-24
PCT/EP2011/002742 WO2011160767A1 (en) 2010-06-24 2011-06-03 Gene expression analyses for characterizing and identifying genotoxic compounds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2526977T3 true ES2526977T3 (es) 2015-01-19

Family

ID=44275704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11724556.3T Active ES2526977T3 (es) 2010-06-24 2011-06-03 Análisis de la expresión de genes para la caracterización e identificación de compuestos genotóxicos

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20130102493A1 (es)
EP (1) EP2585612B1 (es)
JP (1) JP5421501B2 (es)
CN (1) CN102959090B (es)
CA (1) CA2803677C (es)
DE (1) DE102010024898B4 (es)
ES (1) ES2526977T3 (es)
IL (1) IL223816A (es)
WO (1) WO2011160767A1 (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104364649B (zh) * 2012-06-13 2017-05-17 默克专利股份有限公司 用于鉴定具有基因毒性的化合物的蛋白表达分析
WO2015069489A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Merck Patent Gmbh Predictive biomarker for hypoxia-activated prodrug therapy
EP4194853A1 (en) * 2016-12-28 2023-06-14 National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition Characteristic analysis method and classification of pharmaceutical components by using transcriptomes
CN112602153A (zh) * 2018-08-30 2021-04-02 生命科技股份有限公司 用于对pcr测定进行基因分型的机器学习系统

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2798392B1 (fr) * 1999-09-13 2005-07-15 Exonhit Therapeutics Sa Marqueurs genetiques de la toxicite, preparation et utilisations
JP4290438B2 (ja) * 2003-02-21 2009-07-08 ダイキン工業株式会社 Ｄｎａマイクロアレイ法を用いる毒性物質の同定方法
DE602005023517D1 (de) * 2004-11-24 2010-10-21 Hoffmann La Roche Verfahren zur bestimmung von genotoxizität
EP1880332A4 (en) * 2005-04-27 2010-02-17 Emiliem NOVEL METHODS AND DEVICES FOR EVALUATING TOXIC SUBSTANCES
JP4841279B2 (ja) * 2006-03-23 2011-12-21 一般財団法人 化学物質評価研究機構 被検物質の発がん性予測方法
CN102439138B (zh) * 2009-03-13 2018-03-30 阿勒根公司 可用于基于免疫的肉毒杆菌毒素血清a型活性测定的细胞

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013534820A (ja) 2013-09-09
US20130102493A1 (en) 2013-04-25
IL223816A (en) 2016-07-31
EP2585612B1 (en) 2014-10-22
JP5421501B2 (ja) 2014-02-19
CN102959090B (zh) 2015-11-25
DE102010024898B4 (de) 2012-10-25
DE102010024898A1 (de) 2011-12-29
CA2803677C (en) 2018-10-09
EP2585612A1 (en) 2013-05-01
CA2803677A1 (en) 2011-12-29
WO2011160767A1 (en) 2011-12-29
CN102959090A (zh) 2013-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102511807B1 (ko) 인간 ｅｚｈ2의 억제제 및 이의 사용 방법
Avissar-Whiting et al. Bisphenol A exposure leads to specific microRNA alterations in placental cells
Yoshino et al. Gene expression profiling predicts response to temozolomide in malignant gliomas
EP1831398B1 (en) Method for determining resistance or sensitivity to taxoid-based medicaments
ES2900301T3 (es) Biomarcadores asociados con la inhibición de BRM
US9371567B2 (en) Methods and kits to predict therapeutic outcome of BTK inhibitors
JP2010535782A5 (ja) メチルトランスフェラーゼを標的にすることによるメチル化を元に戻す方法
JP2019030300A (ja) 乳癌の治療および診断のための方法および組成物
US20160063179A1 (en) System for predicting prognosis of locally advanced gastric cancer
WO2003097830A1 (fr) Procede pour evaluer la sensibilite a l&#39;imatinib
WO2013130882A1 (en) Compositions and methods for treating cancer
US20160032401A1 (en) Glycine, Mitochondrial One-Carbon Metabolism, and Cancer
ES2526977T3 (es) Análisis de la expresión de genes para la caracterización e identificación de compuestos genotóxicos
US20120004119A1 (en) Gene expression markers of oncolytic virus sensitivity
JP2006523456A (ja) 分子細胞遺伝学的方法を用いる癌連鎖遺伝子および治療標的の確認
KR102018899B1 (ko) p53-비돌연변이 암에 대한 암 마커 유전자 및 치료제 스크리닝 방법
Chen et al. Single nucleotide polymorphisms and expression of ERCC1 and ERCC2 vis-a-vis chemotherapy drug cytotoxicity in human glioma
US20110151469A1 (en) Interferon epsilon (ifne1) as a marker for targeted cancer therapy
Borlon et al. Identification of p53-dependent genes potentially involved in UVB-mediated premature senescence of human skin fibroblasts using siRNA technology
WO2019031637A1 (ko) p53-비돌연변이 암에 대한 암 마커 유전자 및 치료제 스크리닝 방법
US20160299149A1 (en) Assays and methods for cell proliferation-targeted treatment therapies
Chung et al. Rapid screen of human genes for relevance to cancer using fission yeast
ES2393984B1 (es) Método de obtención de datos útiles para evaluar la respuesta al tratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU)
Cui et al. The changes of gene expression profiles in hydatidiform mole and choriocarcinoma with hyperplasia of trophoblasts
Feiner et al. An aging and p53 related marker: HOXA5 promoter methylation negatively correlates with mRNA and protein expression in old age