ES2900301T3 - Biomarcadores asociados con la inhibición de BRM - Google Patents

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Abstract

Un método para determinar si un sujeto que padece un cáncer asociado con una mutación de BRG1 responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM, en el que el cáncer es un carcinoma de pulmón de células escamosas, carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón de células grandes, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de hígado u ovario, que comprende: a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto con un reactivo capaz de detectar células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1; y b) comparar la muestra obtenida de dicho sujeto afectado con una muestra similar tomada de un sujeto de control no canceroso o normal, en la que la presencia de una o más mutaciones de BRG1 en dicha muestra obtenida de dicho sujeto afectado indica que dicho sujeto afectado responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM.

Description

DESCRIPCIÓN
Biomarcadores asociados con la inhibición de BRM
Campo de la invención
La invención está dirigida a métodos para determinar la sensibilidad al tratamiento con un inhibidor de BRM, kits y composiciones que comprenden inhibidores de BRM para su uso en el tratamiento de pacientes que tienen cáncer asociado con una mutación de BRG1.
Antecedentes de la invención
Los complejos multiproteicos SWI/SNF de mamífero (mSWI/SNF) regulan la estructura de la cromatina a través de la remodelación de nucleosomas dependiente de ATP y, por lo tanto, controlan muchos procesos celulares clave (Wilson, B. G. y C. W. Roberts (2011). Nat Rev Cancer 11(7): 481-492). Varias subunidades de los complejos mSWI/SNF tienen funciones como supresores tumorales, y estudios genómicos recientes revelaron mutaciones recurrentes en varias de estas subunidades, con una frecuencia de mutación colectiva de aproximadamente el 20 % en todos los cánceres (Kadoch, C., Hargreaves, D. C., et al. (2013) Nat Genet. 45: 592-601). La subunidad catalítica de SWI/SNF BRG1, también conocida como SMARCA4, está mutada con frecuencia en los adenocarcinomas de pulmón y otros tipos de cáncer (Becker, T. M., S. Haferkamp, et al. (2009) Mol Cancer 8: 4) (Imielinski, M., A. H. Berger, et al. (2012) Cell 150(6): 1107-1120).
Los mecanismos por los cuales las mutaciones de mSWI/SNF contribuyen a la tumorigénesis siguen siendo poco conocidos y su inactivación presenta un desafío para diseñar estrategias terapéuticas contra estas lesiones genéticas. Las mutaciones en subunidades específicas de los complejos mSWI/SNF se encuentran en distintos tipos de cáncer. En general, los complejos mSWI/SNF han surgido como la clase de reguladores de cromatina mutados con mayor frecuencia en el cáncer; se ha descubierto que al menos seis subunidades del complejo se inactivan específicamente con alta frecuencia en los cánceres, incluyendo subconjuntos de ovario, mama, riñón, pulmón, páncreas, útero, vejiga, estómago, colon e hígado (Kadoch, C., Hargreaves, D. C., et al. (2013) Nat Genet. 45: 592­ 601).
BRM (también conocida como SMARCA2) es el parálogo de BRG1 (o gen 1 relacionado con BRM/SWI2, también conocido como SMARCA4), y estas dos proteínas funcionan como subunidades dependientes de ATP mutuamente excluyentes dentro del complejo de remodelación de la cromatina de SWI/SNF de mamífero. Se requiere BRM o BRG1 para que las células ensamblen un complejo SWI/SNF catalíticamente activo. Se han caracterizado múltiples variantes del complejo SWI/SNF con diferente composición de subunidades, pero solo una subunidad catalítica (BRM o BRG1) está presente en cada complejo.
Se ha demostrado que BRG1 funciona como supresor tumoral y está mutada significativamente en cánceres humanos (Medina, Romero et al. 2008; Becker, Haferkamp et al. 2009). La evidencia de la función supresora de tumores de BRG1 se ha demostrado mediante la reexpresión de BRG1 de tipo silvestre en líneas celulares mutantes de BRG1, dando como resultado la diferenciación y la detención del ciclo celular (Hendricks, K. B., F. Shanahan, et al. (2004) Mol Cell Biol 24(1): 362-376, Dunaief, J. L., B. E. Strober, et al. (1994) Cell 79(1): 119-130). Los ratones Brg1+/- desarrollan carcinoma mamario con una incidencia del 10 % en un año (Bultman, S. J., J. I. Herschkowitz, et al (2008) Oncogene 27(4): 460-468). Se han identificado mutaciones de pérdida de función en BRG1 en ~30 % de las líneas establecidas de cáncer de pulmón no microcítico, y el silenciamiento de BRG1 se encuentra en muchas otras líneas de células cancerosas y muestras de tumores, incluyendo los cánceres de pulmón, páncreas y ovario, melanomas y sarcomas rabdoides pediátricos (Wilson et al.; Roberts et al.). Es importante destacar que los resultados recientes del proyecto Cancer Genome Atlas (TCGA) identificaron las mutaciones de BRG1 como una de las mutaciones más prominentes en muestras tumorales de pacientes con adenocarcinoma de pulmón, que se produce en ~10 % de todas las muestras tumorales (una tasa similar a la de otros oncogenes bien caracterizados y supresores de tumores tales como EGFR y LKB1) (Imielinski et al. (2012) Cell 150(6): 1107-1120). Por lo tanto, la identificación de los nodos letales sintéticos clave en los cánceres mutantes de mSWI/SNF, tales como en los cánceres con mutaciones/deficientes en BRG1, será fundamental para desarrollar las estrategias terapéuticas apropiadas para dirigirse a dichos cánceres.
Hay un grupo creciente de evidencias que sugiere que el perfil genético de un paciente puede ser determinante para la sensibilidad de un paciente a un tratamiento terapéutico. Dadas las numerosas terapias disponibles para un individuo que tiene cáncer, podría usarse una determinación de los factores genéticos que influyen, por ejemplo, en la respuesta a un fármaco particular, para proporcionar al paciente una pauta de tratamiento personalizada. Dichas pautas de tratamiento personalizadas ofrecen la posibilidad de maximizar el beneficio terapéutico para el paciente, mientras que minimizan los efectos secundarios relacionados que pueden asociarse con pautas de tratamiento alternativas y menos eficaces. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar factores que puedan usarse para predecir si un paciente probablemente responderá a una terapia particular. Es de particular interés determinar factores predictivos en el campo de la biología del cáncer y aprovechar terapéuticamente los descubrimientos relacionados con los nodos letales sintéticos clave en los diversos cánceres mutantes de SWI/SNF.
Sumario de la invención
La invención se define por las reivindicaciones. La divulgación que comprende la invención se basa en la identificación de una novedosa relación letal sintética entre las subunidades catalíticas de mSWI/SNF BRM y BRG1, a partir de cribados agrupados de ARN en horquilla corto (ARNhc) del epigenoma humano. Específicamente, la divulgación que comprende la invención se basa en el nuevo hallazgo de que la inhibición de la función de BRM bloquea el crecimiento de células cancerosas con alteración o pérdida de la función de BRG1 debido a mutaciones inactivadoras en el gen BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1 a través de mecanismos alternativos distintos de las mutaciones inactivadoras. La divulgación que comprende la invención representa un avance significativo con respecto al conocimiento actual en el campo, ya que hasta la fecha no se han identificado sistemáticamente interacciones letales sintéticas con el estado de mutación de BRG1 ("letalidad sintética", que se refiere a cuando una combinación de mutaciones en dos o más genes conduce a una viabilidad celular reducida y/o una tasa reducida de proliferación celular, mientras que una mutación en solo uno de estos genes no lo hace). Dado que BRM es el parálogo de BRG1, el descubrimiento sugiere un modelo en el que las mutaciones de BRG1 conducen a un complejo hipomórfico que promueve la tumorigénesis y en el que las células cancerosas no pueden tolerar la inactivación completa del complejo. Por lo tanto, el direccionamiento a subunidades de mSWI/SNF que exhiben actividades redundantes con respecto a los complejos mutados, por ejemplo, direccionamiento a BRM y BRG1, puede presentar una estrategia general para diagnosticar y/o tratar cánceres mutados de mSWI/SNF.
En un aspecto, la invención incluye un método para analizar, evaluar y/o detectar el estado de mutación de BRG1, los niveles de expresión del gen BRG1, los niveles de proteína BRG1 en paralelo al estado de expresión de BRM y/o la función de la proteína BRG1, para predecir si un sujeto que padece cáncer asociado con una mutación de BRG1 responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM. El análisis, la evaluación y/o la detección del estado o los niveles de mutación de BRG1 pueden incluir ejemplos no limitantes, tales como analizar y/o evaluar muestras de un sujeto que padece dicho cáncer para detectar (i) mutaciones de BRG1 no codificantes o de inserción/deleción (por ejemplo, cambio de marco) que dan como resultado la pérdida de proteína o actividad; (ii) mutaciones de BRG1 de sentido alterado que inactivan la función de la proteína; (iii) cambios en los niveles de expresión del gen BRG1; (iv) cambios en los niveles de proteína BRG1; y/o (v) cambios en la función de la proteína BRG1. Cualquiera de los cambios, mutaciones o diferencias son relativos a una muestra correspondiente en otro sujeto (por ejemplo, un sujeto de control no canceroso o normal), o en el mismo sujeto en un punto temporal diferente (por ejemplo, después del tratamiento con un tratamiento contra el cáncer). En paralelo, para que los sujetos que padecen cáncer con pérdida de BRG1 sean candidatos adecuados para el tratamiento con un inhibidor de BRM, el sujeto debe conservar una copia funcional y/o debe exhibir una expresión adecuada del gen BRM, y se predice que los sujetos con pérdida dual de BRG1 y BRM no responden a un inhibidor de BRM.
Dicho método para analizar, evaluar y/o detectar el estado de mutación de BRG1, los niveles de expresión del gen BRG1, los niveles de proteína BRG1 en paralelo al estado de expresión de BRM y/o la función de la proteína BRG1, para predecir si un sujeto que padece cáncer responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM, comprende:
a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto afectado con un reactivo capaz de detectar células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1 y/o uno o más cambios en los niveles de expresión del gen BRG1, los niveles de proteína BRG1 y/o la función de la proteína BRG1; y
b) comparar la muestra obtenida de dicho sujeto afectado con una muestra similar tomada de un sujeto de control no canceroso o normal, en la que la presencia de una o más mutaciones de BRG1 en dicha muestra obtenida de dicho sujeto afectado indica que dicho sujeto afectado responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM, o
c) comparar la muestra obtenida de dicho sujeto afectado con una muestra similar tomada de un sujeto de control no canceroso o normal, en la que el nivel de expresión de proteína o ARNm de BRG1 en dicha muestra obtenida de dicho sujeto afectado indica que dicho sujeto afectado responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM; y
d) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto con un reactivo capaz de detectar niveles de expresión de BRM en células cancerosas humanas.
En determinadas realizaciones, el tipo de cáncer es cualquier tipo de cáncer que se encuentre que alberga mutaciones en BRG1, que muestra pérdida de la expresión de BRG1, que muestra pérdida o deterioro de la función de la proteína BRG1 y/o que muestra cambios en la expresión del gen BRG1 o los niveles de proteína BRG1, conservando al mismo tiempo una copia funcional de la proteína BRM y/o mostrando la expresión adecuada de BRM. Dicho tipo de cáncer puede describirse o caracterizarse en el presente documento como "sensible al tratamiento con inhibidores de BRM", "sensible a la inhibición terapéutica de BRM", "sensible a inhibidores de BRM" o a través del uso de términos similares.
En otras realizaciones, el tipo de cáncer sensible a inhibidores de BRM es uno asociado con mutaciones de BRG1 documentadas o pérdida documentada de expresión de BRG1, incluyendo cánceres de pulmón, mama, riñón, intestino grueso, ovario, próstata, tracto aerodigestivo superior, estómago, endometrio, hígado, páncreas, tejido hematopoyético y linfoide, piel, tiroides, pleura, ganglios autónomos, sistema nervioso central, tejidos blandos, sarcomas rabdoides pediátricos, melanomas y otros cánceres con pérdida de función de BRG1 debido a la mutación de BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1.
Aún en otras realizaciones, el cáncer sensible a inhibidores de BRM es un tipo en el que la sensibilidad se observó experimentalmente durante los datos de ARNhc combinados, como se describe en el presente documento. Dichos tipos de cáncer sensibles a inhibidores de BRM incluyen cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de hígado y cáncer de ovario.
En determinadas realizaciones, el reactivo empleado para analizar, evaluar y/o detectar el estado de mutación de BRG1, los niveles de expresión del gen BRG1, los niveles de proteína BRG1 y/o la función de la proteína BRG1 mediante métodos de la invención, por ejemplo, en células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1, es un anticuerpo anti BRG1. En determinadas realizaciones, dicho reactivo es una o más sondas de PCR, por ejemplo, sondas específicas para una mutación de BRG1 descrita en el presente documento. Dicha sonda se puede diseñar fácilmente usando técnicas estándar en la técnica para (i) secuenciar el gen BRG1, o sus exones, para identificar mutaciones, por ejemplo, como las enumeradas en el presente documento; y (ii) sintetizar, o haber sintetizado, sondas de ácido nucleico complementarias a las mismas.
En determinadas realizaciones, dicha sonda puede diseñarse de acuerdo con técnicas de secuenciación y síntesis de sondas conocidas en la técnica y usarse para analizar, evaluar y/o detectar una mutación de BRG1 enumerada en la Tabla 1 y, por ejemplo, es una sonda de ácido nucleico complementaria a una de dichas mutaciones enumeradas en la Tabla 1. En determinadas realizaciones diferentes, dicha sonda puede diseñarse de acuerdo con técnicas de secuenciación y síntesis de sondas conocidas en la técnica y usarse para analizar, evaluar y/o detectar una mutación de BRG1 enumerada en la Tabla 2 y, por ejemplo, es una sonda de ácido nucleico complementaria a una de dichas mutaciones enumeradas en la Tabla 2.
En determinadas realizaciones, el método reconocido en la técnica de secuenciación genética y síntesis de sondas de ácido nucleico es la secuenciación de próxima generación (NGS, por sus siglas en inglés) del gen, exones o ARNm de BRG1 usando sondas de PCR específicas para el gen BRG1. La secuenciación de próxima generación también se conoce como secuenciación de alto rendimiento; los métodos paralelizan o amplían masivamente el proceso de secuenciación, produciendo millones de secuencias al mismo tiempo que se distinguen de la secuenciación didesoxi "Sanger" de primera generación (Meldrum, C., Doyle, M.A., et al., (2011) Clin Biochem Rev.
32(4) 177-195). En determinadas realizaciones, dicho reactivo es una o más sondas de PCR, por ejemplo, sondas específicas para detectar niveles de ARNm de BRM.
En determinadas realizaciones, el método reconocido en la técnica de secuenciación genética y síntesis de sondas de ácido nucleico es la secuenciación de ARN del gen, exones o ARNm de BRG1 usando sondas de PCR específicas para los transcritos del gen BRG1. En determinadas realizaciones, dicho reactivo es una o más sondas de PCR, por ejemplo, sondas específicas para detectar niveles de ARNm de BRM.
El método descrito anteriormente de secuenciación genética y síntesis de sondas de ácido nucleico puede aplicarse también a la detección del gen, exones o ARNm de BRM, por ejemplo, para verificar que los sujetos que padecen cáncer que presentan pérdida de BRG1 conservan la expresión adecuada del gen BRM.
En determinadas realizaciones, el reactivo empleado para analizar, evaluar y/o detectar niveles de expresión del gen BRM, niveles de proteína BRM y/o función de la proteína BRM mediante métodos de la invención, por ejemplo, en células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1, es un anticuerpo anti BRM. En determinadas realizaciones, dicho reactivo es una o más sondas de PCR, por ejemplo, sondas específicas para detectar niveles de ARNm de BRM. En determinadas realizaciones, el método es la secuenciación de próxima generación del ARNm de BRM usando sondas de PCR específicas para el gen BRM.
La Tabla 1 representa una lista de mutaciones de BRG1 asociadas con líneas de células cancerosas y muestras de pacientes. Se predice que estas mutaciones genéticas (es decir, mutaciones no codificantes o de inserción/deleción que dan como resultado cambios de marco), debido a su correspondiente pérdida de expresión de BRG1, causarán la pérdida de la función de BRG1 y harán que las células sean sensibles a la inhibición de BRM.
Las designaciones en la tabla son las siguientes:
fs = una mutación por cambio de marco que produce una proteína BRG1 inactiva;
del = una deleción que conduce a una proteína BRG1 inactiva;
* = un codón finalizador prematuro que conduce a la proteína BRG1 inactiva; y
splice = una mutación en un sitio de corte y empalme que conduce a una proteína BRG1 inactiva.
Las mutaciones enumeradas en la Tabla 1 se recopilan de fuentes bibliográficas, indicadas en la columna "Referencia", incluyendo una lista completa de mutaciones en células cancerosas de la base de datos del genoma del cáncer COSMiC (Forbes, S. A., N. Bindal, et al. (2011) Nucleic Acids Res 39 (edición de la base de datos): D945-950) y la Novartis Cancer Cell Line Encycolpedia (CCLE) (Barretina, J., G. Caponigro, et al. (2012) Nature 483(7391): 603-607). Los cambios de ácido nucleico en el gen BRG1 enumerados en la Tabla 1 se numeran basándose en su posición en el transcrito de ARNm de BRG1 para las mutaciones descritas en la base de datos COSMIC y se numeran basándose en su ubicación cromosómica para la CCLE en la base de datos CCLE. Se conocen en la bibliografía otras anotaciones publicadas de mutaciones de BRG1 en cánceres de pulmón (Medina, P. P., O. A. Romero, et al. (2008) Hum Mutat 29(5): 617-622) (Imielinski, et al. (2012) Cell 150(6): 1107-1120).
Tabla 1: Resumen de mutaciones de BRG1
Efecto sobre la proteína BRG1
Cambio de ácido nucleico en el gen (expresión o sustitución de
BRG1 aminoácidos) Referencia
Pérdida de la expresión de BRG1 Sin proteína BRG1 Barretina et al. (2012) c.130G>A p.G44R Forbes et al. (2011) c.169delC p.T58fs*36 Forbes et al. (2011) c.455delC p.P153fs*150 Forbes et al. (2011) c.479A>G p.Q160R Forbes et al. (2011) c.589C>T p.P197S Forbes et al. (2011) c.729delC p.P244fs*59 Forbes et al. (2011) c.805_806delCC p.P270fs*16 Forbes et al. (2011) c.805delC p.M272fs*31 Forbes et al. (2011) c.830C>A p.P277H Forbes et al. (2011) c.991C>T p.Q331* Forbes et al. (2011) c.1142G>A p.R381Q Forbes et al. (2011) c.1195A>T p.K399* Forbes et al. (2011) c.1208A>G p.E403G Forbes et al. (2011) c.1216G>A p.A406T Forbes et al. (2011) c.1458C>G p.F486L Forbes et al. (2011) c.1525G>T p.A509S Forbes et al. (2011) c.1615C>T p.R539C Forbes et al. (2011) c.1630C>T p.Q544* Forbes et al. (2011) c.1677_1761del85 p? Forbes et al. (2011)
c.1733_1761+40del69 p? Forbes et al. (2011) c.1750A>T p.K584* Forbes et al. (2011) c.1756A>T p.K586* Forbes et al. (2011) c.1761G>T p.? Forbes et al. (2011) c.1781G>C p.G594A Forbes et al. (2011)
c.1917_1918GG>CT p.L639>? Forbes et al. (2011) c.2008G>T p.E670* Forbes et al. (2011)
Efecto sobre la proteína BRG1
Cambio de ácido nucleico en el gen (expresión o sustitución de
BRG1 aminoácidos) Referencia
c.2011G>T p.E671* Forbes et al. (2011) c.2059A>G p.K687E Forbes et al. (2011) c.2184_2206del23 p.Q729fs*4 Forbes et al. (2011) c.2207A>G p.H736R Forbes et al. (2011) c.2290T>A p.W764R Forbes et al. (2011) c.2300C>T p.S767F Forbes et al. (2011) c.2338G>A p.E780K Forbes et al. (2011) c.2441C>A p.T814K Forbes et al. (2011) c.2461G>A p.E821K Forbes et al. (2011) c.2461G>A p.E821K Forbes et al. (2011) c.2461G>A p.E821K Forbes et al. (2011) c.2644G>A p.E882K Forbes et al. (2011) c.2651A>C p.H884P Forbes et al. (2011) c.2653C>T p.R885C Forbes et al. (2011) c.2687T>A p.V896E Forbes et al. (2011) c.2729C>T p.T910M Forbes et al. (2011) c.2729C>T p.T910M Forbes et al. (2011) c.2729C>T p.T910M Forbes et al. (2011) c.2729C>T p.T910M Forbes et al. (2011) c.2735C>A p.T912K Forbes et al. (2011) c.2837C>T p.P946L Forbes et al. (2011) c.2896C>T p.R966W Forbes et al. (2011) c.2986A>T p. I996F Forbes et al. (2011) c.3056C>T p.T1019I Forbes et al. (2011) c.3146C>T p.P1049L Forbes et al. (2011) c.3166G>T p.E1056* Forbes et al. (2011) c.3254_3270del17 p.L1085fs*32 Forbes et al. (2011) c.3304T>C p.F1102L Forbes et al. (2011) c.3304T>C p.F1102L Forbes et al. (2011) c.3306C>G p.F1102L Forbes et al. (2011) c.3306C>G p.F1102L Forbes et al. (2011) c.3403C>T p.R1135W Forbes et al. (2011) c.3424T>G p.F1142V Forbes et al. (2011) c.3469C>T p.R1157W Forbes et al. (2011) c.3469C>T p.R1157W Forbes et al. (2011) c.3475delG p.L1161fs*3 Forbes et al. (2011) c.3475G>T p.G1159W Forbes et al. (2011) c.3476delG p.L1161fs*3 Forbes et al. (2011) c.3478G>C p.G1160R Forbes et al. (2011) c.3488T>C p.L1163P Forbes et al. (2011) Efecto sobre la proteína BRG1
Cambio de ácido nucleico en el gen (expresión o sustitución de
BRG1 aminoácidos) Referencia c.3526A>T p.S1176C Forbes et al. (2011) c.3531C>A p.D1177E Forbes et al. (2011) c.3557C>T p.A1186V Forbes et al. (2011) c.3566G>A p.R1189Q Forbes et al. (2011) c.3572A>G p.H1191R Forbes et al. (2011) c.3574C>T p.R1192C Forbes et al. (2011) c.3694G>T p.G1232C Forbes et al. (2011) c.3694G>A p.G1232S Forbes et al. (2011) c.3695G>A p.G1232D Forbes et al. (2011) c.3702C>A p.F1234L Forbes et al. (2011) c.3706C>T p.Q1236* Forbes et al. (2011) c.3727C>T p.R1243W Forbes et al. (2011) c.3729_3730delGC p.A1245fs*13 Forbes et al. (2011) c.3745G>T p.A1249S Forbes et al. (2011) c.3850G>A p.D1284N Forbes et al. (2011) c.3857_3858AG>CA p.E1286A Forbes et al. (2011) c.4007G>A p.R1336H Forbes et al. (2011) c.4271C>T p.P1424L Forbes et al. (2011) c.4471C>T p.R1491* Forbes et al. (2011) c.4471C>T p.R1491* Forbes et al. (2011) c.4617C>G p.F1539L Forbes et al. (2011) c.4698_4699GG>TT p.K1566_E1567>N* Forbes et al. (2011) c.4801C>T p.R1601W Forbes et al. (2011) c.4826T>C p.L1609P Forbes et al. (2011) c.4936G>A p.E1646K Forbes et al. (2011) g.chr19:11095992G>A p.R89H Barretina et al. (2012) g.chr19:11097098C>T p.P197S Barretina et al. (2012) g.chr19:11097110C>T p.Q201* Barretina et al. (2012) g.chr19:11097617C>T p.S266L Barretina et al. (2012) g.chr19:11097622G>A p.V268M Barretina et al. (2012) g.chr19:11097624->C p.V268fs Barretina et al. (2012) g.chr19:11097625CC>- p.P269fs Barretina et al. (2012) g.chr19:11097673C>A p.P285T Barretina et al. (2012) g.chr19:11105565C>G p.T494R Barretina et al. (2012) g.chr19:11105573A>T p. I497F Barretina et al. (2012) g.chr19:11105603T>C p.Y507H Barretina et al. (2012) g.chr19:11105624G>T p.E514* Barretina et al. (2012) g.chr19:11105651G>A p.E523K Barretina et al. (2012) g.chr19:11106922G>A p.D543N Barretina et al. (2012) g.chr19:11106958C>T p.Q555* Barretina et al. (2012) Efecto sobre la proteína BRG1
Cambio de ácido nucleico en el gen (expresión o sustitución de
BRG1 aminoácidos) Referencia g.chrl 9:11107056G>T p.K587N Barretina et a . (2012) g.chr19:11113807C>- p.L639fs Barretina et a . (2012) g.chrl 9:11118576A>G p.E668_splice Barretina et a . (2012) g.chr19:11118633AGA>- p.K689del Barretina et a . (2012) g.chr19:11118658C>G p.D694E Barretina et a . (2012) g.chr19:11118684C>T p.A703V Barretina et a . (2012) g.chr19:11121117 GCAGTCCT ACT AT
GCCGTGGCCC>- p.L728fs Barretina et a . (2012) g.chr19:11121131C>T p.A733V Barretina et a . (2012) g.chr19:11123640T>A p.W764R Barretina et a . (2012) g.chr19:11123647T>G p.V766G Barretina et a . (2012) g.chr19:11123672C>A p.N774K Barretina et a . (2012) g.chr19:11123686A>G p.D779G Barretina et a . (2012) g.chr19:11123687C>T Barretina et a . (2012) g.chr19:11123688G>A p.E780K Barretina et a . (2012) g.chr19:11123701G>A p.G784E Barretina et a . (2012) g.chr19:11123707C>T p.T786I Barretina et a . (2012) g.chr19:11129635CGCTGTC>- p.T814fs Barretina et a . (2012) g.chr19:11129638T>C p.L815P Barretina et a . (2012) g.chr19:11129645C>G p.N817K Barretina et a . (2012) g.chr19:11129655G>A p.E821K Barretina et a . (2012) g.chr19:11129670G>T p.A826S Barretina et a . (2012) g.chr19:11129671C>- p.A826fs Barretina et a . (2012) g.chr19:11129735C>T Barretina et a . (2012) g.chr19:11130342G>A p.E861K Barretina et a . (2012) g.chr19:11132396C>T p.P74L Barretina et a . (2012) g.chr19:11132400G>A p.I873_splice Barretina et a . (2012) g.chr19:11132419A>G p.I879V Barretina et a . (2012) g.chr19:11132426A>G p.D881G Barretina et a . (2012) g.chr19:11132437C>T p.R885C Barretina et a . (2012) g.chr19:11132438G>T p.R885L Barretina et a . (2012) g.chr19:11132442GAA>- p.K887del Barretina et a . (2012) g.chr19:11132457C>G p.C891W Barretina et a . (2012) g.chr19:11132513C>T p.T910M Barretina et a . (2012) g.chr19:11132522C>T p.P913L Barretina et a . (2012) g.chr19:11132529G>C p.Q915H Barretina et a . (2012) g.chr19:11132551G>C p.A923P Barretina et a . (2012) g.chr19:11132561A>T p.N926I Barretina et a . (2012) g.chr19:11132584A>T p.K934* Barretina et a . (2012) g.chr19:11134230C>T p.R966W Barretina et a . (2012) Efecto sobre la proteína BRG1
Cambio de ácido nucleico en el gen (expresión o sustitución de
BRG1 aminoácidos) Referencia g.chrl 9:11134234G>A p.R967H Barretina et a . (2012) g.chrl 9:11134239C>T p.H969Y Barretina et a . (2012) g.chrl 9:11134251C>T p.R973W Barretina et a . (2012) g.chr19:11134252G>A p.R973Q Barretina et a . (2012) g.chr19:11134267G>T p.R978L Barretina et a . (2012) g.chr19:11138497CTT GAT AGAATT C T
TCC>- p.L1085fs Barretina et a . (2012) g.chr19:11138569A>G p.M1109V Barretina et a . (2012) g.chr19:11141427G>A p.R1135Q Barretina et a . (2012) g.chr19:11141498G>- p.G1159fs Barretina et a . (2012) g.chr19:11141499G>T p.G1159V Barretina et a . (2012) g.chr19:11141507G>T p.G1162C Barretina et a . (2012) g.chr19:11141513A>T p.N1164Y Barretina et a . (2012) g.chr19:11141547A>G p.D1175G Barretina et a . (2012) g.chr19:11141550G>A p.S1176N Barretina et a . (2012) g.chr19:11141556G>A p.W1178* Barretina et a . (2012) g.chr19:11143972C>T p.Q1185* Barretina et a . (2012) g.chr19:11143976C>T p.A1186V Barretina et a . (2012) g.chr19:11143994G>A p.R1192H Barretina et a . (2012) g.chr19:11144027G>A p.R1203H Barretina et a . (2012) g.chr19:11144038G>A p.V1207I Barretina et a . (2012) g.chr19:11144049GGA>- p.E1212del Barretina et a . (2012) g.chr19:11144113G>A p.G1232S Barretina et a . (2012) g.chr19:11144114G>A p.G1232D Barretina et a . (2012) g.chr19:11144122G>T p.D1235Y Barretina et a . (2012) g.chr19:11144148GC>- p.R1243fs Barretina et a . (2012) g.chr19:11144150G>A p.R1244H Barretina et a . (2012) g.chr19:11144179GAGGAGCAGGAT>- p.EEQD1254del Barretina et a . (2012) g.chr19:11145606G>A p.R1323H Barretina et a . (2012) g.chr19:11152007G>T p.E1399* Barretina et a . (2012) g.chr19:11152064G>T p.D1418Y Barretina et a . (2012) g.chr19:11152145C>T p.R1445W Barretina et a . (2012) g.chr19:11152157G>T p.E1449* Barretina et a . (2012) g.chr19:11152172A>C p.N1454H Barretina et a . (2012) g.chr19:11152176C>A p.P1455Q Barretina et a . (2012) g.chr19:11152179C>T p.P1456L Barretina et a . (2012) g.chr19:11152215C>G p.A1468G Barretina et a . (2012) g.chr19:11168992G>T p.E1496* Barretina et a . (2012) g.chr19:11169001G>T p.E1499* Barretina et a . (2012) g.chr19:11169474G>A p.R1515H Barretina et a . (2012) Efecto sobre la proteína BRG1
Cambio de ácido nucleico en el gen (expresión o sustitución de
BRG1 aminoácidos) Referencia
p.R1561W Barretina et al. (2012) p.Q1562R Barretina et al. (2012) p.1566_1567KE>N* Barretina et al. (2012) p.D1569N Barretina et al. (2012) p.E1577G Barretina et al. (2012) p.E1582* Barretina et al. (2012)
Figure imgf000010_0001
p.R1621* Barretina et al. (2012)
Tabla 2: Tipos de cáncer con mutaciones conocidas de BRG1 que han demostrado ser sensibles a los ARNhc de BRM
Línea celular Mutación Efecto Tipo de cáncer SK-HEP-1 p.E1582* Pérdida de la función homocigota Hígado
HCC-15 M272fs/y sin expresión de ARNm/LOH* Pérdida de la función homocigota Pulmón A549 L728fs Pérdida de la función homocigota Pulmón
NCI-H1299 T560*/ Pérdida de la función homocigota Pulmón
TYK-nu Sin expresión de ARNm/ Pérdida de la función homocigota Ovario
NCI-H838 I873_splice Pérdida de la función homocigota Pulmón
*- LOH significa "Pérdida de heterocigosidad" e indica la ausencia de un gen supresor de tumores funcional en la región perdida.
En un aspecto, se proporciona un método para determinar la sensibilidad de una célula cancerosa a un inhibidor de BRM, que comprende:
a) ensayar una o más mutaciones de BRG1 en dicha célula cancerosa; y
b) comparar la una o más mutaciones de BRG1 con BRG1 en una célula de control no cancerosa o normal, en la que la presencia de dicha una o más mutaciones de BRG1 en dicha célula cancerosa indica que dicha célula es sensible a un inhibidor de BRM.
En un aspecto, se proporciona un método para determinar la sensibilidad de una célula cancerosa a un inhibidor de BRM, que comprende:
a) ensayar una o más mutaciones de BRG1 en dicha célula cancerosa;
b) ensayar la expresión de BRM en dicha célula cancerosa;
c) comparar la expresión de BRM con la expresión de BRM en una célula de control no cancerosa o normal; y
d) comparar la una o más mutaciones de BRG1 con BRG1 en una célula de control no cancerosa o normal, en el que la presencia de la expresión de BRM y la presencia de dicha una o más mutaciones de BRG1 en dicha célula cancerosa indica que dicha célula es sensible a un inhibidor de BRM.
En determinadas realizaciones, el tipo de cáncer es cualquier tipo de cáncer que se encuentre que alberga mutaciones en BRG1 o que muestra pérdida de expresión de BRG1 pero que conserva la expresión de BRM. En otras realizaciones, el tipo de cáncer son las mutaciones de BRG1 documentadas asociadas o la pérdida documentada de expresión de BRG1, incluyendo cáncer de pulmón, mama, riñón, intestino grueso, ovario, próstata, tracto aerodigestivo superior, estómago, endometrio, hígado, páncreas, tejido hematopoyético y linfoide, piel, tiroides, pleura, ganglios autónomos, sistema nervioso central, tejidos blandos, sarcomas rabdoides pediátricos, melanomas y otros cánceres con pérdida de función de BRG1 debido a la mutación de BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1. Aún en otras realizaciones, el cáncer es cáncer de pulmón no microcítico, melanoma y cáncer de ovario asociado con la pérdida de función de BRG1 debido a la mutación de BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1 y donde se encuentran ejemplos
En determinadas realizaciones, el reactivo empleado para determinar la sensibilidad de una célula cancerosa a un inhibidor de BRM es un anticuerpo anti BRG1. En determinadas realizaciones, dicho reactivo es una o más sondas de PCR, por ejemplo, sondas específicas para una mutación de BRG1 descrita en el presente documento. En determinadas realizaciones, dicha sonda puede usarse para analizar, evaluar y/o detectar una mutación de BRG1 enumerada en la Tabla 1, por ejemplo, es una sonda de ácido nucleico complementaria a una de dichas mutaciones enumeradas en la Tabla 1. En determinadas realizaciones diferentes, dicha sonda puede usarse para analizar, evaluar y/o detectar una mutación de BRG1 enumerada en la Tabla 2, por ejemplo, es una sonda de ácido nucleico complementaria a una de dichas mutaciones enumeradas en la Tabla 2.
En otro aspecto, se proporciona un método de cribado de inhibidores de BRM, comprendiendo dicho método:
a) poner en contacto una muestra que contiene una o más células que albergan una o más mutaciones de BRG1 con un inhibidor de BRM candidato;
b) medir la reducción en el crecimiento o viabilidad de dichas células en dicha muestra;
c) poner en contacto una muestra similar que contiene una o más células que albergan una o más mutaciones de BRG1 con un inhibidor de BRM conocido;
d) medir la reducción en el crecimiento o viabilidad de dichas células en dicha muestra similar;
e) comparar la reducción en el crecimiento o la viabilidad de dichas células que albergan una o más mutaciones de BRG1 de dicha muestra con la viabilidad de dicha muestra similar, en la que una reducción similar en la viabilidad indica que dicha muestra candidata es un inhibidor de BRM.
En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende un inhibidor de BRM para su uso en el tratamiento del cáncer en una población seleccionada de pacientes de cáncer, en la que la población de pacientes de cáncer se selecciona basándose en sus sujetos que albergan una o más mutaciones de BRG1.
En otro aspecto, se proporciona un kit para predecir la sensibilidad de un sujeto que padece cáncer para el tratamiento con un inhibidor de BRM, que comprende: i) reactivos capaces de detectar células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1; y ii) instrucciones sobre cómo utilizar dicho kit.
En los métodos descritos en el presente documento, los métodos para detectar una proteína o un aminoácido mutante, o la pérdida de expresión de la proteína, pueden realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tales como inmunoensayos, inmunohistoquímica, ELISA, citometría de flujo, análisis de transferencia de Western, HPLC y espectrometría de masas. Además, en los métodos de la invención como se describe en el presente documento, los métodos para detectar una mutación en una molécula de ácido nucleico que codifica BRG1 incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), ensayos basados en TaqMan, secuenciación directa, hibridación dinámica específica de alelo, matrices de SNP de oligonucleótidos de alta densidad, ensayos de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ensayos de prolongación de cebador, ensayos de ligasa de oligonucleótidos, análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria, electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE), cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante, análisis de fusión de alta resolución, ensayos de proteínas de unión a emparejamientos incorrectos de ADN, SNPLex®, electroforesis capilar o secuenciación de próxima generación (NGS) de ADN o ARNm genómico.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Un cribado de ARNhc combinado amplio de epigenoma identifica a BRM como una diana letal sintética en células cancerosas mutantes en BRG1. a. Gráfico en cascada que muestra el logaritmo del valor de p calculado con el estadístico RSA (Konig, R., C. Y. Chiang, et al. (2007) Nat Methods 4(10): 847-849) que informa de la sensibilidad de cada línea celular en el cribado de ARNhc combinado para la atenuación de BRM. Las barras de color negro son líneas celulares con pérdida de la función de BRG1 debido a la mutación de BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1. Las barras de color gris son líneas celulares que son de tipo silvestre (WT) para BRG1. Las líneas celulares agrupadas a la derecha del gráfico en cascada con valores de p más negativos son aquellas que muestran inhibición del crecimiento tras la atenuación de BRM y todas tienen pérdida de función de BRG1. b. Gráficos en cascada para las puntuaciones z (Birmingham, A., L. M. Selfors, et al. (2009) Nat Methods 6(8): 569-575) de los 12 ARNhc de Br M individuales que muestran una correlación estadísticamente significativa en su perfil de actividad según lo calculado por el algoritmo ATARIS (Shao, D. D., A. Tsherniak, et al. (2013) Genome Res 23(4): 665-678), el color es como en (a). Las líneas celulares con puntuaciones z más negativas son aquellas que muestran inhibición del crecimiento tras la atenuación de BRM con cada ARNhc individual.
Figura 2. La sensibilidad a los ARNhc de BRM corresponde a la pérdida de expresión de la proteína BRG1.
Transferencia de Western que demuestra los niveles de proteína de BRG1 y BRM en líneas de células cancerosas de tipo silvestre y mutantes en BRG1 representativas perfiladas en el cribado de ARNhc combinado de epigenoma. La expresión de BRG1 no se detecta en líneas celulares mutantes en BRG1, pero está presente en líneas celulares BRG1-WT. CORL23 es una línea celular cancerosa con una mutación de BRG1 heterocigota (K689del) y, por lo tanto, aún conserva la expresión de BRG1. La línea celular SBC5, que muestra tanto la pérdida de expresión de BRG1 como la pérdida de expresión de BRM por transferencia de Western, no fue sensible a los ARNhc de BRM, como se muestra en la figura 1, lo que demuestra que la conservación de la expresión de BRM es necesaria para que las líneas celulares mutantes en BRG1 sean sensibles a la inhibición de BRM.
Figura 3. Los ARNhc dirigidos a BRM producen una atenuación eficaz de BRM y no dan como resultado una destrucción inespecífica en una línea celular deficiente en BRM SW13. a. Transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) que muestra una reducción significativa de los transcritos de ARNm de BRM en células HCT116 tras la inducción de ARNhc de BRM, pero no de ARNhc de control (CTL) no dirigido o células precursoras con doxiciclina (Dox) (48 horas, 100 ng/ml). Los valores se muestran como media ± desviación estándar. Los ARNhc dirigidos a BRM usados en el cribado de ARNhc combinado muestran una eficacia de atenuación comparable con respecto a los ARNhc de BRM 2025 y 5537 usados en experimentos de seguimiento. b. La inducción de ARNhc de control no dirigido, así como de ARNhc de BRM 2025(c) o ARNhc de BRM 5537 (d) con Dox no inhibe el crecimiento de células SW13 deficientes en BRG1 y BRM como se esperaba en un ensayo de proliferación estándar o (e) en un ensayo de formación de colonias
Figura 4. La inhibición de BRM inhibe significativa y selectivamente el crecimiento de células cancerosas mutantes en BRG1. a. Transferencia de Western que muestra la reducción de la proteína BRM tras el tratamiento con doxiciclina (Dox) (120 horas, 100 ng/ml) en células NCI-H838 deficientes/mutantes en BRG1 transducidas de manera estable con ARNhc de BRM inducible-2025 o 5537. Se incluyó un ARNhc de control (CTL) no dirigido y no mostró ninguna disminución en la expresión de BRM. Se incluyó vinculina (VCL) como control de carga. b.
Transferencia de Western como en (a) pero en NCI-H460 de BRG1 de tipo silvestre. La inducción con Dox de ARNhc de BRM pero no de ARNhc CTL da como resultado la reducción de la proteína BRM. Se incluyó p-TUBULINA como control de carga. c. Se sembraron por triplicado células NCI-H838 de ARNhc CTL o de BRM a razón de 500 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células se trataron con Dox y se midió el crecimiento celular usando el ensayo Cell Titer Glo en los momentos indicados. La inducción con Dox de ARNhc de BRM pero no de ARNhc CTL reduce significativamente la proliferación celular. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y los valores se muestran como media ± desviación estándar d. Ensayo de crecimiento celular como en (d), pero con células NCI-H460 de ARNhc CTL o de BRM. La inducción con Dox de ARNhc de BRM no inhibe la proliferación celular. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y los valores se muestran como media ± desviación estándar e. Se sembraron células NCI-H838 de ARNhc CTL o de BRM a razón de 2000 células por pocillo. Las células se trataron con Dox (100 ng/ml) y se controló la formación de colonias después de 11 días con tinción con violeta cristal. La inducción con Dox de ARNhc de BRM pero no de ARNhc CTL inhibe la formación de colonias. f. Se sembraron células NCI-H460 de ARNhc CTL o de BRM a razón de 1000 por pocillo, y se trataron con Dox y se controlaron para determinar la formación de colonias como en (e). La inducción con Dox de ARNhc de BRM, similar al ARNhc CTL, no inhibe la formación de colonias.
Figura 5. La atenuación de BRM inhibe el crecimiento de líneas de células cancerosas mutantes en BRG1 adicionales. a. Transferencia de Western que muestra la reducción de la proteína BRM tras el tratamiento con doxiciclina (Dox) (96 horas, 100 ng/ml) de células A549 deficientes/mutantes en BRG1 transducidas de manera estable con ARNhc de BRM inducible-2025 o 5537. Se incluyó un ARNhc de control (CTL) no dirigido y no mostró ninguna disminución en la expresión de BRM. Se incluyó p-TUBULINA como control de carga. b. Se sembraron por triplicado células A549 de ARNhc CTL o de BRM a razón de 1000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células se trataron con Dox y se midió el crecimiento celular usando el ensayo Cell Titer Glo en los momentos indicados. La inducción con Dox de ARNhc de BRM pero no de ARNhc CTL reduce significativamente la proliferación celular. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y los valores se muestran como media ± desviación estándar c. Se trataron células a 549 que contenían ARNhc de b Rm inducible-2025 con o sin Dox durante 7 días y se evaluaron los cambios en el ciclo celular mediante análisis del contenido de ADN mediante tinción con yoduro de propidio. El porcentaje de células que muestran contenido de fase G1 y S se muestra en cada histograma. d. Se indujeron células A549 que contenían ARNhc CTL o ARNhc de BRM con Dox durante 7 días, y se controló la tinción de p-galactosidasa asociada a la senescencia (precipitado de color azul). e. Se sembraron células A549 de ARNhc CTL o de BRM a razón de 2000 células por pocillo, se trataron con Dox durante 13 días y se controló la formación de colonias con tinción de violeta cristal. La inducción con Dox de ARNhc de BRM pero no de ARNhc CTL inhibe la formación de colonias. f. Se indujeron células A549 que contenían ARNhc CTL o ARNhc de BRM con Dox durante 16 días y se tiñeron para determinar H3K9me3. g. Transferencia de Western como en (a) pero en células NCI-H1299 mutantes en BRG1. h. Ensayo de crecimiento celular como en (b), pero con células NCI-H1299 de ARNhc CTL o de BRM y 500 células sembradas. La inducción con Dox de ARNhc de BRM pero no de ARNhc CTL reduce significativamente la proliferación celular. i. Se trataron células NCI-H1299 que contenían ARNhc de BRM inducible-2025 con o sin Dox durante 7 días y se evaluaron los cambios en el ciclo celular mediante análisis del contenido de ADN mediante tinción con yoduro de propidio. El porcentaje de células que muestran contenido de fase G1 y S se muestra en cada histograma. j. Se indujeron células NCI-H1299 que contenían ARNhc CTL o ARNhc de BRM con Dox durante 7 días y se controlaron para determinar la tinción de p-galactosidasa asociada a la senescencia (precipitado de color azul). Las células positivas para p-galactosidasa se indican con una punta de flecha de color negro. k. Se sembraron células NCI-H1299 de ARNhc Ct L o de BRM a razón de 1000 células por pocillo. Las células se trataron con Dox (100 ng/ml) y se controló la formación de colonias después de 10 días con tinción con violeta cristal. La inducción con Dox de ARNhc de BRM pero no de ARNhc CTL inhibe la formación de colonias. l. Se indujeron células NCI-H1299 que contenían ARNhc CTL o ARNhc de BRM con Dox durante 16 días y se tiñeron para determinar H3K9me3.
Figura 6. La atenuación doble y no única de BRG1 y BRM inhibe el crecimiento de células BRG1-WT. a.
Transferencia de Western para los niveles de BRG1 y BRM en lisados de células BEAS2B que contienen ARNhc CTL, ARNhc de BRG1-2202, ARNhc de BRM-2025 o ARNhc dual (ARNhc de BRG1-2202 y ARNhc de BRM-2025) que se trataron durante 3 días con o sin Dox. Se usó p-ACTINA como control de carga. b. Se sembraron células BEAS2B que contenían CTL, ARNhc de BRG1 2202, ARNhc de BRM-2025 o ARNhc dual (ARNhc de BRG1-2202 y ARNhc de BRM-2025) a razón de 500 células por pocillo y se trataron con o sin Dox durante 10 días. La formación de colonias se controló con tinción con violeta cristal. c. Se sembraron células NCI-H460 que contenían CTL, ARNhc de BRG1-2202, ARNhc de BRM-2025 o ARNhc dual (ARNhc de BRG1-2202 y ARNhc de BRM-2025) en placas de 6 pocillos y se trataron durante 11 o 13 días con o sin Dox. El número de células se cuantificó mediante un ensayo de exclusión con azul tripán y se normalizó con respecto a la muestra de Dox para cada línea celular.
Figura 7. La atenuación de BRM conduce a la detención del ciclo celular, la senescencia y un aumento de H3K9me3. a. Se trataron células NCI-H838 que contenían ARNhc de BRM inducible-2025 con o sin Dox durante 7 días y se evaluaron los cambios en el ciclo celular mediante análisis del contenido de ADN mediante tinción con yoduro de propidio. El porcentaje de células que muestran contenido de fase G1 y S se muestra en cada histograma. b. Se indujeron células NCI-H838 que contenían ARNhc CTL o ARNhc de BRM con Dox durante 7 días y se controlaron para determinar la tinción de p-galactosidasa asociada a la senescencia. Las células positivas para pgalactosidasa se indican con una punta de flecha de color negro. c. Se indujeron células NCI-H838 que contenían ARNhc CTL o ARNhc de BRM con Dox durante 16 días y se tiñeron para determinar H3K9me3.
Figura 8. La atenuación de BRM inhibe selectivamente el crecimiento de tumores mutantes en BRG1 in vivo.
Se inocularon en ratones células cancerosas NCI-H1299 que expresaban de forma estable ARNhc de control (CTL) no dirigido inducible por dox o dos ARNhc dirigidos a BRM distintos (sh2025 o sh5537). Los ratones portadores de tumores se trataron con vehículo o con dox. a. Transferencia de Western de BRM tumoral y VINCULINA como control de carga después de 7 días de tratamiento. b. Imágenes representativas de la tinción IHC de BRM después de 7 días de tratamiento. c. Porcentaje de núcleos positivos para BRM después de 7 días de tratamiento. Los gráficos representan la media ± SEM (n = 3 por grupo de tratamiento). (d, e) Se inocularon en ratones células cancerosas n C i-H1299 d o NCI-H460 e que expresaban de forma estable ARNhc CTL, de BRM sh2025 o sh5537 inducible por dox. Cuando el volumen del tumor alcanzó 100-300 mm3, los ratones se trataron continuamente con dieta de vehículo (círculos de color negro) o dieta complementada con dox (círculos de color blanco). El volumen tumoral de los ratones tratados con vehículo y dox se representa como la media ± SEM (n = 8 por grupo de tratamiento). * indica P <0,05 de A volumen tumoral para la dox en relación con el grupo tratado con vehículo. f. Imágenes representativas de tinción IHC de Ki67 de tumores NCI-H1299 después de 7 días de tratamiento. g. Porcentaje de núcleos positivos para Ki67 en tumores NCI-H1299 después de 7 días de tratamiento. Los gráficos representan la media ± SEM (n = 3 por grupo de tratamiento).
Figura 9. Inhibición eficaz y duradera de BRM en tumores NCI-H1299 y NCI-H460 in vivo. a. Las líneas de células cancerosas NCI-H1299 y NCI-H460 se obtienen ambas de carcinomas de pulmón de células grandes (Takahashi, Nau et al. 1989; Giaccone, Battey et al. 1992). De manera consistente, los xenoinjertos de líneas celulares de NCI-H1299 (paneles superiores) y NCI-H460 (paneles inferiores) están compuestos por células tumorales grandes, poco diferenciadas y carecen de producción de mucina. Las células tumorales NCI-H1299 presentan un fenotipo rabdoide con núcleos colocados excéntricamente e inclusiones eosinófilas intracitoplasmáticas positivas para vimentina. Las células tumorales NCI-H460 también son positivas para vimentina pero no muestran inclusiones eosinófilas intracitoplasmáticas obvias en la tinción H&E. Las células tumorales NCI-H1299 son negativas para BRG1 y muestran una expresión variable de BRM. Las células tumorales NCI-H460 son positivas para BRG1 y muestran niveles bajos de expresión de BRM. El porcentaje de núcleos positivos para BRG1 en NCI-H1299 y NCI-H460 se muestra en el panel de la derecha. Los gráficos representan la media ± SEM (n = 7-8 por grupo de tratamiento). b. Se inocularon en ratones células cancerosas NCI-H1299 que expresaban de forma estable ARNhc de control (CTL) no dirigido inducible por dox o dos ARNhc dirigidos a BRM distintos (sh2025 o sh5537). Los ratones portadores de tumores se trataron durante 17 días (final del estudio) con vehículo o con dox. La inmunotransferencia de BRM tumoral y vinculina después de 17 días de tratamiento muestra una atenuación de BRM eficiente y duradera. c. Imágenes representativas de la tinción IHC de BRM de tumores NCI-H1299 después de 17 días de tratamiento.
d. Porcentaje de núcleos positivos para BRM en tumores NCI-H1299 después de 17 días de tratamiento. Los gráficos representan la media ± SEM (n = 8 por grupo de tratamiento). e. Se inocularon en ratones células cancerosas NCI-H460 que expresaban de forma estable ARNhc de control (CTL) no dirigido inducible por dox o dos ARNhc dirigidos a BRM distintos (sh2025 o sh5537). Los ratones portadores de tumores se trataron durante 7 días o 14 días (final del estudio) con vehículo o con dox. Debido a la necrosis extensa en este modelo, la tinción IHC de BRM con análisis de imágenes de regiones tumorales viables, en lugar de inmunotransferencia, demostró ser el método más fiable para evaluar la eficiencia de atenuación de BRM. Se muestran imágenes representativas de la tinción IHC de BRM de tumores NCI-H460 después de 7 días (paneles superiores) y 14 días (paneles inferiores) de tratamiento. f.
Porcentaje de núcleos positivos para BRM en tumores NCI-H460 después de 7 días (panel izquierdo) o 14 días (panel derecho) de tratamiento. Los gráficos representan la media ± SEM (n = 3 por grupo de tratamiento para el punto temporal de 7 días; n = 7 por grupo de tratamiento para el punto temporal de 14 días).
Figura 10. La inhibición de BRM induce la detención del ciclo celular en tumores NCI-H1299 mutantes en BRG1 pero no en tumores NCI-H460 BRG1-WT. a. Se inocularon en ratones células cancerosas NCI-H1299 que expresaban de forma estable ARNhc de control (CTL) no dirigido inducible por dox o dos ARNhc dirigidos a BRM distintos (sh2025 o sh5537). Los ratones portadores de tumores se trataron durante 17 días (final del estudio) con vehículo o con dox. Se muestran imágenes representativas de tinción IHC de Ki67 de tumores NCI-H1299 después de 17 días de tratamiento. b. Porcentaje de núcleos positivos para Ki67 en tumores NCI-H1299 después de 17 días de tratamiento. Los gráficos representan la media ± SEM (n = 8 por grupo de tratamiento). c. Se inocularon en ratones células cancerosas NCI-H460 que expresaban de forma estable ARNhc de control no dirigido (CTL) inducible por dox o dos ARNhc dirigidos a BRM distintos (sh2025 o sh5537). Los ratones portadores de tumores se trataron durante 7 días o 14 días (final del estudio) con vehículo o con dox. Se muestran imágenes representativas de la tinción IHC de Ki67 de tumores NCI-H460 después de 7 días (paneles superiores) y 14 días (paneles inferiores) de tratamiento. d. Porcentaje de núcleos positivos para Ki67 en tumores NCI-H460 después de 7 días (panel izquierdo) o 14 días (panel derecho) de tratamiento. Los gráficos representan la media ± SEM (n = 3 por grupo de tratamiento para el punto temporal de 7 días; n = 8 por grupo de tratamiento para el punto temporal de 14 días).
Descripción detallada de la invención
La desregulación epigenética es un sello distintivo emergente de los cánceres, y la identificación de mutaciones somáticas recurrentes en las enzimas modificadoras de la cromatina implica un papel causal de los estados alterados de la cromatina en la tumorigénesis. (You, J. S. y P. A. Jones (2012) Cancer Cell 22(1): 9-20).
Si bien la mayoría de las mutaciones epigenéticas son inactivantes y, por lo tanto, no presentan objetivos directamente farmacológicos, se razona que estas mutaciones pueden alterar el estado epigenómico de las células cancerosas e inducir así novedosas vulnerabilidades epigenéticas. Para buscar sistemáticamente interacciones letales sintéticas epigenéticas, se realizó un cribado de ARNhc combinado en una gran colección de líneas de células cancerosas usando una genoteca dirigida a un conjunto diverso de reguladores epigenéticos.
Si bien el ARNi ha demostrado ser un enfoque genético avanzado muy poderoso, la solidez y la reproducibilidad de los cribados de ARNi se han visto desafiadas por la prevalencia de efectos inespecíficos y la incapacidad de predecir los ARNhc de alta potencia con gran confianza (Sigoillot, F.D., y King, R. W., (2011 ACS Chem Biol 6(1): 47-60). En un esfuerzo por superar estas limitaciones, se construyó una genoteca de ARNhc de amplia cobertura que se razonó para producir aciertos de mayor confianza debido a la amplia cobertura de ARNhc para cada gen. La genoteca de ARNhc empleada en este trabajo contenía 17 ARNhc por gen contra una colección diversa de reguladores epigenéticos, con un enfoque particular en genes con accesibilidad farmacológica, y se interrogó a través de un panel de 58 líneas celulares de la Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (Barretina, Caponigro et al. (2012) Nature 483(7391): 603-607).
El impacto en el crecimiento de los ARNhc para cada línea celular se definió mediante una puntuación z (Birmingham, A., L. M. Selfors, et al. (2009) Nat Methods 6(8): 569-575), que refleja el factor de cambio en la representación del ARNhc en relación con su representación en el grupo de plásmidos de partida. Además, para aprovechar la redundancia del ARNhc en la genoteca de amplia cobertura, se calcularon los valores de p centrados en genes usando el algoritmo de la actividad redundante de ARNip (RSA, por sus siglas en inglés) (Konig, R., C. Y. Chiang, et al. (2007) Nat Methods 4(10): 847-849).
Para identificar genes cuya inactivación se requiere selectivamente en un subconjunto de líneas de cáncer, se realizó un agrupamiento de K-medias del valor RSA para cada gen (Hartigan, J. A. y Wong, M. A. (1979) Applied Statistics (28): 100-108), que define grupos de líneas celulares "sensibles" e "insensibles" y, posteriormente, clasifica los aciertos basándose en la diferencia en los centros de los agrupamientos.
Curiosamente, el gen con la puntuación letal diferencial robusta más fuerte del cribado de la genoteca de epigenomas de amplia cobertura fue BRM (también conocido como SMARCA2), una subunidad de los complejos de remodelación de cromatina de mSWI/SNF, con una puntuación incluso más alta que el control positivo para KRAS (figura 1a). La aplicación del algoritmo ATARIS (Shao, D. D., A. Tsherniak, et al. (2013)
Genome Res 23(4): 665-678), que proporciona un método estadístico para identificar los ARNhc que comparten un perfil de actividad común, reveló que 12 ARNhc de BRM independientes mostraban perfiles de letalidad similares (figura 1b), lo que apoya firmemente la noción de que este efecto de letalidad diferencial se debe a la atenuación de BRM más que a una actividad inespecífica no específica. En conjunto, estos hallazgos implican a BRM como un gen que se requiere diferencialmente para la proliferación de un subconjunto de líneas de células cancerosas. Para identificar si una característica genética o molecular específica predice la sensibilidad a la inactivación de BRM, se realizó un interrogatorio sistemático de todas las características de la CCLE, incluyendo la expresión génica, el número de copias y la mutación en los datos de la CCLE (Barretina, J., G. Caponigro, et al. (2012) Nature 483(7391): 603-607).
Sorprendentemente, las mutaciones de pérdida de función en la subunidad catalítica de mSWI/SNF BRG1 se correlacionó fuertemente con la sensibilidad al algoritmo de ARNhc de BRM (p = 2,03 x 10-4) (Konig, R., C. Y. Chiang, et al. (2007) Nat Methods 4(10): 847-849). BRM y BRG1 son parálogos estrechamente relacionados que funcionan como subunidades de ATPasa mutuamente excluyentes de los complejos mSWI/SNF. Aunque BRM y BRG1 se conservan significativamente a nivel de proteína, muestran funciones superpuestas y distintas (Ho, L. y Crabtree G.R. (2010) Nature 463(7280) 474-84). La identificación de BRM como un acierto letal sintético en el contexto de mutaciones de BRG1 planteó la posibilidad de que BRM esté sustituyendo las funciones esenciales de los complejos mSWI/SNF en células cancerosas deficientes en BRG1, creando así una vulnerabilidad selectiva al cáncer. Una predicción de este modelo sería que solo la pérdida completa (es decir, homocigota) pero no la pérdida heterocigota de BRG1 debería conducir a la dependencia de BRM. De hecho, las líneas celulares con pérdida completa de BRG1 eran sensibles a los ARNhc de BRM, mientras que las células que albergaban mutaciones de BRG1 heterocigotas y aún conservaban la expresión de BRG1 no eran sensibles a los ARNhc de BRM (como se observa en la Tabla 2 y las figuras 1, 2). En conjunto, estos hallazgos demuestran que las células que carecen de una copia funcional de BRG1 se vuelven extremadamente dependientes del BRM residual que contiene los complejos mSWI/SNF para su supervivencia. Cabe destacar que la línea celular SBC5, que muestra tanto la pérdida de expresión de BRG1 como de BRM por transferencia de Western no fue sensible a los ARNhc de BRM (figuras 1 y 2), lo que demuestra que la conservación de la expresión de BRM es necesaria para que las líneas celulares mutantes en BRG1 sean sensibles a inhibición de BRM.
Con el fin de examinar más a fondo el impacto del agotamiento de BRM en las células deficientes en BRG1, se diseñaron varias líneas celulares de tipo silvestre y deficientes en BRG1 con construcciones de ARNhc inducible por doxiciclina (dox) que se dirigen a BRM. En primer lugar se verificó que los ARNhc dirigidos a BRM, incluyendo las secuencias que se usaron en los experimentos de cribado de ARNhc combinado, dieron como resultado una atenuación eficiente de los transcritos de BRM en un sistema inducible por dox (figura 3a). Además, se determinó que los dos ARNhc de BRM que se aplicaron en estos estudios de validación posteriores (ARNhc de BRM 2025 y ARNhc de BRM 5537) no produjeron ningún efecto inhibidor del crecimiento inespecífico cuando se indujeron en una línea celular que carecía de la diana (como se observa en la figura 3b, c, d, e).
En las tres líneas celulares de cáncer de pulmón mutantes en BRG1 probadas (NCI-H838, NCI-H1299 y A549), la atenuación de BRM dio como resultado una profunda inhibición del crecimiento en la proliferación a corto plazo, así como en los ensayos de formación de colonias (como se observa en la figura 4a, c, e y la figura 5a, b, e, g y k). De acuerdo con los resultados de los datos de cribado, la atenuación de BRM no afectó a la proliferación de células con BRG1 intacto, tal como la línea de células de cáncer de pulmón WT BRG1 NCI-H460 (como se observa en la figura 4b, d, f) y BEAS2B, una línea de células epiteliales de pulmón inmortalizada no tumorigénica (como se observa en la figura 6). Como era de esperar, la atenuación de BRG1 tampoco afectó a la proliferación de estas dos líneas de BRG1 WT (como se observa en la figura 6). Sorprendentemente, sin embargo, la atenuación simultánea de BRG1 y BRM condujo a una marcada inhibición del crecimiento en estas dos líneas celulares de BRG1 WT, lo que apoya fuertemente la relación letal sintética de BRM y BRG1 (como se observa en la figura 6).
A continuación, se buscó investigar con más detalle el mecanismo de inhibición del crecimiento en respuesta a la inactivación de BRM. El examen de los perfiles del ciclo celular en las líneas celulares mutantes en BRG1 indicó que la atenuación de BRM condujo a una detención prominente de G1 (como se observa en la figura 7a y la figura 5c, i) sin la aparición de una población sub-G1 que de otro modo sería indicativa de muerte celular. En particular, en las células NCI-H838 y NCI-H1299, la detención de G1 se acompañó de la aparición de células senescentes, como lo demuestra la tinción positiva para la p-galactosidasa ácida (como se observa en la figura 7b y la figura 5j), lo que sugiere que el efecto inhibidor del crecimiento de BRM está mediado, al menos en este subconjunto de líneas dependientes de BRG1, a través de la inducción de la detención y senescencia de G1.
De forma interesante, se observa que H3K9me3 detectado por inmunofluorescencia se aumentó tras la atenuación de BRM particularmente en células NCI-H838 (como se observa en la figura 7c) y NCI-H1299 (como se observa en la figura 5l). Cabe destacar que H3K9me3 es una marca de histona represiva que es característica de las regiones de genes heterocromáticos y puede asociarse con células que experimentan senescencia (Narita, M., S. Nunez, et al. (2003) Cell 113(6): 703-716). Por lo tanto, el marcado aumento de H3K9me3 represivo en respuesta al agotamiento de BRM en las células mutantes en BRG1 puede ser un reflejo de que las células entran en un estado de crecimiento detenido/senescente.
Con el fin de comprender mejor los mecanismos moleculares asociados con la letalidad sintética que surge de la inhibición de BRM en células cancerosas mutantes en BRG1, se realizaron estudios de perfiles transcripcionales globales en un curso temporal de atenuación de BRM inducible por dox en líneas de células cancerosas mutantes en BRG1, NCI-H1299 y A549. Se analizó la expresión génica a las 48 horas (Día 2), así como a las 72 (Día 3) y 96 horas (Día 4) después de la inducción por dox de ARNhc de BRM.
Los genes regulados positivamente (más de 1,5 veces) y negativamente (menos de -1,5 veces) se validaron posteriormente mediante RT-PCR cuantitativa y representan un conjunto diverso de funciones, aunque cabe apreciar que varios genes, tales como PLAU, GPR56, TGM2 y SPARC, entre otros, están implicados en la adhesión celular y la remodelación de la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) (Tabla 3). Cabe destacar que, si bien muchos de estos genes no se han identificado previamente y, por lo tanto, son novedosos, se ha informado que un subconjunto de estos genes está modulado por la expresión de BRG1 (Liu et al., Cell 2001, Hendricks et al., Mol Cell Biol 2004) y, por lo tanto, podrían representar dianas comunes de complejos mSWI/SNF que contienen BRG1 y BRM. Estos resultados sugieren que algunos de estos genes pueden ser dianas directas de BRM (SWI/SNF) y que la inhibición de BRM da como resultado una modulación transcripcional de una diversidad de genes que vuelven a conectar la célula cancerosa hacia la inhibición del crecimiento.
La Tabla 3 muestra una lista de genes verificados por RT-PCR cuantitativa que se modulan tras la atenuación de BRM en células NCI-H1299 y A549 en un curso temporal de inducción por dox de ARNhc de BRM. Los valores representan el factor de cambio de cada transcrito en relación con el control menos dox para cada punto temporal. Los valores negativos representan factores de disminución y los valores positivos representan factores de aumento. Los factores de cambio de la atenuación para SMARCA2/BRM se incluyen como controles. También se enumera el ensayo taqman que se usó para generar datos para cada gen. Los cambios en la expresión asociados con la atenuación de b Rm pueden ser marcadores farmacodinámicos (PD) útiles para controlar la respuesta de los pacientes al tratamiento con inhibidores de BRM.
Tabla 3. Cambios en la expresión génica tras la atenuación de BRM
Células NCI-H1299 Células A549 mutantes en BRG1 mutantes en BRG1 ARNhc de ARNhc de BRM 2025 BRM 2025 Ubicación Entrez Taqman
Gen cromosómica Gene Id. ID. de ensayo día2 día3 día4 día2 día3 día4 SMARCA (ABI)
2 chr9p22.3 6595 Hs00268234_m1 -14,7 -19,8 -17,1 -17,7 -31,9 -23,2
Hs.PT.56a.4077503
GPR56 chr16q13 9289 7 -6,7 -11,0 -14,0 -3,6 -6,5 -8,5
Hs. PT.56a.1977607
PLAU chr10q24 5328 8 -5,7 -8,5 -9,0 -3,5 -12,3 -19,0
Hs.PT.56a.2097477
ARHGDIB chr12p12.3 397 2 -3,3 -7,3 -8,5 -3,8 -26,5 -41,6
Hs. PT.56a.1937434.
TGM2 chr20q12 7052 g -3,4 -3,6 -3,3 -4,6 -11,7 -11,6
Hs. PT.56a.2733471
KRT80 chr12q13.13 144501 8g -4,9 -12,5 -29,4 -9,4 -42,9 -77,9
Hs.PT.56a.3895151
ACOX2 chr3p14.3 8309 5 -8,3 -0,8 -3,4 -3,7 -11,6 -12,7 LINC0067 10049946 Hs.PT.56a.2750538
3 7 4 -1,6 -1,5 -2,0 -1,9 -4,7 -7,1 Hs.PT.56a.4084823
TGFBI chr5q31 7045 2 -1,8 -2,6 -4,2 -2,1 -4,9 -8,6
Hs.PT.56a.2038126
CALB2 chr16q22.2 794 4 -2,4 -4,4 -3,5 -3,4 -14,0 -13,8
Hs.PT.56a.3896941
MGLL chr3q21.3 11343 0g -2,9 -5,9 -9,8 -2,2 -8,6 -18,0
(ABI)
S100P chr4p16 6286 Hs00195584_m1 -1,1 -2,5 -1,5 -3,1 -17,3 -42,5 C15orf52 chr15q15.1 388115 Hs.PT.56a.4476793 -4,0 -5,1 -7,6 -4,9 -16,3 -26,8 MYO5B chr18q21 4645 Hs.PT.56a.1129168 -3,3 -12,9 -19,6 -2,8 -13,0 -23,1
Hs.PT.56a.4069691
KCNN4 chr19q13.2 3783 0g -2,7 -5,1 -9,6 -2,0 -6,6 -15,1 LOXL2 chr8p21.3 4017 Hs.PT.56a.2256221 -2,1 -2,8 -4,1 -2,6 -6,8 -12,4
(ABI)
SPARC chr5q31.3-q32 6678 Hs00234160_m1 -1,7 -4,9 -10,6 -6,3 -20,0 -34,9 Células NCI-H1299 Células A549 mutantes en BRG1 mutantes en BRG1 ARNhc de ARNhc de BRM 2025 BRM 2025 Ubicación Entrez Taqman
Gen cromosómica Gene Id. ID. de ensayo día2 día3 día4 día2 día3 día4
CLDN2 (ABI)
chrXq22.3-q23 9075 Hs00252666_s1 -4,8 -43,0 -158,6 -2,4 -5,6 -4,7
EHF (ABI)
chr11p12 26298 Hs00171917 m1 -5,3 -19,2 -32,0 -1,4 -2,1 1,1 TMEM15 (ABI)
8 chr3p21.3 25907 Hs00374916_s1 -1,4 -1,4 -1,3 -2,0 -2,2 -3,3 MMP1 (ABI)
chr11q22.3 4312 Hs00899658_m1 -1,8 -1,6 -1,2 -3,1 -5,5 -4,2 chrXp11.23- Hs.PT.56a.2720771
SYP p11.22 6855 2 1,7 2,9 3,8 2,3 3,7 4,6
(ABI)
ID4 chr6p22-p21 3400 Hs02912975_g1 3,4 7,3 8,6 2,3 3,2 3,8
Hs.PT.56a.3895835
ID2 chr2p25 3398 3 3,5 6,6 5,9 1,1 1,1 1,1 Hs.PT.56a.1437191
ELFNI chr7p22.3 392617 0 1,4 1,8 1,7 2,8 15,8 16,8
Hs.PT.56a.2521158
ADM chr11p15.4 133 0g 2,2 3,1 2,1 1,8 3,9 3,8
Hs.PT.56a.2062380
FLJ27352 chr15q21.3 145788 1 1,8 2,9 2,6 1,5 2,1 3,2
Hs.PT.56a.3948388
IGFBP3 chr7p13-p12 3486 1.g 1,7 2,0 1,9 -1,6 -2,3 -2,6
(ABI)
NR4A3 chr9q22 8013 Hs00545009_g1 1,9 2,3 2,0 5,7 22,3 38,5
Hs.PT.56a.4003777
NR4A2 chr2q22-q23 4929 2 1,6 2,2 2,4 5,9 11,7 13,4
Hs.PT.56a.4004909
CSPG5 chr3p21.3 10675 9 1,3 1,8 1,1 1,6 2,1 2,0
(ABI)
PRSS35 chr6q14.2 167681 Hs00856285_s1 2,1 6,1 25,7 1,4 2,3 2,3
El microambiente del tumor puede afectar profundamente, en algunos contextos, a la respuesta terapéutica a la quimioterapia y los agentes dirigidos. Por lo tanto, se investigó si la dependencia selectiva de los cánceres mutantes en BRG1 sobre BRM se traduce en un entorno in vivo. Se compararon los efectos de la atenuación de BRM en modelos de xenoinjerto de NCI-H1299 mutante en BRG1 y NCI-H460 BRG1-WT (como se observa en la figura 9a), que contienen ARNhc de control (CTL) inducible por dox o dos ARNhc dirigidos a BRM (sh2025 o sh5537) distintos.
Estos datos muestran claramente que mediante la detección inmunohistoquímica, los tumores mutantes en BRG1 carecen de expresión de BRG1, mientras que los tumores BRG1 WT conservan BRG1. Por lo tanto, este podría ser un medio importante por el cual se podría determinar la pérdida de BRG1 en un paciente. Tras el tratamiento con dox, la expresión de BRM disminuyó notablemente en los tumores de ARNhc de BRM pero no en los tumores de ARNhc CTL (como se observa en las figuras 8a-c y las figuras 9b-f). Se mantuvo una atenuación de BRM eficiente hasta el final de los estudios (como se observa en la figura 9b-f).
El tratamiento con Dox de ratones portadores de xenoinjertos de NCI-H1299 mutantes en BRG1 con sh2025 o sh5537 condujo a una inhibición significativa del crecimiento tumoral (como se observa en la figura 8d). Este efecto se debió a la inhibición de BRM en lugar del tratamiento con dox solo, ya que los tumores de ARNhc CTL NCI-H1299 progresaron rápidamente a pesar del tratamiento (como se observa en la figura 8d). De manera consistente, el marcador de proliferación Ki67 disminuyó significativamente en los tumores de ARNhc de BRM NCI-H1299 tratados con dox pero no en los tumores de ARNhc CTL NCI-H1299 (como se observa en la figura 8f,g y la figura 10a,b). Por el contrario, la atenuación de BRM no afectó al crecimiento de los tumores NCI-H460 BRG1 WT (como se observa en la figura 8e y la figura 10c,d), lo que demuestra los efectos selectivos de la inhibición de BRM in vivo. Juntos, estos hallazgos indican que la letalidad sintética de BRM y BRG1 se traduce en un entorno in vivo, y brindan más evidencia sobre los efectos selectivos del direccionamiento de BRM.
Los resultados de nuestro estudio indican que las células cancerosas que albergan mutaciones inactivadoras de BRG1 son muy sensibles a la inhibición de BRM, lo que demuestra un novedoso papel de los complejos que contienen BRM en la promoción de la supervivencia de las células tumorales. Sin embargo, es interesante observar que se informa que una subpoblación de cánceres de pulmón con mutaciones de BRG1 tiene una expresión baja o nula de BRM (Reisman, D. N., J. Sciarrotta, et al. (2003) Cancer Res 63(3): 560-566)(Matsubara, D., Y. Kishaba, et al. (2013) Cancer Sci 104(2): 266­ 273). Si bien no se sabe cómo sobreviven las células cancerosas que pierden ambas ATPasas, nuestros datos indican que las células cancerosas deficientes en BRG1 que expresan BRM siguen siendo muy sensibles a la inhibición de BRM. De hecho, se confirmó que las líneas deficientes en BRG1 que responden a los ARNhc de BRM expresan BRM (como se observa en la figura 2). Basándose en los resultados presentados en este estudio, se propone un modelo en el que la actividad reducida o hipomórfica del complejo SWI/SNF promueve la tumorigénesis. En este contexto, las mutaciones de pérdida de función de BRG1 crean una vulnerabilidad específica del cáncer que se puede aprovechar terapéuticamente dirigiéndose selectivamente a este complejo que contiene BRM residual.
Nuestro estudio posiciona a BRM como una diana terapéutica atractiva para los cánceres deficientes en BRG1. Aunque BRM y BRG1 están muy relacionados, muestran funciones redundantes y distintas. Mientras que la inactivación de BRG1 es letal para el embrión (Bultman, S., T. Gebuhr, et al. (2000) Mol Cell 6(6): 1287-1295), la de BRM da como resultado animales viables sin deficiencias manifiestas (Reyes, J. C., J. Barra, et al. (1998) EMBO J 17(23): 6979-6991), que predice una buena ventana terapéutica con inhibidores selectivos de BRM. Cabe destacar que BRM contiene un bromodominio y un dominio de ATPasa, que presentan vías atractivas para el desarrollo de inhibidores dirigidos. La importancia clínica de estos hallazgos se destaca por la prevalencia de mutaciones de BRG1 en varios cánceres. Por ejemplo, muchos tipos de cáncer, incluidos los adenocarcinomas de pulmón, un subtipo de cáncer de pulmón asociado con mal pronóstico, albergan frecuentes mutaciones inactivadoras en la subunidad catalítica de SWI/SNF BRG1/SMARCA4 (Imielinski, M., Berger, A. H., et al. (2012) Cell 150(6) 1107-20). En conclusión, nuestro enfoque centrado en el cribado de ARNhc del epigenoma es un primer conjunto de estudios para dilucidar sistemáticamente un nodo letal sintético clave dentro del complejo SWI/SNF en un cáncer mutante SWI/SNF, y allana el camino para vías críticas y novedosas para la intervención terapéutica en cánceres deficientes en BRG1.
Preparación de muestras
Se proporciona, entre otras cosas, un ensayo para la detección de la identidad de la secuencia de ácido nucleico que codifica las mutaciones de BRG1.
El método puede incluir la detección de la mutación en un líquido corporal tal como sangre (por ejemplo, suero o plasma), médula ósea, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal/pleural, líquido linfático, líquido ascítico, líquido seroso, esputo, líquido lagrimal, deposiciones y orina, o en un tejido tal como un tejido tumoral. El tejido tumoral pude ser tejido fresco o tejido incluido en parafina.
Como se usa en el presente documento, un "sujeto" se refiere a un ser humano o animal, incluyendo todos los mamíferos tales como primates (particularmente primates superiores), ovejas, perros, roedores (por ejemplo, ratón o rata), cobayas, cabras, cerdos, gatos, conejos y vacas. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un animal experimental o animal adecuado como modelo de enfermedad.
Las muestras de líquido corporal pueden obtenerse de un sujeto usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Los métodos para extraer ADN celular de muestras de líquido corporal se conocen bien en la técnica. Típicamente, las células se lisan con detergentes. Después de la lisis celular, las proteínas se retiran del ADN usando diversas proteasas. A continuación, el ADN se extrae con fenol, se precipita en alcohol y se disuelve en una solución acuosa. Los métodos para extraer ADN acelular de muestras de líquido corporal también se conocen en la técnica. Normalmente, el ADN acelular en una muestra de líquido corporal se separa de las células, se precipita en alcohol y se disuelve en una solución acuosa.
Generalmente, una muestra de tumor sólido puede ser una muestra de ensayo de células o tejido que se obtiene de un sujeto con cáncer por biopsia o resección quirúrgica. Una muestra de células o tejido puede extraerse por biopsia por aspiración con aguja. Para ello, se inserta una aguja fina fijada a una jeringa a través de la piel y en el tejido de interés. La aguja se guía típicamente a la región de interés usando ultrasonidos o imágenes de tomografía computarizada (TC). Una vez insertada la aguja en el tejido, se crea un vacío con la jeringa de modo que las células o el líquido puedan succionarse a través de la aguja y recogerse en la jeringa. Una muestra de células o tejido también puede extraerse por biopsia de incisión o central. Para ello, se extrae un cono, un cilindro o un poquito de tejido de la región de interés. Generalmente se usan imágenes de TC, ultrasonidos o un endoscopio para guiar este tipo de biopsia. Más particularmente, la lesión cancerosa completa puede extraerse por biopsia de escisión o resección quirúrgica. La muestra de ensayo es típicamente una muestra de células extraídas como parte de una resección quirúrgica.
La muestra de ensayo de, por ejemplo, tejido, también puede almacenarse en, por ejemplo, RNAlater (Ambion; Austin Tex.) o ultracongelarse y almacenarse a -80 °C para su uso posterior. La muestra de tejido biopsiado también puede fijarse con un fijador, tal como formaldehído, paraformaldehído o ácido acético/etanol. La muestra de tejido fijada puede incluirse en cera (parafina) o una resina plástica. La muestra de tejido incluida (o muestra de tejido congelada) puede cortase en secciones delgadas. También puede extraerse el ARN o la proteína de una muestra de tejido fijada o incluida en cera.
Los cánceres susceptibles de tratamiento de acuerdo con la presente invención incluyen cánceres o enfermedades proliferativas celulares tales como tumores y/o el crecimiento de células cancerosas asociado con mutaciones de BRG1. Las enfermedades pueden incluir aquellas que muestran una pérdida de la función de BRG1, ya sea por mutación en el gen BRG1 o pérdida de la expresión de BRG1. Los ejemplos de mutaciones de BRG1 incluyen, pero sin limitación, las enumeradas en la Tabla 1, Tabla 2 y descritas experimentalmente en el presente documento.
Definiciones
Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma en singular "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas.
Todas las designaciones numéricas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentración y peso molecular, incluidos los intervalos, son aproximaciones que se varían (+) o (-) en incrementos de 0,1. Se ha de entender, aunque no siempre se indique explícitamente, que todas las designaciones numéricas van precedidas por el término "aproximadamente". También debe entenderse, aunque no siempre se mencione explícitamente, que los reactivos descritos en el presente documento son meramente ilustrativos y que en la técnica se conocen equivalentes de estos.
Los términos "marcador" o "biomarcador" se usan indistintamente en el presente documento. Un biomarcador es un ácido nucleico o polipéptido y la presencia o ausencia de una mutación o expresión diferencial del polipéptido se usa para determinar la sensibilidad a cualquier inhibidor de BRM. Por ejemplo, BRG1 es un biomarcador en una célula cancerosa cuando está mutada en comparación con BRG1 en una célula (no cancerosa) normal o célula de control.
Una célula es "sensible", muestra "sensibilidad" para la inhibición o es "susceptible de tratamiento" con un inhibidor de BRM cuando la viabilidad celular se reduce y/o la tasa de proliferación celular se reduce tras el tratamiento con un inhibidor de BRM en comparación con un control no tratado.
Las expresiones "letalidad sintética" y "letal sintética" se usan para referirse a una combinación de mutaciones en dos o más genes que conduce a una viabilidad celular reducida y/o una tasa de proliferación celular reducida, mientras que una mutación en solo uno de estos genes no
Como se describe adicionalmente en el presente documento, una célula cancerosa, un tipo de cáncer o un sujeto afectado por un cáncer, es "sensible a inhibidores de BRM", "sensible al tratamiento con inhibidores de BRM", "sensible a la inhibición terapéutica de BRM" o se describe en términos similares si es susceptible al tratamiento con un inhibidor de BRM, por ejemplo, debido a que alberga una o más mutaciones de BRG1 de los tipos descritos en el presente documento.
"BRM" y "BRG1" se refieren a dos parálogos de la subunidad ATPasa en el complejo SWI/SNF, también conocidos como SMARCA2 y SMARCA4, respectivamente. A menos que se indique específicamente lo contrario, BRM, como se usa en el presente documento, se refiere a BRM humano, cuya secuencia proteínica tiene el número de acceso Swiss-Prot P51531.2; y BRG1, como se usa en el presente documento, se refiere a BRG1 humano, cuya secuencia proteínica tiene los números de acceso Swiss-Prot P51532.2. BRM, BRG1 y el complejo SWI/SNF se describen en detalle en revisiones tales como Wilson, BG, et al. Nat Rev Cancer. 9 de junio de 2011;11 (7):481-92. La secuencia genómica de BRG1 (SMARCA4) tiene la secuencia de referencia de NCBI: NG_011556.1; sus ARNm son resultado de una diversidad de formas de corte y empalme (es decir, variantes de transcritos), incluyendo los números de referencia de NCBI NM_001128844.1, NM_001128849.1, NM_001128845.1, NM_001128846.1, NM_001128847.1, NM_001128848.1 y NM_003072.3. La secuencia genómica de BRM (SMARCA2) tiene la secuencia de referencia de NCBI: NC_000009.11, sus ARNm son resultado de dos formas de corte y empalme (es decir, variantes de transcritos), incluyendo los números de referencia de NCBI NM_003070.3 y NM_139045.2.
Un cáncer es que está "asociado con una mutación de BRG1" incluye los tipos de cáncer asociados con mutaciones de BRG1 documentadas o la pérdida de expresión de BRG1 documentada, incluyendo, pero sin limitación, cánceres de pulmón, mama, riñón, intestino grueso, ovario, próstata, tracto aerodigestivo superior, estómago, endometrio, hígado, páncreas, tejido hematopoyético y linfoide, piel, tiroides, pleura, ganglios autónomos, sistema nervioso central, tejidos blandos, sarcomas rabdoides pediátricos, melanomas y otros cánceres con pérdida de función de BRG1 debido a la mutación de BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1.
Un "tipo silvestre", "normal" o "no mutante" se refiere a secuencias de BRG1 que comprenden el número de acceso P51532.2.
Un "mutante" o "mutación" es cualquier cambio en la secuencia de ADN o proteínica que se desvía de BRG1 de tipo silvestre. Esto incluye, sin limitación, cambios de ácido nucleico de una sola base o cambios de un solo aminoácido, inserciones, eliminaciones y truncamientos del gen BRG1 de tipo silvestre (incluyendo cada una de sus formas de corte y empalme (es decir, variantes de transcritos)) y su proteína correspondiente. Se pueden encontrar ejemplos de mutaciones de BRG1 en la Tabla 1, Tabla 2, y se describen experimentalmente en el presente documento.
Una "célula de control", "célula normal" o "de tipo silvestre" se refiere a tejido o células no cancerosas.
Un "tejido de control", "tejido normal" o "de tipo silvestre" se refiere a tejido o células no cancerosas.
Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, tanto desoxirribonucleótidos como ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de un gen (por ejemplo, una sonda, cebador, etiqueta SAGE o EST), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones de la estructura del nucleótido se pueden conferir antes o después del acoplamiento del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir con componentes que no sean nucleótidos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de su polimerización tal como mediante conjugación con un componente marcador. El término también se refiere a moléculas tanto monocatenarias como bicatenarias. A no ser que se especifique o se requiera de otro modo, cualquier realización de esta divulgación que sea un polinucleótido incluye tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias complementarias conocidas o previstas para constituir la forma bicatenaria.
Un "gen" se refiere a un polinucleótido que contiene al menos un marco abierto de lectura (ORF, por sus siglas en inglés) que puede codificar un polipéptido o proteína particular después de transcribirse y traducirse. Se puede usar una secuencia polinucleotídica para identificar fragmentos más grandes o secuencias codificantes de longitud completa del gen con el que se asocian. Se conocen métodos para aislar secuencias de fragmentos más grandes por los expertos en la técnica.
La "expresión génica" o, como alternativa, un "producto génico" se refiere a los ácidos nucleicos o aminoácidos (por ejemplo, péptido o polipéptido) que se generan cuando un gen se transcribe y se traduce.
El término "polipéptido" se usa indistintamente con el término "proteína" y, en su sentido más amplio, se refiere a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos o miméticos peptídicos. Las subunidades pueden estar conectadas mediante enlaces peptídicos. En otra realización, la subunidad puede estar conectada mediante otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc.
Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere tanto a aminoácidos naturales como a no naturales o sintéticos, y tanto a isómeros ópticos D como a L, análogos de aminoácidos y miméticos peptídicos. Un péptido de tres o más aminoácidos se denomina comúnmente oligopéptido si la cadena peptídica es corta. Si la cadena peptídica es larga, el péptido se denomina comúnmente polipéptido o proteína.
El término "aislado" significa separado de otros constituyentes, celulares y de otro tipo, con los que el polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o uno o más fragmentos de los mismos, están asociados normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, un polinucleótido aislado está separado de los nucleótidos contiguos 3' y 5' con los que está asociado normalmente en su entorno nativo o natural, por ejemplo, en el cromosoma. Como resulta evidente para los expertos en la técnica, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o uno o más fragmentos de los mismos no naturales no requieren "aislamiento" para distinguirlos de su homólogo de origen natural. Además, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o uno o más fragmentos de los mismos "concentrado", "separado" o "diluido" se distingue de su homólogo de origen natural en el hecho de que la concentración o el número de moléculas por volumen es superior en una versión "concentrada" o inferior en una versión "separada" en comparación con la de su homólogo de origen natural.
Una "sonda", cuando se usa en el contexto de la manipulación de polinucleótidos, se refiere a un oligonucleótido que se proporciona como reactivo para detectar una diana potencialmente presente en una muestra de interés mediante hibridación con la diana. Normalmente, una sonda comprenderá un marcador o un medio por el que se pueda unir un marcador, ya sea antes o después de la reacción de hibridación. Los marcadores adecuados incluyen, pero sin limitación, radioisótopos, fluorocromos, compuestos quimioluminiscentes, colorantes y proteínas, incluidas las enzimas.
Un "cebador" es un polinucleótido corto, generalmente con un grupo 3'-OH libre que se une a una diana o "plantilla" potencialmente presente en una muestra de interés mediante hibridación con la diana y posteriormente fomenta la polimerización de un polinucleótido complementario a la diana. Una "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") es una reacción en la que se obtienen copias replicadas de un polinucleótido diana usando un "par de cebadores" o un "conjunto de cebadores" que consiste en un cebador "cadena arriba" y uno "cadena abajo", y un catalizador de polimerización, tal como una ADN-polimerasa, y típicamente una enzima polimerasa termoestable. Los métodos para la PCR son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en PCR: A Practical Approach, M. MacPherson et al., IRL Press at Oxford University Press (1991). Todos los procesos de producción de copias replicadas de un polinucleótido, tales como la PCR o la clonación de genes, se denominan de forma colectiva en el presente documento "replicación". Un cebador también se puede usar como sonda en reacciones de hibridación tales como los análisis de inmunotransferencia de Northern o Southern (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición (1989)).
Como se usa en el presente documento, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el que el ADN se transcribe en ARNm y/o el proceso mediante el que el ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el polinucleótido se obtiene a partir de ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota.
La expresión "expresado de forma diferencial", cuando se aplica a un gen, se refiere a la producción diferencial del ARNm transcrito y/o traducido a partir del gen o el producto proteínico codificado por el gen. Un gen expresado de forma diferencial puede estar sobreexpresado o subexpresado en comparación con el nivel de expresión de una célula normal o de control. Sin embargo, como se usa en el presente documento, la sobreexpresión es un aumento en la expresión génica y, generalmente, es al menos 1,25 veces o, como alternativa, al menos 1,5 veces o, como alternativa, al menos 2 veces o, como alternativa, al menos 3 veces o, como alternativa, al menos 4 veces la expresión sobre la detectada en una célula o tejido homólogo normal o de control. Como se usa en el presente documento, la subexpresión es una reducción de la expresión génica y, generalmente, es al menos 1,25 veces o, como alternativa, al menos 1,5 veces o, como alternativa, al menos 2 veces o, como alternativa, al menos 3 veces o, como alternativa, al menos 4 veces la expresión por debajo de la detectada en una célula o tejido homólogo normal o de control. La expresión "expresado de forma diferencial" también se refiere a cuando se detecta expresión en una célula cancerosa o tejido canceroso, pero la expresión en una célula de control o tejido normal (por ejemplo, célula o tejido no canceroso) es indetectable.
Puede producirse un alto nivel de expresión del gen a causa de la sobreexpresión del gen o un aumento en el número de copias del gen. El gen también puede traducirse en niveles proteínicos aumentados a causa de la desregulación o ausencia de un regulador negativo. Finalmente, puede producirse una alta expresión del gen debido a estabilización aumentada o degradación reducida de la proteína, que provoca la acumulación de la proteína.
Un "perfil de expresión génica" o "característica génica distintiva" se refiere a un patrón de expresión de al menos un biomarcador que reaparece en múltiples muestras y refleja una propiedad compartida por esas muestras, tal como mutación, respuesta a un tratamiento particular o activación de un proceso biológico o ruta particular en las células. Un perfil de expresión génica se diferencia entre muestras que comparten esa propiedad común y las que no con mejor precisión de lo que probablemente se conseguiría asignando las muestras a los dos grupos al azar. Un perfil de expresión génica se puede usar para predecir si muestras de estado desconocido comparten esa propiedad común o no. Debe esperarse algo de variación entre el o los biomarcadores y el perfil típico, pero la similitud global del o de los biomarcadores con el perfil típico es tal que es estadísticamente improbable que la similitud se observara por casualidad en muestras que no comparten la propiedad común que refleja el o los biomarcadores.
El término "ADNc" se refiere a ADN complementario, es decir, moléculas de ARNm presentes en una célula u organismo que se convierten en ADNc con una enzima tal como la transcriptasa inversa. Una "genoteca de ADNc" es una colección de todas las moléculas de ARNm presentes en una célula u organismo, convertidas todas ellas en moléculas de ADNc con la enzima transcriptasa inversa e insertadas a continuación en "vectores" (otras moléculas de ADN que pueden seguir replicándose tras la adición de ADN exógeno). Los vectores ilustrativos para las genotecas incluyen un bacteriófago (también conocido como "fago"), virus que infectan bacterias, por ejemplo, un fago lambda. A continuación, la genoteca se puede analizar con una sonda para determinar el ADNc específico (y, por lo tanto, el ARNm) de interés.
Como se usa en el presente documento, "soporte de fase sólida" o "soporte sólido", que se usan indistintamente, no se limitan a un tipo específico de soporte. Por el contrario, existe una amplia gama de soportes disponibles y estos son conocidos por el experto en la técnica. Los soportes de fase sólida incluyen geles de sílice, resinas, películas de plástico derivatizado, microesferas de vidrio, microesferas de plástico, geles de alúmina, micromatrices y chips. Como se usa en el presente documento, la expresión "soporte sólido" también incluye liposomas, células y matrices sintéticas que presentan antígenos. Un soporte de fase sólida adecuado se puede seleccionar en función del uso final deseado y la idoneidad para diversos protocolos. Por ejemplo, para la síntesis de péptidos, el soporte de fase sólida puede referirse a resinas tales como poliestireno (por ejemplo, resina PAM obtenida en Bachem Inc., Peninsula Laboratories), resina poliHIPE(R)™ (obtenida en Aminotech, Canadá), resina de poliamida (obtenida en Peninsula Laboratories), resina de poliestireno injertado con polietilenglicol (TentaGelR™, Rapp Polymere, Tubingen, Alemania) o resina de polidimetilacrilamida (obtenida en Milligen/Biosearch, California).
También se puede unir un polinucleótido a un soporte sólido para su uso en ensayos de cribado de alto rendimiento. El documento PCT WO 97/10365, por ejemplo, desvela la construcción de chips de oligonucleótidos de alta densidad. Véanse también las Pat. de EE.UU. N.° 5.405.783; 5.412.087 y 5.445.934. Usando este método, las sondas se sintetizan en una superficie de vidrio derivatizado para formar las matrices del chip. Se acoplan fosforamiditas de nucleósidos fotoprotegidas a la superficie del vidrio, se desprotegen selectivamente mediante fotólisis a través de una máscara fotolitográfica y se hacen reaccionar con una segunda fosforamidita de nucleósido protegida. El proceso de acoplamiento/desprotección se repite hasta que se completa la sonda deseada.
Como un ejemplo, la actividad transcripcional puede evaluarse midiendo los niveles de ARN mensajero usando un genochip tal como los genochips Affymetrix® HG-U133-Plus-2 (Affymetrix, Santa Clara, CA). La cuantificación de alto rendimiento en tiempo real del ARN de una gran cantidad de genes de interés, por lo tanto, llega a ser posible en un sistema reproducible.
La expresión "condiciones rigurosas de hibridación" se refiere a condiciones en las que una sonda de ácido nucleico se hibridará específicamente con su subsecuencia diana y no con otras secuencias. Las condiciones que determinan la rigurosidad de la hibridación incluyen: temperatura, fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tales como formamida. La variación de uno de estos factores puede influir sobre otro factor y un experto en la técnica apreciará los cambios en las condiciones necesarias para mantener el nivel deseado de rigurosidad. Un ejemplo de una hibridación altamente rigurosa es: cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 65-68 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50 % a 42 °C. Un ejemplo de una hibridación "moderadamente rigurosa" son las condiciones de: cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 50-65 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 20 % a 37-50 °C. Las condiciones moderadamente rigurosas se usan cuando se desea una cantidad moderada de emparejamientos incorrectos del ácido nucleico. Un experto en la técnica apreciará que el lavado forma parte de las condiciones de hibridación. Por ejemplo, las condiciones de lavado pueden incluir 02.X-0,1X de SSC/SDS al 0,1 % y temperaturas de 42-68 °C, en las que el hecho de aumentar la temperatura aumenta la rigurosidad de las condiciones de lavado.
Cuando la hibridación se produce en una configuración antiparalela entre dos polinucleótidos monocatenarios, la reacción se denomina "reasociación" y se describe que estos polinucleótidos son "complementarios". Un polinucleótido bicatenario puede ser "complementario" u "homólogo" respecto a otro polinucleótido, si se puede producir hibridación entre una de las hebras del primer nucleótido y el segundo. La "complementariedad" u "homología" (el grado en que un polinucleótido es complementario respecto a otro) es cuantificable en lo que se refiere a la proporción de bases en hebras opuestas que cabe esperar que formen puentes de hidrógeno entre sí, de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases aceptadas generalmente.
Un polinucleótido o región polinucleotídica (o un polipéptido o región polipeptídica) tiene un determinado porcentaje (por ejemplo, un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o un 99 %) de "identidad de secuencia" con otra secuencia lo que significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son iguales al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los que se describen en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., (1987) Suplemento 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1. Preferentemente, se usan los parámetros por defecto para la alineación. Un programa de alineación preferente es BLAST, usando los parámetros por defecto. En particular, los programas preferentes son BLASTN y BLASTP, usando los siguientes parámetros por defecto: Código genético=normal; filtro=ninguno; hebra=ambas; corte=60; expectativa=10; matriz=BLOSUM62; descripciones=50 secuencias; clasificación según=HIGH SCORE; bases de datos=no redundantes.
La expresión "trastornos proliferativos celulares" deberá incluir la desregulación de la función fisiológica normal caracterizada por una división y/o crecimiento celular anómalo o pérdida de función. Ejemplos de "trastornos proliferativos celulares" incluyen, pero sin limitación, hiperplasia, neoplasia, metaplasia y diversos trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, los caracterizados por la desregulación de la apoptosis de los linfocitos T.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "células neoplásicas", "enfermedad neoplásica", "neoplasia", "tumor", "células tumorales", "cáncer" y "células cancerosas" (usadas indistintamente) se refieren a células que exhiben un crecimiento relativamente autónomo, de modo que exhiben un fenotipo de crecimiento atípico caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular (es decir, una división celular desregulada). Las células neoplásicas pueden ser malignas o benignas. Una "célula o tejido metastásico" significa que la célula puede invadir y destruir las estructuras corporales circundantes. El cáncer puede incluir, sin limitación, linfoma de linfocitos B grandes difuso, linfoma, leucemia linfocítica, leucemia de linfocitos B linfoblástica aguda y linfoma de Burkitt.
El término "PBMC" se refiere a células mononucleares de sangre periférica e incluye "PBL" - linfocitos de sangre periférica.
"Suprimir" o "supresión" del crecimiento tumoral indica una reducción en el crecimiento de las células tumorales cuando se ponen en contacto con un inhibidor de BRM en comparación con el crecimiento tumoral sin contacto con un compuesto inhibidor de BRM. El crecimiento de las células tumorales se puede evaluar mediante cualquier medio conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, medir el tamaño del tumor, determinar si las células tumorales están proliferando usando un ensayo de incorporación de 3H-timidina, medir la captación de glucosa mediante la formación de imágenes por FDG-PET (tomografía por emisión de positrones con fluorodesoxiglucosa) o contar las células tumorales. La "supresión" del crecimiento de las células tumorales se refiere a todos o uno cualquiera de los siguientes estados: ralentización, retraso y detención del crecimiento del tumor, así como también la reducción del tumor.
Un "sujeto", "individuo" o "paciente" se usa indistintamente en el presente documento y se refiere a un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, ratones, simios, seres humanos, animales de granja, animales que participan en deportes y animales de compañía.
Detección de mutaciones de BRG1
La detección de mutaciones de BRG1 puede hacerse de muchísimas maneras, por ejemplo: Secuenciación de ADN, métodos basados en PCR, incluyendo RT-PCR, análisis de micromatrices, transferencia de Southern, transferencia de Northern, secuenciación de próxima generación y análisis de tira reactiva.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede usarse para amplificar e identificar mutaciones de BRG1 del ADN genómico o el ARN extraído de tejido tumoral. La PCR se conoce bien en la técnica y se describe con detalle en Saiki et al., Science 1988, 239:487 y en la Patente de EE.UU. N.° 4.683.195 y la Patente de EE.UU. N.° 4.683.203.
Se proporcionan métodos de detección de mutaciones de BRG1 mediante hibridación. El método comprende identificar una mutación de BRG1 en una muestra poniendo en contacto el ácido nucleico de la muestra con una sonda de ácido nucleico que puede hibridar con el ácido nucleico con una mutación de BRG1 o fragmento del mismo y detectar la hibridación. La sonda de ácido nucleico se marca de manera detectable con un marcador tal como un radioisótopo, un agente fluorescente o un agente cromógeno. Los radioisótopos pueden incluir, sin limitación, 3H, 32P, 33P y 35S etc. Los agentes fluorescentes pueden incluir, sin limitación: FITC, texas red, rodamina, etc.
La sonda usada en la detección que puede hibridar con el ácido nucleico con una mutación de BRG1 puede ser de aproximadamente 8 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 75 nucleótidos, de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleótidos. La sonda o sondas pueden proporcionarse en un kit, que comprende al menos una sonda oligonucleotídica que hibrida con o hibrida adyacente a una mutación de BRG1. El kit también puede proporcionar instrucciones para el análisis de muestras de cáncer de los pacientes que pueden contener una mutación de BRG1, y dichas mutaciones de BRG1 indican que el paciente es sensible o insensible al tratamiento con un inhibidor de BRM.
También puede usarse polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP, por sus siglas en inglés) para detectar mutaciones de BRG1. Esta técnica se describe bien en Orita et al., p Na S 1989, 86:2766-2770.
Los anticuerpos dirigidos contra BRG1 pueden ser útiles en la detección de cáncer y la detección de formas mutadas de BRG1. Pueden generarse anticuerpos que reconocen y se unen específicamente solo a un mutante específico de BRG1 y no se unen (o se unen débilmente) a BRG1 de tipo silvestre. Estos anticuerpos serían útiles en la determinación de la mutación específica que estuviera presente y también en la cuantificación del nivel de proteína BRG1. Por ejemplo, un anticuerpo puede dirigirse contra un dominio funcional de una proteína BRG1, tal como el dominio ATPasa o el bromodominio. Un anticuerpo que reconozca este cambio de aminoácido y no se una específicamente a BRG1 de tipo silvestre podría identificar la mutación específica en secciones tisulares y también los niveles de proteína por transferencia de Western. Dichos anticuerpos pueden generarse contra una mutación de BRG1 usando péptidos que contengan la mutación de BRG1 específica de interés.
Se cree que una célula cancerosa que contiene una mutación de BRG1 puede lisarse y se puede realizar una transferencia de Western para detectar la cantidad de proteína BRG1 mutante, usando una célula que contenga BRG1 de tipo silvestre como control.
Los anticuerpos dirigidos contra BRM pueden ser útiles en la detección del nivel de expresión de BRM. De manera similar, se cree que una célula cancerosa que contiene una mutación de BRG1 se puede lisar y se puede realizar una transferencia de Western para detectar el nivel de proteína BRM que se usa y compararse con una muestra con expresión conocida de BRM como control.
Medición de la expresión génica
La detección de la expresión génica se puede realizar mediante cualquier método adecuado incluyendo, por ejemplo, detectar la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen o la cantidad de ADNc producido a partir de la transcripción inversa del ARNm transcrito a partir del gen o la cantidad del polipéptido o proteína codificada por el gen. Estos métodos se pueden realizar de muestra en muestra o se pueden modificar para realizar un análisis de alto rendimiento. Por ejemplo, usando chips de micromatriz Affymetrix™ U133.
En un aspecto, la expresión génica se detecta y se cuantifica mediante hibridación con una sonda que hibrida específicamente con la sonda adecuada para ese biomarcador. Las sondas también se pueden unir a un soporte sólido para su uso en ensayos de cribado de alto rendimiento usando métodos conocidos en la técnica. El documento WO 97/10365 y las Pat. de EE.UU. N.° 5.405.783, 5.412.087 y 5.445.934, por ejemplo, desvelan la construcción de chips de oligonucleótidos de alta densidad que pueden contener una o más de las secuencias desveladas en el presente documento. Usando los métodos desvelados en las Pat. de EE.UU. N.° 5.405.783, 5.412.087 y 5.445.934, las sondas descritas en el presente documento se sintetizan sobre una superficie de vidrio derivatizado. Se acoplan fosforamiditas de nucleósidos fotoprotegidas a la superficie del vidrio, se desprotegen selectivamente mediante fotólisis a través de una máscara fotolitográfica y se hacen reaccionar con una segunda fosforamidita de nucleósido protegida. El proceso de acoplamiento/desprotección se repite hasta que se completa la sonda deseada.
En un aspecto, el nivel de expresión de un gen se determina mediante la exposición de una muestra de ácido nucleico al chip modificado con la sonda. El ácido nucleico extraído se marca, por ejemplo, con una etiqueta fluorescente, preferentemente durante una etapa de amplificación. La hibridación de la muestra marcada se realiza con un nivel adecuado de rigurosidad. El grado de hibridación de la sonda-ácido nucleico se mide cuantitativamente usando un dispositivo de detección. Véanse las Pat. de EE.UU. N.° 5.578.832 y 5.631.734.
Como alternativa, uno cualquiera entre el número de copias, la transcripción o la traducción del gen se puede determinar usando técnicas conocidas. Por ejemplo, puede resultar útil un método de amplificación tal como la PCR. Se describen procedimientos generales para la PCR en MacPherson et al., PCR: A Practical Approach, (IRL Press at Oxford University Press (1991). Sin embargo, las condiciones de PCR usadas para cada reacción de aplicación se determinan empíricamente. Una serie de parámetros influyen sobre el éxito de una reacción. Entre ellos están la temperatura y tiempo de reasociación, el tiempo de prolongación, la concentración de Mg2+ y/o ATP, el pH y la concentración relativa de cebadores, plantillas y desoxirribonucleótidos. Después de la amplificación, los fragmentos de ADN resultantes se pueden detectar mediante electroforesis en gel de agarosa seguida de visualización con tinción de bromuro de etidio e iluminación ultravioleta.
En una realización, los ácidos nucleicos hibridados se detectan mediante la detección de uno o más marcadores unidos a los ácidos nucleicos de muestra. Los marcadores se pueden incorporar mediante cualquiera de varios medios muy conocidos por los expertos en la técnica. Sin embargo, en un aspecto, el marcador se incorpora simultáneamente durante la etapa de amplificación en la preparación del ácido nucleico de muestra. Por lo tanto, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores marcados o nucleótidos marcados proporcionará un producto de amplificación marcado. En una realización separada, la amplificación de la transcripción, como se ha descrito anteriormente, usando un nucleótido marcado (por ejemplo, CTP y/o UTP marcado con fluoresceína) incorpora un marcador en los ácidos nucleicos transcritos.
Como alternativa, se puede añadir un marcador directamente a la muestra de ácido nucleico original (por ejemplo, ARNm, poliA, ARNm, ADNc, etc.) o al producto de amplificación después de que se complete la amplificación. Los medios para unir marcadores a ácidos nucleicos son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el desplazamiento de mella o marcaje terminal (por ejemplo, con un ARN marcado) mediante la acción de una cinasa sobre el ácido nucleico y la unión posterior (ligadura) de un enlazador de ácido nucleico que une el ácido nucleico de la muestra a un marcador (por ejemplo, un fluoróforo).
Los marcadores detectables adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la presente divulgación incluyen la biotina para tinción con un conjugado de estreptavidina marcado, microesferas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads™), tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, texas red, rodamina, proteína fluorescente verde y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras utilizadas habitualmente en un ELISA) y marcadores calorimétricos tales como microesferas de oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno polipropileno, látex, etc.). Las patentes que describen el uso de dichos marcadores incluyen las Pat. de EE.UU. N.° 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241.
La detección de los marcadores es muy conocida por los expertos en la técnica. Por lo tanto, por ejemplo, los radiomarcadores se pueden detectar usando una película fotográfica o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes se pueden detectar usando un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimáticos típicamente se detectan proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan simplemente visualizando el marcador coloreado.
El marcador detectable se puede añadir al ácido o ácidos nucleicos diana (muestra) antes o después de la hibridación, tal como se describe en el documento WO 97/10365. Estos marcadores detectables se unen directamente o se incorporan al ácido nucleico diana (muestra) antes de la hibridación. Por el contrario, los "marcadores indirectos" se unen a la doble hélice híbrida después de la hibridación. Por lo general, el marcador indirecto se conecta a un resto de unión que se ha conectado con el ácido nucleico diana antes de la hibridación. Por ejemplo, el ácido nucleico diana se puede biotinilar antes de la hibridación. Después de la hibridación, un fluoróforo conjugado con avidina se enlazará con las dobles hélices híbridas portadoras de biotina para proporcionar un marcador que se detecta fácilmente. Para consultar un artículo de revisión detallado sobre los métodos para marcar ácidos nucleicos y detectar ácidos nucleicos hibridados marcados, véase Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
Detección de polipéptidos
Las mutaciones de BRG1, cuando se traducen en proteínas, pueden detectarse por anticuerpos específicos. Las mutaciones en la proteína BRG1 pueden cambiar la antigenicidad de la proteína BRG1, de modo que un anticuerpo generado contra un antígeno mutante de BRG1 (por ejemplo, un péptido específico que contiene una mutación) se unirá específicamente a la BRG1 mutante y no reconocerá el tipo silvestre.
El nivel de expresión de mutaciones de BRG1 también puede determinarse examinando la expresión proteínica o el productor proteínico de mutantes de BRG1. La determinación del nivel proteínico implica medir la cantidad de cualquier unión inmunoespecífica que se produce entre un anticuerpo que reconoce y se une selectivamente al polipéptido del biomarcador en una muestra obtenida de un paciente y comparar esta con la cantidad de unión inmunoespecífica de al menos un biomarcador en una muestra de control. La cantidad de expresión proteínica de la BRG1 puede estar aumentada o reducida en comparación con la expresión de control.
En la técnica existen diversas técnicas disponibles para el análisis de proteínas. Estas incluyen, pero sin limitación, ensayos radioinmunológicos, ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos in situ (usando, por ejemplo, marcadores de oro coloidal, enzimas o radioisótopos), análisis por transferencia de Western, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos inmunofluorescentes, citometría de flujo, inmunohistoquímica, HPLC, espectrometría de masas, microscopia confocal, ensayos enzimáticos, resonancia de plasmones superficiales y PAGE-SDS.
Ensayo de biomarcadores y tratamiento con inhibidores de BRM
Una vez que un paciente se ha ensayado para el estado de BRG1 y se ha predicho que será sensible a un tratamiento con un inhibidor de BRM, puede realizarse la administración de cualquier inhibidor de BRM a un paciente en una dosis, de manera continua o intermitente a lo largo de todo el tratamiento. Los métodos para determinar el medio y la dosis de administración más eficaces son muy conocidos por el experto en la técnica y variarán según la composición usada para el tratamiento, el propósito del tratamiento, la célula diana que se esté tratando y el sujeto que se esté tratando. Se pueden realizar administraciones múltiples o únicas, seleccionándose el patrón y el nivel de las dosis por el médico a cargo. Las formulaciones de dosificación y los métodos para administrar los agentes adecuados se pueden ajustar empíricamente.
Las mutaciones de BRG1 pueden ensayarse después de la administración de inhibidores de BRM para determinar si el paciente sigue siendo sensible al tratamiento con inhibidores de BRM. Además, las mutaciones de BRG1 pueden ensayarse en múltiples puntos temporales después de una sola administración de un inhibidor de BRM. Por ejemplo, después de administrar una inyección intravenosa rápida inicial de un inhibidor de BRM, puede ensayarse una mutación de BRG1 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 8 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 3 días, 1 semana o 1 mes o varios meses después del primer tratamiento.
Las mutaciones de BRG1 pueden ensayarse después de cada administración de inhibidores de BRM, de modo que si hay múltiples administraciones de inhibidores de BRM, entonces el ensayo de mutaciones de BRG1 después de cada administración puede determinar la sensibilidad del paciente continuada. El paciente podría experimentar múltiples administraciones de inhibidores de BRM y a continuación ensayarse para mutaciones de BRG1 en diferentes puntos temporales. Por ejemplo, un ciclo de tratamiento puede requerir la administración de una dosis inicial de inhibidor de BRM, una segunda dosis un periodo de tiempo especificado después y aún una tercera dosis horas después de la segunda dosis. Las mutaciones de BRG1 pueden ensayarse 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 8 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 3 días, 1 semana o 1 mes o varios meses después de la administración de cada dosis de inhibidor de BRM.
Finalmente, pueden administrarse diferentes inhibidores de BRM y seguidos de ensayo para una mutación de BRG1. En esta realización, se elige más de un inhibidor de BRM y se administra al paciente. A continuación, la mutación de BRG1 puede ensayarse después de la administración de cada inhibidor de BRM diferente. Este ensayo también puede hacerse en múltiples puntos temporales después de la administración del inhibidor de BRM diferente. Por ejemplo, podría administrarse un primer inhibidor de BRM al paciente y ensayarse la mutación de BRG1 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 8 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 3 días, 1 semana o 1 mes o varios meses después de la administración. A continuación, podría administrarse un segundo inhibidor de BRM y puede ensayarse la mutación de BRG1 de nuevo 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 8 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 3 días, 1 semana o 1 mes o varios meses después de la administración del segundo inhibidor de BRM.
Pueden prepararse kits para evaluar la actividad de cualquier inhibidor de BRM. Por ejemplo, puede usarse un kit que comprende cebadores de ácido nucleico para PCR o para hibridación en micromatriz para una mutación de BRG1 para evaluar la sensibilidad al inhibidor de BRM (es decir, la susceptibilidad al tratamiento con uno o más inhibidores de BRM). Como alternativa, sería útil un kit provisto de anticuerpos para las mutaciones de BRG1 enumeradas en la tabla 2 en el ensayo para la sensibilidad a inhibidores de BRM.
Es muy conocido en la técnica el hecho de que los cánceres se pueden volver resistentes a un tratamiento quimioterapéutico, especialmente cuando ese tratamiento se prolonga. Ensayar una mutación de BRG1 puede hacerse después de tratamiento prolongado con cualquier agente quimioterapéutico para determinar si el cáncer sería sensible al inhibidor de BRM. Si el paciente se ha tratado previamente con otro agente quimioterapéutico u otro inhibidor de BRM, es útil ensayar una mutación de BRG1 para determinar si el tumor es sensible a un inhibidor de BRM. Este ensayo puede ser especialmente beneficioso para el paciente si el cáncer remite y después se vuelve a desarrollar o ha metastatizado hasta un sitio diferente.
Cribado de inhibidores de BRM
Es posible usar mutaciones de BRG1 para cribar inhibidores de BRM. Este método comprende proporcionar una célula que contiene una mutación de b RG1 de la Tabla 1 o con pérdida de expresión de BRG1, poner en contacto la célula con un inhibidor de BRM candidato y la CI50 de la célula tratada se compara con un inhibidor de BRM conocido que entra en contacto con una célula que es de tipo silvestre para BRG1.
Las mutaciones de BRG1 descritas en el presente documento pueden detectarse por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, una mutación de BRG1 a la que se hace referencia en el presente documento es en la hebra codificante del gen por conveniencia. Como reconoce un experto en la técnica, sin embargo, las moléculas de ácido nucleico que contienen el gen pueden ser moléculas bicatenarias complementarias y, por lo tanto, una referencia a un sitio particular en la hebra codificante se refiere también al sitio correspondiente en la hebra no codificante complementaria. Es decir, puede hacerse referencia al mismo sitio mutante en cualquier hebra y puede diseñarse un oligonucleótido para que hibride específicamente con cualquier hebra en una región diana que contiene el sitio polimórfico y/o mutante. Por lo tanto, también se incluyen polinucleótidos monocatenarios y mutaciones que son complementarias a la hebra codificante de las variantes genómicas descritas en el presente documento.
Pueden usarse muchas técnicas diferentes para identificar si la secuencia de ácido nucleico codifica una mutación de BRG1, incluyendo análisis de polimorfismos de conformación monocatenaria (SSCP, por sus siglas en inglés), análisis de estructuras heterobicatenarias por cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC, por sus siglas en inglés), secuenciación directa de ADN y métodos informáticos (Shi et al, Clin Chem A1U6AA12 (2001)). Los métodos más comunes actualmente incluyen hibridación, prolongación de cebador y métodos de escisión. Cada uno de estos métodos debe conectarse a un sistema de detección apropiado. Las tecnologías de detección incluyen polarización fluorescente (Chan et al., Genome Res. 9:492-499 (1999)), detección luminométrica de liberación de pirofosfato (pirosecuenciación) (Ahmadiian et al., Anal. Biochem. 280:103-10 (2000)), ensayos de escisión basados en transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés), DHPLC y espectrometría de masas (Shi, Clin Chem 47:164-172 (2001); Pat. de EE.UU. N.° 6.300.076 B1). En una realización, se puede usar un analizador automático (por ejemplo, una máquina de PCR o una máquina de secuenciación automática) para determinar la presencia o ausencia de una mutación de BRG1. Todos estos métodos se conocen bien por los expertos en la técnica.
En una realización particularmente preferida, las mutaciones pueden detectarse usando tecnología INVADER™ (disponible en Third Wave Technologies Inc. Madison, Wisconsin EE.UU.). En este ensayo, un oligonucleótido "invasor" cadena arriba específico y una sonda cadena abajo parcialmente solapante conjuntamente forman una estructura específica cuando se unen a la plantilla de ADN complementario. Esta estructura se reconoce y se corta en un sitio específico por la enzima Cleavasa, que provoca la liberación de la solapa 5' del oligonucleótido sonda. A continuación, este fragmento sirve como oligonucleótido "invasor" con respecto a dianas secundarias sintéticas y sondas de señal secundarias marcadas por fluorescencia contenidas en la mezcla de reacción. Esto provoca la escisión específica de las sondas de señal secundarias por la enzima Cleavasa. Se genera una señal fluorescente cuando se escinde esta sonda secundaria (marcada con moléculas de tinte con capacidad de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia). Las Cleavasas tienen requisitos rigurosos con respecto a la estructura formada por las secuencias de ADN solapantes o solapas y, por lo tanto, pueden usarse para detectar específicamente emparejamientos incorrectos de un solo par de bases inmediatamente cadena arriba del sitio de escisión en la hebra de ADN cadena abajo. Ryan D et al., Molecular Diagnosis 4(2): 135-144 (1999) y Lyamichev V et al. Nature Biotechnology 17: 292-296 (1999), véanse también las Pat. de EE.UU. N.° 5.846.717 y 6.001.567.
Se incluyen además composiciones que contienen sondas oligonucleotídicas y cebadores diseñados para hibridar específicamente con la secuencia de ácido nucleico que codifica una mutación de BRG1, o que son adyacentes a un sitio muíante. La región que contiene la mutación de interés puede amplificarse usando cualquier método de amplificación dirigida por oligonucleótido incluyendo, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Pat. de EE.UU. N.° 4.965.188), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barany et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 88:189-193 (1991); solicitud de patente PCT publicada WO 90/01069) y ensayo de ligadura de olignucleótidos (OLA) (Landegren et al, Science 241: 1077-1080 (1988)). Los oligonucleótidos útiles como cebadores o sondas en dichos métodos deben hibridar específicamente con una región del ácido nucleico que contiene o está adyacente al sitio polimórfico/mutante. Típicamente, los oligonucleótidos tienen entre 10 y 35 nucleótidos de longitud y, preferentemente, entre 15 y 30 nucleótidos de longitud. Más preferentemente, los oligonucleótidos tienen de 20 a 25 nucleótidos de longitud. La longitud exacta del oligonucleótido dependerá de muchos factores que se consideran de forma rutinaria y se ponen en práctica por los expertos en la técnica.
Pueden usarse otros procedimientos conocidos de amplificación de ácidos nucleicos para amplificar la región que contiene la mutación de BRG1 incluye sistemas de amplificación basados en transcripción (Pat. de EE.Uu . N.° 5.130.238; documento EP 329.822; Pat. de EE.UU. N.° 5.169.766, solicitud de patente PCT publicada WO89/06700) y métodos isotérmicos. (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992)).
Una mutación en la subunidad de BRG1 puede ensayarse antes o después de amplificación usando uno de varios métodos basados en hibridación conocidos en la técnica. Típicamente, se utilizan oligonucleótidos específicos de alelo en la realización de dichos métodos. Los oligonucleótidos específicos de alelo pueden usarse como pares de sondas marcadas de forma diferente, mostrando un miembro del par un emparejamiento perfecto con una variante de una secuencia diana y mostrando el otro miembro un emparejamiento perfecto con una variante diferente. Preferentemente, los miembros del conjunto tienen temperaturas de fusión dentro de 5 grados Celsius y más preferentemente dentro de 2 grados Celsius, entre sí, cuando hibridan con cada sitio polimórfico o mutante que se está detectando. La hibridación de un oligonucleótido específico de alelo con un polinucleótido diana puede realizarse con ambas entidades en solución, o dicha hibridación puede realizarse cuando el oligonucleótido o el polinucleótido diana se fija covalente o no covalentemente a un soporte sólido. La fijación puede mediarse, por ejemplo, por interacciones de anticuerpo-antígeno, poli-L-Lys, estreptavidina o avidina-biotina, puentes salinos, interacciones hidrófobas, enlaces químicos, reticulación con UV, cocción, etc. El oligonucleótido específico de alelo puede sintetizarse directamente en el soporte sólido o unirse al soporte sólido después de la síntesis. Los soporte sólidos adecuados para su uso en métodos de detección descritos en el presente documento incluyen sustratos hechos de silicio, vidrio, plástico, papel y similares, que pueden formarse, por ejemplo, en pocillos (como en placas de 96 pocillos), portaobjetos, láminas, membranas, fibras, chips, placas y microesferas. El soporte sólido puede tratarse, recubrirse o derivatizarse para facilitar la inmovilización del oligonucleótido específico de alelo o ácido nucleico diana.
Los polipéptidos que albergan una mutación de BRG1 también pueden ensayarse usando métodos conocidos en la técnica, tales como radioinmunoensayos o inmunoensayos ligados a enzimas, inmunoensayos ligados a enzimas de unión competitiva, inmunohistoquímica, espectrometría de masas, ELISA, técnicas/plataformas del lugar de atención, transferencia puntual, análisis de transferencia de Western, cromatografía, preferentemente cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o similares. Pueden usarse anticuerpos marcados, porciones de unión de los mismos, u otros compañeros de unión. Los anticuerpos pueden ser de origen monoclonal o policlonal, o pueden producirse biosintéticamente. Los compañeros de unión también pueden ser moléculas de origen natural o producirse sintéticamente. La cantidad de proteínas en complejo se determina usando metodologías convencionales de detección de proteínas descritas en la técnica. Puede encontrarse una revisión detallada del diseño, teoría y protocolos de ensayo inmunológico en numerosos textos de la técnica, incluyendo Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, Nueva York, 1984.
Puede usarse una diversidad de diferentes marcadores en los ensayos descritos en el presente documento incluyendo marcadores directos tales como etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales, tintes, radionúclidos y similares, fijados al anticuerpo. Los marcadores indirectos incluyen diversas enzimas bien conocidas en la técnica, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de hidrógeno y similares. En un ensayo de una etapa, la proteína diana (es decir, una mutación de BRG1) se inmoviliza y se incuba con un anticuerpo marcado. El anticuerpo marcado se une a la molécula diana inmovilizada. Después del lavado para eliminar las moléculas no unidas, la muestra se ensaya para determinar la presencia del marcador. Se incorporan numerosos métodos inmunohistoquímicos en formatos del punto de atención y dispositivos portátiles, todos los cuales pueden usarse para determinar la presencia de la proteína.
El uso de anticuerpos inmovilizados específicos para las proteínas o polipéptidos también se contempla por la presente divulgación. Los anticuerpos pueden inmovilizarse en una diversidad de soportes sólidos, tales como partículas de matriz magnética o cromatográfica, la superficie de una placa de ensayo (tal como pocillos de microvaloración), trozos de un material de sustrato sólido (tal como plástico, nylon, papel) y similares. Puede prepararse una tira de ensayo recubriendo con el anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos una matriz en un soporte sólido. A continuación, esta tira puede sumergirse en la muestra de prueba y procesarse a través de lavados y etapas de detección para generar una señal medible, por ejemplo, una mancha coloreada.
En un ensayo de dos etapas, se puede incubar una proteína diana inmovilizada (por ejemplo, una muestra de lisado de una célula cancerosa que alberga una mutación de BRG1) con un anticuerpo no marcado. El complejo de anticuerpo sin marcar, si está presente, se une a continuación a un segundo anticuerpo marcado que es específico para el anticuerpo no marcado. La muestra se lava y se ensaya para determinar la presencia del marcador. La elección de marcador usado para marcar los anticuerpos variará dependiendo de la aplicación. Sin embargo, la elección del marcador la puede determinar fácilmente un experto en la materia.
La transferencia puntual la practican de forma rutinaria los expertos en la técnica para detectar una proteína deseada usando un anticuerpos como sonda (Promega Protocols and Applications Guide, segunda edición, 1991, página 263, Promega Corporation). Se aplican muestras a una membrana usando un aparato de transferencia puntual. Se incuba una sonda marcada con la membrana, y se detecta la presencia de la proteína.
El análisis de transferencia de Western se conoce bien por los expertos en la técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Vol. 3, capítulo 18, Cold Spring Harbor Laboratory). En la transferencia de Western, la muestra se separa por SDS-PAGE. El gel se transfiere a una membrana. La membrana se incuba con anticuerpo marcado para la detección de la proteína deseada.
Kits
La invención proporciona además kits para determinar si existe una mutación de BRG1 en una muestra tomada de un sujeto, por ejemplo, una mutación de BRG1 en la Tabla 1. Los kits son útiles para seleccionar pacientes que se beneficiarán específicamente del tratamiento con uno o más inhibidores de BRM. Un kit puede comprender cebadores y sondas útiles para detectar una o más mutaciones de BRG1. Un kit puede comprender además controles de ácido nucleico, tampones e instrucciones de uso. Un kit también puede comprender reactivos e instrucciones para detectar la pérdida de expresión de BRG1. Un kit también puede comprender reactivos e instrucciones para detectar la pérdida de la función de BRG1, por ejemplo, mediante transferencia de Western, ELISA, inmunohistoquímica o técnicas similares. Un kit también puede comprender reactivos e instrucciones para confirmar el mantenimiento de la función y expresión de BRM a pesar de la mutación de BRG1, la pérdida de función y/o la pérdida de expresión.
Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención como se define por las reivindicaciones. De hecho, la presente invención, como se define por las reivindicaciones, no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Cribado de ARNhc combinado para identificar los reguladores epigenéticos necesarios para la proliferación de células cancerosas
Para identificar los genes implicados en la regulación epigenética que son esenciales para la viabilidad de las células cancerosas humanas, se cribó una genoteca de ARNhc de amplia cobertura (17 ARNhc por gen) dirigida a reguladores epigenéticos para determinar los efectos sobre la proliferación en un panel de 50 líneas celulares de la Cancer Cell Line Encyclopedia como se ha descrito anteriormente.
Al utilizar la estadística del algoritmo RSA para calcular el valor de p logarítmico para cada línea de células cancerosas usada en el cribado, las líneas de cáncer de pulmón no microcítico NCI-H838, NCI-H1299, A549 y HCC-15, que albergan mutaciones de BRG1, mostraron tener valores de p logarítmicos -7,90, -11,6, -13,27 y -13,45, respectivamente, correspondientes a una inhibición del crecimiento estadísticamente significativa después de la inhibición de la función de BRM por la atenuación mediada por ARNhc (los datos del cribado se muestran en la Tabla 4 y se resumen visualmente en la figura 1a). De manera similar, la línea de cáncer de hígado mutante en BRG1 SK-HEP-1 y la línea celular de cáncer de ovario TYK-nu con pérdida de expresión de BRG1 tienen valores de p logarítmicos de -14,92 y -10,9 respectivamente, correspondientes a una inhibición del crecimiento estadísticamente significativa tras la inhibición de la función de BRM por la atenuación mediada por ARNhc. La línea celular pancreática mutante en BRG1 KP-1NL muestra un efecto de crecimiento más modesto pero estadísticamente significativo con un valor de p logarítmico de -4,28 consistente con la inhibición de BRM que también inhibe el crecimiento de cánceres de páncreas con pérdida de función de BRG1 causada por la mutación de BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1.
Por el contrario, las otras líneas de células cancerosas, cuyos valores de p no superaron -3, no son sensibles a los ARNhc de BRM. Estos resultados demuestran la sensibilidad de un subconjunto de líneas de células cancerosas con pérdida de función de BRG1 debido a la mutación de BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1 de una variedad de linajes que incluyen cánceres de pulmón, hígado y ovario que muestran inhibición del crecimiento celular después de la inhibición de la actividad de BRM tras la atenuación de BRM por ARNhc. También es importante señalar en esta tabla que muchas de las líneas mutantes en BRG1 también muestran una baja expresión de BRG1 (por debajo de 0,4), lo que demuestra que la detección de los niveles de expresión de BRG1 en muestras de cáncer es un marcador fiable de la sensibilidad de los cánceres a la inhibición de BRM.
Tabla 4: Resumen de datos de ARNhc combinados que documentan la inhibición del crecimiento en líneas celulares mutantes en BRG1 en respuesta a la atenuación de BRM.
Línea Valor de p Sensible Expresión Descripción de la Sitio primario celular logarítmico por K- de BRG1 mutación
(RSA) medias
SK-HEP-1 -14,92 Sensible 0,2575 p.E1582* homocigota Hígado
HCC-15 -13,45 Sensible 0,34 p.P269fs homocigota Pulmón
A549 -13,29 Sensible 0,21125 p.L728fs homocigota Pulmón
NCI-H1299 -11,96 Sensible 0,29625 p.K578fs, p.T560* Pulmón
NCI-H838 -10,37 Sensible 0,5825 p.I873_splice homocigota Pulmón
Carece de la expresión de
TYK-nu -10,21 Sensible 0,36125 BRM Ovario
Carece de la expresión de
KP-1NL -5,85 Insensible 0,25875 BRM Páncreas
HMC-1-8 -4,60 Insensible 1,01625 Tipo silvestre Mama
HGC-27 -4,12 Insensible 2,485 Tipo silvestre Estómago
A2058 -2,77 Insensible Sin datos Tipo silvestre Piel
BT-549 -2,41 Insensible 1,275 Tipo silvestre Mama
HCC1806 -2,32 Insensible 1,16375 Tipo silvestre Mama
A-498 -2,31 Insensible 0,8475 p.A923P heterocigota Riñón
KMRC-20 -2,04 Insensible 0,52375 Tipo silvestre Riñón
RMG-I -1,87 Insensible 0,70375 Tipo silvestre Ovario
Pa-Tu-8988T -1,85 Insensible Sin datos Tipo silvestre Páncreas
GP2d -1,78 Insensible 1,13375 p.I879V heterocigota Intestino grueso JHH-7 -1,69 Insensible 1,4625 Tipo silvestre Hígado
Hey-A8 -1,67 Insensible 0,63875 Tipo silvestre Ovario
A2780 -1,59 Insensible 1,80375 p.T910M heterocigota Ovario
p.Y120fs, p. L1163P
HCT116 -1,56 Insensible 0,8475 heterocigota Intestino grueso Sistema nervioso U-251 MG -1,50 Insensible 0,8675 Tipo silvestre central
RMUG-S -1,47 Insensible 0,44 Deleción heterocigota Ovario
HEC-50B -1,47 Insensible Sin datos Tipo silvestre Endometrio
JHOM-1 -1,45 Insensible 0,7175 Tipo silvestre Ovario
HEC-151 -1,45 Insensible 1,0075 T910M heterocigota Endometrio OVTOKO -1,35 Insensible 0,605 Tipo silvestre Ovario
Sin Información de
HMCB -1,32 Insensible 1,5925 Secuencia disponible Piel
G-401 -1,30 Insensible 2,13125 Tipo silvestre Tejido blando Carece de la expresión de
KP4 -1,25 Insensible 0,3675 BRG1 Páncreas
SNU-449 -1,23 Insensible Sin datos Tipo silvestre Hígado
MIA PaCa-2 -1,18 Insensible 1,90625 Tipo silvestre Páncreas
LS411N -1,11 Insensible 0,915 Tipo silvestre Intestino grueso Hep3B -1,11 Insensible Sin datos Tipo silvestre Hígado
VMRC-RCW -1,08 Insensible 0,63 p.P647L heterocigota Riñón
Sistema nervioso H4 -0,99 Insensible Sin datos Tipo silvestre central
Sin Información de
SW480 -0,95 Insensible 0,60625 Secuencia disponible Intestino grueso JHOS-2 -0,83 Insensible 0,5825 Tipo silvestre Ovario
RD -0,75 Insensible 2,24875 Tipo silvestre Tejido blando
Línea Valor de p Sensible Expresión Descripción de la Sitio primario celular logarítmico por K- de BRG1 mutación
(RSA) medias
ES-2 -0,70 Insensible 0,94 Tipo silvestre Ovario
PC-14 -0,68 Insensible 0,855 Tipo silvestre Pulmón
RKO -0,67 Insensible 0,7025 Tipo silvestre Intestino grueso COR-L23 -0,62 Insensible 1,3075 p.K689del heterocigota Pulmón
KNS-62 -0,58 Insensible 0,68875 Tipo silvestre Pulmón
Ishikawa
(Heraklio) 02
ER- -0,57 Insensible Sin datos Tipo silvestre Endometrio
HuH-7 -0,48 Insensible 1,13 Tipo silvestre Hígado
KYSE-150 -0,48 Insensible 0,80875 p.N944K heterocigota Esófago
LCLC-103H -0,46 Insensible 0,74875 Tipo silvestre Pulmón
TOV-21G -0,46 Insensible 1,5175 Tipo silvestre Ovario
HT-29 -0,43 Insensible 0,87 Tipo silvestre Intestino grueso 786-O -0,43 Insensible 1,3275 Tipo silvestre Riñón
HPAC -0,40 Insensible 0,83 Tipo silvestre Páncreas
JHUEM-1 -0,33 Insensible 1,01375 p.S1176N heterocigota Endometrio
HCC-44 -0,32 Insensible 0,895 Tipo silvestre Pulmón
LK-2 -0,31 Insensible 1,73375 Tipo silvestre Pulmón
OVISE -0,27 Insensible 1,3275 Tipo silvestre Ovario
JMSU-1 -0,25 Insensible 2,34625 Tipo silvestre Tracto urinario
SBC-5 -0,24 Insensible 0,35 Carece de BRG1 y BRM Pulmón
Métodos
Diseño y construcción de genotecas. Se construyó una genoteca personalizada de ARNhc de 6.500 elementos centrada en las enzimas implicadas en la regulación epigenética usando síntesis de oligonucleótidos basada en chips y se clonó como una combinación en el sitio BpiI del plásmido lentiviral pRSI9 (referencia Cellecta). La genoteca de ARNhc se dirigió a 384 genes (Tabla 4) con un promedio de 17 ARNhc/genes únicos. El ARNhc incluye 2 emparejamientos incorrectos en G/U en la hebra pasajera, un bucle de 7 nucleótidos y una secuencia de direccionamiento de 21 nucleótidos. Las secuencias de direccionamiento se diseñaron usando un algoritmo patentado (Cellecta). El oligo correspondiente a cada ARNhc se sintetizó con un código de barras único de 18 nucleótidos para medir la representación por NGS. La secuenciación de la combinación de plásmidos mostró una excelente normalización (figura 1B) con >90 % de clones presentes en una representación de /- 5 veces de las medianas de los recuentos en la combinación.
Empaquetamiento, transducción y cribado viral. Se sembraron 12.000 células 293T por placa en múltiples placas de 150 mm recubiertas con colágeno 24 h antes de la transfección. Las células se transfectaron de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (ref.). Para cada placa de 150 mm, las células se transfectaron usando 24,3 ul de reactivo TransIT diluido 875,7 ul de OPTI-MEM que se combinó con 3,6 ug de la combinación de plásmidos y 4,5 ug de la mezcla de empaquetamiento de Cellecta (que contenía los plásmidos psPAX2 y pMD2 que codifican Gag/Pol y VSV-G, respectivamente). El virus se recogió 72 h posteriores a la transfección, se dividió en alícuotas y se congeló a -80 °C para su uso posterior. El título viral se midió infectando células HCT116 con una curva de respuesta a la dosis viral de 10 puntos y midiendo el porcentaje de células infectadas controlando la expresión del casete de expresión de RFP que forma parte de la construcción viral por FACS. Los títulos virales típicos estuvieron en el intervalo de 1-5 x 106 TU/ml usando este procedimiento.
Para cada línea celular, se determinó la dosis óptima de puromicina requerida para lograr >95 % de muerte celular en 72 h midiendo la viabilidad celular con un ensayo Cell TiterGlo para una respuesta a la dosis de 6 puntos que variaba de 0 a 5 ug de puromicina. El volumen de virus requerido para dar una m O i de 0,3 se determinó usando una respuesta a la dosis de 10 puntos que variaba de 0 a 400 ul de sobrenadante viral en presencia de 8 ug/ml de polibreno. La infectividad se determinó como el % de células positivas para RFP según lo medido por FACS.
Los cribados se ejecutaron por duplicado. Para infecciones a gran escala, se sembraron en placa 24 millones de células 24 h antes de la infección en matraces T-175 (las densidades celulares típicas estaban entre 2 - 8 millones de células/matraz). El día de la infección, el medio de cultivo se reemplazó por medio fresco que contenía 8 ug/ml de polibreno y se añadió suficiente virus para dar una MOI de 0,3. 24 h después de la infección, el medio de cultivo se reemplazó por medio fresco que contenía puromicina. 72 h después de la adición de puromicina, las células se tripsinizaron y 24 millones de células se colocaron en placas en nuevos matraces. Se usó una alícuota de células para medir la eficiencia de transducción determinada midiendo el % de células positivas para RFP y fue típicamente >90 %. Las células se mantuvieron en cultivo y se dividieron según fue necesario para garantizar que no superaran el 90 % de confluencia durante el transcurso del cribado. En cada división, se pasaron 24 millones de células a nuevos matraces, lo que garantiza una representación de >1000 células/ARNhc en la genoteca y se midió el % de células positivas para RFP para garantizar la estabilidad de la población transducida en el tiempo. Cuando las células alcanzaron 5 duplicaciones de la población, se recogieron 40 millones de células por centrifugación y se almacenaron a -20 °C.
Purificación de ADN genómico y PCR para la producción de genotecas. Se resuspendieron 20 millones de células en PBS de acuerdo con el protocolo DNeasy (Qiagen) a 200 ul de PBS por 5 millones de células. A continuación, esta resuspensión se divide en alícuotas de 200 ul (células 5e6) en 4 tubos de 1,5 ml, se trata con Proteinasa K, RNasaA y Tampón AL, se incuban para la lisis y se procesan para determinar el aislamiento del ADNg como se indica. La concentración final de ADN se ensaya usando el reactivo Picogreen dando un rendimiento típico de 1 ug de ADNg por millón de células.
Para la generación de genotecas NGS, los códigos de barras se amplifican en reacciones de PCR de 8 x 50 ul usando 1 ug de ADNg por reacción con Titanium Taq y los cebadores N.° 3323 (PEFwdGEX), N.° 3324 (PECellectaA), N.° 3197-3223 (uno de 27 oligos de indexación; véase esquema de PCR en la figura 1C) durante 28 ciclos. El producto se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa para comprobar el producto de ~120 pb esperado y se purificó usando el kit de limpieza de PCR Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) y la cantidad de producto purificado se cuantificó mediante un ensayo de concentración de ADN Picogreen. La representación del código de barras se midió mediante secuenciación de próxima generación en un sistema Illumina GA2X.
Análisis de datos. Los recuentos de cada muestra se normalizaron a 16 millones de lecturas. El número de lecturas observadas para cada código de barras en duplicaciones de 5 poblaciones se dividió por el número de lecturas del código de barras correspondiente en la combinación de plásmidos original para dar el factor de cambio en la representación durante el experimento. Se calculó una puntuación z robusta usando la mediana y la MAD para el factor de cambio en los recuentos en toda la genoteca de ARNhc. Las genotecas de ARNhc de amplia cobertura utilizadas en este trabajo permiten una llamada de acierto de alta confianza a nivel de gen, en lugar del análisis de ARNhc individuales en el conjunto de datos. Para la llamada de aciertos basada en genes, se usaron dos mediciones estadísticas, (1) Actividad de ARNip redundante o RSA (ref.), y (2) puntuación Z Q1. Para identificar correlaciones estadísticamente significativas entre la sensibilidad del ARNhc y las características genéticas de las líneas celulares, primero se realizó un agrupamiento de k-medias para el valor RSA de un gen particular en todas las líneas celulares cribadas para identificar grupos de líneas celulares "sensibles" e "insensibles". A continuación, esta partición se usó para calcular la significación estadística de la coexistencia de todas las características genéticas en el conjunto de datos de la CCLE (ref. Documento CCLE).
Cultivo celular
Se cultivaron NCI-H1299, NCI-H460 y NCI-H838 en medio RPMI1640 (Lonza, N.° 12-115Q) que contenía FBS al 10 % (Thermo Hyclone, N.° SH30071.03) y las células A549 se cultivaron en DMEM (con alto contenido de glucosa y piruvato de sodio) (Lonza, N.° 12-604F) que contenía FBS al 10 %. Se cultivaron células BEAS2B en medio de crecimiento de células epiteliales bronquiales (Lonza, N.° CC-3170).
Transferencia de Western
Las células se recogieron en tampón de lisis que contenía Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Na(2)EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Tritón al 1 %, pirofosfato de sodio 2,5 mM, p-glicerofosfato 1 mM, Na3VO41 mM, 1 pg/ml de leupeptina y PMSF 1 mM (Cell signaling N.° 9803). Se cargaron 10-20 pg de proteína en un gel de poliacrilamida al 4-15 % de Bio-Rad en gradiente. La proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Bio-RAD, N.° 170-4157) a 25 V durante 10 min. La membrana se bloqueó en leche al 4 % o tampones de bloqueo del bloque de inicio (Thermo Scientific, cat. N.° 37543). Los anticuerpos usados incluyen anti BRM (Cell Signaling Technology (CST N.° 6889) a una dilución 1:500-1000 en tampón de bloqueo durante una noche a 4 °C, se usó anti BRG1 (CST N.° 3508) a 1:500-1000 en tampón de bloqueo durante una noche a 4 °C, se usó anti p-tubulina (Santa Cruz Biotech, N.° SC-5274) a 1:2000 durante una noche a 4 °C, y se usó anti vinculina (Sigma N.° v9131) a 1:2000 durante una noche a 4 °C. Se usó un anticuerpo secundario IgG-HRP anti conejo de cabra (Santa Cruz Biotech N.° SC-2030) a 1:5000, durante 90 minutos a ambiente y la señal quimioluminiscente se detectó usando el sustrato de máxima sensibilidad SuperSignal West Femto (Pierce, Cat. N.° 34095).
Generación de construcciones de ARNhc inducibles
Las secuencias de ARNhc se diseñaron para incluir sitios de restricción EcoRI y AgeI para permitir la clonación posterior en el sistema de vector inducible pLKO-Tet-On. Las secuencias para los oligos usados son las siguientes con la secuencia codificante en negrita y la secuencia no codificante en minúsculas. La horquilla CTCGAG se usó para sh2025 y sh5537, mientras que se usó la secuencia en horquilla cellecta GTTAATATTCATAGC para el oligo superior y GCTATGAATATTAAC para el oligo inferior para los ARNhc 631, 1738, 4492 y 4493 basados en cellecta. Las secuencias de los oligonucleótidos usadas son las siguientes de 5' a 3':
Secuencia de ARNhc de control (CTL) no dirigido (oligonucleótidos superior e inferior): CCGGGGATAATGGTGATTGAGATGGCTCGAGccactcaatcaccattatccTTTTT (SEQ ID NO: 1);
AATTAAAAAGGATAATGGTGATTGAGATGGCTCGAGccactcaatcaccattatcc (SEQ ID NO: 2)
BRM sh2025
CCGGGAAGAGAGTGATTCTGATTATCTCGAGataatcagaatcactctcttcTTTTT (SEQ ID NO:3);
AATTAAAAAGAAGAGAGTGATTCTGATTATCTCGAGataatcagaatcactctcttc (SEQ ID NO:4);
BRM sh5537
CCGGGTTGAAAGCGCTATTGAATATCTCGAGatattcaatagcgctttcaacTTTTT (SEQ ID NO:5);
AATTAAAAAGTTGAAAGCGCTATTGAATATCTCGAGatattcaatagcgctttcaac (SEQ ID NO:6);
ARNhc de BRM de Cellecta 631 CCGGCGACTCTATCTAACTGGATATGTTAATATTCATAGCatgtccagttagatagagtcgTTTTTT (SEQ ID NO:7);
AATTAAAAAACGACTCTATCTAACTGGATATGCTATGAATATTAACatgtccagttagatagagtcg (SEQ ID NO:8);
ARNhc de BRM de Cellecta 1738 CCGGCCAAACTTGTAGTGAGTGATTGTTAATATTCATAGCaatcgctcactacaggtttggTTTTTT (SEQ ID NO:9);
AATTAAAAAACCAAACTTGTAGTGAGTGATTGCTATGAATATTAACaatcgctcactacaggtttgg (SEQ ID NO:10); ARNhc de BRM de Cellecta 4492 CCGGGACAGGTGTTTAGCTTACTTTGTTAATATTCATAGCaaggtaagctaaacgcctgtoTTTTTT (SEQ ID NO:11); AATTAAAAAAGACAGGTGTTTAGCTTACTTTGCTATGAATATTAACaaggtaagctaaacgcctgtc (SEQ ID NO:12); ARNhc de BRM de Cellecta 4493 CCGGGCAGCTAAAGAGAAGAAGAGGGTTAATATTCATAGCcttcttcttctctttggctgcTTTTTT (SEQ ID NO:13);
AATTAAAAAAGCAGCTAAAGAGAAGAAGAGGGCTATGAATATTAACcttcttcttctctttggctgc (SEQ ID NO:14).
ARNhc de BRG1 2202
CCGGGCCAAGCAAGATGTCGATGATCTCGAGatcatcgacatcttgcttggcTTTTT (SEQ ID NO: 15) AATTAAAAAGCCAAGCAAGATGTCGATGATCTCGAGatcatcgacatcttgcttggc (SEQ ID NO: 16)
Se reasociaron 11,25 ul de cada uno de los oligonucleótidos superior e inferior (0,1 nmoles/jl) y 2,5 ul de tampón de reasociación 10X (NaCl 1 M, Tris-HCl 100 mM, pH 7,4) a 95 °C durante 4 min seguido de 10 min de incubación a 24 °C en termociclador. Los oligos reasociados se diluyeron posteriormente a 1:400 en tampón de reasociación 0,5X y se usó 1 |jl en una reacción de ADN ligasa de t 4 junto con el vector pLKO-Tet-On digerido con EcoRI/AgeI purificado en gel. La transformación se realizó en células de E. coli competentes Stbl3 one shot (Invitrogen, N.° C7373-03) y los clones seleccionados se digirieron con XhoI para verificar la presencia del inserto. Los clones positivos se confirmaron mediante secuenciación usando el siguiente cebador de secuenciación 5' GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA3' (SEQ ID NO:17).
Producción de sobrenadantes lentivirales para las construcciones de ARNhc inducible. Se sembraron células 293T de pases tempranos a 2,4-4 x 10A6 células en placas de cultivo de 100 mm de colágeno I BD BioCoat™ (BD Biosciences, N.° 354450). Las células se transfectaron con plásmidos de empaquetamiento lentivirales (2,4 pg de A8,9 y 0,6 pg de VSVG) con 2,4 pg de construcción de ARNhc usando el reactivo de transfección TransIT-293 (Mirus, N. ° MIR 2700). El medio se reemplazó 24 horas después de la transfección y los sobrenadantes virales se recogieron a las 24 y 36 h. Los sobrenadantes virales se combinaron y se filtraron a través de filtros de acetato de celulosa de O, 45 uM (Corning, N.° 430314).
Infección lentiviral de líneas celulares de cáncer de pulmón. La infección lentiviral de líneas celulares de cáncer de pulmón se realizó colocando 100.000 células en una placa de 6 pocillos e infectándolas al día siguiente con 1 ml de sobrenadante lentiviral en presencia de polibreno (8 pg/ml). Las células se infectaron por centrifugación durante 1 hora (800 G) a temperatura ambiente. El medio se reemplazó al día siguiente y se seleccionaron combinaciones estables de células con 800 ng/ml de neomicina.
Ensayos de crecimiento y formación de focos. Se sembraron por triplicado 500-750 células en placas de 96 pocillos. Las células no se trataron o se trataron con 100 ng/ml de doxiciclina (Clontech, N.° 631311) inmediatamente después de la colocación en placas y a continuación se repusieron cada dos días. La viabilidad celular se midió usando Cell Titer Glo (Promega, G7573) en varios puntos temporales. Los ensayos de formación de focos se realizaron sembrando 1000 células/pocillo de una placa de 6 pocillos por triplicado y tratándolas con 0 o 100 ng/ml de Dox inmediatamente después de la colocación en placas y el tratamiento continuo con Dox cada 2-3 días. Después de 10-14 días, se visualizaron las colonias mediante tinción con violeta cristal.
Análisis del ciclo celular. Las células se tripsinizaron, se lavaron con 1 ml de PBS y se fijaron en etanol al 70 % durante una noche a 4 °C. Después de 2 lavados con 1 ml de PBS, las células se resuspendieron en PBS que contenía 33 pg/ml de yoduro de propidio y 200 pg/ml de ARNasa A durante 30 min a 37 °C. La citometría de flujo se realizó en un citómetro BD FACSCanto y se analizó con el software FloJo (Tree Star).
Ensayos de senescencia. La actividad de p-galactosidasa asociada a la senescencia se controló con el kit de tinción de p-galactosidasa de senescencia (Cell Signaling, N.° 9860) según las instrucciones del fabricante.
Inmunofluorescencia. Las células se cultivaron en presencia o ausencia de doxiciclina durante los tiempos indicados en portaobjetos de cámara revestidos con colágeno I (BD, 354630) y se fijaron con formaldehído al 3,7 % durante 10 min. Los anticuerpos primarios se incubaron durante una noche a 4 °C a una dilución de 1:1000; los anticuerpos secundarios se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente a una dilución de 1:1000; se usó DAPI (1 ug/ml) para teñir los núcleos. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: anti trimetilhistona 3 de conejo (Lys9) (Millipore; 07-442). Se usaron Alexa488 anti conejo de burro (Life Technologies; N.° A-21206) o Alexa568 anti conejo (Life Technologies; N.° A10042) como anticuerpos secundarios.
Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa. Se sembraron células HCT116 en placas de 96 pocillos (1000-1500/pocillo por triplicado), posteriormente se infectaron con 15 ul de lentivirus con 8 ng/ml de polibreno y se infectaron por centrifugación a 800 G durante 1 hora a temperatura ambiente. 24 horas después de la infección, las células se seleccionaron con 1,5 mg/ml de neomicina durante 3 días y, posteriormente, se trataron con 0 o 100 ng/ml de dox durante 2 días para inducir la expresión de ARNhc. Después de 48 horas de tratamiento con Dox, las placas se lavaron con PBS frío, a continuación se lisaron con 50 pl de tampón de lisis proporcionado en el kit Taqman gene expression Cells-to-Ct (Applied biosystems, N.° 4399002). Después de añadir la solución finalizadora, se usaron 12,5 - 22,5 pl de lisados para la síntesis de ADNc en el presente de tampón RT y la enzima (volumen total de 50 pl) proporcionados por el kit. A continuación, se usaron 2-4 pl de ADNc para el ensayo de expresión génica ABI taqman en una reacción total de 12 pl mediante el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900 HT (Applied Biosystems, ABI). Los ensayos de expresión génica ABI taqman incluyen: Se usaron cebadores/sonda de p-actina VIC-MGB (Applied Biosystems), ensayo de expresión del gen BRM, Hs00268234_m1 en cada reacción para coamplificar la transcripción de p-actina. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se normalizaron a niveles de p-actina. La expresión relativa del ARNm viene dada por la fórmula 2' (Ct de la muestra - ct de la p-actina>, en la que el Ct (recuento de ciclos) es el valor umbral del ciclo.
Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa para genes regulados positivamente/negativamente seleccionados de experimentos de perfiles transcripcionales
Las células se sembraron en placas a 0,1-0,15x10A6/pocillo en placas de seis pocillos y se trataron con o sin doxiciclina (100 ng/ml) durante 2, 3 y 4 días. A continuación, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y se lisaron con 350 ul de tampón RLT (+ B-mercaptoetanol al 1 %) proporcionado en el mini kit RNeasy (Qiagen N.° 74106). El lisado se homogeneizó usando QIAshredder (Qiagen N.° 79654) y la digestión de ADNasa en columna se realizó con un conjunto de ADNasa libre de RNasa (Qiagen N.° 79254) según las instrucciones del fabricante. Las muestras se aplicaron a una columna de centrifugación RNeasy Mini que contenía una membrana a base de sílice proporcionada por el kit RNeasy Mini (Qiagen N.° 74106). Después del lavado, se eluyó el ARN en 50 ul de ddH2O libre de ARNasa y se midió la concentración usando un espectrofotómetro de 8 muestras Nanodrop ND-8000. El ADNc se sintetizó a partir del ARN total usando el kit de síntesis de ADNc iScript (BioRad N.° 170-8891). Se añadieron 0,5 - 1,5 |jg de ARN total en un volumen total de 20 |jl que contenía 5 |jl de supermezcla de transcripción inversa iScript (BioRad N.° 170-8841).
La reacción se cebó durante 5 min a 25 °C, y la transcripción inversa se realizó durante 30 min a 42 °C y la transcripción inversa se inactivó con una incubación de 5 minutos a 85 °C. El ADNc obtenido se diluyó 1:10 en ddH2O y se usaron 4 j l para la PCR cuantitativa en un volumen de reacción total de 10 j l y triplicados. La mezcla maestra se preparó con 6 j l de FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche N.° 04914058001) y 0,6 j l con una mezcla de sonda/cebador 20x (ABI) o una mezcla de sonda/cebador (IDT) que contenía 5 jM de sonda y 10 jM de cada cebador inverso y directo. La qPCR se realizó en una placa de 384 pocillos usando el sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT (Applied Biosystems). El nivel de ARNm se normalizó con respecto a la beta actina humana del gen constitutivo que se detectó en una reacción separada.
Estudios de eficacia in vivo. Se aclimataron ratones desnudos atímicos hembra (Harlan) en las instalaciones para animales de Novartis Institutes for BioMedical Research (ciclo de luz/oscuridad de 12 horas) con acceso a voluntad a alimentos y agua durante al menos 3 días antes de la manipulación. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con la Novartis Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Se inocularon por vía subcutánea ratones (6-8 semanas de edad, n = 8) en la región axilar dorsal derecha con células cancerosas NCI-H1299 (10*106 células en 200 ul de HBSS) o NCI-H640 (5x106 células en 200 ul de HBSS) que expresaban de manera estable ARNhc de control (CTL) no dirigido inducible por dox o dos ARNhc dirigidos a BRM distintos (sh2025 o sh5537). El volumen tumoral se midió dos veces por semana por calibración en dos dimensiones y se calculó como (ancho2 x largo x n/6). Cuando el volumen tumoral promedio alcanzó aproximadamente 250 mm3, los animales se asignaron al azar para recibir una dieta con vehículo (dieta estándar) o una dieta complementada con doxiciclina (Mod LabDiet® 5053, 400 ppm de doxiciclina) durante la duración del estudio. Al finalizar cada estudio, se recogió tejido tumoral de cada grupo y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido o se fijó durante una noche en formalina al 10 %. Para evaluar la atenuación temprana y los efectos farmacodinámicos, se administró vehículo o dieta de doxiciclina a un conjunto separado de animales portadores de tumores (n = 3/grupo) durante 7 días consecutivos, después de lo cual se extirpó el tejido tumoral y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido o se fijó en formalina tamponada neutra al 10 %.
Inmunohistoquímica y análisis de imágenes. Las muestras de tumor de xenoinjerto se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante aproximadamente 24 horas, se procesaron y se incluyeron en parafina. La tinción inmunohistoquímica se realizó en el Ventana Discovery System. Los anticuerpos primarios usados son BRG1 de Abcam (ab108318); BRM de Cell Signalling (6889); E-cadherina de Cell Signalling (3195); Ki67 de Vector Laboratories (clon SP6, VP-RM04); y vimentina de Cell Signalling (5741). Se capturaron imágenes de secciones tumorales completas usando Aperio Scanscope y se analizaron con ImageScope (Aperio Technologies, Vista, CA) y el Visiopharm Integrator System (V.4.4.4.0; Visiopharm, Hcrsholm, Dinamarca). El tejido estromal y las regiones necróticas se excluyeron manualmente usando las herramientas de dibujo proporcionadas por las plataformas de software de análisis. Los tejidos se segmentaron usando el módulo TissuemorphDP. La intensidad de DAB se cuantificó como porcentaje de núcleos positivos.
Tinción con azul alcián. Las muestras de tumor de xenoinjerto se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % durante aproximadamente 24 horas, se procesaron y se incluyeron en parafina. Las secciones de FFPE se cortaron a 5 jM , se montaron en portaobjetos, se hornearon a 60 °C durante al menos 30 minutos y se desparafinaron. A continuación, los portaobjetos se aclararon dos veces en H2 O, se transfirieron a ácido acético acuoso al 3 % durante 3 minutos y se trasladaron directamente a azul alcián al 1 % en ácido acético al 3 % a pH 2,5 durante 30 minutos. A continuación, se colocaron los portaobjetos en agua corriente durante 10 minutos, después de lo cual se aclararon en dH2 O antes de colocarlos en Nuclear Fast Red al 0,1 % (Kernechtrot) durante 5 minutos. Los portaobjetos se lavaron de nuevo con agua corriente y a continuación se deshidrataron. Por último, los portaobjetos se cubrieron con Permaslip.
Análisis estadístico. Se usaron pruebas de la t para datos emparejados para determinar la significación estadística. Para los estudios de inhibición del crecimiento tumoral, se realizó un análisis estadístico sobre el volumen tumoral delta (volumen tumoral final menos volumen tumoral inicial). Símbolos usados: * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; ns, no significativo.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar si un sujeto que padece un cáncer asociado con una mutación de BRG1 responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM, en el que el cáncer es un carcinoma de pulmón de células escamosas, carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón de células grandes, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de hígado u ovario, que comprende:
a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto con un reactivo capaz de detectar células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1; y
b) comparar la muestra obtenida de dicho sujeto afectado con una muestra similar tomada de un sujeto de control no canceroso o normal, en la que la presencia de una o más mutaciones de BRG1 en dicha muestra obtenida de dicho sujeto afectado indica que dicho sujeto afectado responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el reactivo capaz de detectar células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1 o pérdida de expresión de BRG1 es un anticuerpo anti BRG1.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el reactivo capaz de detectar células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1 es una o más sondas de PCR específicas para una de las mutaciones de BRG1 enumeradas en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 4.
4. Un método in vitro para determinar la sensibilidad de una célula cancerosa asociada con la pérdida de la función de BRG1, ya sea a través de una mutación de BRG1 o la pérdida de expresión de BRG1, a un inhibidor de BRM, en el que la célula cancerosa es una célula de carcinoma de células escamosas, una célula de carcinoma no microcítico, una célula de carcinoma de células grandes, una célula de adenocarcinoma o una célula de cáncer de ovario, que comprende:
a) ensayar una o más mutaciones de BRG1 en dicha célula cancerosa; y
b) comparar la una o más mutaciones de BRG1 con BRG1 en una célula de control no cancerosa o normal, en la que la presencia de dicha una o más mutaciones de BRG1 en dicha célula cancerosa indica que dicha célula es sensible a un inhibidor de BRM.
5. Un método in vitro para determinar la sensibilidad de una célula cancerosa a un inhibidor de BRM, en el que la célula cancerosa es una célula de carcinoma de células escamosas, una célula de carcinoma no microcítico, una célula de carcinoma de células grandes, una célula de adenocarcinoma o una célula de cáncer de ovario, que comprende: a) ensayar una o más mutaciones de BRG1 en dicha célula cancerosa;
b) ensayar la expresión de BRM en dicha célula cancerosa;
c) comparar la expresión de BRM con la expresión de BRM en una célula de control no cancerosa o normal; y
d) comparar la una o más mutaciones de BRG1 con BRG1 en una célula de control no cancerosa o normal, en el que la similitud en la expresión de BRM y la presencia de dicha una o más mutaciones de BRG1 en dicha célula cancerosa indica que dicha célula es sensible a un inhibidor de BRM.
6. El método de la reivindicación 4 o 5, en el que se emplea un anticuerpo anti BRG1 para determinar la sensibilidad de la célula cancerosa a un inhibidor de BRM.
7. El método de la reivindicación 4 o 5, en el que se emplea una o más sondas de PCR específicas para una de las mutaciones de BRG1 enumeradas en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 4 para determinar la sensibilidad de la célula cancerosa a un inhibidor de BRM
8. El método de la reivindicación 1, 4 o 5, en el que el inhibidor de BRM es un ARN en horquilla corto (ARNhc) o ARN inhibidor corto (ARNip).
9. El método de la reivindicación 1,4 o 5, en el que el inhibidor de BRM es un conjugado de anticuerpo-fármaco.
10. Uso de un kit para predecir la sensibilidad de un sujeto que padece un cáncer asociado con una mutación de BRG1 para el tratamiento con un inhibidor de BRM, en el que el cáncer es un carcinoma de células escamosas, carcinoma no microcítico, carcinoma de pulmón de células grandes, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de hígado u ovario, que comprende: i) reactivos capaces de detectar células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1; y ii) instrucciones sobre cómo usar dicho kit.
11. Uso del kit de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el reactivo capaz de detectar células cancerosas humanas que albergan una o más mutaciones de BRG1 se selecciona de un anticuerpo anti BRG1 y de una o más sondas de PCR específicas para una de las mutaciones de BRG1 enumeradas en Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 4.
12. Una composición que comprende un inhibidor de BRM para su uso en el tratamiento del carcinoma de pulmón de células escamosas, carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón de células grandes, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de hígado y ovario en una población de pacientes seleccionada, en la que la población de pacientes se selecciona sobre la base de padecer carcinoma de pulmón de células escamosas, carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón de células grandes, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de hígado u ovario asociado con una o más mutaciones de BRG1.
13. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que las mutaciones de BRG1 se seleccionan del grupo que consiste en mutaciones de BRG1 enumeradas en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 4.
14. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el inhibidor de BRM es un ARN en horquilla corto (ARNhc).
15. Un método para determinar si un sujeto que padece un cáncer asociado con la pérdida de la función de la proteína BRG1, o la falta de expresión de BRG1, responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM, en el que el cáncer es un carcinoma de células escamosas, carcinoma no microcítico, carcinoma de células grandes, célula de adenocarcinoma o cáncer de ovario, que comprende:
a) poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto con un reactivo capaz de detectar células cancerosas humanas que presentan pérdida de la función de la proteína BRG1, o falta de expresión de BRG1; y
b) comparar la muestra obtenida de dicho sujeto afectado con una muestra similar tomada de un sujeto de control no canceroso o normal, en el que la detección de pérdida de función de la proteína BRG1, o la falta de expresión de BRG1, en dicha muestra obtenida de dicho sujeto afectado indica que dicho sujeto afectado responderá al tratamiento terapéutico con un inhibidor de BRM.
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