ES2773456T3 - Método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer usando un compuesto que inhibe p300 - Google Patents

Método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer usando un compuesto que inhibe p300 Download PDF

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Abstract

Un método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de una mutación inactivadora en CBP contenida en la muestra biológica y determinar al paciente con la mutación inactivadora en CBP detectada como sensible al tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300, en donde la mutación inactivadora es una eliminación homocigota de CBP, una mutación sin sentido de CBP, o una de las mutaciones Asn83Thr, Ser893Leu, Arg1446Cys, Trp1472Cys, Asn2175Ser, Glu1835Stop, Asn2111Ser, Leu551lle, Gly1411Glu o Ala2044Gly.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer usando un compuesto que inhibe p300 [Campo técnico]
La presente invención se refiere a un método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300 y un método para seleccionar un candidato para el tratamiento del cáncer mediante el uso de la supresión funcional de CBP como índice. La presente invención también se refiere a un método para tratar cáncer que tiene supresión funcional de CBP con un compuesto que inhibe p300. La presente invención se refiere además a un reactivo para detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP, que se usa en estos métodos. La presente invención se refiere además a un método para seleccionar un compuesto para su uso en el tratamiento de cáncer que tiene supresión funcional de CBP mediante el uso de la inhibición de p300 como índice.
[Antecedentes de la técnica]
Los inhibidores de la tirosina cinasa son eficaces contra tumores sólidos con mutaciones activadoras en el gen de la tirosina cinasa, tal como las mutaciones en EGFR o la fusión de ALK que se encuentran en el adenocarcinoma de pulmón (NPL 1). Los presentes inventores y otros investigadores han identificado recientemente fusiones de oncogén RET en adenocarcinoma de pulmón (NPL 2). Esto respalda la importancia del gen de la tirosina cinasa como una diana terapéutica.
Mientras tanto, las mutaciones somáticas inactivadoras en genes que codifican subunidades de proteínas reguladoras de la cromatina (por ejemplo, histona acetiltransferasas CBP/CREBBP y p300/EP300, histona metiltransferasas MLL2 y SETD2, histona desmetilasas JARID1C y UTX, y factores de remodelación de la cromatina BRG1, ARID1A, ARID2, PBRM1 y SNF5) han sido en gran medida atractivas, ya que se identificaron por primera vez mediante el análisis de secuenciación de células cancerosas en todo el genoma. Se considera que estas mutaciones inhiben funciones en la transcripción o reparación de roturas de doble cadena de ADN y se cree que son cruciales para el desarrollo y/o progresión del cáncer.
Desafortunadamente, aún no se han desarrollado estrategias terapéuticas para atacar específicamente las células cancerosas que tienen estas mutaciones.
[Lista de citas]
[Bibliografía no de patente]
[NPL 1] Pao W, Girard N. Lancet Oncol. 2011; Febrero; 12 (2): 175-80
[NPL 2] Shaw AT, et al., Nat Rev Cancer. 2013; Noviembre; 13 (11): 772-87
[Sumario de la Invención]
[Problema técnico]
La presente invención se ha realizado a la luz de estas circunstancias, y un objeto de la presente invención es desarrollar una estrategia terapéutica para apuntar específicamente a las células cancerosas que tienen supresión funcional de CBP.
[Solución al Problema]
La terapia de letalidad sintética es un método muy prometedor para tratar el cáncer. Por ejemplo, los genes BRCA1 y BRCA2 están en la relación de letalidad sintética con el gen PARP1. El crecimiento de células cancerosas deficientes en BRCA1 o deficientes en BRCA2 depende de las funciones de la proteína PARP1. Ahora, estos hallazgos se han traducido a la clínica a través del desarrollo de inhibidores de PARP para tratar tumores deficientes en BRCA1/BRCA2 (Chan DA, et al., Nat Rev Drug Discov. 2011; 10: 351-64). Además, la terapia de letalidad sintética se ha propuesto para el tratamiento del cáncer deficiente en un gen implicado en la reparación del emparejamiento erróneo de ADN o el metabolismo celular (Muller FL, et al., Nature. 2012; 488: 337-42, Chan DA, et al., Sci Transl Med. 2011; 3: 94ra70, y Martin SA, et al., Cancer Cell. 2010; 17: 235-48). Los presentes inventores han llevado a cabo estudios diligentes para aplicar la terapia de letalidad sintética a una estrategia terapéutica para destruir específicamente las células cancerosas que albergan mutaciones de CBP.
Como resultado, los presentes inventores han encontrado que la supresión de la expresión de la proteína p300 o la inhibición funcional de esta proteína en las células cancerosas que albergan mutaciones de CBP suprime notablemente el crecimiento de las células cancerosas, mientras que dicha supresión del crecimiento no ocurre en las células con CBP competente. Además, el porcentaje de células positivas a la tinción con anexina V/PI aumentó en las células cancerosas cuyo crecimiento se suprimió, lo que demuestra que se indujo la apoptosis. Además, un experimento con ratones en el que se trasplantaron células cancerosas que albergan mutaciones de CBP también demostró el efecto inhibidor in vivo de la supresión de la expresión de p300 sobre el crecimiento de células cancerosas que albergan mutaciones de CBP.
A partir de estos resultados, los presentes inventores han encontrado que CBP y p300 están en relación con la letalidad sintética, y el tratamiento que inhibe p300 (particularmente, su actividad de histona acetiltransferasa) es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer que tiene supresión funcional de CBP. Los presentes inventores también han revelado que esta estrategia terapéutica logra un tratamiento eficaz basado en diagnósticos complementarios porque se puede administrar un inhibidor de p300 a un paciente con cáncer seleccionado con supresión funcional de CBP como índice.
Los presentes inventores han encontrado además que la detección de un fármaco útil en el tratamiento del cáncer con CBP mutado se puede realizar mediante el uso de si inhibe o no p300 como índice. Sobre la base de estos hallazgos, se ha completado la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a la terapia de letalidad sintética para atacar específicamente las células cancerosas que tienen supresión funcional de CBP, tal como mutaciones de CBP, y a diagnósticos complementarios para la terapia de letalidad sintética, y proporciona más específicamente los siguientes aspectos: (1) Un método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP contenida en la muestra biológica y determinar al paciente con la supresión funcional de CBP detectada como sensible al tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300.
(2) Un método para seleccionar un candidato para el tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP contenida en la muestra biológica y seleccionar al paciente con la supresión funcional de CBP detectada como el candidato para el tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300.
(3) Un método para tratar el cáncer que tiene supresión funcional de CBP, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP contenida en la muestra biológica y administrar un compuesto que inhibe p300 al paciente con la supresión funcional de CBP detectada.
(4) Un reactivo para detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP en un método de acuerdo con cualquiera de (1) a (3), comprendiendo el reactivo cualquiera de las siguientes moléculas (a) a (c) como principio activo:
(a) un cebador oligonucleotídico que se une específicamente al gen CBP,
(b) una sonda oligonucleotídica que se une específicamente al gen CBP, y
(c) un anticuerpo que se une específicamente a la proteína CBP.
(5) Un método para la detección de un compuesto para su uso en el tratamiento del cáncer que tiene supresión funcional de CBP, comprendiendo el método la etapa de seleccionar el compuesto mediante el uso de si inhibe o no p300 como índice.
(6) Un agente terapéutico para el cáncer en el que se ha detectado la supresión funcional de CBP, que comprende un compuesto que inhibe p300.
[Efectos ventajosos de la Invención]
De acuerdo con la presente invención, la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer con un inhibidor de p300 se puede predecir eficazmente con la supresión funcional de CBP como índice. De acuerdo con la presente invención, se detecta la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP (por ejemplo, inactivación de mutaciones o reducción de la expresión) en una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, y se selecciona el paciente que tiene la supresión funcional de CBP. Después, este paciente seleccionado puede ser sometido al tratamiento del cáncer con un inhibidor de p300. Por tanto, los resultados del tratamiento de pacientes con cáncer pueden mejorarse en gran medida. El uso de una sonda o un cebador para el gen CBP y un anticuerpo contra CBP permite que los diagnósticos complementarios se realicen eficazmente mediante dicha detección de la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP.
[Breve Descripción de los Dibujos]
[Figura 1] La Figura 1 es un diagrama que muestra el efecto de la supresión de la expresión de p300 en líneas celulares de cáncer que tienen mutaciones de CBP. La Figura 1A es una fotografía que muestra los resultados de la transferencia Western. La Figura 1B es un gráfico que muestra las tasas de supervivencia celular. La Figura 1C es un gráfico que muestra las tasas de formación de colonias.
[Figura 2] La Figura 2 es un diagrama que muestra el efecto de la supresión de la expresión de p300 en líneas celulares normales. Los gráficos superiores muestran los resultados de detectar el crecimiento celular de cada línea celular normal. Las fotografías inferiores muestran el agotamiento de p300 mediado por ARNip en cada línea celular normal.
[Figura 3] La Figura 3 es un diagrama que muestra la sensibilidad de las líneas celulares de cáncer que tienen mutaciones de CBP a un inhibidor de p300 C646. La Figura 3A es un gráfico que muestra las tasas de supervivencia de las líneas celulares de cáncer de pulmón. La Figura 3B es un gráfico que muestra la CI50 de C646 contra las líneas celulares de cáncer de pulmón. La Figura 3C es un gráfico que muestra las tasas de supervivencia de las líneas celulares de linfoma. La Figura 3D es un gráfico que muestra la CI50 de C646 contra las líneas celulares de linfoma.
[Figura 4] La Figura 4 es un diagrama que muestra el mecanismo subyacente a la muerte celular de las líneas celulares de cáncer que tienen mutaciones de CBP por supresión de la expresión de p300. El diagrama superior muestra la relación general de la muerte celular con la apoptosis, la senescencia celular y la autofagia. La fotografía inferior muestra el cambio en varios marcadores.
[Figura 5] La Figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de la detección de la inducción de apoptosis de líneas celulares de cáncer que tienen mutaciones de CBP mediante la supresión de la expresión de p300 usando la capacidad de tinción de la anexina V como índice. La Figura 5A muestra los resultados obtenidos a las 96 horas después de la transfección con sip300. La Figura 5B muestra los resultados obtenidos a las 48 horas y 96 horas después del tratamiento con C464.
[Figura 6] La Figura 6 es un diagrama que muestra el efecto de la supresión de la expresión de p300 en ratones en los que se trasplantó una línea celular de cáncer con mutaciones de CBP. El diagrama superior muestra el esquema del experimento. Los gráficos inferiores muestran los resultados de analizar el crecimiento tumoral en ratones en los que se trasplantaron células cancerosas de control (izquierda) o células cancerosas cuya expresión de p300 fue suprimida por la acción de Dox (derecha).
[Figura 7] La Figura 7 es un diagrama que muestra mutaciones de CBP en una línea celular de cáncer de pulmón y una línea celular de linfoma. En el diagrama, "HoD" denota eliminación homocigota; "HeD" denota eliminación heterocigota; "N" denota mutación sin sentido; "F" denota mutación de cambio de marco; "MD" denota mutación sin sentido dentro del dominio; y "M" denota mutación sin sentido.
[Figura 8] La Figura 8 es un diagrama que muestra el efecto de la supresión de la expresión de varias histonas acetiltransferasas (HAT) en las células A549 (con CBP competente) y las células H520 (con CBP mutado). La ordenada representa las tasas de supervivencia celular (tasas de formación de colonias).
[Figura 9] La Figura 9 es un diagrama que muestra el cambio en el nivel de expresión de c-Myc causado por la supresión de la expresión de p300 en varias líneas celulares con CBP competente y líneas celulares con CBP mutado.
[Figura 10] La Figura 10 es un diagrama que muestra esquemáticamente el mecanismo subyacente a la supresión de la expresión de c-Myc y la supresión del crecimiento celular mediante la supresión funcional de p300 en células con CBP mutado.
[Descripción de las Realizaciones]
<Método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer y método para seleccionar candidatos para el tratamiento del cáncer>
En la presente invención, tumor, tumor maligno, cáncer, neoplasia maligna, carcinoma, sarcoma y similares se denominan colectivamente "tumor" o "cáncer". En la presente invención, se ha encontrado que CBP y p300 están en la relación de letalidad sintética en células cancerosas, y la inhibición de p300 en células cancerosas que tienen supresión funcional de CBP puede suprimir el crecimiento de las células cancerosas. Sobre la base de este hallazgo, la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300 se puede evaluar con la supresión funcional de CBP como índice. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP contenida en la muestra biológica y determinar al paciente con la supresión funcional de CBP detectada como sensible al tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300.
Dicho paciente con la supresión funcional de CBP detectada es adecuado para el tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300. Se puede realizar un tratamiento eficaz mediante la selección de un paciente sensible a y un paciente no sensible al tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300 con supresión funcional de CBP como índice. Por consiguiente, la presente invención proporciona incluso un método para seleccionar un candidato para el tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP contenida en la muestra biológica y seleccionar al paciente con la supresión funcional de CBP detectada como el candidato para el tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300.
En la presente invención, el "paciente con cáncer" puede ser no solo un ser humano afectado por cáncer sino un ser humano sospechoso de tener cáncer. En el método de la presente invención, el paciente con cáncer en el que se va a detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP no está particularmente limitado, y cada paciente con cáncer puede usarse como este sujeto. El cáncer que tiene supresión funcional de CBP puede ser, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, linterna o adenocarcinoma quístico. Se sabe que un subconjunto del 10 % de cáncer de pulmón, un subconjunto del 13 % de cáncer de vejiga, un subconjunto de linterna del 20 al 40 % y un subconjunto del 7 % de adenocarcinoma quístico tienen mutaciones de CBP. Por tanto, de acuerdo con el método de la presente invención, un paciente con cáncer que tenga dicha frecuencia se puede seleccionar como el "candidato para el tratamiento".
La "muestra biológica" utilizada en la presente invención no está particularmente limitada siempre que se pueda detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP en la muestra biológica. Se prefiere una muestra de biopsia de cáncer. Pueden usarse extractos de proteínas o extractos de ácido nucleico (extractos de ARNm, ADNc o preparaciones de ARNc preparados a partir de extractos de ARNm, etc.) obtenidos de estas muestras.
En la presente invención, tanto "CBP" como "p300" son histona acetiltransferasas que están implicadas en la regulación de la cromatina. Estas enzimas están en una relación paráloga. La secuencia de nucleótidos normal del ADN genómico de CBP natural procedente de seres humanos se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos normal del ADNc de CBP natural procedente de seres humanos se muestra en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos normal de la proteína CBP natural procedente de seres humanos se muestra en la SEQ ID NO: 3. La secuencia de nucleótidos normal del ADN genómico de p300 natural procedente de seres humanos se muestra en la SEQ ID NO: 4. La secuencia de nucleótidos normal del ADNc de p300 natural procedente de seres humanos se muestra en la SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos normal de la proteína p300 natural procedente de seres humanos se muestra en la SEQ ID NO: 6. Debe entenderse que incluso CBP o p300 que no tienen mutación pueden variar en secuencia entre individuos debido al polimorfismo, etc.
En la presente invención, la "supresión funcional de CBP" incluye tanto la inactivación de CBP o la reducción de la actividad de CBP como la reducción de la expresión de CBP. La inactivación de CBP se atribuye normalmente a una mutación inactivadora en CBP. La mutación inactivadora puede ocurrir debido a, por ejemplo, una mutación sin sentido en el dominio de la histona acetiltransferasa (HAT) (posiciones 1342 a 1648 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 3) de CBP, una mutación sin sentido sobre la región completa, o una eliminación completa o parcial del gen. La mutación inactivadora no está limitada a la misma siempre que la mutación provoque la inactivación de CBP. Ejemplos de las mutaciones de CBP se muestran en la Tabla 1 y la Figura 7. En la Tabla 1, las abreviaturas son las siguientes: SCC: carcinoma de células pequeñas; AdC: adenocarcinoma; SqC: carcinoma de células escamosas; LCC: carcinoma de células grandes; nA: no analizado; y ND: no detectado. La marca * denota tamaño aberrante. La marca f denota que el ADN de tejido no canceroso correspondiente no está disponible.
[Tabla 11
Previsto en cambio de Expresión mutación Muestra Histología Exón (cambio) producto génico ARNm Proteína p53 Línea celular
4-32 (Eliminación
H209 SCC homocigota) Fusión IV86-2A/G 1-3 (Eliminación
H1963f SCC homocigota) Nu11 - - Val147Asp His214Arg 3 (Eliminación
LK-2f SqC homocigota) Truncamiento Va1272Met 3 (A248C:
H2122 AdC Heterocigoto) Asn83Thr Gln16Leu Cys176Phs 15(C2678T:
H322f AdC Heterocigoto) Ser893Leu Arg24Sleu 27 (C4336T:
H520f SqC Heterocigoto) Arg1446Cys Trp146stop 28(G4416T:
H1703f SqC Heterocigoto) Trp1472Cys IV88+1G/T 32(A6524G:
Heterocigosidad) 32 Asn21758er
(G5503T:
H1184f SCC Heterocigoto) parada de Glu1835 Asp259Val 32(A6332G:
Lu65f LCC Heterocigoto) Asn2111Ser Glu11Gln (continuación)
Espécimen
quirúrgico
3 (DG91 o 92:
Na98T AdC Heterocigoto) Truncamiento NA Gly271Lys 8 (C1651A:
N501T AdC Heterocigoto) Leu5511le NA NA His193Tyr 26 (G4232A:
S31T SCC Homocigoto) Gly1411Glu NA NA ND 31 (C4926G:
Na79T SqC Heterocigoto) Silencioso NA ND 32(C6131G:
T10-28T SqC Heterocigoto) Ala2044Gly NA NA Tyr220Cys La reducción en la expresión de CBP incluye tanto la reducción en la expresión a nivel transcripcional como la reducción en la expresión a nivel traduccional.
En la presente invención, los ejemplos del enfoque para "detectar la supresión funcional de CBP" incluyen, pero sin limitarse particularmente a, los métodos descritos a continuación.
- Detección de mutación de CBP -En la presente invención, la frase "detectar una mutación" significa detectar una mutación en el ADN genómico como una regla e incluye incluso detectar un cambio en una base en un producto de transcripción o un cambio en un aminoácido en un producto de traducción (es decir, detección indirecta) cuando la mutación en el ADN genómico se refleja en dicho cambio en el producto de transcripción o el producto de traducción.
Una realización preferida del método de la presente invención es un método para detectar una mutación mediante la determinación directa de la secuencia de nucleótidos de una región génica CBP en un paciente con cáncer. En la presente invención, la "región génica CBP" significa una región dada en el ADN genómico que contiene el gen CBP. Esta región también incluye las regiones de control de expresión (por ejemplo, una región promotora y una región potenciadora) del gen CBP, la región no traducida en 3' del gen CBP y similares. Las mutaciones en estas regiones pueden influir, por ejemplo, en la actividad transcripcional del gen CBP.
En este método, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN a partir de una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer. Los ejemplos de la muestra de ADN incluyen una muestra de ADN genómico y una muestra de ADNc preparada a partir de ARN mediante transcripción inversa.
El método para extraer ADN o ARN genómico de la muestra biológica no está particularmente limitado y se puede seleccionar adecuadamente para su uso a partir de enfoques conocidos en la técnica. Ejemplos del método para extraer el ADN genómico incluyen el método SDS fenol (método que implica desnaturalizar proteínas de un tejido conservado en una solución que contiene urea o etanol usando una enzima proteolítica (proteinasa K), un tensioactivo (SDS) y fenol, y precipitar y extraer ADN del tejido con etanol), y el método de extracción de ADN usando Clean Columns(R) (fabricado por Hermes-NexTec GmbH), AquaPure(R) (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.), el kit ZR Plant/Seed DNA (fabricado por Zymo Research Corp.), AquaGenomic Solution(R) (fabricado por MoBiTec GmbH), prepGEM(R) (fabricado por ZyGEM NZ, Ltd.), o BuccalQuick(R) (fabricado por TrimGen Corp.). Ejemplos del método para extraer el ARN incluyen el método de extracción que usa fenol y una sal caotrópica (más específicamente, el método de extracción que usa un kit comercialmente disponible como TRIzol (fabricado por Invitrogen Corp.) o IISOGEN(R) (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), y métodos que utilizan otros kits disponibles comercialmente (kit de extracción de ARN total RNAPrep (fabricado por Beckman Coulter Inc.), RNeasy Mini (fabricado por Qiagen N.V.), kit de extracción de ARN (fabricado por Pharmacia Biotech Inc.), etc.). Ejemplos de la transcriptasa inversa para su uso en la preparación de ADNc a partir del ARN extraído incluyen, pero sin limitarse particularmente a, la transcriptasa inversa procedente de retrovirus tales como RAV (virus Rous asociado) o AMV (virus de la mieloblastosis aviar), y la transcriptasa inversa procedente de retrovirus de ratón tal como MMLV (virus de la leucemia murina de Moloney).
En esta realización, posteriormente, se aísla el ADN que contiene un sitio de mutación en la región génica CBP, y se determina la secuencia de nucleótidos del ADN aislado. El aislamiento del ADN se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, PCR con el ADN genómico o el ARN como plantilla utilizando un par de cebadores oligonucleotídicos diseñados para flanquear el sitio de mutación en la región génica CBP. La determinación de la secuencia de nucleótidos del ADN aislado se puede llevar a cabo mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica, tal como el método Maxam-Gilbert o el método Sanger.
La secuencia de nucleótidos determinada del ADN o el ADNc se puede comparar con un control (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos del ADN o ADNc procedente de un tejido no canceroso del mismo paciente) para determinar la presencia o ausencia de una mutación en la región génica CBP en las células cancerosas del paciente con cáncer.
El método para detectar una mutación en la región génica CBP se puede llevar a cabo mediante varios métodos capaces de detectar mutaciones, además del método para determinar directamente la secuencia de nucleótidos de ADN o ADNc.
La detección de una mutación de acuerdo con la presente invención también se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, el siguiente método: en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se prepara una sonda oligonucleotídica marcada con colorante fluorescente indicador y colorante fluorescente apagado que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos que contiene la mutación en la región génica CBP. Después, la sonda oligonucleotídica se hibrida con la muestra de ADN, y la secuencia de nucleótidos que contiene la mutación en la región génica CBP se amplifica adicionalmente con la muestra de ADN hibridada con la sonda oligonucleotídica como plantilla. Se detecta la fluorescencia emitida por el colorante fluorescente indicador como resultado de la degradación de la sonda oligonucleotídica mediante la amplificación. Posteriormente, la fluorescencia detectada se compara con el control. Ejemplos de dicho método incluyen el método de sonda de doble tinte, denominado método de sonda TaqMan(R). En un método alternativo adicional, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, una secuencia de nucleótidos que contiene la mutación en la región génica CBP se amplifica con la muestra de ADN como plantilla en un sistema de reacción que contiene un intercalador que emite fluorescencia cuando se inserta entre las cadenas dobles de ADN. Se cambia la temperatura del sistema de reacción y se detecta la variación en la intensidad de fluorescencia emitida por el intercalador. La variación detectada en la intensidad de fluorescencia causada por el cambio en la temperatura se compara con el control. Ejemplos de dicho método incluyen el método HRM (fusión de alta resolución).
En un método alternativo adicional, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se amplifica el ADN que contiene el sitio de mutación en la región génica CBP. También, se escinde el ADN amplificado con enzimas de restricción. Posteriormente, se separa el fragmento de ADN de acuerdo con su tamaño. Posteriormente, se compara el tamaño detectado del fragmento de ADN con el control. Ejemplos de dicho método incluyen un método basado en el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) y PCR-RFLP.
En un método alternativo adicional, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se amplifica el ADN que contiene el sitio de mutación en la región génica CBP. También, se disocia el ADN amplificado en ADN monocatenario. Posteriormente, se separa el ADN monocatenario así obtenido mediante disociación en un gel no desnaturalizante. La movilidad del ADN monocatenario separado en el gel se compara con el control. Ejemplos de dicho método incluyen PCR-SSCP (polimorfismo de conformación de cadena sencilla).
En un método alternativo adicional, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se amplifica el ADN que contiene el sitio de mutación en la región génica CBP. También, se separa el ADN amplificado en un gel en el que la concentración de un ADN desnaturalizante se eleva gradualmente. Posteriormente, se compara la movilidad del ADN separado en el gel con el control. Ejemplos de dicho método incluyen electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE, por sus siglas en inglés).
Un método alternativo adicional es un método que usa ADN que contiene el sitio de mutación en la región génica CBP preparado a partir de la muestra biológica, y un sustrato con una sonda oligonucleotídica inmovilizada que hibrida con el ADN. Ejemplos de dicho método incluyen el método de matriz de ADN.
En un método alternativo adicional, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Además, se prepara un "cebador oligonucleotídico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una base inmediatamente en 3' a la base del sitio de mutación en la región génica CBP y una secuencia de nucleótidos en 3' de la misma". Posteriormente, se realiza la reacción de extensión del cebador ddNTP con el ADN como plantilla usando el cebador. Posteriormente, el producto de reacción de extensión del cebador se somete a espectrometría de masas en un espectrómetro de masas. Posteriormente, el genotipo se determina a partir de los resultados de la espectrometría de masas. Posteriormente, el genotipo determinado se compara con el control. Ejemplos de dicho método incluyen MALDI-TOF/MS.
En un método alternativo adicional, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se prepara una sonda oligonucleotídica que consiste en de 5', - "una secuencia de nucleótidos complementaria a la base del sitio de mutación en la región génica CBP y una secuencia de nucleótidos en 5' de la misma" - "una secuencia de nucleótidos que no se hibrida con una base inmediatamente en 3' al sitio de mutación en la región génica CBP y una secuencia de nucleótidos en 3' de la misma"-3' (colgajo). Además, se prepara una "sonda oligonucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la base del sitio de mutación en la región génica CBP y una secuencia de nucleótidos en 3' de la misma". Posteriormente, estos dos tipos de sondas oligonucleotídicas se hibridan con el ADN preparado. Posteriormente, se escinde el ADN hibridado con una enzima de escisión de ADN monocatenario para liberar el colgajo. Ejemplos de enzimas de escisión de ADN monocatenario incluyen, pero sin limitarse particularmente a, cleavasa. En este método, una sonda oligonucleotídica a marcada con un indicador de fluorescencia y un inhibidor de fluorescencia que tiene una secuencia complementaria al colgajo se hibrida a continuación con el colgajo. Posteriormente, se mide la intensidad de la fluorescencia generada. Posteriormente, se compara la intensidad de fluorescencia medida con el control. Ejemplos de dicho método incluyen el método Invader.
En un método alternativo adicional, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se amplifica el ADN que contiene el sitio de mutación en la región génica CBP. Se disocia el ADN amplificado en ADN monocatenario. Solo se separa una de las cadenas de ADN individuales así obtenidas mediante disociación. Posteriormente, se realiza la reacción de extensión mediante una base a la vez desde cerca de la base del sitio de mutación en la región génica CBP. El pirofosfato generado durante esta reacción se deja enzimáticamente emitir luz, y se mide la intensidad de la luminiscencia. Después, se compara la intensidad de fluorescencia medida con el control. Ejemplos de dicho método incluyen el método de pirosecuenciación.
En un método alternativo adicional, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se amplifica el ADN que contiene el sitio de mutación en la región génica CBP. Posteriormente, se prepara un "cebador oligonucleotídico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una base inmediatamente en 3' a la base del sitio de mutación en la región génica CBP y una secuencia de nucleótidos en 3' de la misma". Posteriormente, se realiza la reacción de extensión de un solo nucleótido con el ADN amplificado como plantilla usando el cebador preparado en presencia de un nucleótido marcado con fluorescencia. Se mide el grado de polarización de la fluorescencia. Posteriormente, se compara el grado medido de polarización de la fluorescencia con el control. Ejemplos de dicho método incluyen el método AcycloPrime.
En un método alternativo adicional, en primer lugar, se prepara una muestra de ADN o ADNc a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se amplifica el ADN que contiene el sitio de mutación en la región génica CBP. Posteriormente, se prepara un "cebador oligonucleotídico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una base inmediatamente en 3' a la base del sitio de mutación en la región génica CBP y una secuencia de nucleótidos en 3' de la misma". Posteriormente, se realiza la reacción de extensión de un solo nucleótido con el ADN amplificado como plantilla usando el cebador preparado en presencia de un nucleótido marcado con fluorescencia. Posteriormente, se determina la especie base utilizada en la reacción de extensión de un solo nucleótido. Posteriormente, se compara la especie base determinada con el control. Ejemplos de dicho método incluyen el método SNuPE.
Siempre que la mutación implique un cambio (por ejemplo, sustitución, eliminación o inserción) en el aminoácido en la proteína CBP, la muestra preparada a partir de la muestra biológica puede ser la proteína. En tal caso, por ejemplo, se puede utilizar para detectar la mutación un método que usa una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que se une específicamente a un sitio que tiene un cambio en el aminoácido causado por la mutación. El método para detectar la proteína usando un anticuerpo se describirá más adelante.
- Detección de reducción en la expresión de CBP -En la presente invención, la "reducción en la expresión de CBP" generalmente significa un nivel de expresión más bajo en comparación con un control (por ejemplo, un nivel de expresión en el tejido no canceroso de una persona sana o del mismo paciente).
En el método para detectar el nivel de expresión de CBP a nivel transcripcional, en primer lugar, se preparan el ARN o ADNc mediante el método descrito anteriormente a partir de una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer. Posteriormente, se usan un cebador oligonucleotídico y una sonda oligonucleotídica en la reacción de amplificación y la reacción de hibridación, respectivamente, para detectar el producto de amplificación o el producto de hibridación. Por ejemplo, se puede usar RT-PCR, transferencia Northern, transferencia de puntos, método de matriz de ADN, hibridación in situ, ensayo de protección de ARNasa o secuenciación de ARNm como dicho método. Los expertos en la técnica pueden diseñar un cebador oligonucleotídico o una sonda oligonucleotídica adecuada para cada método mediante un método de rutina sobre la base de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) del ADNc de CBP.
En el método para detectar el nivel de expresión de CBP a nivel traduccional, en primer lugar, se prepara una muestra de proteína a partir de una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer. Posteriormente, se usa un anticuerpo específico para la proteína CBP en la reacción antígeno-anticuerpo para detectar la unión del anticuerpo a la proteína CBP. Cuando el anticuerpo específico para CBP está marcado, la proteína CBP se puede detectar directamente. Cuando este anticuerpo no está marcado, una molécula marcada (por ejemplo, anticuerpo secundario o proteína A) que reconoce este anticuerpo también puede actuar sobre el complejo antígeno-anticuerpo, y la proteína CBP se puede detectar indirectamente mediante el uso del marcador de la molécula. Por ejemplo, el método inmunohistoquímico (inmunotinción), transferencia Western, ELISA, citometría de flujo, citometría de imagen, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación o método de análisis utilizando una matriz de anticuerpos se puede usar como dicho método. La inmunohistoquímica también tiene la ventaja de que se puede obtener al mismo tiempo información adicional tal como la morfología o el estado distribuido de las células cancerosas en un tejido.
El anticuerpo utilizado no está particularmente limitado por su tipo, origen, etc., y es preferentemente un anticuerpo monoclonal. También se puede usar un anticuerpo oligoclonal (una mezcla de varias a varias decenas de anticuerpos) o un anticuerpo policlonal siempre que se pueda detectar CBP con suficiente especificidad. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo funcional tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, sc(Fv)2, dsFv o diacuerpo, o un multímero del mismo (por ejemplo, un dímero, un trímero, un tetrámero o un polímero) también se puede usar. El anticuerpo anti-CBP puede ser un producto disponible comercialmente.
La detección de la proteína CBP también se puede llevar a cabo mediante el uso de espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés). En particular, el análisis por cromatografía líquida acoplada al espectrómetro de masas (LC/MS, por sus siglas en inglés) es sensible y, por lo tanto, ventajoso. La medición de la espectrometría de masas se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la preparación de proteínas a partir de la muestra biológica, el marcaje de las proteínas, el fraccionamiento de las proteínas, sometiendo las fracciones de proteínas a la espectrometría de masas e identificando la proteína CBP a partir del valor de la espectrometría de masas. Se puede usar un reactivo de marcaje de isótopos conocido en la técnica como el marcador, y se puede obtener un reactivo de marcaje apropiado como un producto disponible comercialmente. Además, el fraccionamiento se puede llevar a cabo mediante un método conocido en la técnica y puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, una columna de catión fuerte disponible comercialmente.
- Otros -En la técnica se sabe que la hipermetilación del promotor es en parte responsable de la reducción de la expresión génica. Por consiguiente, la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP se puede detectar posiblemente con la metilación del promotor del gen CBP como índice. La mesilación del promotor se puede detectar mediante el uso de un método conocido en la técnica, por ejemplo, un método que implica detectar directamente, mediante secuenciación, el cambio en la secuencia de nucleótidos tratada con bisulfito que tiene la actividad de convertir la citosina metilada en uracilo, o un método de detección indirecta que usa una endonucleasa de restricción que puede reconocer (o escindir) una secuencia de nucleótidos antes del tratamiento con bisulfito pero no puede reconocer (o escindir) una secuencia de nucleótidos tratada con bisulfito.
De esta forma, cuando se ha detectado la supresión funcional de CBP, por ejemplo, la mutación inactivadora de la pérdida de función en la CBP, cuando se ha detectado la reducción en la expresión de CBP, o cuando se ha detectados cualquiera de los otros fenómenos que causan la inactivación de CBP o la reducción en la expresión de CBP (por ejemplo, hipermetilación del promotor), se puede determinar que el paciente responde al tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300 y se puede seleccionar como el candidato para el tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300. En este contexto, la "capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer" es un índice para decidir si el compuesto que inhibe p300 puede ejercer o no efectos terapéuticos sobre el cáncer. La determinación de la capacidad de respuesta puede incluir no solo la determinación de la presencia o ausencia de la capacidad de respuesta, sino también la evaluación del grado de capacidad de respuesta encontrada (por ejemplo, la evaluación que concluye que se puede esperar una alta capacidad de respuesta o se puede esperar una capacidad de respuesta moderada). Por consiguiente, de acuerdo con el grado de supresión funcional de CBP, por ejemplo, se puede seleccionar un paciente como candidato para el tratamiento a un nivel en el que se pueda esperar una capacidad de respuesta moderada.
Por otro lado, cuando no se ha encontrado una supresión funcional de CBP, el paciente puede ser excluido del candidato para el tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300. Esto puede mejorar la tasa de respuesta del tratamiento.
Cuando p300, que es una diana de este tratamiento, no se expresa normalmente, existe el riesgo de que el tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300 no se pueda llevar a cabo de manera eficaz. Por consiguiente, la expresión normal de p300 también se puede usar como un índice adicional en la predicción de la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer o la selección de un paciente con cáncer. El enfoque para detectar la expresión de p300 es el mismo que en la detección de la expresión de CBP descrita anteriormente.
<Método para tratar cáncer>
La presente invención también proporciona un método para tratar cáncer que tiene supresión funcional de CBP, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP contenida en la muestra biológica y administrar un compuesto que inhibe p300 al paciente con la supresión funcional de CBP detectada.
El "compuesto que inhibe p300" para su uso en este tratamiento no está particularmente limitado y puede ser un compuesto conocido en la técnica o puede ser un compuesto que se identifica mediante detección mencionada más adelante.
El compuesto que inhibe p300 se puede administrar por vía oral o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraarterial o local) al paciente con cáncer en diversas formas, tales como comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas o soluciones de acuerdo con sus características. La dosis no está particularmente limitada siempre que la cantidad sea eficaz para tratar el cáncer mediante la inhibición de p300. La dosis se puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con las propiedades del compuesto, así como la edad, peso corporal, síntomas y condiciones de salud del paciente con cáncer, gravedad del cáncer, etc. La frecuencia de administración no está particularmente limitada y se puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con un propósito. Por ejemplo, una dosis diaria puede administrarse una vez al día o puede administrarse en varias porciones. En el caso de administrar el compuesto que inhibe p300 a un ser humano, la dosis varía de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, preferentemente de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, al día. En el caso del compuesto que inhibe p300 en un ser humano, preferentemente, este compuesto se administra en una porción o en dos a cuatro porciones por día, y esta administración se repite preferentemente a intervalos apropiados. Alternativamente, la dosis diaria puede exceder la cantidad descrita anteriormente, si es necesario, a discreción de un médico.
Esto puede inhibir además p300 en células cancerosas que tienen supresión funcional de CBP en el paciente con cáncer y puede tratar el cáncer por el efecto de la letalidad sintética.
Ejemplos del cáncer al que se dirige el tratamiento incluyen, pero sin limitación, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, linfoma y adenocarcinoma quístico.
<Reactivo para detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP>
La presente invención también proporciona un reactivo para detectar la presencia o ausencia de supresión funcional de CBP en cualquiera de los métodos descritos anteriormente, comprendiendo el reactivo cualquiera de las siguientes moléculas (a) a (c) como principio activo:
(a) un cebador oligonucleotídico que se une específicamente al gen CBP,
(b) una sonda oligonucleotídica que se une específicamente al gen CBP, y
(c) un anticuerpo que se une específicamente a la proteína CBP.
El cebador polinucleotídico se puede diseñar sobre la base de la información de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 2) en el ADN genómico o ADNc de CBP de manera que el cebador sea adecuado para el enfoque descrito anteriormente o la región a amplificar y de manera que la formación de un producto de amplificación de un gen que no sea el gen CBP se evita tanto como sea posible. Los expertos en la técnica pueden llevar a cabo dicho diseño de cebador oligonucleotídico mediante un método rutinario. La longitud del cebador oligonucleotídico suele ser de 15 a 50 bases de largo, preferentemente de 15 a 30 bases de largo, y puede ser más largo que estas longitudes de acuerdo con un enfoque y un propósito.
La sonda polinucleotídica descrita anteriormente se puede diseñar sobre la base de la información de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 2) en el ADN genómico o ADNc de CBP, de manera que el cebador sea adecuado para el enfoque descrito anteriormente o la región a hibridar y de manera que la hibridación con un gen que no sea el gen CBP se evite tanto como sea posible. Los expertos en la técnica pueden llevar a cabo dicho diseño de sonda oligonucleotídica mediante un método rutinario. La longitud de la sonda oligonucleotídica suele ser de 15 a 200 bases de largo, preferentemente de 15 a 100 bases de largo, más preferentemente de 15 a 50 bases de largo, y puede ser más largo que estas longitudes de acuerdo con un enfoque y un propósito.
Preferentemente, la sonda oligonucleotídica se marca apropiadamente para su uso. Ejemplos del método de marcaje pueden incluir un método que implica marcar el extremo 5' del oligonucleótido mediante fosforilación con 32P usando polinucleótido cinasa T4, y un método que implica incorporar una base de sustrato marcada con un isótopo (por ejemplo, 32P), un tinte fluorescente, o biotina en el oligonucleótido usando una ADN polimerasa tal como la enzima Klenow y un cebador tal como un oligonucleótido hexámero aleatorio (método de cebado aleatorio, etc.). El cebador oligonucleotídico y la sonda oligonucleotídica de la presente invención se pueden preparar usando, por ejemplo, un sintetizador de oligonucleótidos disponible comercialmente. La sonda oligonucleotídica también se puede preparar como un fragmento de ADN bicatenario obtenido mediante tratamiento con enzimas de restricción o similares. El cebador oligonucleotídico y la sonda oligonucleotídica de la presente invención no tienen que consistir en nucleótidos naturales (desoxirribonucleótido (ADN) y/o ribonucleótido (ARN)) y pueden estar compuestos parcial o totalmente de nucleótidos no naturales. Ejemplos de los nucleótidos no naturales incluyen PNA (ácido nucleico de poliamida), LNA(R) (ácido nucleico bloqueado), ENA(R) (ácido nucleico con puente de etileno en 2'-O,4'-C) y complejos de los mismos.
El anticuerpo policlonal que sirve como el anticuerpo que se une específicamente a la proteína CBP descrita anteriormente se puede obtener mediante la inmunización de un animal de inmunización con un antígeno (por ejemplo, la proteína CBP, un péptido parcial de la misma o células que expresan la proteína o el péptido parcial) y mediante la purificación del anticuerpo policlonal a partir del antisuero del animal mediante un enfoque convencional (por ejemplo, desestabilización salina, centrifugación, diálisis o cromatografía en columna). El anticuerpo monoclonal que sirve como este anticuerpo se puede preparar mediante el método de hibridoma o el método de ADN recombinante.
Ejemplos típicos del método de hibridoma incluyen el método de Kohler y Milstein (Kohler & Milstein, Nature 1975; 256: 495). En este método, las células productoras de anticuerpos para su uso en una etapa de fusión celular son células de bazo, células de ganglios linfáticos, leucocitos periféricos o similares del animal (por ejemplo, ratón, rata, hámster, conejo, mono o cabra) inmunizadas con un antígeno (por ejemplo, la proteína CBP, un péptido parcial de la misma o células que expresan la proteína o el péptido parcial). También se pueden usar células productoras de anticuerpos obtenidas por la acción del antígeno en un medio sobre estas células o linfocitos o similares descritos anteriormente, aislados previamente de un animal no inmunizado. Se pueden usar varias líneas celulares conocidas en la técnica como células de mieloma. Las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma pueden proceder de diferentes especies animales siempre que estas células puedan fusionarse. Preferentemente, las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma proceden de la misma especie animal. Los hibridomas se producen mediante, por ejemplo, la fusión celular entre células del bazo obtenidas de un ratón inmunizado con el antígeno y las células de mieloma de ratón y se pueden obtener mediante la detección posterior de hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal específico para la proteína CBP. El anticuerpo monoclonal contra la proteína CBP se puede obtener mediante el cultivo de los hibridomas o del líquido ascítico de un mamífero que ha recibido los hibridomas.
El método de ADN recombinante es un enfoque que implica la clonación del ADN que codifica el anticuerpo de los hibridomas, los linfocitos B o similares, incorporando este ADN a un vector apropiado y transfiriendo este vector a las células hospedadoras (por ejemplo, una línea celular de mamífero, E. coli, células de levadura, células de insecto o células vegetales), seguido de la producción del anticuerpo de la presente invención como un anticuerpo recombinante (por ejemplo, P.J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY, P. Shepherd y C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, y Vandamme AM, et al., Eur. J. Biochem. 1990; 192: 767-775). Para la expresión del ADN que codifica el anticuerpo, el ADN que codifica la cadena pesada y el ADN que codifica la cadena ligera pueden incorporarse en vectores de expresión separados, que luego se pueden usar en la transformación de células hospedadoras, o el ADN que codifica la cadena pesada y el ADN que codifica la cadena ligera pueden incorporarse en un único vector de expresión, que luego se puede usar en la transformación de células hospedadoras (véase el documento WO94/11523). El anticuerpo se puede obtener en una forma sustancialmente pura y homogénea mediante el cultivo de las células hospedadoras y mediante la separación y/o purificación del anticuerpo del interior o la solución de cultivo de las células hospedadoras. La separación y/o purificación del anticuerpo puede emplear un método para su uso en la purificación de polipéptidos habitual. Si un animal transgénico (por ejemplo, ganado vacuno, cabra, oveja o cerdo) que alberga el gen del anticuerpo se prepara mediante el uso de una técnica de preparación de animales transgénicos, el anticuerpo monoclonal procedente del gen del anticuerpo puede obtenerse en grandes cantidades de la leche del animal transgénico.
Sobre la base del anticuerpo así obtenido o el gen del mismo, un fragmento de anticuerpo funcional tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, sc(Fv)2, dsFv o diacuerpo, o un multímero del mismo (por ejemplo, un dímero, un trímero, un tetrámero o un polímero) se puede preparar.
En el caso de detectar directamente la cantidad del anticuerpo unido a la proteína CBP, el anticuerpo anti-CBP obtenido se usa directamente o después de ser marcado con, por ejemplo, una enzima, un radioisótopo, un tinte fluorescente o un sistema de avidina-biotina. Por otro lado, en el caso de llevar a cabo un método de detección indirecta para detectar la cantidad del anticuerpo unido a la proteína CBP usando un anticuerpo secundario o similar, el anticuerpo anti-CBP obtenido (anticuerpo primario) no tiene que estar marcado. Para esta detección, se puede usar una molécula marcada (por ejemplo, anticuerpo secundario o proteína A) que reconoce el anticuerpo.
El reactivo de la presente invención puede contener opcionalmente componentes adicionales aceptables para reactivos, tales como agua esterilizada, solución salina, un tampón y un conservante, de acuerdo con la necesidad, además de la molécula descrita anteriormente como principio activo.
<Método para la detección de compuestos para su uso en el tratamiento de cáncer>
La presente invención también proporciona un método para la detección de un compuesto para su uso en el tratamiento de cáncer que tiene supresión funcional de CBP, comprendiendo el método la etapa de seleccionar el compuesto mediante el uso de si inhibe o no p300 como índice.
Ejemplos del compuesto de prueba que se aplica al sistema de detección de la presente invención incluyen, pero sin limitarse particularmente a, bibliotecas de compuestos sintéticos de bajo peso molecular, productos de expresión de bibliotecas de genes, bibliotecas de péptidos, ARNip, anticuerpos, sustancias liberadas por bacterias, extractos y sobrenadantes de cultivo de células (microbios, células vegetales o células animales, polipéptidos purificados o parcialmente purificados, extractos procedentes de organismos marinos, vegetales o animales y bibliotecas aleatorias de presentación de péptidos de fago. El compuesto de prueba puede ser un derivado de un inhibidor de p300 (por ejemplo, un derivado de C646) conocido en la técnica.
En la presente invención, la "inhibición de p300" incluye tanto la inhibición de la actividad de p300 como la inhibición de la expresión de p300. Dado que la pérdida de la actividad de histona acetiltransferasa de p300 se considera que contribuye a la letalidad sintética de CBP y p300, la inhibición de p300 utilizada como índice de detección es preferentemente la inhibición de la actividad de histona acetiltransferasa de p300. Por ejemplo, un método de detección que utiliza un radioisótopo(Lau OD, et al., J. Biol. Chem. 2000; 275: 21953-21959), un método que implica la detección fluorescente de CoA-SH generada como subproductos durante la reacción de la histona acetiltransferasa (Gao T, et al., Methods Mol Biol. 2013; 981: 229-38), y un método de detección que usa NADH (Berndsen CE, Denu JM. Methods. 2005; 36: 321-331) se pueden usar para detectar la actividad de la histona acetiltransferasa.
En la detección, se puede permitir que el compuesto de prueba actúe en este sistema de detección, seguido de la detección de la actividad de la histona acetiltransferasa. Como resultado de la detección, cuando la actividad disminuye en comparación con la actividad de histona acetiltransferasa de p300 en un control (por ejemplo, sin la adición del compuesto de prueba), la actividad de p300 se puede evaluar como inhibida.
Como CBP y p300 están en una relación paráloga, el compuesto obtenido mediante detección es preferentemente más específico para p300 desde el punto de vista de la reducción de reacciones adversas, etc. Se puede evaluar si es específico o no para p300 mediante, por ejemplo, un experimento de unión o un experimento de inhibición de la actividad en cada molécula. Por consiguiente, la detección de la presente invención puede comprender la etapa de seleccionar el compuesto usando si es o no más específico para p300 como índice.
En el caso de detectar la inhibición de la expresión de p300, por ejemplo, se puede permitir que el compuesto de prueba actúe en células que expresan p300, seguido de la detección de la expresión de p300 a nivel transcripcional o nivel traduccional por el método descrito anteriormente. Alternativamente, se puede usar un sistema de ensayo informador basado en una construcción de expresión que contiene un gen informador unido cadena abajo de un promotor de p300. Como resultado de la detección, cuando la expresión disminuye en comparación con la expresión de p300 (o la expresión del informador como un sustituto del mismo en el sistema informador) en un control (por ejemplo, sin la adición del compuesto de prueba), la expresión de p300 se puede evaluar como inhibida.
El compuesto identificado por la detección de la presente invención se puede mezclar con un vehículo farmaceuticamente aceptable y formular mediante un método farmacéutico conocido en la técnica para preparar un producto farmacéutico. Ejemplos del vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen, pero sin limitación, agua esterilizada, solución salina, aceites vegetales, disolventes, bases, emulsionantes, agentes de suspensión, tensioactivos, estabilizantes, agentes aromatizantes, fragancias, excipientes, vehículos, antisépticos, aglutinantes, diluyentes, agentes de tonicidad, agentes calmantes, expansores, disgregantes, tampones, agentes de recubrimiento, lubricantes, colorantes, edulcorantes, espesantes, correctores, solubilizantes y otros aditivos.
[Ejemplos]
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no pretende limitarse a estos Ejemplos.
[Ejemplo 1] Desarrollo de una estrategia terapéutica basada en la letalidad sintética del cáncer con mutación de CBP
1. Material y método
(1) Línea celular
A549, H1299, H157, SQ5, H1703, LK2, H520 (NSCLC), RL, Loucy, RC-K8, U2932, Ramos, Farage, SUP-T1, WSU-NHL, VAL, SUDHL5, Jurkat, TE8 y TE10 se cultivaron por separado en RPMI-1640 o DMEM complementado con suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en inglés) al 10 %. Las células MRC-5 (fibroblastos normales), las células HEK293T (células epiteliales renales inmortalizadas) y las células RPE-1 (células epiteliales retinianas inmortalizadas) se cultivaron por separado en DMEM complementado con FBS al 10 %.
(2) ARN de interferencia pequeño (ARNip)
Se usó ON-TARGET plus SMARTpool siRNA (GE Healthcare Dharmacon Inc.) en la atenuación génica de varias proteínas. Se usó lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen Corp.) en la transfección. Se usó ARNip no dirigido (L-001810-10) como control negativo.3
(3) Análisis de inmunotransferencia
La inmunotransferencia se realizó como se describe en la bibliografía (Ogiwara H, et al., Oncogene 2011; 5; 30:2135-46) usando anticuerpos específicos para las siguientes proteínas: CBP (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; sc-369X), p300 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; sc-48343X), H3 (Motivo activo; 39163), H3K18ac (Millipore Corp.; 07­ 354), p-actina (Cell Signaling Technology, Inc.; 4970), PARP escindida (Cell Signaling Technology, Inc.; 5625), p21/CDKN1A (Cell Signaling Technology, Inc.; 2947), y LC3B (Cell Signaling Technology, Inc.; 3868).
(4) Ensayo de supervivencia celular
El efecto de la atenuación génica del ARNip sobre la supervivencia de las células cancerosas se evaluó mediante el ensayo de supervivencia clonogénica. Cada línea celular de cáncer se transfectó con ARNip (50 nM) usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Corp.). Dos días después, las células se tripsinizaron, se contaron, se volvieron a sembrar en cantidades especificadas en placas de cultivo de 6 pocillos y se cultivaron adicionalmente durante 12 días (o durante 14 días para atenuar varios HAT) para permitir la formación de colonias. Luego se fijaron las células durante 5 minutos en una solución que contenía metanol al 50 % (v/v)/Crystal Violet al 0,01 % (p/v), y se contó el número de colonias.
La viabilidad se determinó mediante el examen del nivel de ATP intracelular usando el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega Corp.). Cada línea celular de cáncer se transfectó con ARNip (50 nM) usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Corp.). Dos días después, las células se tripsinizaron, se contaron y se volvieron a sembrar en cantidades especificadas en una placa de 96 pocillos. Para medir la viabilidad celular, se añadió a las células el kit de ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega Corp.), y se midió la fluorescencia usando Envision (PerkinElmer, Inc.).
(5) Análisis del ciclo celular
Las células se tripsinizaron, se centrifugaron, se lavaron con PBS y se fijaron en etanol helado al 70 %. Luego, las células se centrifugaron nuevamente y se incubaron en PBS que contenía 200 pg/ml de RNasa A y 5 pg/ml de yoduro de propidio. La distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo Guava (Millipore Corp.). (6) Análisis de apoptosis mediante tinción con anexina V/PI
Para detectar células apoptóticas por citometría de flujo, se utilizó el kit de detección de apoptosis Anexina V-FITC/PI (F. Hoffmann-La Roche, Ltd.) de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante. En resumen, el sedimento celular se suspendió en un tampón de unión 1x y se incubó con anexina V-FITC y PI durante 20 minutos en oscuridad. Posteriormente, la fluorescencia de las células se analizó mediante citometría de flujo.
(7) Producción de ARNhc de lentivirus
Para preparar líneas celulares inducibles por tet, cada línea celular se transdujo con pTRIPZ procedente de un vector de lentivirus que expresa ARNhc (Open Biosystems). Las células 293T se transfectaron conjuntamente con plásmidos que codifican ARNhc y plásmidos de empaquetamiento usando el sistema de empaquetamiento Trans-Lentiviral(TM) (Open Biosystems). Al día siguiente, el medio se reemplazó con un nuevo medio de crecimiento, y el sobrenadante que contenía el lentivirus se recuperó y se concentró mediante centrifugación.
(8) Análisis in vivo
Se contaron los números de líneas celulares inducibles con tet, células LK2-shp300 y células LK2-shNT (2 x 106 células/ratón en Matrigel al 50 %; BD Biosciences), y las células de cada línea se resuspendieron en una mezcla 1:1 de un medio y Matrigel (BD Biosciences) en hielo. Las células se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones BALB/c-nu/nu hembra de 7 semanas de edad (CLEA Japan, Inc.) utilizando un protocolo aprobado por el Ethical Committee on Animal Experiments at the National Cancer Center (Comité Ético de Experimentos con Animales en el Centro Nacional del Cáncer). Tres semanas más tarde, cuando el tamaño del tumor alcanzó 200 mm3 o más, los ratones se dividieron aleatoriamente en 2 grupos y se los alimentó con una dieta que contenía doxiciclina (200 ppm) o una dieta de control. El crecimiento tumoral se midió dos veces por semana usando un calibrador. El volumen del tumor trasplantado se calculó cada 3 a 4 días usando un calibrador de acuerdo con la siguiente fórmula: V=Lx W2/2 en donde V representa el volumen (mm3), L representa el diámetro más grande (mm) y W representa el diámetro más pequeño (mm). Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados de acuerdo con los protocolos estándar.
(9) Análisis estadístico
Todas los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos se expresan como la media ± DE. Las diferencias entre las células tratadas con fármacos y las células no tratadas se evaluaron mediante la prueba t de Student. Las diferencias estadísticamente significativas se indican mediante asteriscos ("*", P < 0,05; P < 0,01; "***", P < 0,001; "****", P <0,0001).
2. Resultados
(1) Crecimiento dependiente de p300 de células cancerosas con CBP mutado
Se comparó el efecto del agotamiento de p300 mediado por ARNip sobre el crecimiento de líneas celulares de cáncer con CBP competente y CBP mutado, usando un ensayo de crecimiento celular y un ensayo de supervivencia clonogénica (Figuras 1A a 1C). Como resultado, se analizó la supresión del crecimiento celular y la formación de colonias en todas las células con CBP mutado, pero no en las líneas celulares con CBP competente.
La atenuación génica de p300 no afectó el crecimiento de la línea de fibroblastos no cancerosos MRC5, la línea celular epitelial renal inmortalizada HEK293T y las células epiteliales retinianas inmortalizadas RPE-1 que expresan CBP y p300 (Figura 2).
Estos resultados sugirieron que las células cancerosas con CBP mutado dependen de p300 para su crecimiento. (2) Sensibilidad del linfoma y el cáncer de pulmón con CBP mutado al inhibidor de p300 C646
Luego se examinó la influencia de un inhibidor de p300 C646 en células de cáncer de pulmón y células de linfoma con CBP mutado. Como resultado, se observó una mayor sensibilidad de las células cancerosas con CBP mutado a C646 que la de las células cancerosas con CBP competente (Figuras 3A y 3C). El valor de CI50 para C646 en células cancerosas con CBP mutado tiene una baja tendencia en relación con las células cancerosas con CBP competente (prueba t de Student, p < 0,01) (Figuras 3B y 3D). Estos resultados sugirieron que la inhibición de la actividad de la histona acetiltransferasa de p300 causa específicamente un efecto letal en las células cancerosas con CBP mutado.
(3) Inducción de apoptosis por agotamiento de p300 en células cancerosas con CBP mutado
Luego se examinó el mecanismo subyacente a la inhibición mediante el agotamiento o inhibición de p300 en células cancerosas con CBP mutado. El agotamiento de p300 mediado por ARNip en células H1703 con CBP mutado aumentó la cantidad de PARP escindido (biomarcador de apoptosis), pero no aumentó la cantidad de p21/CDKN1A (biomarcador de senescencia celular) o LC3B (biomarcador de autofagia) (Figura 4). De acuerdo con esto, mediante el análisis de citometría de flujo de células teñidas con anexina V, se confirmó que el agotamiento de p300 mediante ARNip aumenta el porcentaje de células apoptóticas positivas para anexina V en células H1703 y células LK2 con CBP mutado, pero no aumenta el porcentaje de células apoptóticas positivas para anexina V en células H157 y células SQ5 con CBP competente (Figura 5A).
En consideración de los resultados del uso del inhibidor de p300 C646 descrito anteriormente (Figura 5B), estos resultados sugieren que el agotamiento o inhibición de p300 específicamente suprime el crecimiento de células cancerosas con CBP mutado mediante la inducción de la apoptosis.
(4) Crecimiento in vivo dependiente de p300 de células cancerosas con CBP mutado
Las células LK2 con CBP mutado se usaron como modelos de validación preclínica in vivo. Las células que expresan ARNhc o shp300 no dirigidas se prepararon usando un sistema de expresión de ARNhc inducible por tetraciclina y se trasplantaron subcutáneamente a ratones desnudos. Después de que el tamaño del tumor trasplantado alcanzara 200 mm3 o más, se administró doxiciclina a los ratones para inducir ARNi. El crecimiento tumoral se midió con el tiempo. Como se muestra en la Figura 6, el crecimiento del xenoinjerto LK2 shp300 se suprimió significativamente en los ratones tratados con Dox, mientras que el crecimiento del xenoinjerto lK2 shNT no se suprimió significativamente. Esto apoya la relación de letalidad sintética entre CBP y p300 encontrada in vivo. (5) Influencia de la atenuación génica de varios HAT en la tasa de supervivencia celular
Se observó la influencia de la atenuación génica de varios HAT en las células A549 (CBP competente) y las células H520 (CBP mutado) en sus tasas de supervivencia celular. La influencia de la atenuación génica de varios HAT en la tasa de supervivencia celular no se observó en las células A549, mientras que se confirmó que la atenuación génica de p300 en las células H520 reduce significativamente la tasa de supervivencia celular (Figura 8).
(6) Influencia de la atenuación génica de p300 en la expresión de c-Myc
Se observó un cambio en la expresión de la proteína c-Myc causada por la atenuación génica de p300 en varias células.
No se observó cambio en la expresión de la proteína c-Myc por la atenuación génica de p300 en las células H1299, células SQ5 y H157 con CBP competente, mientras que se confirmó que la atenuación génica de p300 disminuía significativamente la expresión de la proteína c-Myc en células LK2, células H1703, células H520, células TE8 y células TE10 con CBP mutado, y células H1299 con CBP inactivado (Figura 9).

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de una mutación inactivadora en CBP contenida en la muestra biológica y determinar al paciente con la mutación inactivadora en CBP detectada como sensible al tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300, en donde la mutación inactivadora es una eliminación homocigota de CBP, una mutación sin sentido de CBP, o una de las mutaciones Asn83Thr, Ser893Leu, Arg1446Cys, Trp1472Cys, Asn2175Ser, Glu1835Stop, Asn2111Ser, Leu551lle, Gly1411Glu o Ala2044Gly.
2. Un método para seleccionar un paciente con cáncer candidato para el tratamiento del cáncer con un compuesto que inhibe p300, que comprende usar una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, detectar la presencia o ausencia de una mutación inactivadora en CBP en la muestra biológica y seleccionar un paciente con la mutación inactivadora en CBP detectada como paciente con cáncer candidato al tratamiento del cáncer con el compuesto que inhibe p300, en donde la mutación inactivadora es una eliminación homocigota de CBP, una mutación sin sentido de CBP, o una de las mutaciones Asn83Thr, Ser893Leu, Arg1446Cys, Trp1472Cys, Asn2175Ser, Glu1835Stop, Asn2111Ser, Leu551lle, Gly1411Glu o Ala2044Gly.
3. Un compuesto que inhibe p300 para su uso en un método para tratar el cáncer que tiene una mutación inactivadora en CBP, en donde la presencia o ausencia de una mutación inactivadora en CBP se detecta en una muestra biológica procedente de un paciente con cáncer, y el compuesto que inhibe p300 se administra al paciente con la mutación inactivadora en CBP detectada, en donde la mutación es una eliminación homocigota de CBP, una mutación sin sentido de CBP, o una de las mutaciones Asn83Thr, Ser893Leu, Arg1446Cys, Trp1472Cys, Asn2175Ser, Glu1835Stop, Asn2111Ser, Leu551lle, Gly1411Glu o Ala2044Gly.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la detección de la presencia o ausencia de una mutación inactivadora en CBP contenida en la muestra biológica comprende poner en contacto la muestra biológica con un reactivo que comprende cualquiera de las siguientes moléculas (a) a (c) como un principio activo:
(a) un cebador oligonucleotídico que se une específicamente al gen CBP,
(b) una sonda oligonucleotídica que se une específicamente al gen CBP, y
(c) un anticuerpo que se une específicamente a la proteína CBP.
5. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la detección de la presencia o ausencia de una mutación inactivadora en CBP contenida en la muestra biológica comprende poner en contacto la muestra biológica con un reactivo que comprende cualquiera de las siguientes moléculas (a) a (c) como un principio activo: (a) un cebador oligonucleotídico que se une específicamente al gen CBP,
(b) una sonda oligonucleotídica que se une específicamente al gen CBP, y
(c) un anticuerpo que se une específicamente a la proteína CBP.
6. Un método para la detección de un compuesto para el tratamiento del cáncer que tiene una mutación inactivadora en CBP, comprendiendo el método seleccionar un compuesto que inhibe p300, en donde la mutación es una eliminación homocigota de CBP, una mutación sin sentido de CBP, o una de las mutaciones Asn83Thr, Ser893Leu, Arg1446Cys, Trp1472Cys, Asn2175Ser, Glu1835Stop, Asn2111Ser, Leu551lle, Gly1411Glu o Ala2044Gly.
7. Un agente terapéutico para su uso en un método de tratamiento del cáncer en el que se ha detectado una mutación inactivadora en CBP, que comprende un compuesto que inhibe p300, en donde la mutación es una eliminación homocigota de CBP, una mutación sin sentido de CBP, o una de las mutaciones Asn83Thr, Ser893Leu, Arg1446Cys, Trp1472Cys, Asn2175Ser, Glu1835Stop, Asn2111Ser, Leu551lle, Gly1411Glu o Ala2044Gly.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 6, en donde el cáncer que tiene una mutación inactivadora en CBP es cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, linfoma o adenocarcinoma quístico.
9. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 5, en donde el cáncer que tiene una mutación inactivadora en CBP es cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, linfoma o adenocarcinoma quístico.
10. El agente terapéutico para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el cáncer que tiene una mutación inactivadora en c Bp es cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, linfoma o adenocarcinoma quístico.
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