JP6588006B2 - p300を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を予測する方法 - Google Patents
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Description
(a)CBP遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー
(b)CBP遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ
(c)CBPタンパク質に特異的に結合する抗体
(5)CBPの機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であって、p300を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程を含む方法。
本発明において、腫瘍、悪性腫瘍、がん、悪性新生物、がん腫、肉腫等を総称して、「腫瘍」または「がん」と表現する。本発明において、CBPとp300ががん細胞において合成致死の関係にあり、CBPの機能抑制が生じているがん細胞において、p300を阻害すると、当該がん細胞の増殖を抑制しうることが見出された。この知見に基づけば、CBPの機能抑制を指標として、p300を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を評価することができる。従って、本発明は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるCBPの機能抑制の有無を検出し、CBPの機能抑制が検出された患者を、p300を阻害する化合物によるがんの治療への応答性があると判定することを含む、p300を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を予測する方法を提供する。
本発明において「変異を検出する」とは、原則として、ゲノムDNA上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムDNA上の変異が転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映される場合には、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること(即ち、間接的な検出)をも含む意味である。
本発明における「CBPの発現低下」とは、通常、対照(例えば、健常者や同一患者の非がん組織における発現レベル)との比較において、それよりも発現レベルが低いことを意味する。
遺伝子の発現低下は、プロモーターの過剰メチル化が要因の一つであることが当該技術分野で公知である。従って、CBPの機能抑制の有無の検出においては、CBP遺伝子プロモーターのメチル化を指標として検出することも考えられる。プロモーターのメチル化の検出には、例えば、メチル化されたシトシンをウラシルに変換する活性を有するバイサルファイト処理後の塩基配列の変化を塩基配列決定により直接的に検出する方法や、バイサルファイト処理前の塩基配列は認識できる(切断できる)がバイサルファイト処理後の塩基配列は認識できない(切断できない)制限エンドヌクレアーゼを利用して間接的に検出する方法などの公知の方法を利用することができる。
また、本発明は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるCBPの機能抑制の有無を検出し、CBPの機能抑制が検出された患者に対し、p300を阻害する化合物を投与することを含む、CBPの機能抑制が生じているがんの治療方法を提供する。
また、本発明は、上記の方法において、CBPの機能抑制の有無を検出するための試薬であって、下記の(a)〜(c)のいずれかに記載の分子を有効成分とする試薬を提供する。
(a)CBP遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー
(b)CBP遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ
(c)CBPタンパク質に特異的に結合する抗体
上記ポリヌクレオチドプライマーは、CBPゲノムDNAやcDNAの塩基配列情報(例えば、配列番号:1や2)に基づき、上記した手法や増幅する領域に即したプライマーとなるように、また、CBP遺伝子以外の遺伝子の増幅産物が極力生じないように設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドプライマー設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、通常15〜50塩基長、好ましくは15〜30塩基長であるが、手法および目的によってはこれより長くてもよい。
また、本発明は、CBPの機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であって、p300を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程を含む方法を提供する。
1.材料および方法
(1)細胞株
A549、H1299、H157、SQ5、H1703、LK2、およびH520(NSCLC)、RL、Loucy、RC−K8、U2932、Ramos、Farage、SUP−T1、WSU−NHL、VAL、SUDHL5、Jurkat、TE8、TE10を10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI−1640またはDMEM中で培養した。MRC−5細胞(正常線維芽細胞)、HEK293T細胞(不死化腎上皮細胞)、RPE−1細胞(不死化網膜上皮細胞)を10% FBSを添加したDMEM中で培養した。
各種タンパク質のノックダウンには、ON−TARGET plus SMARTpool siRNA(Dharmacon社)を用いた。トランスフェクションにはLipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社)を用いた。非標的化siRNA(L−001810−10)を陰性対照として用いた。
以下のタンパク質に対して特異的な抗体を用いて、文献(Ogiwara H, et al. Oncogene 2011;5;30:2135−46)に記載されたように、イムノブロッティングを実施した。CBP(Santacruz社;sc−369X)、p300(Santacruz社;sc−48343X)、H3(Active motif社;39163)、H3K18ac(Millipore社;07−354)、β−actin(Cell signaling Technologies社;4970)、cleaved PARP(Cell signaling Technologies社;5625)、p21/CDKN1A(Cell Signaling Technologies社;2947)、LC3B(Cell Signaling Technologies社;3868)。
がん細胞の生存に及ぼすsiRNAノックダウンの影響を、クロノゲニック生存アッセイ(clonogenic survival assays)を用いて評価した。Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社)を用いてがん細胞株にsiRNAs(50nM)をトランスフェクションした。2日後に細胞をトリプシン処理し、カウントし、6ウェルの培養皿に特定の数で再度播種し、さらに12日間(各種HATのノックダウンにおいては14日間)培養してコロニーを形成させた。次いで、細胞を50%(v/v)メタノール/0.01%(w/v)クリスタルバイオレットを含む溶液中で5分間固定しコロニー数をカウントした。
生存率の評価は、CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assay kit(Promega社)を使用して、細胞内ATPレベルを測定することによって決定した。Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen社)を用いてがん細胞株にsiRNAs(50nM)をトランスフェクションした。2日後に細胞をトリプシン処理し、カウントし、96ウェルプレートに特定の数で再度播種した。細胞の生存率を測定するために、CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assay kit(Promega社)を細胞に添加し、Envision(PerkinElmer社)で蛍光を測定した。
細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、PBSで洗浄して、氷冷した70%エタノールで固定化した。次いで、細胞を再度遠心分離し、200μg/mlのRNアーゼAおよび5μg/mlのヨウ化プロピジウムを含有するPBSでインキュベートして、Guava flow cytometry(Millipore社)で細胞周期分布を分析した。
フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞を検出するために、Annexin V−FITC/PI apoptosis detection kit(Roche社)をメーカーの使用説明書に従って用いた。すなわち、細胞ペレットを1×binding buffer中に懸濁し、暗中で20分間Annexin V−FITCおよびPIとインキュベートした。次いで、細胞の蛍光をフローサイトメトリーで分析した。
tet誘導性細胞株を作製するために、細胞株にshRNA発現レンチウイルスベクター由来のpTRIPZ(Open Biosystems社)をトランスダクションした。shRNAをコードするプラスミドをTrans−LentiviralTM Packaging System(Open Biosystems社)を用いてパッケージングプラスミドとともに293T細胞にトランスフェクションした。翌日に増殖培地を交換し、レンチウイルスを含む上清を回収し、遠心分離により濃縮した。
tet誘導性の細胞株であるLK2−shp300細胞およびLK2−shNT細胞(50% Matrigel中で2×106細胞/マウス;BD Biosciences社)をカウントし、氷上で1:1の培地/Matrigel(BD Bioscience社)で再懸濁し、国立がん研究センターの実験動物に関する倫理委員会によって承認されたプロトコールで、7週齢の雌BALB/c−nu/nuマウス(CLEA Japan社)の脇腹の皮下に注入した。3週間後、腫瘍が200mm3以上の大きさに到達したとき、マウスを無作為に2群に分け、doxycycline(200 ppm)を含有する餌または対照餌のいずれかを与えた。腫瘍の成長を、ノギスを使用して1週間に2回測定した。移植した腫瘍の体積は、ノギスを使用して3〜4日毎に、次の式で計算した。式:V=L×W2/2(Vは体積(mm3)、Lは最大直径(mm)、Wは最小直径(mm))。実験の最後に、標準的なプロトコールに従って、マウスを屠殺した。
全ての実験を三重実験で行った。データは、平均±SDで示した。薬剤処理した細胞と非処理の細胞との差は、スチューデントのt検定で評価し、統計的有意差をアスタリスクで示した(「*」はP<0.05を、「**」はP<0.01を、「***」はP<0.001を、「****」はP<0.0001をそれぞれ示す)。
(1)CBP変異型がん細胞のp300依存性増殖
我々は、細胞増殖アッセイおよびクロノゲニック生存アッセイを用いて、siRNAを介したp300消失が、CBP野生型がん細胞株およびCBP変異型がん細胞株の増殖に与える影響を比較した(図1A〜C)。その結果、検証した全てのCBP変異型細胞において細胞増殖とコロニー形成の抑制が観察されたが、これはCBP野生型細胞株では観察されなかった。
我々は、次に、CBP変異型の肺がん細胞およびリンパ腫細胞に対するp300阻害剤C646の影響を検証した。その結果、CBP変異型がん細胞がCBP野生型がん細胞よりもC646に対して高い感受性を有することを観察した(図3A,C)。C646のCBP変異型がん細胞に対するIC50値は、CBP野生型がん細胞に対するIC50値と比較して低い傾向にあった(スチューデントのt検定でp<0.01)(図3B,D)。これらの結果は、p300のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性の阻害が、CBP変異型がん細胞の致死効果を特異的に引き起こすことを示唆した。
我々は、次に、p300の消失や阻害によるCBP変異型がん細胞の増殖阻害のメカニズムについて検証した。CBP変異型H1703細胞におけるsiRNAを介したp300消失は、分解されたPARP(アポトーシスのバイオマーカー)の量を増加させたが、p21/CDKN1A(細胞老化のバイオマーカー)やLC3B(オートファジーのバイオマーカー)の量は増加させなかった(図4)。これと一致して、アネキシンVで染色した細胞のフローサイトメトリー分析により、siRNAによるp300の消失が、CBP変異型のH1703細胞およびLK2細胞において、アネキシンV陽性アポトーシス細胞の割合を増加させるが、CBP野生型のH157細胞やSQ5細胞では増加させないことが確認された(図5A)。
in vivo前臨床バリデーションモデルとして、CBP変異型LK2細胞を用いて、テトラサイクリン誘導shRNA発現システムにより、非標的化shRNAあるいはshp300を発現する細胞を作製し、ヌードマウスの皮下に移植した。移植腫瘍が200mm3以上の大きさになった後、RNAiを誘導するために、マウスにdoxycyclineを投与し、経時的に腫瘍の増殖を測定した。図6に示すように、LK2 shp300異種移殖片の増殖は、Dox処理したマウスで有意に抑制されたが、LK2 shNT異種移殖片では有意に抑制されなかった。このことは、in vivoにおけるCBPとp300との合成致死の関係を裏付けるものである。
A549細胞(CBPは野生型)およびH520細胞(CBPは変異型)における各種HATのノックダウンによる細胞生存率へ影響を観察した。A549細胞においては各種HATのノックダウンにより細胞生存率への影響は見られなかったが、H520細胞においてはp300のノックダウンにより有意な細胞生存率低下が確認された(図8)。
各種細胞におけるp300ノックダウン時のc−Mycタンパク質発現の変化を観察した。
Claims (6)
- がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるCBPの機能抑制の有無を検出し、CBPの機能抑制が検出された患者を、p300を阻害する化合物によるがんの治療への応答性があると判定することを含む、p300を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を予測する方法。
- がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるCBPの機能抑制の有無を検出し、CBPの機能抑制が検出された患者を、p300を阻害する化合物によるがんの治療の対象として選別することを含む、p300を阻害する化合物によるがんの治療の対象を選別する方法。
- 生物学的試料中におけるCBPの機能抑制の有無を、下記の(a)〜(c)のいずれかに記載の分子を有効成分とする試薬により検出する、請求項1または2に記載の方法。
(a)CBP遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー
(b)CBP遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ
(c)CBPタンパク質に特異的に結合する抗体 - がんが、肺がん、膀胱がん、リンパ腫、および腺様嚢胞がんからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- p300を阻害する化合物を含む、CBPの機能抑制が検出されたがんの治療剤。
- がんが、肺がん、膀胱がん、リンパ腫、および腺様嚢胞がんからなる群より選択される、請求項5に記載の治療剤。
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