DE102013221452B3

DE102013221452B3 - Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit und/oder Spezifität eines Wirkstoffs

Info

Publication number: DE102013221452B3
Application number: DE201310221452
Authority: DE
Inventors: Lan Kluwe
Original assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Current assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2015-02-26
Anticipated expiration: 2033-10-23
Also published as: WO2015059156A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Spezifität und/oder der Wirksamkeit eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs in einer Mischkultur, die Zielzellen und Nicht-Zielzellen umfasst. Das Verfahren umfasst Schritte, bei denen man die Mischkulturen mit dem Wirkstoff inkubiert und anschließend das quantitative Verhältnis der Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen bestimmt und das ermittelte Verhältnis mit einem Referenzwert vergleicht, der in einer entsprechenden Mischkultur bestimmt wurde, die nicht mit dem Wirkstoff inkubiert oder mit einer anderen Konzentration des Wirkstoffs inkubiert wurde. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs, bei dem man verschiedene Substanzen in einem Screening auf eine Wirksamkeit gegen die Zielzellen untersucht, und Substanzen, für die eine Wirksamkeit gegen die Zielzellen beobachtet werden konnte, mittels eines wie vorliegend beschriebenen Verfahrens auf ihre Spezifität und/oder Wirksamkeit gegen die Zielzellen untersucht.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Spezifität und/oder der Wirksamkeit eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs in einer Mischkultur, die Zielzellen und Nicht-Zielzellen umfasst. Das Verfahren umfasst Schritte, bei denen man die Mischkulturen mit dem Wirkstoff inkubiert und anschließend das quantitative Verhältnis der Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen bestimmt und das ermittelte Verhältnis mit einem Referenzwert vergleicht, der in einer entsprechenden Mischkultur bestimmt wurde, die nicht mit dem Wirkstoff inkubiert oder mit einer anderen Konzentration des Wirkstoffs inkubiert wurde. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs, bei dem man verschiedene Substanzen in einem Screening auf eine Wirksamkeit gegen die Zielzellen untersucht, und Substanzen, für die eine Wirksamkeit gegen die Zielzellen beobachtet werden konnte, mittels eines wie vorliegend beschriebenen Verfahrens auf ihre Spezifität und/oder Wirksamkeit gegen die Zielzellen untersucht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Für das Auffinden neuer pharmazeutisch aktiver Wirkstoffe spielen geeignete Screening-Verfahren eine Schlüsselrolle. In jüngerer Zeit haben sich dabei zellbasierte Screening-Assays als vorklinische Modelle durchgesetzt, da sie komplexere Zusammenhänge simulieren können, als die vormals zumeist verwendeten biochemischen Assays. Bei den meisten zellbasierten Screening-Assays werden etablierte Zelllinien, wie z.B. Tumorzelllinien, eingesetzt, weil diese in der Regel umfassend charakterisiert, einfach zu handhaben und in nahezu unbegrenztem Umfang verfügbar sind.
Allerdings können Zelllinien die tatsächliche Situation im zu behandelnden Patienten in der Regel nur schlecht widerspiegeln. So stammen Zelllinien regelmäßig von klinischen Proben eines einzelnen Patienten ab und weisen daher ein bestimmtes genetisches Muster und biologische Eigenschaften auf, das/die sich unter Umständen in anderen Patienten in dieser Form nicht auffinden lässt/lassen. Des Weiteren wurden viele etablierte Zelllinien bereits einer beträchtlichen Anzahl von Passagen unterworfen, was mit dem Risiko behaftet ist, dass die Zelllinien weitere genetische Veränderungen entwickeln, die nicht aus den ursprünglichen Zellen stammen, sondern durch die Passagen verursacht wurden.
Die daraus resultierende Problematik lässt sich anhand von Tumorzelllinien verdeutlichen, die gegenwärtig routinemäßig in Screening-Verfahren verwendet werden, um potentiell wirksame Krebstherapeutika zu identifizieren. Diese Zelllinien stammen aus Patientenproben und repräsentieren einen einzelnen Typ von Tumorzelle mit bestimmten genetischen und biologischen Eigenschaften. Tumore sind allerdings überwiegend heterogene Gewebestrukturen, die aus einer Vielzahl von verschiedenen Subpopulationen von Tumorzellen bestehen, wobei sich die verschiedenen Subpopulationen auf genetischer Ebene und hinsichtlich ihres biologischen Verhaltens erheblich voneinander unterscheiden können. Die heterogene Zusammensetzung eines Tumors, und insbesondere der Einfluss der verschiedenen Zellpopulationen des Tumors auf dessen weitere Entwicklung, werden in einem Assay, der etablierte Zelllinien verwendet, folglich nicht ausreichend berücksichtigt. Es besteht daher die Möglichkeit, dass ein Wirkstoff, der sich in einem auf Zelllinien basierenden Screening-Verfahren als hoch wirksam gegen eine bestimmte Art von Tumor erwiesen hat, bei verschiedenen Patienten, die unter eben einem solchen Tumor leiden, dennoch nahezu wirkungslos ist.
Folglich kann die Verwendung von Zelllinien beim Screening oder bei der Charakterisierung von potentiell neuen Wirkstoffen, abhängig von der jeweiligen Zielsetzung des Assays, mit erheblichen Nachteilen verbunden sein. Auf Grund fehlender Alternativen werden diese Nachteile allerdings gegenwärtig im Rahmen der Forschung und Entwicklung in Kauf genommen.
Ein weiteres Problem, dem man häufig auf dem Gebiet der Wirkstoffentwicklung von Krebstherapeutika begegnet, besteht darin, dass es für eine Vielzahl von Tumoren, insbesondere maligne Tumoren, bis heute nicht möglich ist, etablierte Tumorzelllinien zu erzeugen. In Fällen, in denen Zelllinien etabliert werden können, dauert dieser Vorgang in der Regel mehrere Monate. In dieser Zeit stehen die Zellen für Studien zur Wirksamkeit und/oder Spezifität nicht zur Verfügung, was insbesondere für das Gebiet der personalisierten Medizin nachteilig ist. Bei gutartigen Tumoren, zu denen z.B. vestibuläre Schwannome zählen, ist die Etablierung von Zelllinien und die Durchführung von Screening-Assays mit solchen etablierten Zelllinien grundsätzlich nicht möglich. Bei diesen Tumoren werden Wirksamkeitsstudien mit potentiellen Wirkstoffkandidaten ausschließlich mit Primärkulturen aus Patientenproben durchgeführt.
Bei Primärkulturen handelt es sich um Zellkulturen aus Zellen, die unmittelbar von einer Patientenprobe erhalten wurden. Zellmaterial einer klinischen Probe, die z.B. mittels Biopsie aus einem Patienten erhalten wurde, wird dabei in einem geeigneten Medium vermehrt und anschließend direkt in das Screening-Verfahren eingebracht. Die Zellen der Primärkultur bilden in vielerlei Hinsicht die Situation im zu behandelnden Patienten deutlich besser ab als Zelllinien. So umfassen Primärkulturen meist die verschiedenen, miteinander interagierenden Zellpopulationen. Ferner werden die Zellen hinsichtlich ihrer genetischen Ausstattung nicht durch unnötiges Passagieren verändert. Eine Primärkultur kann bereits nach wenigen Tagen der Kultivierung für ein Screening eingesetzt werden.
DE 697 37 684 T2 beschreibt ein Verfahren zur Beurteilung der Wirksamkeit eines chemotherapeutischen Wirkstoffs, bei dem ein Wirkstoff auf eine primäre Gewebekultur appliziert wird, und die Wirksamkeit durch anschließende Bewertung der Zelladhäsion und der Zellzahl bestimmt wird.
WO 2007/133551 A2 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Wirkstoffs gegen Tumorzellen, bei dem Gewebekulturen verwendet werden, die Menge von RNA gemessen wird, die mit Apoptose assoziiert ist, und diese mit einem Referenzwert verglichen wird.
Primärkulturen werden jedoch trotz dieser Vorteile gegenüber etablierten Zelllinien in der heutigen Forschung auf Grund einer Reihe von Nachteilen zurückhaltend eingesetzt. Neben der begrenzten Verfügbarkeit und der erforderlichen anspruchsvollen Aufarbeitung der Zellen sowie ihrer kurzen Lebensdauer stellt vor allen Dingen das Vorhandensein von verschiedenen Zelltypen in der Primärkultur ein erhebliches Problem dar, da einzelne Reaktionen in einem Assay nicht ohne Weiteres einer bestimmten Zielzelle zugeordnet werden können.
Dieses Problem ist insbesondere bei der zellbasierten Bestimmung der Aktivität eines therapeutischen Wirkstoffs von großer Bedeutung. Im Idealfall richtet sich ein pharmazeutisch aktiver Wirkstoff spezifisch gegen eine bestimmte Art von Zielzelle, z.B. eine bestimmte Art von Tumorzelle, während andere gesunde Zellen, z.B. solche im angrenzenden Gewebe, nicht vom Wirkstoff geschädigt werden. Die Spezifität eines Wirkstoffs ist im Rahmen der Entwicklung von neuen Therapeutika ein ebenso wichtiger Faktor wie die Wirksamkeit, da erst eine ausreichend hohe Spezifität gegen die Zielzellen eine Verwendung ohne schwerwiegende und risikoreiche Nebenwirkungen ermöglicht. Gegenwärtig gibt es kaum zellbasierte Verfahren zur Bestimmung der Spezifität eines Wirkstoffs. Die vereinzelt verfügbaren Assays für die Bestimmung der Spezifität sind aufwändig, materialintensiv und nur von beschränkter Aussagekraft. Ferner sind diese Assays für Primärkulturen, die regelmäßig mehrere verschiedene Zellarten umfassen, ungeeignet.
Einige Assays, die auf die Bestimmung der Spezifität eines Wirkstoffs gerichtet sind, ermitteln diese auf indirektem Wege, indem sie den Wirkmechanismus der applizierten Substanz untersuchen. Dabei wird z.B. ermittelt, ob ein Wirkstoff Einfluss auf bestimmte Signalübertragungswege hat. Diese Tests sind jedoch ebenfalls aufwändig und führen oft zu nicht eindeutigen Ergebnissen.
Demgegenüber stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur direkten und einfachen Bestimmung der Wirksamkeit und/oder Spezifität eines Wirkstoffs bereit, das zuverlässig und schnell mit Hilfe von Mischkulturen durchgeführt werden kann und darüber hinaus nur eine geringe Anzahl von Zellen benötigt. Das Verfahren ist somit insbesondere für die Analyse von Primärkulturen aus Patientenproben geeignet, selbst wenn diese Proben nur geringe Mengen an Zellen enthalten. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht darüber hinaus ein auf einen einzelnen Patienten zugeschnittenes Screening-Verfahren nach einem Wirkstoff, der eine hohe Wirksamkeit mit geringen Nebenwirkungen miteinander vereint. Darüber hinaus kann das Verfahren auch eingesetzt werden, um den Dosisbereich eines Wirkstoffs für einen einzelnen Patienten zu bestimmen, in dem der Wirkstoff eine optimale Wirksamkeit und/oder Spezifität zeigt. Damit sorgt das Verfahren für einen wichtigen Fortschritt auf dem Gebiet der personalisierten Medizin.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht unter anderem auf der Erkenntnis, dass Zielzellen und Nicht-Zielzellen in einer Mischkultur anhand spezifischer Merkmale oder Muster, vorzugsweise genetischer Merkmale oder Muster, bestimmt werden können. Ferner wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass Mischkulturen, die neben den Zielzellen, welche eine Erkrankung charakterisieren, z.B. Tumorzellen, auch Nicht-Zielzellen, wie z.B. gesunde Zellen aus einem Tumor oder aus dem umliegenden Gewebe eines Tumors des Patienten umfassen, in vorteilhafter Weise für die Bestimmung der Spezifität eines Wirkstoffs verwendet werden können, indem die in der Mischkultur vorhanden Nicht-Zielzellen als interne Referenz für die Wirkung des Wirkstoffs auf die in derselben Kultur vorhandenen Zielzellen und die damit verbundene Veränderung der Anzahl von Zielzellen genutzt werden.
Ferner ermöglicht die vorliegende Erfindung die Zuordnung der speziellen Wirkung eines Wirkstoffs (z.B. abtötend, proliferationshemmend oder proliferationsfördernd) zu den entsprechenden Zellen in einer Mischkultur. Die vorliegende Erfindung eröffnet daher neue Möglichkeiten für die Verwendung von Primärkulturen bei der Suche nach wirksamen und/oder spezifischen Wirkstoffen, die eine möglichst hohe Aktivität gegen Zielzellen, wie z.B. Tumorzellen zeigen, und gleichzeitig eine geringe Aktivität gegen die Nicht-Zielzellen des jeweiligen Patienten, der durch Verabreichung des Wirkstoffs behandelt wird, aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt einen wesentlichen Fortschritt auf dem Gebiet der Identifizierung neuer Wirkstoffe und der personalisierten Medizin bereit, da es mit Hilfe des Verfahrens möglich ist, eine Aussage darüber zu treffen, ob ein bestimmter Wirkstoff für die Behandlung einer Erkrankung eines bestimmten Patienten wirksam ist und eine ausreichend hohe Spezifität für die Zielzellen, die diese Erkrankung charakterisieren, aufweist. Dabei wird eine Mischkultur, die aus Zellen hergestellt wird, die aus dem zu behandelnden Patienten gewonnen wurden, mit einem oder mit mehreren Wirkstoffen inkubiert, wobei die relative Veränderung der Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen bestimmt wird. Ein Wirkstoff wird z.B. als geeignet für die Behandlung des Patienten angesehen, wenn pathologisch vermehrte Zielzellen an einer weiteren Vermehrung gehindert oder sogar abgetötet werden, während gleichzeitig die Nicht-Zielzellen nicht oder nur in geringerem Ausmaß an einer Vermehrung gehindert oder abgetötet werden. Das Verfahren eignet sich somit insbesondere zur Identifizierung von Wirkstoffen, die gegen Tumorerkrankungen wirksam sind.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, innerhalb kurzer Zeit aus mehreren für die Behandlung eines bestimmten Patienten in Frage kommenden Wirkstoffen denjenigen auszuwählen, der in Bezug auf die aus dem Patienten gewonnenen Zielzellen eine optimale Wirksamkeit und/oder Spezifität zeigt. Da die Spezifität eines Wirkstoffs auch von der jeweiligen Dosis abhängen kann, die dem Patienten appliziert wird, stellt die Erfindung ferner ein Verfahren bereit, bei dem die Spezifität des Wirkstoffs für die Zielzellen des Patienten in vitro gemäß dem nachstehenden Verfahren in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen des Wirkstoffs bestimmt wird.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung somit ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit und/oder Spezifität von mindestens einem gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoff bereit, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man

(a) eine Mischkultur, die Zielzellen und Nicht-Zielzellen umfasst, mit dem Wirkstoff inkubiert,
(b) nach der Inkubation das quantitative Verhältnis der Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen in der Mischkultur bestimmt,
(c) das ermittelte Verhältnis mit einem Referenzwert vergleicht, der in einer Mischkultur bestimmt wurde, die nicht mit dem Wirkstoff inkubiert oder mit einer anderen Konzentration inkubiert wurde.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit einer Mischkultur durchgeführt, d.h. mit einer Zellkultur, die mindestens zwei verschiedene Zellarten umfasst, welche vorliegend als Zielzellen und Nicht-Zielzellen bezeichnet werden. Als Zielzellen werden dabei solche Zellen verstanden, die mit Hilfe des Wirkstoffs in ihrer physiologischen Aktivität und/oder ihrer Vermehrung moduliert werden sollen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Zielzellen um solche Zellen, die abgetötet oder an einer Vermehrung gehindert werden sollen, da das Vorliegen oder die Vermehrung dieser Zellen für den Patienten mit gesundheitlichen Einschränkungen verbunden ist. Die Zielzellen sind vorzugsweise solche Zellen, deren Vorliegen oder Vermehrung für eine bestimmte Erkrankung charakteristisch ist.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei den Zielzellen um maligne oder benigne Tumorzellen, die möglichst spezifisch abgetötet werden sollen oder deren weitere Vermehrung im Gewebe des Patienten verhindert werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zellen um neoplastische Zellen, die aus einem malignen soliden Tumor erhalten wurden. Bei dem soliden Tumor kann es sich grundsätzlich um jede Art von Tumor handeln, bei dem mittels üblicher operativer Verfahren, z.B. durch Biopsie, eine Gewebeprobe entnommen werden kann, die im folgenden zur Herstellung einer Primärkultur verwendet werden kann. Insbesondere kann es sich bei dem soliden Tumor, aus dem die Zielzellen stammen, um einen Tumor handeln, der in Dickdarm, Dünndarm, Mastdarm, Zwölffingerdarm, Magen, Bauchspeicheldrüse, Leber, Gallenblase, Lunge, Gehirn, Ösophagus, Niere, Brust, Schilddrüse, Eierstöcken, Gebärmutterhals, Hoden, Haut und ähnlichen Organen vorgefunden wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die in Schritt (a) des Verfahrens verwendete Mischkultur eine von einem Patienten gewonnene Primärkultur eines Tumors.
In einer noch weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den Zielzellen um eine Subpopulation von Tumorzellen eines malignen Tumors, die gezielt spezifisch abgetötet werden sollen oder deren weitere Vermehrung im Patienten verhindert werden soll. Bei der Subpopulation kann es sich um eine Subpopulation von Tumorzellen handeln, die ein mutiertes KRAS aufweisen. Es wird vermutet, dass mutiertes KRAS für die Resistenz gegen eine Anti-EGFR-Therapie verantwortlich ist (Misale et al. (2012), Nature 486:532–6, und Diaz et al. (2012), Nature 486: 537–40).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann darüber hinaus auch mit gutartigen Tumoren durchgeführt werden, wie z.B. mit vestibulären Schwannomen, z.B. mit Neurofibromatose Typ 2 (NF2) assoziierten Schwannomen, Meningeomen, kutanen Schwannomen, NF1 assoziierten Neurofibroma-Tumoren, und ähnlichen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist aber auch bei Erkrankungen anwendbar, bei denen ein Wirkstoff gesucht wird, der zu einer gezielten Vermehrung von Zielzellen führt, die im Zuge der Erkrankung in pathologisch geringer Zahl vorliegen. In diesem Fall sollte der zu identifizierende Wirkstoff spezifisch zu einer Vermehrung von Zielzellen führen, während die Nicht-Zielzellen, z.B. andere somatische Zellen nicht oder im geringeren Ausmaß zu einer Teilung und Vermehrung angeregt werden sollten.
Bei den Nicht-Zielzellen handelt es sich vorzugsweise um solche Zellen, die in dem Gewebe vorkommen, aus dem die Zielzellen isoliert wurden, wobei sich die Nicht-Zielzellen von den Zielzellen dadurch unterscheiden, dass sie nicht die für die jeweilige Erkrankung charakteristischen Eigenschaften der Zielzellen zeigen. Es wird sich in der Regel bei den Nicht-Zielzellen um gesunde somatische Zellen des Patienten handeln, aus dem die Zielzellen stammen. Sind die Zielzellen Tumorzellen, so handelt es sich bei den Nicht-Zielzellen vorzugsweise nicht um Tumorzellen. Es kann sich bei den Nicht-Zielzellen um gesunde Zellen handeln, die in dem Gewebe des Patienten, aus dem die Zielzellen isoliert werden, üblicherweise vorkommen. Gesunde Zellen sind Zellen, die keine offensichtlichen pathologischen Veränderungen zeigen. Handelt es sich z.B. bei den Zielzellen um Tumorzellen eines Kolonkarzinoms, so können als Nicht-Zielzellen gesunde, nicht entartete Zellen aus dem Kolon, wie z.B. Fibroblasten des Bindegewebes verwendet werden. Handelt es sich bei den Zielzellen um Tumorzellen eines Schilddrüsenkarzinoms, so können die Nicht-Zielzellen gesunde Follikelepithelzellen der Schilddrüse sein. Nicht-Zielzellen können auch von anderen Regionen desselben Patienten gewonnen werden, z.B. durch Biopsie. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden als Nicht-Zielzelle solche Zellen verwendet, die bei einer Therapie des Patienten besonders verschont bleiben sollen, z.B. Spermatogonien. Diese Zellen können mit den Zielzellen zusammengegeben werden, um die gewünschte Mischkultur herzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zielzellen um Zellen eines vestibulären Schwannoms, während die Nicht-Zielzellen Fibroblasten oder Leukozyten sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zielzellen um Zellen eines soliden Tumors, während die Nicht-Zielzellen Leukozyten aus dem peripheren Blut sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammen die Tumorzellen und die Leukozyten aus demselben Patienten.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung dient der Bestimmung der Wirksamkeit und/oder der Spezifität von mindestens einem gegen die Zielzellen gerichteten Wirkstoff. Ein Wirkstoff im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Substanz, die in einem Organismus, einer Zelle, einem biochemischen Signalweg und/oder einem Molekül eine bestimmte Reaktion hervorruft. Bei dem erfindungsgemäßen Wirkstoff kann es sich um jede Art von Verbindung handeln, die sich therapeutisch durch Verabreichung an einen Patienten verwenden lässt, wie z.B. eine organische oder anorganische Verbindung, eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Lipid oder ein Zucker. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wirkstoff um eine organische Verbindung mit geringem Molekulargewicht (small Molecule), wie z.B. einen Tyrosinkinase-Inhibitor, oder einen therapeutischen Antikörper. Der Wirkstoff kann z.B. synthetisch oder biotechnologisch hergestellt, oder aus anderen, z.B. natürlichen, Quellen isoliert worden sein. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Wirkstoff um einen solchen, der Teil einer Wirkstoff-Bibliothek ist, z.B. einer "small Molecule"-Bibliothek.
Es können auch Kombinationen von zwei oder mehreren Wirkstoffen in das Verfahren eingesetzt werden. Dies bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch verwendet werden kann, um Wirksamkeit und/oder Spezifität einer Wirkstoffkombination zu bestimmen. In diesem Fall wird in Schritt (a) des Verfahrens die zu untersuchende Kombination aus zwei oder mehreren Wirkstoffen eingesetzt.
Im ersten Schritt des Verfahrens wird eine Mischkultur, die sowohl Zielzellen als auch Nicht-Zielzellen umfasst, mit dem zu testenden Wirkstoff oder der Wirkstoffkombination inkubiert. Bei der Mischkultur kann es sich um eine Primärkultur handeln, die ausgehend von einer Zell- oder Gewebeprobe von einem Patienten hergestellt wurde. Solche Primärkulturen werden in der Regel neben den Zielzellen, z.B. den Tumorzellen, mehrere Arten von Nicht-Zielzellen enthalten, wie z.B. Bindegewebszellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Fibroblasten, Leukozyten, und ähnliche.
Die Mischkultur kann eine Vielzahl von verschiedenen Zellarten umfassen, d.h. zwei, drei, vier, fünf oder mehr Zellarten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Mischkultur im Wesentlichen nur zwei verschiedene Arten von Zellen, d.h. weitere Zellarten sind nur in geringen Mengen in der Mischkultur vorhanden. Vorzugsweise beträgt die Verunreinigung mit weiteren Zellarten weniger als 10%, weniger als 5%, weniger als 1% der Gesamtzellzahl.
Obgleich das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise mit Primärkulturen durchgeführt wird, ist es alternativ dazu auch möglich, etablierte Zelllinien als Zielzellen in das Verfahren einzusetzen und die Spezifität und/oder die Wirksamkeit eines Wirkstoffs oder einer Wirkstoffkombination gegen diese Zelllinie zu bestimmen. Ein entsprechendes Beispiel ist im Folgenden als Beispiel 2 aufgeführt. Geeignete Zelllinien sind z.B. alle bekannten Tumorzelllinien, wie die MPNST(malignant peripheral nerve sheath tumor)-Zelllinien. Die Zelllinien können von einer der anerkannten Hinterlegungsstellen, wie z.B. der ATCC oder DSMZ, erhalten wurden. In diesem Fall werden Mischkulturen hergestellt, indem man Nicht-Zielzellen, z.B. Fibroblasten, zu den Zielzellen der etablierten Zelllinien zusetzt. Nicht-Zielzellen können je nach Bedarf aus dem jeweiligen Patienten isoliert werden, z.B. Spermatogonien, die zuvor durch Biopsie gewonnen wurden.
Im Schritt (a) des Verfahrens wird die Mischkultur, die Zielzellen und Nicht-Zielzellen umfasst, mit mindestens einem Wirkstoff unter Bedingungen inkubiert, bei denen der Wirkstoff seine Wirkung auf die Zielzellen (sofern vorhanden) ausüben kann. Geeignete Inkubationsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination kann z.B. in gelöster Form direkt in das Kulturmedium der Mischkultur gegeben werden, oder zunächst mit Medium und/oder weiterer Flüssigkeit vermischt und dann zu der Mischkultur gegeben werden. Besonders bevorzugt ist es, dass der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination zunächst in Wasser oder in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und anschließend der Mischkultur zugesetzt wird.
Geeignete Medien, wie z.B. Medien, die für die Kultivierung von Primärkulturen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt. Um das Überwachsen der Kulturen mit schnell wachsenden Zellarten wie Fibroblasten zu verhindern und das Wachstum der Zielzellen zu fördern, können verschiedene, dem Fachmann bekannte, Strategien angewendet werden. Handelt es sich z.B. bei den Zielzellen um Schwannsche Zellen, insbesondere Zellen eines vestibulären Schwannoms, so können die Kulturplatten z.B. mit Laminin beschichtet werden, um Schwannsche Zellen anzureichern und das Wachstum von Fibroblasten zu hemmen. Der gleiche Effekt wird erzielt, wenn man dem Kulturmedium z.B. Forskolin, Insulin und/oder IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin) zusetzt. Der Fachmann wird ohne Weiteres in der Lage sein, geeignete Kultivierungsbedingungen anhand der jeweiligen Zielzelle auszuwählen.
Dem Fachmann ist darüber hinaus bekannt, dass die optimale Konzentration des Wirkstoffs oder die Wirkstoffkombination je nach Art der Substanz(en) erheblich variieren kann. Ist die optimale Konzentration des Wirkstoffs oder der Wirkstoffkombination für die jeweilige Zielzelle zum Zeitpunkt der Bestimmung der Spezifität noch nicht bekannt, können zunächst verschiedene Konzentrationen des Wirkstoff oder der Wirkstoffkombination in einer Verdünnungsreihe getestet werden. Dabei können z.B. Kulturen der Zielzellen mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr verschiedenen Konzentrationen inkubiert werden, um z.B. einen Konzentrationsbereich eines Wirkstoffs oder der Wirkstoffkombination zu ermitteln, in dem der Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination die Zielzellen besonders effektiv moduliert, z.B. abtötet oder in ihrer Vermehrung hindert.
In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens wird Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens so durchgeführt, dass die Mischkultur aus Zielzellen und Nicht-Zielzellen in parallelen Ansätzen gleichzeitig mit verschiedenen Konzentrationen des Wirkstoffs oder der Wirkstoffkombination inkubiert wird. So kann z.B. eine aus dem Patienten gewonnene Gewebeprobe zunächst in geeignetem Medium vermehrt und anschließend in 6 Mischkulturen aufgeteilt werden. Eine der Mischkulturen dient der Bestimmung des Referenzwertes in Schritt (c) des Verfahrens, wobei dieser Kultur kein Wirkstoff zugesetzt wird. Die übrigen 5 Mischkulturen werden unter identischen Bedingungen mit ansteigenden Konzentrationen desselben Wirkstoffs inkubiert (z.B. 5, 10, 20, 50, 100 nM).
Sofern die Inkubation der Mischkultur mit dem Wirkstoff oder der Wirkstoffkombination in Schritt (a) des obigen Verfahrens mit verschiedenen Konzentrationen erfolgt, kann die IC₅₀ für die Zielzellen in der Mischkultur bestimmt werden und mit der entsprechenden IC₅₀ der Nicht-Zielzellen verglichen werden. Die IC₅₀ ist die Konzentration des Wirkstoffs, bei der 50% der maximalen inhibierenden Wirkung erreicht wird. Ein Vergleich der IC₅₀ der Zielzellen und der Nicht-Zielzellen liefert Informationen über die Spezifität des Wirkstoffs. Eine geringe IC₅₀ für die Zielzellen und eine hohe IC₅₀ für die Nicht-Zielzellen verweist auf eine gute Spezifität des Wirkstoffs.
Die optimale Dauer der Inkubation ist ebenfalls von dem zu untersuchenden Wirkstoff und den Zielzellen abhängig und kann folglich stark variieren. Eine geeignete Inkubationsdauer wird üblicherweise im Bereich von 5 min bis zu 48 h liegen, z.B. mindestens 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min, 45 min, 50 min, oder 55 min. Vorzugsweise erfolgt die Inkubation in Schritt (a) des Verfahrens mindestens 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 12 h, 18 h, 24 h, 30 h, 36 h, 42 h, 48 h, oder mehr. Die Inkubation in Schritt (a) des Verfahrens kann auch mehrere Tage andauern, z.B. mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 oder mehr Tage. Dem Fachmann ist dabei klar, dass die Lebensdauer der Kultur einen wesentlichen Faktor für die maximale Dauer der Inkubation darstellt. So ist z.B. die Überlebenszeit von Primärkulturen meist auf wenige Tage oder Wochen begrenzt.
Sofern eine Inkubation mit dem Wirkstoff über mehrere Tage hinweg erfolgt, kann es erforderlich sein, das Kulturmedium nach einigen Tagen gegen frisches Medium auszutauschen. Ferner kann es erforderlich sein, die Zellen vor der in Schritt (b) des Verfahrens erfolgenden quantitativen Bestimmung durch Zugabe von Trypsin zu behandeln, um sie vom Boden der Kulturschalen abzulösen.
In einem nächsten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach Inkubation der Mischkultur mit dem Wirkstoff oder der Wirkstoffkombination das quantitative Verhältnis der Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen in der Mischkultur bestimmt. Das Verhältnis der Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen ist ein relativer Wert und kann z.B. ermittelt werden, indem die absolute Anzahl der Zielzellen und die absolute Anzahl der Nicht-Zielzellen in der Mischkultur nach Inkubation mit dem Wirkstoff oder der Wirkstoffkombination ermittelt und zueinander in ein Verhältnis gesetzt werden. Die folgende Formel gibt dieses Verhältnis wieder: Verhältnis Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen = Anzahl Zielzellen/Anzahl Nicht-Zielzellen
Alternativ ist es erfindungsgemäß auch möglich, statt der absoluten Anzahl der Zellen in der Probe (d.h. der tatsächlich in der Probe vorliegenden Zellzahl) die relative Anzahl der Zellen bestimmen. In diesem Fall wird lediglich ein für die jeweilige Zelle spezifisches Signal bestimmt, dessen Stärke indirekt Aufschluss über die Anzahl der in der Probe vorhandenen Zellen gibt. Sofern vorliegend Bezug auf die Bestimmung der Anzahl von Zellen genommen wird, kann damit die Bestimmung der absoluten und/oder der relativen Anzahl umfassen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Anzahl der Zielzellen anhand eines ersten Merkmals bestimmt, das für die Zielzellen spezifisch ist. Bei dem Merkmal handelt es sich vorzugsweise um ein genetisches Merkmal, z.B. um eine veränderte Kopienzahl oder um eine spezifische Nukleotidsequenz, die ausschließlich in den Zielzellen vorliegt. Geeignete genetische Merkmale sind z.B. genetische Veränderungen, wie Mutationen in einem oder in mehreren Genen oder in bestimmten genomischen Regionen, oder eine Änderung der Kopienzahl von einem oder mehreren Genen oder genomischen Regionen.
Als Merkmal für die Zielzellen ebenfalls geeignet sind Kopiezahl-neutrale Verluste der Heterozygotie verschiedener genomischer Regionen. Normalerweise liegen im Genom des Patienten jeweils zwei Allele eines bestimmten Gens oder einer genomischen Region vor, die sich voneinander unterscheiden. Neben dem Verlust eines Allels kann auch der Verlust der Heterozygotie für Tumorzellen charakteristisch sein, d.h. eines der Allele wurde ersetzt, sodass nunmehr zwei identische Allele des Gens im Genom des Patienten vorliegen. Solche somatischen Veränderungen kommen regelmäßig in pathologisch veränderten Zellen, wie z.B. in Tumorzellen vor.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem ersten Merkmal, das für die Zielzellen spezifisch ist, um ein Muster aus mehreren Merkmalen, vorzugsweise genetischen Merkmalen, deren Vorliegen in Kombination eine verlässliche Unterscheidung zwischen Zielzellen und Nicht-Zielzellen ermöglicht.
Geeignete Merkmale, die für Zielzellen spezifisch sind, können z.B. durch genetische Untersuchungen, z.B. durch Mutationsanalyse, SNP-Analyse oder LOH(Verlust der Heterozygotie)-Analyse von einem oder mehreren Genen oder von einer oder mehreren genomischen Regionen oder des gesamten Genoms ermittelt werden. Dabei wird vorzugsweise auf Regionen des Genoms abgestellt, von denen bereits bekannt ist, dass sie in den Zielzellen, insbesondere in Tumorzellen, häufig Veränderungen aufweisen. Mutationsanalysen können durch direkte Sequenzierung der Exons der betreffenden Gene, durch Sequenzierung von größeren Genomabschnitten oder durch Sequenzierung des gesamten Genoms durchgeführt werden. LOH-Analysen werden durch Genotypisierung mit verschiedenen Mikrosatelliten-Markern durchgeführt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es ferner, dass die Anzahl der Zielzellen in Schritt (b) des Verfahrens mit Hilfe eines Musters bestimmt wird, d.h. mit Hilfe von mehreren Merkmalen, deren gemeinsames Vorliegen in einer Zelle für die Zielzellen charakteristisch ist. Maligne Tumorzellen weisen im Vergleich zu den entsprechenden gesunden Zellen oftmals 5–10 genetische Veränderungen auf. Daher kann es vorteilhaft sein, die quantitative Bestimmung der Zielzellen in Schritt (b) durch Erfassen von 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Merkmalen, deren gemeinsames Vorliegen für diese Tumorzellen charakteristisch ist, durchzuführen. Häufig vorkommende Merkmale für bestimmte Tumorarten sind in der Literatur ausführlich beschrieben. So beschreiben Stransky et al. (2011), Science, 333 (6046):1157–60 beispielsweise Muster von Mutationen bei malignen Tumoren der Kopf- und Halsregion (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC). Weitere Veröffentlichungen, in denen übliche Mutationen bei verschiedenen malignen Tumoren beschrieben werden, umfassen z.B. Alexandrov et al. (2013), Nature, 500 (7463): 415–21; Hudson et al. (2010), Nature, 464 (7291): 993–8; Beroukhim et al.(2010), Nature, 463 (7283): 899–905; Agrawal et al. (2011), Science, 333 (6046): 1154–7; Watson et al. (2013), Nat Rev Genet., 14 (10): 703–18; und zahlreiche andere. Darüber hinaus sind verschiedene Datenbanken verfügbar, in denen bei verschiedenen Tumoren übliche Mutationen ausführlich beschrieben werden. Siehe z.B. das "cBioPortal for Cancer Genomics" des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (http://www.cbioportal.org/public-portal/index.do).
Gemäß der Erfindung kann eine vom Patienten gewonnene Probe zunächst untersucht werden, indem eine Analyse nach Merkmalen durchgeführt wird, die für die jeweiligen Zielzellen spezifisch sind. Dabei können die in der Patientenprobe vorliegenden Zielzellen einer Mutationsanalyse unterzogen werden, bei der gezielt nach somatische Mutationen, wie z.B. Punktmutationen, Deletionen, Insertionen, Allelverlusten oder Veränderungen der Kopienzahl gesucht wird. Dabei ist es nicht erforderlich, die Zielzellen aus der Patientenprobe zu isolieren und aufzureinigen. Vielmehr wird die gesamte Probe, die neben den Zielzellen auch Nicht-Zielzellen umfasst, in die Analyse eingesetzt. Als Vergleichsprobe kann eine Probe desselben Patienten verwendet werden, die ausschließlich gesunde Zellen enthält. So können z.B. die in einer Blutprobe des Patienten vorliegenden peripheren Leukozyten in die Mutationsanalyse als Vergleich eingesetzt werden. Dies ist selbstverständlich nur dann möglich, wenn die Leukozyten selbst nicht von einer Erkrankung verändert oder anderweitig betroffen sind, wie z.B. im Falle einer Leukämie. Bei solchen Erkrankungen müssen andere Nicht-Tumorzellen als Vergleich bei der Mutationsanalyse verwendet werden, wie z.B. Fibroblasten. Mutationen, die ausschließlich in der Probe nachgewiesen werden, welche die Zielzellen, wie z.B. Tumorzellen, enthält, nicht aber in den peripheren Leukozyten bzw. Fibroblasten können dabei als für die Zielzellen spezifische Mutationen angesehen werden.
Sobald ein oder mehrere Merkmale bestimmt wurden, mit denen sich die Zielzellen in der Mischkultur ausreichend identifizieren lassen, kann eine entsprechende Methodik entwickelt werden, um das Merkmal oder das Muster von Merkmalen spezifisch und effizient Weise nachzuweisen, z.B. durch Sequenzierung, digitale PCR, Mikrosatelliten-Analyse. Die Analyse zur Identifizierung eines oder mehrerer für die Zielzellen charakteristischer Merkmale kann als Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden; in diesem Fall wird die Analyse in der Regel vor Schritt (a) erfolgen. Alternativ dazu kann das für die Zielzellen spezifische Merkmal zum Zeitpunkt der Durchführung des Verfahrens bereits bekannt sein, z.B. weil eine Zell- oder Gewebeprobe des Patienten bereits zu einem früheren Zeitpunkt analysiert wurde, etwa im Rahmen einer früheren Behandlung, oder bei der Bestimmung der Prognose für diesen Patienten, oder im Rahmen von Forschungsaktivitäten. In diesem Fall muss die Mutationsanalyse nicht zwingend als Teil des Verfahrens durchgeführt werden.
Besonders bevorzugt ist es allerdings, dass die Mutationsanalyse der Proben, aus denen die Zielzellen für die Kultur gewonnen werden, als Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt wird. Somit umfasst das oben definierte, aus den Schritten (a)–(c) bestehende Verfahren der Erfindung ferner einen Schritt, bei dem zunächst in den Zielzellen, die in der Zell- oder Gewebeprobe eines Patienten vorliegen, ein oder mehrere für diese Zielzellen charakteristische Merkmale, vorzugsweise genetische Merkmale, identifiziert werden. Das oder die Merkmale ist/sind dabei geeignet, die Zielzelle von Nicht-Zielzellen zu unterscheiden. Wie oben beschrieben wird zu diesem Zweck die aus dem Patienten gewonnne Probe, welche die für die Erkrankung charakteristischen Zielzellen umfasst, einer Mutationsanalyse unterzogen. Die in der Probe nachgewiesenen Mutationen werden mit den Ergebnissen einer Analyse von gesunden Zellen des Patienten, z.B. peripheren Leukozyten, verglichen.
Besonders bevorzugt ist es, dass sich das Merkmal oder Muster, anhand dessen sich die Zielzellen bestimmen lassen, mit einem Mikrosatelliten-Marker nachweisen lässt. Mikrosatelliten-Marker sind kurze, meist nicht-kodierende DNA Sequenzen, die im Genom einer Zelle oft wiederholt werden. Anhand der variierenden Wiederholungen kann bei jeder Person ein einzigartiges Profil mit mehreren Mikrosatelliten ermittelt werden. Die Anwendung dieses genetischen Fingerabdrucks ist besonders bei der Täter-Identifikation und Vaterschaftstest bekannt. Bei der vorliegenden Erfindung kann ein solcher genetische Fingerabdruck als Merkmal für die Zielzellen in einer Mischkultur verwendet werden, deren Zielzellen und Nicht-Zielzellen aus verschiedenen Personen stammen. Dies ist der Fall, wenn eine Mischkultur hergestellt wird, bei der die Zielzellen aus einer etablierten Zelllinie stammen und die Nicht-Zielzellen aus einer anderen Person.
Die Wiederholungen eines Mikrosatelliten auf den zwei Allelen sind bei derselben Person in der Regel unterschiedlich. Somit ermöglichen Mikrosatelliten-Marker eine Untersuchung der Heterozygotie einer genomischen Region bei einem Patienten. Tumorzellen sind häufig durch einen Verlust dieser Heterozygotie gekennzeichnet.
Beispiele für geeignete Mikrosatelliten-Marker, die erfindungsgemäß im Zusammenhang mit vestibulären Schwannomen verwendet werden können, umfassen die NF2-Markern CRYB2, D22S275, NF2CA3, D22S268 und D22S430. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zielzellen um Zellen eines vestibulären Schwannoms, die mittels PCR, insbesondere digitaler PCR, nachgewiesen werden, wobei Primern verwendet werden, welche im Bereich des Mikrosatelliten-Markers D22S430 binden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zielzellen um Zellen eines vestibulären Schwannoms, und das für die Zielzellen spezifische Merkmal ist eine Mutation des NF-2-Gens, insbesondere eine inaktivierende Mutation, wie z.B. ein Frameshift oder eine Trunkierung. In einer weiteren Ausführungsform ist das das für die Zielzellen spezifische Merkmal der Verlust der Heterozygotie des NF-2-Gens.
Sofern das gewählte erste Merkmal oder Muster spezifisch für die Zielzellen ist, gibt die Anzahl und/oder Stärke des gemessenen Signals direkt oder indirekt Aufschluss über die Anzahl der Zielzellen, die in der Mischkultur vorliegen. Dabei wird anhand der Anzahl und/oder Stärke des gemessenen Signals auf die Anzahl von Zielzellen in der Ausgangsprobe geschlossen. Die Häufigkeit des Merkmals kann z.B. mit einem Nachweisverfahren bestimmt werden, das eine semi-quantitative oder quantitative Bestimmung der Häufigkeit des Merkmals in der zellulären DNA ermöglicht. Zu diesem Zweck werden zunächst nach Schritt (a) des Verfahrens die in der Mischkultur vorliegenden Zellen oder ein Teil derselben lysiert, um auf diese Weise die in den Zellen vorhandenen Nukleinsäuren, insbesondere die DNA, einer weiteren Untersuchung, z.B. durch PCR zugänglich zu machen. Die DNA kann zu diesem Zweck mit herkömmlichen Kits für die Nukleinsäure-Aufreinigung gewonnen werden. Alternativ dazu können auch ganze Zellen lysiert und anschließend direkt in eine PCR eingesetzt werden. Ausgehend von dieser DNA wird das Merkmal semi-quantitativ oder quantitativ mittels geeigneter Verfahren nachgewiesen. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und umfassen insbesondere PCR-Verfahren, Hybridisierungsverfahren und Sequenzierungsverfahren. Geeignete PCR-Verfahren umfassen insbesondere quantitative PCR, digitale PCR, Allel-spezifische, kompetitive PCR und andere Assays wie z.B., SnapShop. Geeignete Sequenzierungsverfahren umfassen u.a. massive parallele Sequenzierung (deep sequencing). Die Messung des Merkmals erfolgt vorzugsweise mittels eines PCR-Verfahrens.
Bevorzugt wird das für die Zielzellen spezifische Merkmal durch digitale PCR bestimmt. Die Prinzipien dieser neuen Technologie sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Die digitale PCR erlaubt die absolute Quantifizierung einer DNA-Zielsequenz und stellt ein präzises und überaus sensitives Verfahren dar, das nur sehr geringe Mengen der nachzuweisenden DNA in einer Probe benötigt. Eine DNA-Probe wird hierbei in eine große Anzahl (20.000–100.000) PCR-Ansätze aufgeteilt/partitioniert, wobei jeder PCR-Ansatz ein Volumen im Bereich von wenigen Nanolitern aufweist. Eine Partitionierung sowie die Herstellung einer großen Anzahl von PCR-Ansätzen kann hierbei durch die Bildung von Öltropfen oder Verwendung eines Chips mit Vertiefungen im Größenbereich von wenigen Nanometern erreicht werden. Es wird eine PCR-Reaktion in jedem der Ansätze durch Zugabe geeigneter Primer und der erforderlichen Polymerase-Enzyme gestartet. Der Nachweis der Amplifikation kann durch Verwendung einer markierten Sonde erfolgen. Geeignete Markierungen umfassen insbesondere fluoreszente Farbstoffe, wie z.B. 6-Carboxyfluorescein (6-FAM). Es können auch Farbstoffe verwendet werden, die erst nach Bindung an die doppelsträngige DNA ein Signal erzeugen. Nur solche Ansätze, die die Zielsequenz enthalten, werden amplifiziert und zeigen ein positives Signal. Da die Verteilung von Zielmolekülen dem Possionprinzip folgt, kann die Anzahl positiver Partitionen (PCR-Ansätze) leicht errechnet werden. Geeignete Quantifizierungsverfahren mittels digitaler PCR sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.
Vor, nach oder gleichzeitig mit der Bestimmung der Anzahl der Zielzellen wird die Anzahl der Nicht-Zielzellen in der Mischkultur mittels eines zweiten Merkmals bestimmt. Dieses Merkmal kann für die entsprechenden Nicht-Zielzellen, wie z.B. für Nicht-Tumorzellen, in der Mischkultur spezifisch sein. Bei dem Merkmal handelt es sich vorzugsweise ebenfalls um ein genetisches Merkmal, d.h. um eine spezifische Nukleotidsequenz, die ausschließlich in den Nicht-Zielzellen, nicht hingegen in den Zielzellen, vorliegt. In diesem Fall kann die Bestimmung der Anzahl der Nicht-Zielzellen in der Mischkultur durch Verfahren erfolgen, wie sie oben im Zusammenhang mit dem ersten Merkmal beschrieben wurden. Der Nachweis des Merkmals mit quantitativer PCR, digitaler PCR, und Allel-spezifischer, kompetitiver PCR ist bevorzugt. Der Einsatz digitaler PCR ist besonders bevorzugt.
Es ist wiederum bevorzugt, dass es sich bei dem zweiten Merkmal, das für die Nicht-Zielzellen spezifisch ist, um ein Muster aus mehreren Merkmalen, vorzugsweise genetischen Merkmalen, handelt, deren Vorliegen in Kombination eine verlässliche Unterscheidung zwischen Zielzellen und Nicht-Zielzellen ermöglicht.
Es ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die Mengen des ersten Merkmals oder Musters und des zweiten Merkmals oder Musters mittels desselben Verfahrens bestimmt werden, wie z.B. mittels digitaler PCR.
Es ist ferner bevorzugt, dass es sich bei dem ersten Merkmal und dem zweiten Merkmal um zwei verschiedene Allele desselben Gens handelt. Insbesondere kann es sich bei dem ersten Merkmal, das für Zielzellen, wie z.B. Tumorzellen, spezifisch ist, um ein Allel eines Gens handeln, welches hinsichtlich seiner Sequenz von dem Allel der gesunden Zellen abweicht. In manchen Fällen ist es auch möglich, dass das Allel in Tumorzellen aufgrund eines Allel-Verlusts nicht mehr vorliegt.
Alternativ kann die Anzahl der Nicht-Zielzellen in Schritt (b) anhand eines zweiten Merkmals bestimmt werden, das in den Zielzellen und Nicht-Zielzellen in vergleichbarer Menge vorkommt. Dabei kann es sich z.B. um eine Nukleotidsequenz handeln, die bekanntermaßen stabil ist und sich nicht ändert, z.B. eine Nukleotidsequenz, deren Änderung zum Zelltod führen würde. In diesem Fall kann auf indirekte Weise auf die Anzahl der in der Mischkultur vorliegenden Anzahl der Nicht-Zielzellen geschlossen werden, indem man zunächst die Gesamtanzahl der in der Kultur vorkommenden Zellen (Zielzellen und Nicht-Zielzellen) bestimmt und anschließend die anhand des ersten Merkmals bestimmte Anzahl der Zielzellen von der Gesamtanzahl der Zellen abzieht. Auf diese Weise lässt sich die Anzahl von Nicht-Zielzellen auf einfache Weise rechnerisch ermitteln.
Die Gesamtanzahl der in der Kultur vorkommenden Zellen kann auch anhand anderer Parameter bestimmt werden, u.a., anhand von Proliferation, Vitabilität oder durch direkte Zählung der lebendigen Zellen nach Färbung der toten Zellen mit Trypan-Blau.
Umgekehrt kann in Schritt (b) auch die Anzahl der Zielzellen indirekt ermittelt werden, indem man mit einem zweiten Merkmal, das für Nicht-Zielzellen spezifisch ist, zunächst die Anzahl der Nicht-Zielzellen in der Mischkultur bestimmt und anschließend die Gesamtanzahl der in der Kultur vorkommenden Zellen (Zielzellen und Nicht-Zielzellen) bestimmt. Durch Subtraktion der Anzahl der Nicht-Zielzellen von der Gesamtanzahl der in der Kultur vorkommenden Zellen ergibt sich dann rechnerisch die Anzahl der Tumorzellen.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Gesamtzahl der in der Kultur vorkommenden Zellen bestimmt wird, da dieser Parameter Aufschluss über die cytotoxische oder proliferationshemmende Wirkung des Wirkstoffs gibt.
Nach Bestimmung der Anzahl der Zielzellen und der Nicht-Zielzellen in der Mischkultur wird das Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen gebildet. Dem Fachmann wird verständlich sein, dass erfindungsgemäß auch das reziproke Verhältnis (d.h. Nicht-Zielzellen zu Zielzellen) verwendet werden kann, sofern auch der in Schritt (c) verwendete Referenzwert entsprechend gebildet wurde. Aus Gründen der besseren Verständlichkeit wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung von einem Verhältnis von "Zielzellen zu Nicht-Zielzellen" gesprochen, obgleich damit auch das Verhältnis aus "Nicht-Zielzellen zu Zielzellen" eingeschlossen ist.
Nachdem das quantitative Verhältnis der Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen in der Mischkultur bestimmt wurde, wird in einem nachfolgenden Schritt (c) das ermittelte Verhältnis vorzugsweise mit einem Referenzwert verglichen, der in einer Mischkultur bestimmt wurde, die nicht mit dem Wirkstoff inkubiert wurde. Alternativ dazu ist es auch möglich, dass der Referenzwert anhand einer Mischkultur bestimmt wurde, die mit einer Konzentration des Wirkstoffs inkubiert wurde, die sich von der in Schritt (a) verwendeten Konzentration unterscheidet. So kann die Mischkultur, die zur Bestimmung des Referenzwerts verwendet wird, z.B. mit einer Konzentration des Wirkstoffs inkubiert werden, die halb so groß ist wie die in Schritt (a) des Verfahrens verwendete Konzentration des Wirkstoffs.
Bei dem Referenzwert in Schritt (c) handelt es sich vorzugsweise ebenfalls um ein Verhältnis aus Zielzellen zu Nicht-Zielzellen, wobei die Zielzellen und die Nicht-Zielzellen jeweils denen von Schritt (a) entsprechen. Um eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten, wurden die Mischkulturen von Schritt (a) und Schritt (c) vorzugsweise unter gleichen Bedingungen kultiviert, d.h. es wurde identische oder zumindest ähnliche Inkubationsbedingungen gewählt. Es ist wiederum besonders bevorzugt, dass das Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen in Schritt (c) bestimmt wird, indem man die Anzahl der Zielzellen sowie die Anzahl der Nicht-Zielzellen in der Mischkultur zunächst bestimmt und diese Zellzahlen anschließend zueinander in ein Verhältnis setzt. Alternativ dazu ist es selbstverständlich auch möglich, ein relatives Signal, z.B. eine Signalstärke, zu messen, das/die Aufschluss über die in der Kultur vorliegende Zellzahl gibt. So können z.B. die Stärken von Fluoreszenzmarkern gemessen und unmittelbar zueinander ins Verhältnis gesetzt werden.
Es ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die Mischkulturen von Schritt (a) und Schritt (c) ausgehend von derselben Patientenprobe, z.B. ausgehend von derselben Tumorbiopsie, hergestellt und anschließend in parallelen Ansätzen, d.h. unter identischen Bedingungen, kultiviert werden. In einem solchen Verfahren wird ausgehend von derselben Patientenprobe sowohl eine Testkultur als auch eine entsprechende Kontrollkultur hergestellt. Dies stellt sicher, dass das Verfahren eine besonders hohe Aussagekraft hinsichtlich der Spezifität des Wirkstoffs liefert.
In Fällen hingegen, bei denen z.B. nur wenig Material aus der Patientenprobe zur Verfügung steht, ist es allerdings auch möglich, dass der Referenzwert, d.h. das aus der Kontrollkultur ermittelte Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen, auf Basis einer früheren Probe aus diesem Patienten ermittelt wurde, z.B. anhand einer Biopsieprobe aus demselben Tumor, die 2, 3 oder 4 Wochen vor der Probe entnommen wurde, anhand derer die Mischkultur von Schritt (a) hergestellt wird. Ferner ist es auch möglich, dass der Patient bereits früher einmal gegen die jeweilige Erkrankung, z.B. die Tumorerkrankung behandelt wurde, und die Erkrankung erneut auftritt ("relapse"). In solchen Fällen ist es möglich, dass bereits ein Referenzwert für die Kontrollkultur aus dem jeweiligen Patienten vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorliegt, auf den entsprechend zurückgegriffen werden kann.
Das Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen in der Kontrollprobe von Schritt (c) wird bestimmt, wie es oben im Zusammenhang mit der Mischkultur von Schritt (a) ausführlich beschrieben wurde. Dabei können die gleichen Merkmale oder Muster von Merkmalen verwendet werden, wie sie bei Schritt (b) des Verfahrens verwendet werden. Dies erleichtert einerseits die Durchführung des Verfahrens, da z.B. im Falle einer Bestimmung der Merkmale in den Mischkulturen mittels PCR dieselben PCR-Programme und insbesondere auch dieselben Primer verwendet werden können, was dazu beiträgt, die Materialkosten des Verfahrens gering zu halten. Zum anderen ermöglicht die Verwendung desselben Merkmals bei der Testkultur und der Kontrollkultur eine besonders gute Vergleichbarkeit der gewonnenen Ergebnisse.
Das in Schritt (b) ermittelte Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen wird mit dem aus der Kontrollkultur von (c) gewonnenen Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen verglichen. Der Vergleich erfolgt durch Gegenüberstellung der beiden Verhältnisse. Durch den Vergleich wird festgestellt, ob die Inkubation mit dem Wirkstoff zu einer Änderung des Verhältnisses von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen geführt hat. Sofern verschiedene Konzentrationen des Wirkstoffs parallel getestet wurden, kann darüber hinaus festgestellt werden, bei welcher Konzentration des Wirkstoffs die Änderung zwischen den bestimmten Verhältnissen am größten ist. Zeigt der Vergleich z.B., dass das Verhältnis aus Tumorzellen zu Fibroblasten in der Kontrollkultur von Schritt (c) beispielsweise 10:1 betrug, d.h. ein 10-facher Überschuss von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen, so verweist ein verringertes Verhältnis von z.B. 2:1 in der Testkultur von Schritt (b) darauf, dass der Wirkstoff spezifisch für die jeweiligen Tumorzellen ist und diese in der Kultur selektiv abgetötet hat oder deren Vermehrung blockiert hat.
Wie oben beschrieben kann es aus bestimmten Gründen bevorzugt sein, dass Verhältnis der Zellen in den Mischkulturen als ein Verhältnis von Nicht-Zielzellen zu Zielzellen auszudrücken. In diesem Fall zeigt ein Ansteigen des Verhältnisses von Kontrollkultur zu Testkultur an, dass der untersuchte Wirkstoff für die jeweilige Zielzelle spezifisch ist, sofern die Zielzellen solche sind, die abgetötet werden sollen bzw. deren Vermehrung verhindert werden soll.
Ein Wirkstoff ist erfindungsgemäß als spezifisch für die Zielzellen anzusehen, wenn sich das Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen in Schritt (b) durch die Inkubation mit dem Wirkstoff oder der Wirkstoffkombination gegenüber dem Verhältnis dieser Zellen in der Kontrollkultur von Schritt (c) statistisch signifikant verändert. Sofern die Zielzellen Tumorzellen sind, wird ein spezifischer Wirkstoff oder eine spezifische Kombination von Wirkstoffen dazu führen, dass das in Schritt (b) bestimmte Verhältnis geringer ist als das entsprechende Verhältnis in der als Kontrolle verwendeten Mischkultur von Schritt (c). Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass das in Schritt (b) bestimmte quantitative Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen um mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 50%, mindestens 75% oder mindestens 100% von dem in der Kontrollkultur ermittelten Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen abweicht. Ein Abweichen von mindestens 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% oder sogar von mindestens 1000% ist allerdings besonders bevorzugt.
Es ist bevorzugt, dass das oben beschriebene Verfahren eingesetzt wird, um zu testen, ob ein Wirkstoff für die Behandlung eines Patienten geeignet ist, aus dem die Zellen für die Mischkultur gewonnen wurden. Dies erlaubt eine personalisierte und effiziente Therapie mit möglichst geringen Nebenwirkungen. Ein Wirkstoff ist für die Behandlung des Patienten geeignet, wenn er die Zielzellen, die im Rahmen der Erkrankung pathologisch vermehrt sind, abtötet oder deren weitere Vermehrung verhindert und wenn der Wirkstoff diese Wirkungen nicht oder nur im verringerten Ausmaß gegenüber Nicht-Zielzellen desselben Patienten zeigt.
In einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt, um eine Subpopulation von Zellen zu identifizieren, für die der Wirkstoff spezifisch ist. Dies ermöglicht die gezielte Isolierung der Subpopulation sowie die Entschlüsselung des genauen Wirkmechanismus des Wirkstoffs.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen spezifischen Wirkstoff bereit, wobei der Wirkstoff nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt ist. Der erfindungsgemäße Wirkstoff ist vorzugsweise zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren z.B. zur Krebsbehandlung in einem Individuum.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs in einem therapeutischen Verfahren z.B. zur Krebsbehandlung in einem Individuum.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs, bei dem man

(a) verschiedene Substanzen in einem Screening auf eine Wirksamkeit gegen die Zielzellen untersucht, und
(b) Substanzen, für die eine Wirksamkeit gegen die Zielzellen beobachtet werden konnte, in einem wie oben beschriebenen Verfahren auf ihre Spezifität gegen die Zielzellen untersucht.

Zum Auffinden des Wirkstoffs kann das oben beschriebene Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit und/oder der Spezifität im kleinen Maßstab oder als Hochdurchsatz-Verfahren durchgeführt werden, wobei eine Vielzahl von potentiellen Wirkstoffen gleichzeitig getestet wird. Geeignete Verfahren sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann eine Vielzahl von Molekülen aus einer Molekül-Bibliothek entnommen und getestet werden.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs, Schritte umfassend, bei denen man

(a) eine Mischkultur, die Zielzellen und Nicht-Zielzellen umfasst, mit mindestens einem Wirkstoff inkubiert,
(b) nach der Inkubation die Anzahl der Zielzellen in der Mischkultur bestimmt, vorzugsweise anhand eines wie oben beschriebenen für die Zielzelle spezifischen Merkmals oder Musters aus Merkmalen,
(c) die Anzahl der Zielzellen mit einem Referenzwert vergleicht, der in einer Mischkultur bestimmt wurde, die nicht oder mit einer geringeren Konzentration des Wirkstoffs inkubiert wurde, wobei eine geringere Anzahl der Zielzellen in der Mischkultur von Schritt (b) darauf hinweist, dass der Wirkstoff gegen die Zielzellen wirksam ist.

Das Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit ermöglicht eine konkrete Zuordnung der in Mischkultur beobachteten Wirkungen zu einer bestimmten in der Kultur vorliegenden Zellart, d.h. den Zielzellen. Bei den Zielzellen kann es sich wie oben beschrieben um Zellen handeln, deren Vorliegen und Vermehrung für die Ausbildung einer Erkrankung charakteristisch ist. Vorzugsweise handelt es sich bei den Zielzellen um Zellen eines malignen oder benignen Tumors. Bei den Nicht-Zielzellen handelt es sich vorzugsweise um solche Zellen, die in einer klinischen Probe des Patienten vorliegen, z.B. gesunde somatische Zellen, die gemeinsam mit Tumorzellen in einer Biopsie-Probe vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zielzellen um Zellen eines vestibulären Schwannoms, während die Nicht-Zielzellen Fibroblasten oder Leukozyten sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zielzellen um Zellen eines soliden Tumors, während die Nicht-Zielzellen Leukozyten aus dem peripheren Blut sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammen die Tumorzellen und die Leukozyten aus demselben Patienten.
Bei dem Wirkstoff kann es sich um einen wie oben beschriebenen Wirkstoff oder um eine wie oben beschriebene Wirkstoff-Kombination handeln. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass in Schritt (a) mehrere Mischkulturen parallel mit verschiedenen Konzentrationen des Wirkstoffs oder der Wirkstoff-Kombination inkubiert werden. Das Inkontaktbringen des Wirkstoffs mit den Zielzellen und die nachfolgende Inkubation können erfolgen, wie es oben beschrieben wurde.
Die Bestimmung der Zellzahl der Zielzellen in der Mischkultur, die mit dem Wirkstoff oder der Wirkstoffkombination bei verschiedenen Konzentrationen behandelt wurde, erfolgt vorzugsweise anhand eines wie oben beschriebenen für die Zielzelle spezifischen Merkmals oder Musters aus Merkmalen. Es ist besonders bevorzugt, dass das Merkmal mittels PCR, insbesondere digitaler PCR, oder Sequenzierung nachgewiesen wird.
Wie es bereits vorliegend an anderer Stelle beschrieben ist, kann die Anzahl der Zielzellen durch direkte Messung der absoluten Zellzahl oder indirekt durch Messung einer Signalstärke, welche mit der Zellzahl assoziiert ist, bestimmt werden.
Sofern die Inkubation der Mischkultur mit dem Wirkstoff oder mit der Wirkstoffkombination in Schritt (a) des obigen Verfahrens bei verschiedenen Konzentrationen des Wirkstoffs oder der Wirkstoffkombination erfolgt, kann auch die IC₅₀ für die Zielzellen in der Mischkultur bestimmt werden, wie es an anderer Stelle vorliegend beschrieben wurde. Je geringer dieser Wert ist, desto höher ist die Wirksamkeit des Wirkstoffs oder der Wirkstoffkombination.
Wirkstoffe oder Wirkstoff-Kombinationen können als wirksam in Bezug auf die Zielzellen des jeweiligen Patienten angesehen werden, wenn sie nach Inkubation mit der Mischkultur zu einer Verringerung der Anzahl von Zielzellen relativ zu einer Referenz-Mischkultur führen, wobei letztere nicht mit dem Wirkstoff inkubiert wurde oder mit einer Konzentration des Wirkstoffs, die geringer ist als die in Schritt (a) eingesetzte Konzentration. Vorzugsweise ist die Anzahl der Zielzellen nach der Inkubation mit dem Wirkstoff oder mit der Wirkstoff-Kombination gegenüber der Referenz-Kultur um etwa 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% verringert. Die Verringerung der Anzahl der Zielzellen gegenüber der Referenz-Kultur kann erfindungsgemäß auch etwa 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% oder etwa 1000% betragen.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, den Gegenstand der Erfindung weiter zu veranschaulichen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die quantitative Bestimmung des Mikrosatellitenmarkers D22S430 aus Kontroll-Mischkulturen (A) und Mischkulturen, die mit 10 µM Nilotinib behandelt wurden (B). Allel 1 (1) verweist auf das Vorliegen einer geringen Menge von Nicht-Tumorzellen in der Mischkultur. Allel 2 (2) zeigt die Gesamtmenge der in der Kultur vorhandenen Zellen an, d.h. Tumorzellen und Nicht-Tumorzellen.
2 zeigt das berechnete Verhältnis von Zielzellen zu Nicht-Zielzellen in der Kontroll-Mischkultur und in der Mischkultur, die mit 10 µM Nilotinib behandelt wurden.
3 zeigt die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung des Markers IVS27AAAT2.1 in Mischkulturen aus Zellen der MPNST 462 Tumorzelllinie und Fibroblasten, die mit Rapamycin behandelt wurden.
4 zeigt die graphische Darstellung des Verhältnisses von Tumorzellen zu Nicht-Tumorzellen in Mischkulturen aus Zellen der MPNST 462 Tumorzelllinie und Fibroblasten, die mit 0 µM, 10 µM, und 100 µM Rapamycin behandelt wurden.
5 zeigt eine graphische Darstellung der Spezifität von Rapamycin bei verschiedenen Konzentrationen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Bestimmung der Spezifität des Wirkstoffs Nilotinib für Zellen eines vestibulären Schwannomas
Zellkultur
Eine Gewebeprobe aus einem Akustikusneurinom wurde mit einem Skalpell vorsichtig zerkleinert und in Standard-Kulturmedium (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) mit 10% fetalem Kälberserum (FBS), 2 mM Glutamin und 2 mM Natriumpyruvat) bei 37°C und 10% CO₂ für einen Tag kultiviert. Anschließend wurde Collagenase/Dispase in einer Endkonzentration von 0,5 mg/mL hinzugegeben, und das Tumorgewebe wurde bei 37°C und 10% CO₂ für einen Tag enzymatisch verdaut, um die Zellen aus dem Zellverband zu lösen. Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren einer 10 ml Pipette wurden die Tumorzellen anschließend dissoziiert. Um vollständig vereinzelte Zellen zu gewinnen, wurden die Zellen anschließend durch ein Sieb mit einer Porengröße von 100 μm geleitet. Durch 5-minütige Zentrifugation bei 1500 UpM wurden die Zellen gesammelt und abschließend in ein für Schwannzellen geeignetes Kultivierungsmedium (Standard-Medium mit den folgenden, zusätzlichen Komponenten: 0,5 mM 3-Isobutyl-L-methylxanthin, 2 nM humanes Heregulin, 0,5 μM Forskolin und 2,5 μM Insulin) überführt.
Behandlung mit Nilotinib
Jeweils 10⁵ Zellen wurden in Parallelansätzen in 2 mL Medium in einer Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät. Nach 24 Stunden bei 37°C und 10% CO₂ wurde das jeweilige Medium durch (1) Medium mit 0,2% DMSO (Kontrolle) oder (2) Medium mit 10 μM Nilotinib und 0,2% DMSO (Behandlung) ausgetauscht. Beide Ansätze wurden für weitere 10 Tage bei 37°C und 10% CO₂ inkubiert, wobei täglich die Hälfte des Mediums gegen neues Medium der jeweiligen Zusammensetzung ausgetauscht wurde. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von 0,05% Trypsin-EDTA von der Oberfläche der Vertiefung abgelöst und gesammelt. Anschließend wurde die DNA mit einem handelsüblichen Kit (Qiagen) präpariert.
Genetische Untersuchung mittels Mikrosatelliten-Typisierung Die DNA-Proben, die aus den mit Nilotinib behandelten Zellen gewonnen wurden, und die DNA-Proben, die aus den unbehandelten Kontrollzellen gewonnen wurden, wurden anschließend in eine PCR eingesetzt. Die PCR wurde mit folgenden Primern durchgeführt:
Primer 1: 5'-TTGTGCAGAATGCAGAAAGG-3' - SEQ ID NO:1
Primer 2: 5'-AATGATCTTGGCTTTTCCTCC-3 - SEQ ID NO:2
Hierbei war Primer 1 mit dem Fluoreszenz-Farbstoff FAM markiert. Die Primer binden im Bereich des Mikrosatelliten-Markers D22S430. Die PCR wurde in 10 µl Lösungsvolumen für 31 Zyklen durchgeführt. Die Temperatur während des Anlagerungsschrittes betrug 55°C. Abschließend wurden 1 µl PCR Produkt mit 15 µl Formamid und 0,2 µl Größenstandard (ROX^TM) gemischt, und es wurde eine Fragmentanalyse an einem Sequenziergerät (ABI310) durchgeführt. In der Auswertung der PCR-Ergebnisse korreliert die Fläche unter den Peaks mit der Menge der amplifizierten Allele des Mikrosatelliten-Markers D22S430. Eine automatische Auswertung der Fläche erfolgte durch das Programm GeneScan.
Ergebnis
Die Auswertung ergab sowohl in der mit Nilotinib behandelten Probe als auch in der Kontrollprobe jeweils zwei Gruppen von Peaks, welche die beiden Allele des Mikrosatelliten-Marker D22S430 darstellen (1). Die Fläche der ersten Gruppe von Peaks (in 1 als "1" bezeichnet) war dabei wesentlich kleiner als die Fläche der zweiten Gruppe (in 1 als "2" bezeichnet). Dies bedeutet, dass Allel 1 des Mikrosatelliten-Marker D22S430 in den Tumor-Zellen dieses Vestibularis-Schwannoms verloren gegangen ist. Bei Vestibularis-Schwannomen ist bekannt, dass oftmals eines der beiden NF2-Allele verloren geht. Die kleine Menge an Allel 1 stammt folglich aus Nicht-Tumorzellen, die in geringer Anzahl in der ursprünglichen Gewebeprobe des Akustikusneurinoms vorhanden waren. Allel 2 des Mikrosatelliten-Markers D22S430 ist sowohl in Tumor- als auch in Nicht-Tumorzellen vorhanden. Es ist in 1 erkennbar, dass sich nach der Inkubation mit Nilotinib für einen Zeitraum von 10 Tagen die Anzahl von Zellen, die das Allel 1 enthalten, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle erhöht hat (1, B). Die Berechnung der Flächen unter den Peaks ergab, dass die Anzahl an Tumorzellen im Verhältnis zu den Nicht-Tumorzellen durch die Behandlung deutlich verringert wurde (Tabelle 1, 2).
Da Allel 2 in allen Zellen vorkommt, d.h. sowohl in Tumorzellen als auch in Nicht-Tumorzellen, erfolgt die Berechnung des quantitativen Verhältnisses von Tumorzellen zu Nicht-Tumorzellen auf folgende Weise:
(Menge Allel 2 – Menge Allel 1)/Menge Allel 1
Da die wie oben gemessene Menge der jeweiligen Allele direkt mit der Anzahl der entsprechenden Zellarten korreliert ist, spiegelt das Ergebnis der obigen Berechnung das quantitative Verhältnis von Tumorzellen zu Nicht-Tumorzellen wider.

(Allel 2–Allel 1)/Allel 1

Lauf 1 Lauf 2 Lauf 3 Lauf 4 Durchschnitt Std.

Kontrolle 12,3 16,8 19,9 10,4 14,9 4,3

10 µM Nilotinib 2,0 2,0 2,5 2,3 2,2 0,2

Tabelle 1: Verhältnis der Flächen unter den Peak-Gruppen, die Allel 1 und Allel 2 zugeordnet werden können, errechnet als (Allel 2–Allel 1)/Allel 1, n = 4, Std. = Standardaweichung
Beispiel 2: Bestimmung der Spezifität des Wirkstoffs Rapamycin für Zellen der Tumorzelllinie MPNST 462
Herstellung einer Mischkultur
Die Tumorzelllinie MPNST 462 basiert auf einem malignen Nervenscheidentumor. Etwa 2000 Zellen der MPNST 462 Tumorzelllinie wurden gemeinsam mit etwa 8000 humanen Fibroblasten einer Primärkultur in 2 mL Standardmedium (siehe oben) in einer der 6 Vertiefungen einer Kulturplatte ausgesät und kultiviert.
Behandlung
Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C und 10% CO₂ wurde der antiproliferative Wirkstoff Rapamycin zu den Mischkulturen hinzugefügt, wobei Konzentrationen von 0, 10 und 100 nM im Medium erreicht wurden. Die Kulturen wurden für 5 Tage bei 37°C und 10% CO₂ inkubiert, wobei die Hälfte des Mediums nach 3 Tagen einmal erneuert wurde. Nach 5 Tagen wurden die Zellen durch Zugabe von 0,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA von der Oberfläche der Vertiefung abgelöst und durch Zentrifugation gesammelt.
DNA Präparation
Die DNA der Zellen wurde isoliert, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde.
Genetische Untersuchung mittels Mikrosatelliten-Typisierung
Aus den einzelnen DNA-Proben wurden jeweils 7 Mikrosatelliten Marker (Tabelle 2) mittels PCR amplifiziert. Die PCR wurde in 10 µl Lösungsvolumen für 31 Zyklen durchgeführt. Die Temperatur während des Anlagerungsschrittes betrug 55 bis 60°C. 1 µl jeder PCR Reaktion wurde mit 15 µl Formamid und 0,2 µl Größenstandard (ROX^TM) vermischt und anschließend in dem Sequenziergerät ABI310 untersucht.
Für die Bestimmung des quantitativen Verhältnisses von Tumor-Zellen zu Nicht-Tumorzellen wurde der Marker IVS27AAAT2.1 ausgewählt. Bei diesem Marker weisen die Tumorzellen der Zelllinie MPNST 462 nur ein Allel von 375 bp auf (3, oberste Reihe), während die Fibroblasten zwei Allele von 375 bp bzw. 379 bp aufweisen (3, zweite Reihe von oben). Diese Konstellation simuliert eine Primärkultur aus Tumorzellen und Nicht-Tumorzellen, bei der die Tumorzellen ein Allel verloren haben.
Die gemessene Fläche von Allel 375 des Markers IVS27AAAT2.1 ist proportional zur Anzahl der Gesamtzellen (Tumorzellen plus Nicht-Tumorzellen), und die Fläche von Allel 379 ist proportional zur Anzahl von Nicht-Tumorzellen. Daher ergibt sich das Verhältnis von Tumor- zu Nicht-Tumorzellen als:
(Allel 375 – Allel 379) / Allel 379
Der Marker IVS27AAAT2.1 wird bei DNA aus allen unbehandelten und behandelten Mischkulturen wie oben beschrieben mittels PCR amplifiziert und analysiert. Die PCR sowie die anschließende Analyse wurden insgesamt 3 bis 4 Mal wiederholt. Daraus wurden Mittelwerte und Standardabweichungen ermittelt.
Die Ergebnisse der Analysen sind in 4 graphisch dargestellt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Spezifität und/oder Wirksamkeit eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs, Schritte umfassend, bei denen man (a) eine Mischkultur, die Zielzellen und Nicht-Zielzellen umfasst, mit dem Wirkstoff inkubiert, (b) nach der Inkubation das quantitative Verhältnis der Zielzellen zu den Nicht-Zielzellen in der Mischkultur bestimmt, (c) das ermittelte Verhältnis mit einem Referenzwert vergleicht, der in einer Mischkultur bestimmt wurde, die nicht mit dem Wirkstoff inkubiert oder mit einer anderen Konzentration des Wirkstoffs inkubiert wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielzellen Tumorzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Tumorzellen solche aus Dickdarm, Dünndarm, Mastdarm, Zwölffingerdarm, Magen, Bauchspeicheldrüse, Leber, Gallenblase, Lunge, Gehirn, Ösophagus, Niere, Brust, Schilddrüse, Eierstöcken, Gebärmutterhals, Hoden oder Haut sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Nicht-Zielzellen Nicht-Tumorzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Nicht-Zielzellen Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen oder Bindegewebszellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, bei dem in Schritt (b) die Anzahl der Zielzellen anhand von mindestens einem ersten Merkmal bestimmt wird, das für die Zielzellen spezifisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, bei dem in Schritt (b) die Anzahl der Nicht-Zielzellen anhand von mindestens einem zweiten Merkmal bestimmt wird, das (i) für die Nicht-Zielzellen spezifisch ist, oder (ii) in Zielzellen und Nicht-Zielzellen vorkommt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das erste und/oder zweite Merkmal anhand eines Mikrosatelliten-Markers bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Mikrosatelliten-Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den NF2-Markern CRYB2, D22S275, NF2CA3, D22S268 und D22S430.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–9, wobei das erste und/oder zweite Merkmal mit einem molekularbiologischen Nachweisverfahren bestimmt wird, das eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), eine digitale PCR, oder eine kompetitive PCR umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–10, wobei der Wirkstoff ein chemotherapeutischer Wirkstoff ist, der zur Abtötung von Tumorzellen führt und/oder deren Wachstum hemmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–11, wobei der Referenzwert in Schritt (c) anhand einer Mischkultur erhalten wurde, die unter denselben Bedingungen inkubiert wird, wie die Mischkultur in Schritt (a).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei die Zielzellen der Mischkulturen von Schritt (a) und Schritt (c) von derselben Zell- oder Gewebeprobe eines Patienten erhalten wurden.
Verfahren zur Identifizierung eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs, bei dem man (a) verschiedene Substanzen in einem Screening auf eine Wirksamkeit gegen die Zielzellen untersucht, (b) Substanzen, für die eine Wirksamkeit gegen die Zielzellen beobachtet werden konnte, in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1–13 auf ihre Spezifität gegen die Zielzellen untersucht.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Screening in Schritt (a) um ein Hochdurchsatz-Screening handelt.
Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines gegen bestimmte Zielzellen gerichteten Wirkstoffs, Schritte umfassend, bei denen man (a) eine Mischkultur, die Zielzellen und Nicht-Zielzellen umfasst, mit mindestens einem Wirkstoff inkubiert, (b) nach der Inkubation die Anzahl der Zielzellen in der Mischkultur bestimmt, (c) die Anzahl der Zielzellen mit einem Referenzwert vergleicht, der in einer Mischkultur bestimmt wurde, die nicht oder mit einer geringeren Konzentration des Wirkstoffs inkubiert wurde, wobei eine geringere Anzahl der Zielzellen in der Mischkultur von Schritt (b) darauf hinweist, dass der Wirkstoff gegen die Zielzellen wirksam ist.