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Technisches Gebiet
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Die
Erfindung betrifft genetische Tests für Personen, die ein oder zwei
Kopien eines mutierten, mit der erblichen Hämochromatose assoziierten Gens
tragen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von mit
einer gewöhnlichen
Mutation dieses Gens assoziierten neuen Markern, die die Anwesenheit
oder Abwesenheit der Mutation anzeigen.
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Hintergrund der Technik
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Die
erbliche Hämochromatose
(hereditary hemochromatosis, HH) ist eine erbliche Störung des
Eisenstoffwechsels, wobei im Körper überschüssiges Eisen
angesammelt wird. Bei erkrankten Personen führt dieses überschüssige Eisen zu Schädigungen,
da es sich in verschiedenen Organen ansammelt und zu deren Versagen
führt,
wobei Zirrhose, Diabetes, Sterilität und andere schwere Erkrankungen
auftreten. Weder der genaue physiologische Mecha- nismus der übermäßigen Eisenansammlung
noch das bei dieser Krankheit defekte Gen sind bekannt.
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HH
wird als rezessives Merkmal vererbt; Heterozygoten sind asymptomatisch,
und nur Homozygoten sind von der Krankheit betroffen. Schätzungsweise
tragen etwa 10% der westeuropäischen
Bevölkerung
eine HH-Genmutation, und in den Vereinigten Staaten gibt es etwa
eine Million Homozygoten. Obwohl HH letztlich zu Schäden führt, ist
der Hauptteil der Homozygoten nicht diagnostiziert. Tatsächlich wird
geschätzt,
dass nur etwa 10.000 Menschen in den USA mit dieser Krankheit diagnostiziert
wurden. Die Symptome werden häufig mit
denen anderer Krankheiten verwechselt, und die schweren Schäden der
Krankheit treten oftmals nicht sofort auf. Es wäre wünschenswert, ein Verfahren
bereitzustellen, um Personen zu identifizieren, die letztendlich symptomatisch
werden, damit rechtzeitig Maßnahmen
ergriffen werden können,
um eine schwere Gewebsschädigung
zu vermeiden. Ein Grund, warum keine frühe Diagnose stattfindet, ist
die Unzulänglichkeit
derzeit vorhandener diagnostischer Verfahren zur Bestimmung, welche
Personen ein Risiko aufweisen.
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Obwohl
Bluteisenparameter als Reihenuntersuchung verwendet werden können, wird
für eine
Bestätigung
der Diagnose häufig
eine HLA-Typisierung verwendet, welche umständlich, unspezifisch und kostenintensiv
ist, und/oder eine Leberbiopsie, die unerwünscht invasiv und teuer ist.
Entsprechend wurde versucht, kostengünstige und nicht-invasive Diagnoseverfahren
sowohl für
die Erkennung von Homozygoten mit vorliegender Krankheit, bei denen
eine Erkennung vor dem Auftreten von Symptomen eine Intervention
zu Verhinderung von Organschädigungen
gestatten würde,
als auch für
die Identifizierung von Trägern
zu entwickeln. Die Notwendigkeit einer solchen Diagnose ist beispielsweise
in Finch, C.A., West J Med (1990) 153: 323–325; McCusick, V. et al. Mendelian
Inheritance in Man 11. Aufl., Johns Hopkins University Press (Baltimore,
1994) SS. 1882–1887;
Report of the Joint World Health Organization/HH Foundation/French
HH Association Meeting, 1993, dargelegt.
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Obwohl
das die mit HH assoziierte Mutation tragende Gen derzeit nicht bekannt
ist, haben genetische Verwandtschaftsstudien in HH-Familien gezeigt,
dass das verantwortliche Gen bei Kaukasiern auf dem Chromosom 6
nahe der HLA-Region bei 6p2.13 liegt (Cartwright, Trans Assoc Am
Phys (1978) 91: 273–281;
Lipinski, M. et al. Tissue Antigens (1978) 11: 471–474). Innerhalb
dieses Gens bewirkt eine einzelne Mutation die Mehrheit der krankheitsverursachenden
Chromosomen, die in der heutigen Population vorhanden sind. Dies
wird nachstehend als "gewöhnliche" oder "angestammte" oder "gewöhnliche
angestammte" (common ancestral)
Mutation bezeichnet. Diese Ausdrücke
werden austauschbar verwendet. Es scheint, dass 80–90% aller
HH-Patienten mindestens eine Kopie einer gewöhnlichen angestammten Mutation
tragen, welche spezifische Formen bestimmter Marker nahe an diesem
angestammten HH-Gen mit sich trägt.
Diese Marker liegen, als erste Annäherung, in der Allelform vor,
in der sie beim Auftreten der Mutation vorhanden waren. (Siehe beispielsweise
Simon, M. et al. Am J Hum Genet (1987) 41: 89–105; Jazwinska, E.C. et al.
Am J Hum Genet (1993) 53: 242–257;
Jazwinska, E.C. et al. Am J Hum Genet (1995) 56: 428–433; Worwood,
M. et al. Brit J Hematol (1994) 86: 833–846; Summers, K.M. et al.
Am J Hum Genet (1989) 45: 41–48).
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Obwohl
jeder dieser Marker bei der Identifizierung von Individuen, die
dieses defektive HH-Gen tragen, vermeintlich brauchbar ist, sind
natürlich
im Lauf der Zeit durch Überkreuzungsvorgänge einige
der angestammten Allele von dem für HH verantwortlichen relevanten
genetischen Locus getrennt worden. Daher ist zur Zeit kein einzelner
Marker spezifisch genug, um alle Individuen, die die angestammte
HH-Mutation tragen, zu identifizieren.
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Es
wurden mehrere Marker an der ungefähren Lokation des mit HH assoziierten
Gens beschrieben. Gyapay, G. et al. Nature Genetics (1994) 7: 246–339 beschreiben
die Marker D6S306 und D6S258, von denen nachstehend nachgewiesen
wird, dass sie sich in der unmittelbaren Region des HH-Gens befinden.
Diese Marker bestehen aus Mikrosatelliten-Regionen, die (CA)n-Repeats unterschiedlicher Längen enthalten.
Worwood, M. et al. Brit J Hematol (1994) 86: 833–846 (nachstehend) beschreiben
ein Allel an D6S265 und Jazwinska, E.C. et al. Am J Hum Genet (1994)
3: 2043–2046
beschreiben D6S105 als mit einem HH-spezifischen Genotyp assoziiert.
Stone, C. et al. Hum Molec Genet (1994)3: 2043–2046 beschreiben ein zusätzliches HH-assoziiertes
Allel an D6S1001. Wie nachstehend beschrieben ist, wurde eine Vielzahl
von zuvor nicht entdeckten Mikrosatelliten-Markern und das mit dem
angestammten HH-Gendefekt assoziierte relevante Allel gefunden,
wodurch die Entdeckung von Genotypen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit
mit der Anwesenheit des gewöhnlichen
mutierten HH-Gens assoziiert sind, möglich ist. Zusätzlich wurden
drei mit dem HH-Gen assoziierte Einzelbasenpaar-Polymorphismen identifiziert,
welche bei zusätzlichen
diagnostischen Genotypen aufgenommen werden können. Die nachstehend als mit
HH assoziiert beschriebenen diagnostischen Genotypen sind in der
Bevölkerung
selten, was mit der Häufigkeit
der HH-Genmutation übereinstimmt.
Sie sind jedoch bei einem großen
Anteil der durch HH betroffenen Individuen vorhanden. Entsprechend
kann die Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Genotypen als schnelles,
günstiges
und nicht-invasives Verfahren verwendet werden, um bei einem Individuum
die Anwesenheit oder Abwesenheit der gewöhnlichen Version des defektiven HH-Gens
festzustellen.
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Jazwinska
et al., Am J Hum Genet (1993) Aug; 53(2): S 347–352 versuchen die Lokalisierung
des Hämochromatose-Gens
unter Verwendung bestimmter Mikrosatelliten-Marker zu präzisieren.
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Gasparini
et al., Hum Mol Genet (1993) May; 2(5): S571–576 führten eine Stammbaum-Analyse
bei italienischen Familien mit Hämochromatose
durch, um die Genlokation des hereditären Hämochromatose-Gens in Bezug
auf die HLA-Klasse IA und F Loci zu präzisieren.
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Totaro
et al., Genomics (1996) Feb 1; 31(3): S319–326 versuchten, die Lokation
des hereditären
Hämochromatose-Krankheitsgens
durch physikalische und Transkriptions-Genkartierung zu bestimmen.
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Totaro
et al., Hum Genet (1995); 95: S429–434 beschreiben die Verwendung
einer Strategie auf PCR-Basis, um Polymorphismen zu entdecken, die
eine Identifizierung und Charakterisierung des hereditären Hämochromatose-Krankheitsgens
erlauben können.
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Yaouanq
et al., AM J Hum Genet (1994); 54: S252–263 verwenden eine Stammbaum-Disequilibrium-Analyse
von Krankheits- und
normalen Chromosomen, um die Position des hereditären Hämochromatose-Krankheitsgens
weiter zu präzisieren.
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Nikiforov
et al., Nucleic Acids Research (1994); Bd. 22, Nr. 20: S4167–4175 beschreiben
ein Verfahren zur Kartierung einzelner Nukleotid-Polymorphismen
in DNA unter Verwendung eines auf PCR basierenden Verfahrens.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein geeignetes (bequemes) Verfahren, um Individuen
auf die Anwesenheit oder Abwesenheit, oder die Wahrscheinlichkeit
der Anwesenheit oder Abwesenheit, einer gewöhnlichen HH-assoziierten Mutation
unter Verwendung genetischer Methoden, die nicht-invasiv sind und
leicht angewendet werden können,
zu testen. Es wird lediglich eine Probe, enthaltend genomische DNA
enthaltende Zellen des Individuums, welches getestet werden soll,
benötigt.
Die vorliegende Erfindung umfasst Materialien und Ausrüstungssätze (Kits),
die bei der Durchführung
der genetischen Tests brauchbar sind. Die Allel-Varianten an bestimmten Lokationen nahe
des HH-Gens werden durch kennzeichnende (distinktive) Längen von
Mikrosatelliten-Wiederholungen oder durch spezifische Einzelbasenpaar-Differenzen
in der DNA-Sequenz (hier als "Basenpaar-Polymorphismus" bezeichnet) markiert.
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Es
wird ein Verfahren offenbart, um die Wahrscheinlichkeit der Anwesenheit
oder Abwesenheit einer Genmutation für die erbliche Hämochromatose
(HH) bei einem Individuum zu bestimmen, wobei das Verfahren umfasst,
dass genomische DNA aus den Zellen des Individuums erhalten und
auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Genotyps analysiert wird,
der mindestens durch einen nicht-optionalen Marker definiert wird, welcher
die folgenden Mikrosatelliten-Repeat-Allele umfasst: 19D9:205; 18B4:235;
1A2:239; 1E4:271; 24E2:245; 2B8:206; 3321-1:197; 4073-1:182; 4440-180;
4440-2:139; 731-1:177; 5091-1:148; 3216-1:221; 4072-2:148; 950-1:142;
950-2:164; 950-3:165; 950-4:128; 950-5:180; 950-6:151; 950-8:137; und 63-1:151. Bei
der für
die Mikrosatelliten-Repeat-Allele angegebenen Schreibweise bedeutet
die Zahl nach dem Bindestrich die Anzahl der Nukleotide in dem HH-assoziierten Allel
zwischen und einschließlich
der flankierenden Primer, wenn die Primer die hier veranschaulichten
sind. Die Abwesenheit dieses Genotyps weist auf die Wahrscheinlichkeit
der Abwesenheit der HH-Genmutation in dem Genom des betreffenden
Individuums hin. Die Anwesenheit dieses Genotyps weist auf die Wahrscheinlichkeit
der Anwesenheit der HH-Genmutation in dem Genom des betreffenden
Individuums hin.
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Während die
Anwesenheit nur eines dieser Allele auf eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für die Anwesenheit
des gewöhnlichen
angestammten genetischen HH-Defekts hinweist, wird diese Wahrscheinlichkeit durch
die Anwesenheit multipler Allele dieser nicht-optionalen Marker
weiter erhöht.
Daher umfassen die zu bestimmenden Genotypen vorzugsweise mindestens
zwei, besonders bevorzugt mindestens drei, und am meisten bevorzugt
mindestens vier, und vorzugsweise mehr als vier dieser Allele. Zusätzlich wird
die statistische Wahrscheinlichkeit der Ergebnisse durch Kombination
der Information über
die Anwesenheit oder Abwesenheit ein oder mehrerer dieser nicht-optionalen
Marker mit der Information über
die Anwesenheit oder Abwesenheit von im Stand der Technik bekannten
diagnostischen Allelen weiter erhöht, einschließlich D6S258:199,
D6S265:122, D6S105:124, D6S306:238, D6S464:206 und 0651001:180.
Die Vorhersagekraft dieser krankheitsassoziierten Allele bei der
Messung in humaner genomischer DNA kann quantifiziert werden. Ein
Beispiel eines rechnergestützen
Verfahrens hierfür
ist in Terwilliger, J. D. Am J Hum Genet (195) 56: 777–787 angegeben.
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Zusätzlich wurden
HHP-1, HHP-19 und HHP-29 (nachstehend beschrieben) Basenpaar-Polymorphismen
etabliert; die Anwesenheit des HH-assoziierten Allels eines dieser
Basenpaar-Polymorphismen, insbesondere in Kombination mit einem
beliebigen HH-mutationsassoziierten
Mikrosatelliten-Repeat-Allel weist auf die Anwesenheit der gewöhnlichen
HH-Genmutation hin.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung daher ein in-vitro-Verfahren
zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwe senheit der gewöhnlichen
angestammten erblichen Hämochromatose-(HH)-Genmutation
in einem Individuum, wobei das Verfahren umfasst: Bewerten der von
dem Individuum erhaltenen DNA; und Bewerten der DNA auf die Anwesenheit
oder Abwesenheit des HH-assoziierten
Allels des hier als HHP-1:A, HHP-19:G und HHP-29:G bezeichneten
Basenpaar-Polymorphismus, wobei die Abwesenheit des HH-assoziierten
Allels auf die Wahrscheinlichkeit der Abwesenheit der angestammten
HH-Genmutation in dem Genom des Individuums und die Anwesenheit
des HH-assoziierten Allels auf die Wahrscheinlichkeit der Anwesenheit der
HH-Genmutation in dem Genom des Individuums hinweist. Vorzugsweise
umfasst das Verfahren auch die Bestimmung eines Genotyps, der eine
Kombination des Basenpaar-Allels mit einem HH-assoziierten Mikrosatelliten-Repeat-Allel darstellt.
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Die
Erfindung bezieht sich ferner auf DNA-Primerpaare für die PCR-Vervielfältigung
(Amplifikation), welche die Mikrosatelliten-Repeat-Allele flankieren
und welche die Marker für
den Basenpaar-Polymorphismus flankieren, der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
brauchbar ist, und auf Ausrüstungssätze (Kits),
welche diese Primerpaare enthalten. Die Erfindung bezieht sich auch
auf Primer, welche die Bestimmung des Basenpaar-Polymorphismus mit einem Oligonukleotid-Ligations-Assay
(OLA) oder mit alternativen Verfahren erlauben. Die Erfindung betrifft
ebenso die Verwendung der Nukleotidsequenz-Information um die Mikrosatelliten-Repeats
herum, um weitere Primerpaare für
eine Vervielfältigung
zu entwickeln. Die Anmelder haben extensive Sequenzinformationen
etwa 500 Basenpaare in jeder Richtung der Marker 18B4, 19D9, 1A2,
1E4, 24E2, 2B8 und 63-1 bereit gestellt. Das Vorhandensein dieser
Sequenzinformation bietet weitere Möglichkeiten für die Entwicklung
von Primern für
die Vervielfältigung
der betreffenden DNA-Region.
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Entsprechend
bezieht sich die Erfindung auch auf Primer, welche auf der Basis
dieser Sequenzinformation entwickelt wurden, und auf ein computer-lesbares
Medium, auf welchem die in der nachstehend beschriebenen 1A–1W dargestellten
Nukleotidsequenzen, oder Fragmente davon, aufgezeichnet sind. Die
beanspruchten Fragmente sind diejenigen, die nicht mit derzeit in
computer-lesbarer Form erhältlichen übereinstimmen.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt die Sequenzinformation, welche
die mehrere erfindungsgemäße Marker
umgebenden Anteile des Genoms betrifft. 1A zeigt
1260 bp um 18B4; 1B zeigt 1260 bp um 19D9; 1C zeigt
1 kb um 1A2; 1D zeigt 1380 bp um 1E4; 1E zeigt
1260 bp um 24E2; 1F zeigt etwa 1 kb um 2B8; 1G zeigt
731-1 einschließende
Sequenzen; 1H zeigt 5091-1 einschließende Sequenzen; 1I zeigt 4440-1
einschließende
Sequenzen; 1J zeigt 4440-2 einschließende Sequenzen; 1K zeigt
4073-1 einschließende
Sequenzen; 1L zeigt 3321-1 einschließende Sequenzen; 1M zeigt
3216-1 einschließende
Sequenzen; 1N zeigt 4072-2 einschließende Sequenzen; 10 zeigt
950-1 einschließende
Sequenzen; 1P zeigt 950-2 einschließende Sequenzen; 1R zeigt
950-3 einschließende
Sequenzen; 1S zeigt 950-4 einschließende Sequenzen; 1T zeigt
950-5 einschließende
Sequenzen; 1U zeigt 950-6 einschließende Sequenzen; 1V zeigt
950-8 einschließende
Sequenzen; 1W zeigt 63-1 einschließende Sequenzen; 1X zeigt
65-1 einschließende
Sequenzen; 1Y zeigt 65-2 einschließende Sequenzen; 1Z zeigt
63-2 einschließende
Sequenzen; 1AA zeigt 63-3 einschließende Sequenzen; 18B zeigt 373-8 einschließende Sequenzen; 1CC zeigt 373-29 einschließende Sequenzen; 1DD zeigt 68-1 einschließende Sequenzen; 1EE zeigt 241-6 einschließende Sequenzen; 1FF zeigt 241-29 einschließende Sequenzen.
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Die
Lokation der Mikrosatelliten-Repeat-Sequenz selbst ist in diesen
Figuren unterstrichen.
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2 zeigt
die bei der Vervielfältigung
und der OLA-Bestimmung des erfindungsgemäßen Basenpaar-Polymorphismus
verwendeten Primer.
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Ausführungsformen
der Erfindung
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Es
wurde eine Vielzahl von neuen Marken gefunden, die Mikrosatelliten-Repeats
unterschiedlicher Länge
aufweisen und die mit einer angestammten Mutation in dem mit der
erblichen Hämatochromatose
assoziierten Gen assoziiert sind, und es wurden die mit dem HH-Gendefekt
assoziierten Allelformen charakterisiert. Im Allgemeinen befinden
sich die Marker auf dem Chromosom 6 in der Nähe des mit dem defektiven Genotyp
assoziierten Locus; sie zeigen eine Vielzahl von Allelvariationen,
die gekennzeichnet sind durch den Unterschied in der Anzahl der
Nukleotide der Zwischensequenz (intervenierenden Sequenz) zwischen
den flankierenden Sequenzen, die bei allen Personen konserviert
sind. Die Nukleotid-Zwischensequenzen bestehen im Wesentlichen aus
Di-, Tri- und Tetranukleotid-Repeats, am häufigsten des Dinukleotids (CA)n. Wie im Stand der Technik allgemein bekannt,
ist dieser Typ von Repeat als "Mikrosatellit"-Repeat bekannt.
Die die Marker charakterisierenden Mikrosatellit-Repeatregionen
können
einfache Mikrosatellit-Repeats sein, die nur einen Typ von Repeatsequenz
enthalten, oder sie können
zusammengesetzt sein. Zusätzlich
zu (CA)n werden (CT)n und
andere Repeatsequenzen gefunden.
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Diese
Repeatsequenzen werden hier allgemein als "Mikrosatellit-Repeats" bezeichnet. Wie nachstehend dargestellt,
werden die in Bezug auf jeden Marken konservierten flankierenden
Sequenzen von Nukleotid-Zwischensequenzen unterbrochen, die eine
Anzahl von etwa 110 bis etwa 300 Basen aufweisen. Im Allgemeinen
unterscheidet sich die Größe jedes
Allels im Zusammenhang mit einem einzelnen Marker um 2–4 Basen
von dem nächsten
Allel.
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Der
Ausdruck "Marker", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich entweder auf einen Basenpaar-Polymorphismus oder
auf eine Mikrosatelliten-Region, in welcher eine unterschiedliche
Anzahl von (CA)n oder anderen Repeats mit
konservierten Regionen flankiert werden; die konservierten Regionen,
die entweder den Basenpaar-Polymorphismus oder den Mikrosatelliten-Repeat
flankieren, können
vorteilhaft verwendet werden, um Primer für die Vervielfältigung
der relevanten DNA-Regionen herzustellen, In einigen Fällen werden zwei
Sätze von
PCR-Primern benötigt:
einer, um die allgemeine Region interessierender DNA zu vervielfältigen,
und der andere, um eine OLA-Bestimmung des Basenpaar-Polymorphismus durchzuführen. Werden
die Mikrosatelliten-Regionen unter Verwendung der hier angegebenen
Primer vervielfältigt,
die konservierte Regionen an einem beliebigen Ende der Repeats repräsentieren,
ergeben sich Zwischensequenzen von unterschiedlicher Länge. Für jeden
Marker hat eines der Allele, die in der untersuchten Testgruppe
gefunden werden, eine höhere
Frequenz bei Individuen, von denen bekannt ist, dass sie von HH
betroffen sind, als in der allgemeinen Bevölkerung. Ein individueller
Marker allein lässt
keine vollständige
Bestimmung (Aussage) zu, da jedes mit HH assoziierte Allel wenigstens
in einigen normalen Individuen oder Chromosomen vorliegt. Die Anwesenheit
der mit HH assoziierten Form auch nur eines Markers deutet jedoch
auf eine erhöhte
Wahrscheinlichkeit hin, dass die Person die Mutation trägt. Indem
multiple Marker, mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei,
insbesondere bevorzugt mindestens vier, oder eine größere Vielzahl
solcher Allele verwendet wird, um einen charakteristischen Genotyp
zu bestimmen, wird dieses Problem soweit vermindert, dass eine hohe
Aussagekraft erhalten wird. Die Häufigkeit des Auftretens der
charakteristischen Genotyp-Kombination von Allelen, die in von HH
betroffenen Individuen am häufigsten
auftritt, liegt bei normalen Personen bisher bei Null; werden mehr
Individuen getestet, wird sicherlich gefunden werden, dass eine
kleine Anzahl der Normalbevölkerung
einige dieser Genotypen teilt. Dies wird erwartet, da etwa eines
von 15 Individuen ein Träger
der gewöhnlichen
angestammten Mutation ist, aber klinisch normal ist und es auch
bleibt.
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Um
die Bezeichnung zu standardisieren, werden die Marker, die Mikrosatelliten-Repeat-Allele
darstellen, durch den Namen des Markers gekennzeichnet, gefolgt
von einem Bindestrich und der Anzahl der Nukleotide in dem Allel,
welches häufiger
bei HH-Personen gefunden wird. Die Bezeichnung 1A2:239 bedeutet
also den Marker, der von den nachstehend beschriebenen SEQ ID NO:1
und SEQ ID NO:2 eingeschlossen wird, 239 Nukleotide aufweist (was
die Summe der Nukleotide zwischen den beiden identifizierten Primer-Sequenzen
in dem HH-Genotyp repräsentiert),
zusätzlich
zu den Nukleotiden, die in den nachstehend beispielhaft angegebenen
relevanten Primern, d.h. SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2, eingeschlossen
sind. In ähnlicher
Weise bedeutet 24E2:245 245 Nukleotide zwischen den und einschließlich der
beiden Primer, die als SEQ ID NO:5 und SEQ ID NO:6 in dem HH-Genotyp
identifiziert wurden. Die Lokation der Zwischennukleotide für die Repeat-Marker
ist als unterstrichene Sequenz in den 1A–1W dargestellt.
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In 1 sind Nukleotidsequenzen unterschiedlicher
Längen
auf beiden Seiten der hier beschriebenen Marker gezeigt. Jeder Teil
der Figur zeigt die einen Polymorphismus umgebende relevante Sequenz.
Diese Sequenzen weisen eine ausreichende Län ge auf, dass sie auf einem
computer-lesbaren Medium bereitgestellt werden können. Solche Medien umfassen
die im Stand der Technik bekannten, wie Disketten, Festplatten, Random
Access Memory (RAM), Lesespeicher (Read Only Memory, ROM), und CD-ROMs.
Die Erfindung bezieht sich auch auf computer-lesbare Medien, auf
denen die Nukleotidsequenz in Bezug auf jeden Marker aufgenommen
ist, wie es in 1 dargestellt ist,
oder einen Teil jeder solchen Sequenz, wobei der Teil neu ist – d.h. derzeit
nicht in computer-lesbarer Form vorhanden ist.
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Zusätzlich zu
den vorstehend beschriebenen Mikrosatelliten-Repeatmarkern wurden
drei Einzelbasenpaar-Polymorphismen gefunden, bei denen ein Allel
auf den Chromosomen betroffener Individuen in hohem Anteil vorhanden
ist. Diese Basenpaar-Polymorphismen,
die als HHP-1, HHP-19 und HHP-29 bezeichnet sind, wurden während der
Sequenzierung des relevanten Teils von Chromosom 6 entdeckt, das
von betroffenen im Vergleich zu nicht betroffenen Individuen erhalten
wurde. HHP-1 liegt etwa 80.000 Basenpaare Centromer-proximal zu
dem Marker D6S105; HHP-19 liegt etwa 110.000 Basenpaare Centromer-proximal
zu dem Marker D6S105, und HHP-29 liegt etwa 185.000 Basenpaare Centromer-proximal
zu dem Marker D6S105. Die genaue Natur der Basenpaar-Polymorphismen
ist in den nachstehenden Beispielen angegeben. Die Anwesenheit eines
Allels, insbesondere in Kombination mit einer beliebigen anderen
charakteristischen Allelvariante der hier beschriebenen oder im
Stand der Technik bekannten Mikrosatelliten-Repeatmarker zeigt die
Anwesenheit der gewöhnlichen
HH-Mutation an.
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Um
den diagnostischen Test durchzuführen,
wird eine geeignete genomische DNA der Person enthaltende Probe
beschafft und die DNA unter Verwendung herkömmlicher Methoden extrahiert.
DNA kann beispielsweise einfach durch Kochen der Probe in SDS präpariert
werden. Meist wird eine Blutprobe, ein Mundhöhlen-Abstrich, ein Haarfollikel-Präparat oder
ein Nasalaspirat als Quelle für
die Zellen zur Bereitstellung der DNA verwendet. Die extrahierte
DNA wird dann einer Vervielfältigung
unterzogen, beispielweise unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion
(polymerase chain reaction, PCR) nach Standardverfahren. Es wird
eine sequentielle Vervielfältigung
mit verschiedenen Paaren von Primern durchgeführt und die vervielfältigte DNA wird
nach jeder Vervielfältigung
wieder gewonnen, oder, alternativ, kann die DNA-Probe in Aliquots
unterteilt und jedes Aliquot getrennt vervielfältigt werden, sofern genügend DNA
vorhanden ist. Die Größe des Inserts des
vervielfältigten
Markers, der ein Mikrosatelliten-Repeat darstellt, wird dann unter
Verwendung der Gelelektrophorese bestimmt (siehe Weber und May,
Am H Hum Genet (1989) 44: 388–339;
Davies, J. et al. Nature (1994) 371: 130–136. Die Anwesenheit oder
Abwesenheit des Einzelbasenpaar-Polymorphismus wird durch Standardverfahren,
einschließlich
manueller und automatisierter DNA-Fluoreszenzsequenzanalyse, Primer-Extensionsverfahren
(Nikiforov, T.T. et al. Nucl Acids Res (1994) 22: 4167–4175);
Oligonukleotid-Ligationsassay (OLA)(Nickerson, D.A. et al. Proc
Natl Acad Sci USA (1990) 87: 8923–8927); allelspezifische PCR-Techniken
(Rust, 5. et al. Nucl Acids Res (1993) 6: 3623–3629); RNase-Mismatch-Spaltung,
Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (single strand conformation
polymorphism, SSCP), denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese
(DGGE) und dergleichen bestimmt.
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Wie
weiter in Beispiel 1 beschrieben wird, ist ein mit HH assoziierter
Genotyp durch die nachstehenden Allele 19D9:205; 18B4:235; 1A2:239;
D6S306:238; 1E4:217; 24E2:245 definiert; weitere Allele, die aufgenommen
werden können,
umfassen 2B8:206 und D6S258:199. Die Abwesenheit dieses Genotyps
deutet auf die Abwesenheit der angestammten HH-Genmutation in dem
Genom des betreffenden Individuums hin; und die Anwesenheit dieses
Genotyps weist auf die Anwesenheit dieser HH-Genmutation hin.
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Zusätzlich zu
den vorstehend beschriebenen Genotypen charakterisieren auch Genotypen,
die durch die Anwesenheit des mit dem HHP-1, HHP-19 und HHP-29 assoziierten
Einzelbasenpaar-Polymorphismus
in Verbindung mit einem beliebigen der HH-assoziierten Allelvarianten
unter den Mikrosatelliten-Repeatmarkern gekennzeichnet sind, ein
Individuum, dessen Genom die gewöhnliche
HH-Mutation aufweist. Falls gewünscht, kann
das mit der gewöhnlichen
HH-Mutation assoziierte bestimmte Allel in analoger Weise zu der
Bezeichnung, die für
die hier beschriebenen Mikrosatelliten-Repeatmarker verwendet wird,
bezeichnet werden. Die HH-assoziierten Allele für die Basenpaar-Polymorphismen
sind daher HHP-1:A; HHP-19:G und HHP-29:G (siehe Beispiel 4).
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Die
mit den Einzelbasenpaar-Polymorphismen HHP-1, HHP-19 und HHP-29
assoziierten Allele stehen, soweit bisher beobachtet, in vollständigem Kopplungs-Ungleichgewicht
(linkage disequilibrium). Eine Bestimmung, dass eines dieser Allele
anwesend oder abwesend ist, spezifiziert daher die Anwesenheit oder
Abwesenheit des anderen. Beispielsweise ist ein Individuum, das
homozygot für
das HHP-1:A-Allel ist, gleichfalls homozygot für das HHP-19:G- und das HHP-29:G-Allel.
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Wie
aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist, sind individuelle
Chromosomen nicht notwendigerweise isoliert, und der mit einem einzelnen
Chromosom assoziierte Markersatz kann, muss aber nicht, bei der
Bestimmung der Genotypen bestimmt werden. Streng genommen sollte
die Anwesenheit von mit der gewöhnlichen
HH-Mutation assoziierten Allelen auf dem gleichen Chromosom vorliegen.
Die Anwesenheit des diagnostizierten Genotyps per se ist aber ausreichend,
um die Wahrscheinlichkeit, dass die Person Träger der gewöhnlichen HH-Mutation ist, anzuzeigen,
auch wenn die Chromosomen bei der Analyse nicht getrennt werden.
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Es
ist jedoch offensichtlich, dass die unterschiedlichen Genotypen
zwischen heterozygoten Trägern und
bezüglich
der angestammten HH-Mutation homozygoten Individuen unterscheiden
können.
Es kann also die Anwesenheit von mehr als einem Genotypen bei einem
einzelnen Individuum festgestellt werden, auch wenn eine Gesamt-DNA-Probe
untersucht wird.
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Die
nachstehend beschriebenen diagnostischen Verfahren weisen zusätzliche
Vorteile auf. Obwohl die im Stand der Technik bekannten Verfahren
zur Identifizierung der mit HH assoziierten Mutation invasiv sind, verlangt
die derzeitige medizinische Praxis eine Untersuchung naher Verwandter,
um bisher unbekannte Fälle aufzudecken,
so dass eine präventative
Phlebotomie durchgeführt
werden kann (Bothwell, T.H. et al. in "The Metabolic Basis of Inherited Disease", McGraw Hill, New
York, 1995, SS. 2237–2269;
Edwards, C.Q. et al. New Engl J Med (1993) 328: 1616–1620).
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren sind in
der Lage, andere Fälle
innerhalb dieses Familienzusammenhangs mit hoher Genauigkeit zu
bestimmen, auch falls HH in dieser Familie durch eine nicht-angestammte
Mutation hervorgerufen wird; da andere betroffene Familienmitglieder
den gleichen Genotyp aufweisen wie das betroffene Mitglied (auch
wenn dieser Genotyp nicht einer der hier aufgezählten angestammten Typen ist).
Daher können
diese Marker andere Familienmitglieder, die homozygot für das HH-Gen
sind, identifizieren.
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Die
Anwesenheit des HH-Genotyps hat auch eine Vorhersagekraft bezüglich bestimmter
Therapien, wenn die Wirksamkeit einer Therapie mit dem HH-Genotyp
korreliert ist. Es wurde beispielsweise beschrieben, dass eine eventuell
vorliegende Hämochromatose
die Wirksamkeit einer Interferon-Behandlung bei Hepatitis C beeinträchtigt (Bacon,
B., Abstracts of the Fifth Conference of the International Association
for the Study of Disorders of Iron Metabolism (1995), 15–16. Das
Wissen um den Genotyp eines Patienten bezüglich einer HH-Mutation liefert
daher eine Entscheidungshilfe bei der Bestimmung einer Therapieform
bei mit Störungen des
Eisenstoffwechsels verbundenen Zuständen, insbesondere wenn die
Leber betroffen ist. Da die Beziehungen zwischen Therapieformen
und Eisenstoffwechsel weiter erforscht werden, liefern die erfindungsgemäßen diagnostischen
Verfahren eine nützliche
Handhabe bei der Entwicklung von Therapieprotokollen in Übereinstimmung
mit der Anwesenheit oder der Abwesenheit der gewöhnlichen HH-Mutation.
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Die
nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, aber nicht beschränken.
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Beispiel 1
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Identifizierung von Markern
für HH
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Die
die relevanten Sequenzen enthaltenden Klone wurden mit einer Genome-Walking-Strategie,
ausgehend von den vorstehend beschriebenen Markern D6S306, D6S105
und D6S258, gewonnen. Standard-Chromosome-Walking-Strategien sind
in Sambrook, J. et al. Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Aufl.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) und in Dracopoli,
H. et al. (Hrsgb.) Current Protocols in Human Genetics, J. Wiley & Sons, New York
(1994) beschrieben.
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Es
wurde die DNA-Sequenz des menschlichen Genoms in der Region der
HH-Genmutation bestimmt. Es wurde eine genomische 3 kb-Klonbibliothek
durch Ultraschallbehandlung von Cosmid- und Phage P1-Klonen hergestellt.
Die ultraschall-behandelte genomische DNA wurde endständig repariert,
es wurden BstXI-Adapter zugefügt
und die Fragmente in pOT2 ligiert. Die erhaltenen Klone wurden einer
Transposon-vermittelten DNA-Sequenzanalyse unterzo gen (siehe Strathman,
et al., Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88: 1247–1250).
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Durch
die Bestimmung der Sequenz von DNA in dieser Region wurde die Anwesenheit
von 10 bisher unbekannten Mikrosatelliten-Repeat-Elementen (bestehend
aus sich wiederholenden Di-, Tri- und Tetranukleotid-Repeats) entdeckt;
am häufigsten
wurde das Dinukleotid (CA)n festgestellt.
Die Länge
dieser Repeats ist in der menschlichen Population typischerweise
polymorph und daher bedeuten unterschiedliche Längen unterschiedliche Allele,
die nach den Mendel'schen
Gesetzen vererbt werden. Daher können
sie als genetische Marker verwendet werden (Weber, J. et al. Am
J Hum Genet (1989) 44: 338–396).
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Da
die die Repeats umgebende genomische Sequenz nun verfügbar war,
können
PCR-Primer hergestellt werden, die diese Repeats flankieren und
die konservierte Sequenzen darstellen. Tabelle 1 führt die
Namen dieser Sequenz-Repeatmarker (Sequenzwiederholungs-Marker)
und die entsprechenden DNA-Sequenzen der flankierenden PCR-Primer
an.
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Wie
in Tabelle 1 dargestellt ist, wurde eine große Anzahl neuer Marker identifiziert;
bezüglich
der bereits im Stand der Technik bekannten Marker D6S306, D6S258,
D6S105, D6S1001 und D6S464 wurden auch die geeigneten Primer-Oligonukleotide
bestimmt. Wie in Beispiel 2 gezeigt wird, wurden auch die mit HH
assoziierten Allele für
die neuen Marker und für
vier bekannte Marker bestimmt.
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Beispiel 2
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Mit der Anwesenheit von 88 assoziierte
Allele
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Es
wurde die gesamte genomische DNA von in der CEPH-Kollektion (Dausset, J. et al. Genomics (1990)
6: 575–577)
repräsentierten
Familien als Substrat zur Vervielfältigung mit den 14 die Marker
in Tabelle 1 repräsentierenden
Primerpaaren verwendet. Es ist von keinem der Individuen der CEPH-Kollektion
be kannt, dass es HH hat; daher deuten die Ergebnisse dieser Individuen
auf die Häufigkeit
der verschiedenen Allele in der Normalpopulation hin. Diese Ergebnisse
sind in Tabelle 2 als "%Normale" angegeben.
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Bezüglich HH
wurden die Haplotypen für
viele der Einzelchromosomen aus der DNA von Zellhybridlinien erhalten,
von denen jedes ein Einzelchromosom 6 eines von HH-betroffenen Individuums
enthält
(Shay, J.W. Techniques in Somatic Cell Genetics, Plenem, New York,
1982). Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 als "%HH" angegeben.
Für jeden
Marker war im Vergleich zu Normal-Individuen generell ein Allel in HH-Chromosomen
häufiger.
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Beispiel 3
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Bestimmung von mit HH assoziierten Haplotypen
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Tabelle
3 zeigt eine Zusammenstellung von Haplotypen der in HH-Chromosomen
am häufigsten
auftretenden Allele. Der Haplotyp A vereint sechs der zehn Marker;
die Haplotypen B und C erweitern die Ansammlung mit jeweils einem
zusätzlichen
Marker und beim Haplotyp D sind zwei weitere zusätzliche Marker, also insgesamt
acht, vereint.
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Tabelle
4 zeigt die Verteilung dieser Haplotypen, bestimmt bei 74 Hämochromatose-Chromosomen und
bei 56 Chromosomen von nicht betroffenen Individuen. Zur Assoziation
der Haplotypen mit bestimmten Chromosomen in den CEPH-Individuen
und den HH-Individuen
können
Vererbungsmuster verwendet werden.
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Tabelle
4 zeigt deutlich, dass keiner der Haplotypen A–D bei nicht-betroffenen Individuen
oder nicht-betroffenen Chromosomen auftritt, die bisher getestet
wurden. Ein sehr hoher Prozentsatz der von HH betroffenen Individuen
weist den Haplotyp A auf, und eine signifikante Zahl weisen B–D auf.
In der Tat sind diese Haplotypen auf der Mehrzahl der Chromosomen
von HH betroffenen Individuen anwesend.
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Beispiel 4
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Einzelbasenpaar-Polymorphismen
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Während der
in Beispiel 1 beschriebenen Sequenzierung genomischer DNA der HH-Region
und durch Vergleich der von betroffenen und nicht-betroffenen Individuen
erhaltenen DNA wurden drei Einzelbasenpaar-Polymorphismen gefunden
und wie folgt mit HHP-1, HHP-19 und HHP-29 bezeichnet:
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HHP-1
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Nicht-betroffene Sequenz:
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- TCTTTTCAGAGCCACTCACGCTTCCAGAGAAAGAGCCT (SEQ ID NO:73)
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Betroffene Sequenz:
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- TCTTTTCAGAGCCACTCACACTTCCAGAGAAAGAGCCT (SEQ ID NO:74)
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HHP-19
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Nicht-betroffene Sequenz:
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- ATATATCTATAATCTATATTTCTTAAGACAATTAAGAATG (SEQ ID NO:75)
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Betroffene Sequenz:
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- ATATATCTATAATCTATATTTCTTGAGACAATTAAGAATG (SEQ ID NO:76)
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HHP-29
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Nicht-betroffene Sequenz:
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- TTGGGGATTTTATAGATTTTATTTTTAAAAAATGTTTAATCTTTGT (SEQ ID NO:77)
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Betroffene Sequenz:
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- TTGGGGATTTTATAGATTTTAGTTTTAAAAAATGTTTAATCTTTGT (SEQ ID NO:78)
- TTGGGGATTTTATAGATTTTAGTTTTAAAAAATGTTTAATCTTTGT
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Die
Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Einzelbasenpaar-Sequenzunterschiede
kann natürlich durch
Verwendung geeigneter Primer für
die Vervielfältigung
und Sequenzierung aus den gleichen DNA-Proben bestimmt werden, aus
denen auch die Information über
die (CA)n Repeat-Allele erhalten wurde. 2 zeigt
die Sequenzen von Primern, die zur Vervielfältigung (amplifikation) und
Sequenzierung der vorstehenden drei Basenpaar-Polymorphismen verwendet
wurden. Die Vervielfältigungs-Primer
für HHP-1
sind mit AG77 und AG78 bezeichnet; die Vervielfältigungs-Primer für HHP-19
sind mit AG110 und AG111 bezeichnet; und die Vervielfältigungs-Primer
für HHP-29
sind mit AG165 und AG166 bezeichnet. Die bei der Bestimmung der
Sequenz durch OLA verwendeten Primer sind wie folgt bezeichnet:
für HHP-1:
AG64, AG62 und AG63; für HHP-19:
AG143, AG144 und AG145; und für
HHP-29 AG190, AG191 und AG192. In den dargestellten Sequenzen bedeutet "bio" Biotin-Kupplung
und "dig" bedeutet gekoppeltes
Digoxygenin.
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Tabelle
5 zeigt die Häufigkeit
dieser Punktmutationen bei betroffenen und nicht-betroffenen Chromosomen:
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Die
Allele für
HHP-1:A treten bei 64% der betroffenen Chromosomen auf; ihr Auftreten
bei 6% Zufalls-Chromosomen gleicht etwa der geschätzten Häufigkeit
der gewöhnlichen
HH-Mutation in der
Population. Wie vorstehend gesagt, ist nach den bisher erhaltenen
Ergebnissen die Anwesenheit von HHP-1:A mit der Anwesenheit von
HHP-19:G und HHP-29:G assoziiert.
