DE69834127T2

DE69834127T2 - Diagnostischer test auf spinocerebellar ataxia typ 6

Info

Publication number: DE69834127T2
Application number: DE69834127T
Authority: DE
Inventors: Cheng-Chi Houston LEE
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1998-01-07
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2018-01-08
Also published as: JP2001508311A; IL130825A; US6303307B1; NZ336483A; AU6015898A; DE69834127D1; CN1293203C; JP4164128B2; IL130825A0; EP1015628A4; KR20000062427A; ATE322555T1; CN1251616A; RU2195497C2; WO1998044155A1; AU735756B2; US7329487B2; US5853995A; US20040023277A1; KR100575381B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die Gebiete der Molekulargenetik und Diagnose genetischer Erkrankungen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Genotypisierung von Krankheiten im großen Maßstab und diagnostische Tests und Kits dafür.
Beschreibung des Standes der Technik
Es hat sich herausgestellt, dass die Expansion von Repeatsequenzen, die die Trinukleotide CAG, CTG, CGG oder GAA beinhalten, die Hauptursache verschiedener neurologischer Erkrankungen ist¹. Darunter wurden die CAG-Repeatexpansionen mit einer Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen wie z.B. Morbus Huntington², spinobulbärer Muskelatrophie³, spinocerebellärer Ataxie Typ 1 (SCA1)⁴, spinocerebellärer Ataxie Typ 2 (SCA2)^5-7, spinocerebellärer Ataxie Typ 3/Machado-Joseph-Krankheit (SCA3/MJD)⁸ und dentatorubraler pallidolysialer Atrophie/Haw-River-Syndrom⁹ in Zusammenhang gebracht. All diese Krankheiten sind progredient und führen zur Degeneration der Neuronen im Zentralnervensystem. Die CAG-Repeats in den jeweiligen Genen weisen Längenpolymorphismen in der menschlichen Population auf, die typischerweise 40 Repeats nicht überschreiten. Bei den erkrankten Personen enthalten die expandierten Allele 36–121 Repeats¹⁰.
CAG-Repeatexpansionen sind viel kleiner als die Hunderte oder Tausende von Repeats, die häufig bei Krankheiten mit CGG-, CTG- und GAA-Expansionen^11-14 zu beobachten sind. Die expandierten CAG-Allele weisen variable Instabilitätsgrade sowohl in der Keimbahn als auch in Körpergeweben auf^15,16. Veränderungen der CAG-Repeatgröße im Laufe der Generationen tendieren insbesondere bei väterlicherseits erfolgender Ubertragung häufig zu weiterer Expansion und bilden die molekulare Grundlage für eine Voraussage. Die CAG-Repeat-Arrays dieser Erkrankungen befinden sich in den Codierbereichen der betreffenden Gene und werden in Polyglutamintrakte in den Proteinprodukten translatiert¹⁷. Es wurde postuliert, dass eine Expansion des Polyglutamintrakts bei jeder Krankheit mit dominanter Vererbung zu einem Funktionszugewinn in dem Proteinprodukt führt. Basierend auf den relativ einheitlichen Eigenschaften von Erkrankungen, die durch CAG-Repeatexpansionen entstehen, wurde spekuliert, dass andere neurodegenerative Erkrankungen mit ähnlichen klinischen Eigenschaften ebenfalls Expansionen der CAG-Repeats aufweisen könnten. In der Tat belegte eine Studie von Trottier et al., dass ein Antikörper gegen einen Polyglutamintrakt anomal große Proteine in Geweben von Patienten mit SCA2 oder spinocerebellärer Ataxie Typ 7 (SCA7) nachweist, was darauf deutet, dass die für SCA2 und SCA7 verantwortliche Mutation eine Expansion eines Polyglutamin-Repeattrakts ist¹⁸.
Im Stand der Technik fehlen effektive Mittel zur Genotypisierung genetischer Erkrankungen im großen Maßstab und diagnostische Tests und Kits zur Diagnostizierung solcher Erkrankungen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen im Stand der Technik schon lange bestehenden Bedarf und Wunsch.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der menschlichen spannungsabhängigen α_1A-Calciumkanaluntereinheit wurde ein polymorphes CAG-Repeat identifiziert. Um zu belegen, dass die Expansion dieses CAG-Repeats die Ursache einer vererbten progredienten Ataxie sein könnte, wurde bei einer großen Anzahl nicht verwandter Kontrollen und Ataxiepatienten eine Genotypisierung durchgeführt. Acht nicht verwandte Patienten mit spät einsetzender Ataxie hatten Allele mit einer im Vergleich zu der Anzahl von Repeats bei 475 nicht unter Ataxie leidenden Personen (4–16) großen Anzahl von Repeats (21–27). Die Analyse der Repeatlänge in Familien der erkrankten Personen zeigte, dass die Expansion je nach Phänotyp der einzelnen Patienten unterschiedlich war. Sechs Isoformen der menschlichen α_1A-Calciumkanaluntereinheit wurden identifiziert. Das CAG-Repeat befindet sich innerhalb des offenen Leserasters und codiert laut Voraussage Glutamin in drei der Isoformen. Daher ist eine geringe Polyglutaminexpansion im menschlichen α_1A-Calciumkanal höchstwahrscheinlich die Ursache einer neu klassifizierten autosomalen dominanten spinocerebellären Ataxie (SCA6).
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Person an spinocerebellärer Ataxie Typ 6 (SCA6) leidet oder gefährdet ist, SCA6 zu entwickeln, bereit, das die Beurteilung, ob die Zahl der CAG-Nukleotid-Repeateinheiten im Gen der α_1A-Calciumkanaluntereinheit der Person größer als eine Kontrollzahl ist, umfasst, wobei angezeigt wird, dass die genannte Person an spinocerebellärer Ataxie Typ G (SCA6) leidet oder gefährdet ist, SCA6 zu entwickeln.
In einer ersten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte: Amplifikation einer als Probe dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz des Gens der α_1A-Calciumkanaluntereinheit durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines sich von einer Sequenz des Gens herleitenden Oligonukleotid-Primers zur Herstellung amplifizierter genomischer DNA-Fragmente von der Probe; Elektrophorese der als Probe dienenden amplifiziexten genomischen DNA-Fragmente zur Erzeugung eines Elektrophoresemusters von der Probe; Amplifikation einer als Kontrolle dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz des Gens durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung des Oligonuklotid-Primers zur Herstellung amplifizierter genomischer DNA-Fragmente von der Kontrolle; Elektrophorese der als Kontrolle dienenden amplifizierten genomischen DNA-Fragmente zur Erzeugung eines Elektrophoresemusters von der Kontrolle; Vergleich des Elektrophoresemusters von der Probe mit dem Elektrophoresemuster von der Kontrolle; und Bestimmung, ob die zu testende Person gefährdet sein könnte, durch die Instabilität der CAG-Repeatsequenz des Gens verursachte SAC6 zu entwickeln, wobei – wenn das genomische DNA-Elektrophoresemuster der Probe Fragmente enthält, die größer als Fragmente des genomischen DNA-Elektrophoresemusters der Kontrolle sind – die Person an einer durch Instabilität der CAG-Repeatsequenz des Gens verursachten SCA6 leidet oder gefährdet ist, SCA6 zu entwickeln.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte: Amplifikation genomischer DNA-CAG-Repeatsequenzen des Gens in einer Probe einer Person durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines oder mehrerer sich von einer Sequenz des Gens herleitender Oligonukleotid-Primer; Restriktion der amplifizierten genomischen DNA-CAG-Repeatsequenzen mit einem Restriktionsenzym; Trennen der einer Restriktion unterzogenen, amplifizierten genomischen DNA-CAG-Repeatsequenzen mittels Elektrophorese zur Erzeugung eines Elektrophoresemusters von der Probe; Markierung einer Sonde, die die amplifizierten genomischen DNA-CAG-Repeatsequenzen in der Probe nachweisen kann; Hybridisierung der Probe der einer Restriktion unterzogenen, amplifizierten genomischen DNA-CAG-Repeatsequenzen mit einer ersten Aliquote der markierten Sonde unter Hybridisierungsbedingungen zur Erzeugung eines Hybridisierungsmusters von der Probe für die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz von der Probe; Amplifikation einer als Kontrolle dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz des Gens durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotid-Primer, wobei die als Kontrolle dienende genomische DNA-CAG-Repeatsequenz aus einer erkrankungsfreien Quelle stammt; Restriktion der als Kontrolle dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz mit einem Restriktionsenzym; Trennen der als Kontrolle dienenden, einer Restriktion unterzogenen genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz mittels Elektrophorese zur Erzeugung eines Elektrophoresemusters von der Kontrolle; Kombination der als Kontrolle dienenden, einer Restriktion unterzogenen genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz mit einer zweiten Aliquote der Sonde unter Hybridisierungsbedingungen zur Erzeugung eines Hybridisierungsmusters von der Kontrolle für die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz; Vergleich des Hybridisierungsmusters der Probe für die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz von der Probe mit dem Hybridisierungsmuster der Kontrolle für die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz von der Kontrolle; und Bestimmung, ob die zu testende Person gefährdet sein könnte, durch die Instabilität der CAG-Repeatsequenz des Gens verursachte SCA6 zu entwickeln, wobei – wenn die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz der Probe größer als die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz der Kontrolle ist – die Person an einer durch Instabilität der CAG-Repeatsequenz des Gens verursachten SCA6 leidet oder gefährdet ist, SCA6 zu entwickeln.
Andere und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zum Zwecke der Offenbarung hervor.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Damit der Gegenstand mit den oben genannten Merkmalen, Vorteilen und Aufgaben der Erfindung im Detail nachvollziehbar ist, erhält man durch Bezug auf bestimmte Ausführungsformen, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind, genauere Beschreibungen der Erfindung. Diese Zeichnungen bildet einen Teil der Spezifikation. Es ist jedoch zu beachten, dass die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen und daher nicht als ihren Umfang einschränkend gelten sollen.
1 stellt Isoformen des menschlichen spannungsabhängigen α_1A-Ca²⁺-Kanals dar.
1A zeigt, dass sämtliche unterschiedlichen Isoformen in mindestens zwei unabhängigen cDNA-Klonen beobachtet wurden.
stellt eine Nukleotidvariation mit 94 Basenpaaren dar,
eine 36 bp-Deletion. Die Stelle der GGCAG-Insertion ist durch einen vertikalen Strich gekennzeichnet und die Position des Glutamintrakts (polyQ) ist als
dargestellt. Die durch diese Variationen beeinträchtigten Aminosäureveränderungen sind in 2 dargestellt. Nur die Isoformen mit der GGCAG-Insertion verfügen über das erweiterte offene Leseraster. 1B stellt die das Stopkodon der menschlichen Ca²⁺-Kanalisoformen B1-1 und BI-1 (CCCAG) flankierenden Sequenzen dar. Die Buchstaben oben und unten bezeichnen jeweils die von der Sequenz codierte Aminosäure. Das Stopkodon ist durch das TAN-Nukleotid gekennzeichnet. Das Nukleotid „N" ist ein „G"-Nukleotid, bei dem die Größe des „G"-Peaks nach einem „A"-Peak reduziert ist, einem Merkmal des FS-Taq-Enzyms in der Dye Terminator-Sequenzierungschemie von Applied Biosystem. Bei der Sequenzierung des reversen Stranges wurde bestätigt, dass es sich hierbei tatsächlich um ein „G"-Nukleotid handelt. Die Komplementärsequenz von TAG – CTA – ist unterstrichen. abgeleitete offene Leseraster darstellen. Identische Aminosäuren sind mit „-" gekennzeichnet; Lücken in der Anordnung werden durch „." dargestellt. Die BI-1-cDNA von Mensch und Kaninchen besteht je nach Isoform zu 90–94% aus identischen Aminosäuren. Da der spannungsabhängige α_1A-Ca²⁺-Tunnel voller Länge beim Menschen noch nicht bestimmt wurde, wurden die Aminosäurestränge in der Kaninchen-BI-1-Sequenz als Referenz nummeriert (OCCCBI-1 bei GenBank). Durch die hypothetische Insertion der GGCAG-Nukleotide in die Kaninchen-BI-1-Isoform (Zugangsnummer X57476) wird das abgeleitete Peptidleseraster um 237 Aminosäuren erweitert, wobei sich das Stopkodon bei Mensch und Kaninchen an derselben Position befindet. In diesem abgeleiteten Leseraster ist das Glutaminrepeat unterstrichen; es beginnt bei Mensch und Kaninchen mit der Aminosäureposition 2328 der cDNA-Sequenzen. Ohne diese Insertion stoppt das von den BI-1-Isoformen von Mensch und Kaninchen abgeleitete Leseraster an der Aminosäureposition 2273, gekennzeichnet mit „*" (hier aufgelistet als 2275 aufgrund der Einschleusung von zwei Anordnungslücken). Die Aminosäuren, die entsprechend den V1-, V2- und V3-Variationen und der GGCAG-Insertion in ihren Isoformen variieren, sind durch Kästchen gekennzeichnet. Die V3-Isoform hat eine trunkierte 3'-Region mit einem polyA⁺-Trakt. Die Sequenzen der entsprechenden Isoformen sind bei GenBank deponiert (Zugangsnummern: U79663, U79664, U79665, U79666, U79667 und U79668).
3 stellt die Northern-Blotting-Analyse der Expression des menschlichen spannungsabhängigen α_1A-Ca²⁺-Kanals dar. Die Hybridisierung erfolgte unter Verwendung der S5-cDNA als Sonde. In der cerebralen mRNA lag eine deutliche Bande von 8,5 kb mit einem für diese Sonde spezifischen und durch die β-Actinsonde nicht erfassten Schmiermuster vor. Die Verschmierung in der cerebralen mRNA könnte eine Kreuzhybridisierung mit den verschiedenen alternativen Splice-Formen oder eine Degeneration widerspiegeln.
4 stellt die Analyse der PCR-amplifizierten Produkte in Familien mit cerebellärer Ataxie dar, die mit S5-F1- und S5-R1-Primern, die das CAG-Repeat flankieren, hergestellt wurden. 4A zeigt das expandierte Allel mit 27 Repeats bei den vier erkrankten Personen (I.2, II.3, II.5 und II.7) der INSCA-Familie, aber bei keinem der asymptomatischen Familienmitglieder. 4B zeigt, dass das expandierte Allel mit 22 CAG-Repeats bei allen fünf erkrankten Mitgliedern (II.1, II.2, II.3, III.1 und III.2) der MS2SCA-Familie beobachtet wird. 4C zeigt, dass in der MDSCA-Familie ein größenmäßig abweichendes Allel mit 23 CAG-Repeats bei zwei Brüdern (II.1 und II.3) und einer Schwester (II.2) mit klinischer Ataxie vorlag, nicht jedoch bei der asymptomatischen Tochter von II.1. 4D stellt die SISCA-Familie dar, in der zwei durch fünf meotische Ereignisse getrennte erkrankte Mitglieder (IV.1 und III.7) dieselbe Anzahl von CAG-Repeats (22) auf ihren größeren Allelen aufweisen. Verfolgt man dieses Allel durch den Stammbaum, zeigt sich, dass die erkrankten Vorfahren (III.5, II.2, II.4 und I.2) höchstwahrscheinlich dieses expandierte Allel aufwiesen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Person an spinocerebellärer Ataxie Typ 6 (SCA6) leidet oder gefährdet ist, SCA6 zu entwickeln, das die Beurteilung, ob die Zahl der CAG-Nukleotid-Repeateinheiten im Gen der α_1A-Calciumkanaluntereinheiten der Person größer als eine Kontrollzahl ist, umfasst, wobei angezeigt wird, dass die genannte Person an SCA6 leidet oder gefährdet, ist SCA6 zu entwickeln.
In einer ersten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte: Amplifikation einer als Probe dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz des Gens der α_1A-Calciumkanaluntereinheit durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines sich von einer Sequenz des Gens herleitenden Oligonukleotid-Primers zur Herstellung amplifizierter genomischer DNA-Fragmente von der Probe; Elektrophorese der als Probe dienenden amplifizierten genomischen DNA-Fragmente zur Erzeugung eines Elektrophoresemusters von der Probe; Amplifikation einer als Kontrolle dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz des Gens durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung des Oligonuklotid-Primers zur Herstellung amplifizierter genomischer DNA-Fragmente von der Kontrolle; Elektrophorese der als Kontrolle dienenden amplifizierten genomischen DNA-Fragmente zur Erzeugung eines Elektrophoresemusters von der Kontrolle; Vergleich des Elektrophoresemusters von der Probe mit dem Elektrophoresemuster von der Kontrolle; und Bestimmung, ob die zu testende Person gefährdet sein könnte, durch die Instabilität der CAG-Repeatsequenz des Gens verursachte SAC6 zu entwickeln, wobei – wenn das genomische DNA-Elektrophoresemuster der Probe Fragmente enthält, die größer als Fragmente des genomischen DNA-Elektrophoresemusters der Kontrolle sind – die Person an einer durch Instabilität der CAG-Repeatsequenz des Gens verursachten SCA6 leidet oder gefährdet ist, SCA6 zu entwickeln.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren folgende Schritte: Amplifikation genomischer DNA-CAG-Repeatsequenzen des Gens in einer Probe einer zu testenden Person durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines oder mehrerer sich von einer Sequenz des Gens herleitender Oligonukleotid-Primer; Markierung einer Sonde, die die amplifizierten genomischen DNA-CAG-Repeatsequenzen in der Probe nachweisen kann; Kombination der Probe der amplifizierten genomischen DNA-CAG-Repeatsequenzen mit einer ersten Aliquote der mar kierten Sonde unter Hybridisierungsbedingungen zur Erzeugung eines Hybridisierungsmusters der Probe für die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz der Probe; Amplifikation einer als Kontrolle dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz des Gens durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines oder mehrerer Oligonukleotid-Primer, wobei die als Kontrolle dienende genomische DNA-CAG-Repeatsequenz aus einer erkrankungsfreien Quelle stammt; Kombination der als Kontrolle dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz mit einer zweiten Aliquote der Sonde unter Hybridisierungsbedingungen zur Erzeugung eines Hybridisierungsmusters der Kontrolle für die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz; Vergleich des Hybridisierungsmuster der Probe für die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz von der Probe mit dem Hybridisierungsmuster der Kontrolle für die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz von der Kontrolle; und Bestimmung, ob die zu testende Person gefährdet sein könnte, durch die Instabilität der CAG-Repeatsequenz des Gens verursachte SCA6 zu entwickeln, wobei – wenn die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz der Probe größer als die genomische DNA-CAG-Repeatsequenz der Kontrolle ist – die Person an einer durch Instabilität der CAG-Repeatsequenz des Gens verursachten SCA6 leidet oder gefährdet ist, SCA6 zu entwickeln.
Erfindungsgemäß kann der Fachmann herkömmliche molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken einsetzen. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erläutert (siehe z.B. Maniatis, Frisch und Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); „DNA Cloning: A Practical Approach", Band I und II (D.N. Glover, Hrsg., 1985); „Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, Hrsg., 1984); „Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames und S.J. Higgins, Hrsg., 1985); „Transcription and Translation" (B.D. Hames und S.J. Higgins, Hrsg., 1984); „Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, Hrsg., 1986); „Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, „A Practical Guide To Molecular Cloning", 1984.
Daher sollen die folgende Begriffe, sofern sie hierin auftauchen, wie nachfolgend aufgeführt definiert sein.
Ein „Vektor" ist ein Replikon wie z.B. ein Plasmid, ein Phage oder ein Kosmid, an dem zur Auslösung der Replikation des daran befestigten Segmentes ein weiteres DNA-Segment befestigt werden kann. Ein Vektor gilt als „pharmakologisch akzeptabel", wenn seine Verabreichung von einem Empfängersäugetier toleriert werden kann. Ein solches Mittel gilt als in einer „therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn sein Vorliegen zu einer Änderung der Physiologie eines Empfängersäugetiers führt. Bei der Behandlung einer Retrovireninfektion beispielsweise würde eine Verbin dung, die den Infektionsgrad oder den Grad des durch die Infektion verursachten physiologischen Schadens vermindert, als therapeutisch wirksam gelten.
Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf die Polymerform der Desoxyribonukleinsäuren (Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin) als Einzelstrang- oder Doppelstranghelix. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und beschränkt sich nicht auf eine bestimmte Tertiärform. Daher schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA, die man unter anderem in linearen DNA-Molekülen findet (z.B. Restriktionsfragmente), Viren, Plasmide und Chromosomen ein. Bei der Diskussion der Struktur hierin wird, wie in herkömmlicher Weise üblich, nur die Sequenz in 5'-3'-Richtung entlang des nicht transkribierten DNA-Stranges angegeben (d.h. des Stranges mit einer zur mRNA homologen Sequenz).
Eine DNA-„Codiersequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die bei Steuerung geeigneter Regulationssequenzen in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird. Die Grenzen der Codiersequenz werden durch ein Startkodon am 5'-Ende (Amino) und ein Translationsstopkodon am 3'-Ende (Carboxy) bestimmt. Eine Codiersequenz schließt z.B., jedoch nicht ausschließlich prokaryontische Sequenzen, cDNA eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen eukaryontischer (z.B. Säugetier-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen ein. Ein Polyadenylisierungssignal und die Transkriptionsbeendigungssequenz befinden sich für gewöhnlich am 3'-Ende der Codiersequenz.
Der Begriff „Oligonukleotid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die erfindungsgemäße Sonde und ist definitionsgemäß ein Molekül, das zwei oder mehr, vorzugsweise mehr als drei Ribonukleotide umfasst. Seine genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die wiederum von der letztendlichen Funktion und Verwendung des Oligonukleotids abhängen.
Der Begriff „Primer", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, sei es natürlich vorkommend, z.B. in einem gereinigten Restriktionsdigest, oder synthetisch hergestellt, das unter Bedingungen, unter denen die Synthese eines zu einem Nukleinsäurestrang komplementären Primererweiterungsproduktes induziert wird, d.h. bei Vorliegen von Nukleotiden und einem Induktionsmittel wie z.B. einer DNA-Polymerase bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert, als Syntheseinitiierungspunkt dienen kann. Der Primer kann einzel- oder doppelsträngig sein und muss ausreichend lang sein, um die Synthese des gewünschten Expansionsproduktes bei Vorliegen des Induktionsmittels zu initiieren. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren ab, z.B. der Temperatur, der Primerquelle und dem angewandten Verfah ren. Bei diagnostischen Anwendungszwecken enthält der Oligonukleotid-Primer z.B. je nach Komplexität der Targetsequenz typischerweise 15–25 oder mehr Nukleotide, kann aber auch weniger Nukleotide enthalten.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe „Restriktionsendonukleasen" und „Restriktionsenzyme" auf bakterielle Enzyme, die jeweils doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nukleotidsequenz zerschneiden.
Die in diesen Studien am häufigsten eingesetzten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, chemische Substanzen, die bei Einwirkung von ultraviolettem Licht fluoreszieren, und andere. Eine Reihe von fluoreszierenden Materialien ist bekannt und kann als Markierungen verwendet werden. Dazu gehören z.B. Fluorescein, Rhodamin, Auramin, Texas-Rot, AMCA-Blau und Lucifer Yellow. Ein besonderes Nachweismaterial ist ein in Ziegen produzierter und mittels eines Isothiocyanats mit Fluorescein konjugierter Antikaninchen-Antikörper.
Die folgenden Beispiele sind zum Zwecke der Illustration verschiedener Ausführungsformen der Erfindung angegeben und sollen die vorliegende Erfindung in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1
Isolierung von S5-cDNA
Die Isolierung der S5-cDNA erfolgte durch Durchsuchen einer primären menschlichen Gehirn-cDNA-Bibliothek mit einer radioaktiv markierten Oligonukleotidsonde (GCT)₇. Bei der menschlichen Gehirn-cDNA erfolgte mit Hilfe der Methodik von Guber und Hoffman⁴⁴ ein Oligo-d(T)-Priming mit mRNA von Clontech (Palo Alto, CA). Die cDNA-Bibliothek wurde mit einem Not I-Restriktionslinker zur Klonierung in einen IZAP II-Vektor konstruiert. Die Bibliothek wurde in einer Dichte von 1.000 Plaques pro 150 mm Luria-Broth-Agarplatten beschichtet. Insgesamt wurden 150.000 Primärklone durchsucht. Die Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Oligonukleotidsonde (GCT)₇ erfolgte bei 55 °C in einer wässrigen Standardhybridisierungslösung⁴⁵. Die Filter wurden 3 × 30 Minuten bei 55 °C in 2 X SSC und 0,1% SDS gewaschen. Die Hybridisierungsklone wurde zur Plasma-Rescue gereinigt. Die Plasmid-DNA wurde mittels eines AutoGen 740-Instrumentes isoliert und mit Hilfe eines ABI-Kits nach einer Prüfvorschrift auf einem ABI-373A-Sequenzierer sequenziert. Die Sequenzierung der cDNA erfolgte zur Bestätigung des Vorliegens der Dreifach-Repeatsequenz. Die S5-cDNA war eine der bei diesem Ansatz gewonnenen 387 einzigartigen rekombinanten cDNA. Weitere klone des α_1A-Calciumkanals wurden unter Verwendung der S5-cDNA als Sonde isoliert. Zusätzlich zu der obigen menschlichen Gehirn-cDNA-Bibliothek wurde eine kommerzielle menschliche Fötalgehirn-cDNA-Bibliothek mit einer Eco RI-Klonierstelle von Stratagene (La Jolla, CA) durchsucht und die identifizierten Klone der Bibliothek zur Rekonstruktion der 3'-Region der Not 1-Stelle zum poly(A)-Trakt verwendet.
Beispiel 2
PCR-Analyse
Der Grad des CAG-Längenpolymorphismus im α_1A-Calciumkanal wurde mit Hilfe folgender Primer bestimmt: S5-F1 (5'-CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC-3') (SEQ-ID-Nr. 1) und S5-R1 (5'-TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG-3') (SEQ-ID-Nr. 2); es können aber auch andere geeignete Primer auf der Basis der Gensequenz des α_1A-Calciumkanals für diesen Zweck verwendet werden. Für die Reaktion wurden jeweils 5 pmol der Primer am Ende mit 1 mCi [γ³²P]-ATP unter Verwendung von 0,05 Einheiten Polynukleotidkinase 30 Minuten lang markiert. Die PCR-Analyse enthielt jeweils 20 ng genomische DNA gemischt mit 5 pmol der radioaktiv markierten Primer S5-Ri und S5-F1 mit einem Gesamtvolumen von 25 ml sowie 0,25 Einheiten Taq-Polymerase, 125 μM dNTP, 10 mM Tris (pH 8,9), 2,5 mM MgCl₂, 30 mM KCl und 3,5 Vol.-% Glycerin. Die Proben wurden bei 95 °C 3 Minuten lang denaturiert und anschließend in 28 Zyklen denaturiert (94 °C, 25 Minuten), geglüht (68 °C, 30 Sekunden) und erweitert (72 °C, 2 Minuten). Der Reaktion wurden 15 ml Formamid (Loading Dye) zugesetzt und das Gemisch 20 Minuten lang bei 95 °C denaturiert. 7 ml wurden einer Elektrophorese durch ein 6% Polyacrylamid/8 M-Harnstoffgel unterzogen. Die Allelgrößen wurden durch Vergleich der Migration relativ zu einer M13-Sequenzierungsleiter bestimmt. Kontroll-DNA schlossen 65 Proben aus den CEPH-Familien, 125 nicht verwandte Kontrollproben von verschiedenen Kollegen in der Abteilung für Molekular- und Humangenetik, 160 Proben von diabetischen Geschwisterpaaren, 41 sporadische Brustkrebsfälle, 42 Parkinsonfälle, 24 Dystonie-Indexfälle und 18 sporadische Alzheimer-Fälle ein.
Beispiel 3
Northern-Blotting-Analyse
Die Northern-Blotting-Analyse mit polyA⁺-RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben wurde von Clonetech bezogen. 200 ng S5-cDNA-Insert wurden mit Hilfe eines Zufallsmarkierungskits von Pharmacia mit [α³²P]dCTP radioaktiv markiert. Die Sonde wurde über Nacht bei 65 °C gemäß der von Clonetech empfohlenen Prüfvorschrift hybridisiert. Der Filter wurde 3 × 30 Minuten bei 68 °C in 0,1 Z SSC und 0,1% SDS gewaschen und anschließend mit einem Röntgenfilm belichtet. Weniger stringente Waschgänge bei 68 °C in 0,5 X SSC und 0,1% SDS führten zu sehr viel mehr Banden in unterschiedlichen Geweben, was auf eine Kreuzreaktion mit anderen Calciumkanalgenen deutet.
Beispiel 4
Bindungsanalyse
Die Untersuchung der Genotypdaten zeigt eine klare Verbindung zwischen einer erhöhten Anzahl von CAG-Repeats und dem Ataxie-Phänotyp. Von den 133 Ataxiepatienten hatten acht Repeatlängen von mehr als 20, wohingegen keine der Kontrollpersonen Repeatlängen von mehr als 16 aufwies. Diese Verbindung wurde mit Hilfe einer 2 × 2-Tabelle, die das Vorliegen von Expansionen in Ataxiefällen versus Kontrollen vergleicht, bewertet. Das Signifikanzniveau wurde mit Hilfe des exakten Fisher-Tests bestimmt.
Mit Hilfe der Haplotypanalyse wurde gezeigt, dass Expansion und Erkrankung zusammen übertragen werden. Um die Situation eines einzelnen Genortes mit einem Phänotyp (Ataxie) und einem Polymorphismus (Expansion) zu simulieren, wurden zwei vollständig miteinander verbundene Genorte – ein Erkrankungsgenort und ein Polymorphismus – in vollständigem Bindungsungleichgewicht verwendet. Die Haplotypfrequenzen wurden berechnet, indem man annahm, dass alle 133 Fälle an einer Art dominant vererbten Ataxie leiden. Es sollte daher in allen Fällen jeweils eine krankheitserzeugende Mutation geben. Acht dieser Mutationen (etwa 6%) wurden durch CAG-Repeatexpansionen hervorgerufen, die anderen 94% durch andere Mutationen, entweder Nichtexpansionsmutationen in diesem Gen oder Mutationen in anderen Genen. Die zur Berechnung der Haplotypfrequenzen erforderliche Zusatzinformation ist die Populationshäufigkeit der dominanten Ataxie an unbekannten Genorten. Je höher die Schätzung dieser Frequenz, umso niedriger der LOD-Score. Für diese Analyse, in der die Genfrequenz bei 1/1000 liegt, wurde eine konservative Zahl von 1/500 verwendet. Die vier Haplotypfrequenzen sind also 0,999 (keine Ataxie – keine Expansion), 0,0 (keine Ataxie – Expansion), 0,00094 (Ataxie – keine Expansion) und 0,00006 (Ataxie – Expansion). Der LOD-Score der vier Ataxiefamilien wurde mit Hilfe dieser Haplotypfrequenzen unter Einsatz des Softwareprogramms FASTLINK, Version 3.0P berechnet. Beeinträchtigungsstatus und Genotypen wurden bei allen Patienten bestimmt; nicht erkrankte Personen ohne Genotypisierung wurden mit „unbekannter Beeinträchtigungsstatus" und „unbekannter Genotyp" spezifiziert.
Zur Identifikation von Krankheiten, die infolge einer Expansion eines CAG-Repeats entstehen, wurde mit Hilfe polymorpher CAG-Repeats und DNA-Proben von Patienten mit spät einsetzenden neurodegenerativen Erkrankungen eine Genotypisierung im großen Maßstab vorgenommen. Die vorliegende Erfindung berichtet, dass das menschliche Homolog des BI-1-Gens des spannungsabhängigen Kaninchen-α_1A-Calciumkanals eine polymorphe CAG-Repeatsequenz enthält, die bei einem Teil der Patienten mit diagnos tizierter autosomaler dominanter cerebellärer Ataxie expandiert ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expansion eines CAG-Repeats, das laut Vorhersage Polyglutamin in dem menschlichen Gen des spannungsabhängigen α_1A-Ca²⁺-Kanals codiert, die offensichtliche Ursache einer Form der cerebellären Ataxie ist.
Beispiel 5
CAG-Repeats in der menschlichen α_1A-Calciumkanaluntereinheit
Zur Identifizierung von Genen, die Trinukleotid-Repeatsequenzen enthalten, wurde mit Hilfe eines (GCT)₇-Repeat-Oligonukleotids als Sonde eine nicht amplifizierte menschliche Gehirn-cDNA-Bibliothek durchsucht. Diese Durchsuchung identifizierte 387 gemäß Bestimmung auf Basis der Sequenzanalyse unabhängige cDNA-Klone. Die Größe der Repeats in diesen Klonen reichte von 4 bis 21. In dieser Durchsuchung wurden partielle cDNA-Klone, die den Genen der dentatorubralen pallidolysialen Atrophie/Haw-River-Syndrom⁹ bzw. der Machado-Joseph-Krankheit⁸ entsprechen, isoliert. SCA1 und SCA2 entsprechende cDNA-Klone und Gene des Morbus Huntington wurden bei dieser Durchsuchung nicht isoliert, wahrscheinlich aufgrund dessen, dass sich das CAG-Repeat in den einzelnen Genen in der 5'-Region eines großen Transkripts befindet und die cDNA-Bibliothek bei Erzeugung durch Oligo-d(T)-Priming auf die 3'-cDNA-Enden ausgerichtet ist.
Der erste umfassend untersuchte Klon war eine als S5 bezeichnete cDNA, die 13 CAG-Repeats enthielt. Bei der abgeleiteten Peptidsequenz dieser 1,2 kb-cDNA stimmen 90% der Aminosäuren mit der BI-1-Isoform des spannungsabhängigen Kaninchen-α_1A-Ca²⁺-Kanals (auch als Ca²⁺-Kanal vom P/Q-Typ bekannt) überein, was darauf deutet, dass der S5-Klon eine partielle cDNA des menschlichen Homologs ist¹⁹. Die abgeleitete menschliche Peptidsequenz stimmt auch mit der Rattengehirn-α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit zu 90% überein²⁰. Es wurde bereits früher berichtet, dass die partielle menschliche cDNA-Sequenz, die der Kaninchen-BI-1-Aminosäureposition 722–1036 entspricht, zu 92% bzw. 82% mit der Kaninchen- bzw. Ratten-α_1A-Untereinheit des Calciumkanals übereinstimmt²¹. Die erfindungsgemäße cDNA enthält eine Codiersequenz, die dem Carboxyendbereich des Kaninchenproteins beginnend mit Aminosäureposition 1325 entspricht. Die Sequenzdaten deuten darauf hin, dass die isolierte cDNA die menschliche α_1A-Untereinheit des Calciumkanals codiert.
Unter Verwendung des Somazellhybridkartierungspanels Nr. 2 von Corriel wurde der α_1A-Ca²⁺-Kanal mittels STS-Mapping auf dem menschlichen Chromosom 19 lokalisiert. Diriong et al.²² haben über das Mapping der α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit auf dem menschlichen Chromosom 19p13 mit Hilfe eines partiellen cDNA-Klons berichtet. Das Gensymbol dieses Genortes wurde als CACNLIA4 bezeichnet²². Margolis et al.²³ berich teten über eine partielle menschliche cDNA (entsprechend der Position 6487–7165 des Kaninchen-BI-1-Nukleotids) des CACNLIA4-Gens, die sich gemäß Mapping auf Chromosom 19 befindet. Ophoff et al.²⁴ veröffentlichten vor kurzem einen Bericht, der die Sequenz voller Länge des menschlichen CACNLIA4-Gens beschreibt.
Bei Kaninchen wurden zwei Isoformen (BI-1 und BI-2) der α_1A-Calciumkanaluntereinheit identifiziert¹⁹. Diese Isoformen unterscheiden sich bezüglich der Sequenz am Carboxyende voneinander, wobei BI-2 zusätzlich 151 Aminosäuren aufweist. Man glaubt, dass diese Isoformen das Ergebnis einer Insertion/Deletion von 423 Nukleotiden sind. Das Vorliegen der 423 Nukleotide in BI-1 schleust ein Stopkodon ein, das zu der kürzeren, 2273 Aminosäuren enthaltenden Isoform führt. Im Rattengehirn wurden mindestens vier alternativ gesplicte Isoformen des Gens des α_1A-Ca²⁺-Kanals beobachtet, doch es wurde nur über die Sequenz einer Isoform berichtet²⁰.
Der Vergleich zwischen den Kaninchen- und menschlichen Sequenzen zeigte, dass das CAG-Repeat erhalten blieb und sich in der abgeleiteten, nicht translatierten 3'-Region der Kaninchen-α_1A-Ca²⁺-Kanal-BI-1 und der S5-cDNA befand. Durch die Entdeckung eines hohen Übereinstimmungsgrades (700 Nukleotide mit 84% Übereinstimmung) zwischen der nicht translatierten 3'-Region der Kaninchen-BI-1-Isoform und dem erfindungsgemäßen menschlichen S5-Klon entstand die Möglichkeit, dass zusätzliche Splice-Varianten auftreten und einige ein offenes Leseraster, in dem das CAG-Repeat translatiert wird, enthalten können. Um dies zu untersuchen, wurden die primäre menschliche cDNA-Bibliothek und eine kommerzielle Fötalgehirn-cDNA-Bibliothek mit Hilfe der S5-cDNA als Sonde erneut durchsucht. Insgesamt wurden 17 weitere Klone isoliert; die sorgfältige Sequenzanalyse dieser Klone erlaubte die Identifizierung mehrerer alternativ gesplicter Isoformen der Carboxylregion des menschlichen α_1A-Ca²⁺-Kanals (1A). Insbesondere enthalten fünf dieser cDNA ein Insert aus 5 Basenpaaren (GGCAG) vor dem TAG-Stopkodon der SS-cDNA (1B). Klone mit diesem 5 bp-Insert besitzen ein erweitertes abgeleitetes offenes Leseraster mit zusätzlichen 239 Aminosäuren in dem menschlichen Gen. Die hypothetische Insertion dieser 5 bp-Sequenz in den Kaninchen-BI-1-Calciumkanal bei Aminosäureposition 2273 erweitert das abgeleitete Leseraster um 237 Aminosäuren, und die Peptidhomologie zu der menschlichen Sequenz bleibt größtenteils erhalten (80% Übereinstimmung), was für das Vorliegen einer solchen Isoform in dem Kaninchengehirn spricht (siehe 2). In dieser BI-1-Isoform (GGCAG) codiert das CAG-Repeat Polyglutamin, beginnend an der Aminosäureposition 2328, im Gen des menschlichen und Kaninchen-α_1A-Calciumkanals.
In den anderen Klonen wurden weitere Isoformen des Gens des menschlichen α_1A-Ca²⁺-Kanals beobachtet. Um sicherzustellen, dass keiner dieser Klone durch Klonierar tefakte entstanden waren, wurden mindestens zwei unabhängige Klone pro Isoform isoliert und sequenziert. Insgesamt wurden sechs Varianten inklusive der Variante, die mit der Kaninchen-BI-1-Isoform (beim Menschen ebenfalls als BI-1 bezeichnet) identisch ist, beobachtet. Die Variante mit der Bezeichnung BI-1(VI) besitzt eine 94 bp-Sequenz, die sich auf der Nukleotidebene von BI-1 unterscheidet, auf der Aminosäurebene jedoch homolog ist. Diese Variante wurde auch bei Kaninchen beschrieben¹⁹. Die in dieser Studie isolierte BI-1(VI)-Isoform ist mit der von Ophoff et al.²⁴ beschriebenen abgeleiteten Peptidsequenz zu 99,8% identisch. Es gibt drei Unterschiede bei den Aminosäuren an den Positionen 1460 (Ala bis Gly), 1605 (Ala bis Val) und 1618 (Ala bis Val). Die Aminosäuren an diesen Positionen in der abgeleiteten Sequenz stimmen hinsichtlich mehrerer analysierter Klone überein und sind mit den von der Kaninchen- und Rattenα_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit abgeleiteten Aminosäuren identisch. Die BI-1- und BI-1(VI)-Isoformen werden in Kombination mit der GGCAG-Insertion (SEQ-ID-Nr. 3 bzw. SEQ-ID-Nr. 4) beobachtet. Weitere Splice-Varianten sind z.B. BI-1(V2)-GGCAG (SEQ-ID-Nr. 5) mit einer 36 Nukleotid-Deletion und eine Variante mit einer trunkierten 3'-Region (BI-1 V2,V3) (1A). Die identifizierten Klone besitzen unterschiedliche Kombinationen dieser Varianten mit identischen Flankierungssequenzen in dem nicht variierenden Segment, so dass Klonierungsartefakte ausgeschlossen sind.
In Ubereinstimmung mit dem Vorliegen zahlreicher Isoformen ergab die Northern-Blotting-Analyse bei hoher Hybridisierungsstringenz mit der S5-cDNA eine einzelne Bande von 8,5 kb, die über einer Verschmierung über und unter der mRNA vorherrschender Größe im Gehirn lag (3). Bei geringerer Hybridisierungsstringenz wurden zahlreiche weitere Banden in allen Geweben beobachtet, was auf eine Kreuzhybridisierung mit anderen Arten von Calciumkanälen deutet (Daten nicht dargestellt). Alle Klone dieser menschlichen Gehirnbibliothek mit einer Größe zwischen 1,2 und 3,1 kb stellen nur den Carboxylbereich der menschlichen α_1A-Ca²⁺-hanaluntereinheit dar. Das CAG-Repeat in der jeweiligen cDNA des Erwachsenengehirns, die von einer einzigen menschlichen mRNA-Quelle abgeleitet wurde, enthielt entweder 11 oder 13 Repeats, was auf die Darstellung von dem homologen Chromosomenpaar transkribierter polymorpher CAG-Allele deutet.
Beispiel 6
Genotypisierung im großen Maßstab für expandierte CAG-Repeats
Die Möglichkeit der Identifizierung von CAG-Repeatsequenzen abweichender Länge, die sich vom Polymorphismus normaler Länge in der menschlichen α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit unterscheiden, wurde mit Hilfe der Genotypisierung von Ataxiepatienten im großen Maßstab untersucht. Diese Technik basiert auf der Annahme, dass, wenn die Trinukleotidexpansion für SCA6 verantwortlich ist, Expansionen bei den er krankten Personen relativ häufig beobachtet, bei Nichterkrankungsallelen jedoch nicht oder nur sehr selten auftreten würden.
Es wurden DNA-Proben von 475 nicht verwandten ataxiefreien Personen aus der Allgemeinbevölkerung und 133 DNA-Proben von nicht verwandten Indexfällen, die bekannterweise unter progredienter cerebellärer Ataxie leiden, analysiert. Mit Hilfe eines Paares radioaktiv markierter synthetischer Oligonukleotid-Primer, die die CAG-Repeatsequenz der menschlichen α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit flankieren, wurde die CAG-Repeatregion aller Proben amplifiziert und die Größe der CAG-Repeatregion mittels Gelelektrophorese bestimmt. Die Repeatgrößen der Proben aus der Ataxiegruppe wurden mit denen der Proben-DNA der Allgemeinbevölkerung verglichen.
Tabelle 1 stellt die Größenverteilung der CAG-Repeats in dem Gen der α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit der 133 Indexpatienten mit cerebellärer Ataxie sowie die Größenverteilung der CAG-Repeats in dem Gen der α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit der Proben der 475 ataxiefreien Personen dar. Der ethnische Hintergrund der Kontroll- und Patientenkollektive schloss Personen europäischer, afrikanischer, amerikanischer, hispanischer und asiatischer Herkunft ein. Die Personen der Allgemeinbevölkerung wiesen 10 Allele mit 4 bis 16 CAG-Repeateinheiten sowie eine Heterozygosität von 71 % auf. Bei den Patienten mit cerebellärer Ataxie reichte die Anzahl der CAG-Repeats von 7 bis 27, bei einer Heterozygosität von 74%. Wie aus der Allelgrößenverteilung ersichtlich, besaßen acht nicht verwandte Patienten von 133 Ataxie-Indexfällen (6%) ein größeres Allel mit mindestens 21 CAG-Repeateinheiten. Die Expansion war zwar relativ gering, wurde jedoch bei den 475 Personen aus der ataxiefreien Kontrollgruppe nicht beobachtet, was es extrem unwahrscheinlich macht, dass es sich um einen Polymorphismus normaler Länge handelt (P<10^–5 beim exakten Fisher-Test).
Tabelle 1: Vergleich der Anzahl der CAG-Repeateinheiten auf Ataxie- und Nichtataxie-Chromosomen
Die genomische DNA dieser acht Indexfälle wurde mit S5-Primern amplifiziert, subkloniert und sequenziert. Die Anzahl der in der Sequenzanalyse erhaltenen CAG-Repeateinheiten stimmte mit der Zunahme der Anzahl reiner CAG-Repeateinheiten in der α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit überein. Die unterschiedliche Anzahl der CAG-Repeateinheiten in diesen expandierten Allelen spricht gegen ein seltenes Founder-Allel. Die Beobachtung abweichender Allele expandierter Größe in dem Ataxiekollektiv und ihre Abwesenheit in der Allgemeinbevölkerung stimmte mit der Möglichkeit überein, dass diese expandierten Allele die Mutationsbasis in einem Teil der analysierten Ataxiepatienten darstellen.
Das Verfahren der Genotypisierung im großen Maßstab war bei der Identifizierung der CAG-Expansion im Gen der α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit wirksam. Daher kann dieses Konzept bei der Suche nach anderen Mutationstypen im Zusammenhang mit dem Dreifach-Repeat-Erkrankungsphänomen genutzt werden. Prinzipiell nimmt man an, dass die Trinukleotid-Repeatexpansion mit Allelen zusammenhängt, die bei Erkrankungsphänotypen häufig auftreten, bei Nichterkrankungsphänotypen dagegen nicht oder selten. Die Genotypisierung im großen Maßstab unterscheidet sich daher von den Ansätzen zur Identifizierung anderer menschlicher Krankheitsgene wie z.B. dem Ansatz der Positionsklonierung. Bei diesem Ansatz muss vor der Isolierung des Kandidatenkrankheitsgens eine genetische Verbindung mit einer spezifischen Chromosomenregion etabliert werden. Mit Hilfe der Positionsklonierung wurden die Gene für Morbus Huntington, spinobulbäre Muskelatrophie, spinocerebelläre Ataxie Typ 1, spinocerebelläre Ataxie Typ 2, spinocerebelläre Ataxie Typ 3/Machado-Joseph-Krankheit sowie die Gene für das fragile X-Syndrom und myotone Muskeldystrophie identifiziert.
Der erfindungsgemäße Ansatz unterscheidet sich auch von dem Zufallskandidatengen-Ansatz bei menschlichen Erkrankungen, wobei bei der Identifizierung der Gene keine systematische Strategie angewandt wird. Das Gen der dentatorubralen pallidolysialen Atrophie/Haw-River-Syndroms⁹ wurde mit Hilfe des Zufallskandidatengen-Ansatzes identifiziert. Die Strategie der vorliegenden Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass Dreifach-Repeatsequenzen bei Krankheitsgenen einen Längenpolymorphismus aufweisen, weswegen sie für eine Genotypisierung im großen Maßstab geeignet sind. Die Genotypisierung im großen Maßstab identifiziert abweichende Allelgrößen bei erkrankten Patienten im Vergleich zu der erkrankungsfreien Bevölkerung. Die konzeptbasierte Strategie macht die Notwendigkeit einer vorherigen Etablierung einer spezifischen Genassoziation (Verbindung) in Familienstammbäumen, die bei der Positionsklonierung als erster Schritt erfolgt, überflüssig. Die erfindungsgemäße Strategie der Genotypisierung im großen Maßstab stellt einen direkten Gen/Krankheitsstatus-Ansatz dar.
Beispiel 7
Vererbung expandierter Allele bei Ataxiepatienten
Vier der Indexfälle stammten aus Familien, in denen weitere erkrankte Mitglieder klinisch bewertet worden waren und DNA für die Genotypenanalyse erhalten werden konnte. 21 Familienmitglieder nahmen nach Abgabe ihrer Einverständniserklärung an der Studie teil. 14 der 21 Personen wiesen klinische Symptome einer Ataxie auf. In jeder dieser Familien wurde die Ataxie autosomal-dominant vererbt, wobei das Alter bei Einsetzen der Krankheit zwischen 28 und 50 Jahren lag.
Genotypanalysen von Familienmitgliedern mit Hilfe der S5-Primer belegten, dass sich das expandierte Allel mit dem Erkrankungsphänotyp in den einzelnen Familien abtrennt. 4A zeigt beispielsweise das expandierte Allel mit 27 Repeats bei den vier erkrankten Personen aus der INSCA-Familie, nicht aber in den asymptomatischen Familienmitgliedern inklusive eines entfernten Verwandten (Daten nicht dargestellt). Bei dieser Familie reichte das Alter bei Einsetzen der Krankheit von 28 bis 31 Jahre und drei der asymptomatischen Personen waren 41 Jahre oder älter. 4B zeigt, dass das expandierte Allel mit 22 Repeats bei allen fünf erkrankten Mitgliedern der MS2SCA-Familie beobachtet wurde. In der MDSCA-Familie (4C) lag bei zwei Brüdern (II.1 und II.3) und einer Schwester (II.2) mit klinischer Ataxie, nicht aber bei der asymptomatischen Tochter von II.1 ein Allel abweichender Größe mit 23 CAG-Repeats vor. In der SISCA-Familie (4D) besaßen zwei durch 5 meiotische Ereignisse getrennte erkrankte Personen (IV.1 und III.7) dieselbe Anzahl an CAG-Repeats (22) auf ihren größeren Allelen. Verfolgt man dieses Allel durch den Stammbaum, zeigt sich, dass die erkrankten Vorfahren (III.5, II.2, II.4 und I.2) dieses expandierte Allel höchstwahrscheinlich aufwiesen. Die Abtrennung des expandierten Allels mit der Krankheit in diesen Familien ist hochsignifikant, wie der kumulative Haplotyp-LOD-Score von 5,08 bei einer Rekombinationshäufigkeit von 0 bei der Analyse der Genotypsisierungsdaten erkrankter Personen mit Hilfe des Computerprogramms FASTLINK, Version 3.0P zeigt (siehe oben)^26,27. Die LOD-Scores der einzelnen Familien sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Zusammenfassend belegt der statistisch signifikante Befund, dass die expandierten Allele nur bei Patienten mit diagnostizierter cerebellärer Ataxie, nicht aber bei 475 ataxiefreien Kontrollen beobachtet werden konnten, und der eindeutige Zusammenhang dieser expandierten Allele mit der Erkrankung belegt, dass die Polyglutaminexpansion in der spannungsabhängigen α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit die Ursache dieser spät einsetzenden, dominant vererbten Ataxie ist.
Tabelle 2: LOD-Scores der Haplotypanalyse
Beispiel 8
Klinische und pathologische Befunde bei Patienten mit CAG-Repeatexbansion
Die klinischen Merkmale der Patienten in den oben beschriebenen Familien waren sehr ähnlich und bestehen hauptsächlich aus einer leichten, aber langsam progredienten cerebellären Ataxie der Glieder und des Gangbilds, Dysarthrie, Nystagmus und einem leichten sensorischen Defizit bezüglich Vibration und Propriozeption. Die Krankheit ist äußerst heimtückisch und die meisten Patienten realisieren anfangs nicht, dass sie erkrankt sind, sondern beschreiben ein Gefühl von momentanem Gleichgewichtsverlust und „Benommenheit", wenn sie sich rasch umdrehen oder eine schnelle Bewegung machen. Typischerweise realisieren die Patienten erst Jahre nach dieser ersten Empfindung, dass sie dauerhafte Gleichgewichts- und Koordinationsschwierigkeiten entwickelt haben. Die Krankheit schreitet für gewöhnlich über 20–30 Jahre fort und führt dazu, dass der Patient schlecht gehen kann und schließlich an den Rollstuhl gefesselt ist. Bei den wenigen älteren Patienten wurde Ersticken beobachtet, was auf eine Beteiligung des Hirnstamms deutet; bei vielen Mitgliedern der MDSCA- und MS2SCA-Familien war die Erkrankung die Todesursache. Die Patienten in den MDSCA-, SISCA- und MS2SCA-Familien mit einer Repeatzahl von 22–23 entwickeln die Symptome im Allgemeinen zwischen 40 und 50; in der INSCA-Familie, bei der das expandierte Allel 27 Repeats enthält, setzt die Krankheit bei allen erkrankten Personen zwischen dem 28. und 31. Lebensjahr ein. Eine Kernspintomographie des Gehirns der erkrankten Personen zeigt eine isolierte cerebelläre Atrophie. Detaillierte neuropathologische Studien über zwei verstorbene Mitglieder der SISCA-Familie zeigten eine ausgeprägte cerebelläre Atrophie und eine sehr leichte Atrophie des Hirnstamms²⁸. Die mikroskopische Untersuchung zeigte einen starken Untergang cerebellärer Purkinje-Zellen, einen mäßigen Untergang von Granulatzellen und Nucleus dentatus-Neuronen sowie einen leichten bis mäßigen neuronalen Untergang in der Oliva inferior.
Die erblichen cerebellären Ataxien sind eine klinisch und genetisch heterogene Gruppe neurologischer Störungen im Zusammenhang mit der gestörten Funktion des Cerebellums und seiner afferenten und efferenten Verbindungen. Bislang wurden 6 autosomaldominante spinocerebelläre Ataxien (SCAs) mittels Mapping den menschlichen Chromosomen 6, 12, 14, 16, 11 und 3 zugeordnet; die entsprechenden Genorte heißen SCA1, SCA2, SCA3, SCA4, SCAS, bzw. SCA7¹⁰. In vielen Familien mit dominant vererbter und progredienter Ataxie bleibt der Miapping-Ort der Gene jedoch unbekannt. Die Zuordnung der α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit zu dem menschlichen Chromosom 19p13 mittels Mapping und die Identifizierung der CAG-Repeatexpansion in diesem Kanal als Mutationsmechanismus in vier Familien definieren einen neuen SCA-Genort auf dem menschlichen Chromosom 19p13, der als SCAG bezeichnet werden kann.
In der Vergangenheit wurde der Begriff SCA6 zur Beschreibung dominant vererbter SCAs verwendet, die sich keinem der bekannten Genorte zuordnen ließen^29,30. Diese Mapping-Nomenklatur wurde revidiert; der SCA6-Genort wurde der dominant vererbten Ataxie auf Chromosom 19p13 zugeordnet (HGM-Nomenklaturkomitee). Die erbliche paroxysmale cerebelläre Ataxie (HPCA) oder episodische Ataxie (EA) wurde mittels Mapping ebenfalls der 19p13-Region zugeordnet^31,32. Der Genort einer anderen episodischen Erkrankung, familiärer hemiplegischer Migräne (FHM)³³, wurde auf 19p13 in einer Region lokalisiert, der das Gen für HPCA/EA zugeordnet war. Patienten mit HPCA oder EA leiden typischerweise unter periodischer Ataxie mit scheinbar normaler Koordination zwischen den Anfällen. Dies erinnert an die episodische Empfindung des Schwankens, die bei Patienten Jahre vor der dauerhaften Manifestation der Ataxie beschrieben wird. Die einzige gleichbleibende Anomalität bei der neurologischen Untersuchung von HPCA/EA ist das Vorliegen eines Nystagmus; dieser Befund wird bei allen Patienten erhoben. Bildgebungsstudien des Gehirns zeigten, dass einige HPCA/EA-Patienten eine cerebelläre Atrophie aufweisen³¹. Interessanterweise wiesen erkrankte Personen aus verschiedenen Familien mit FHM eine degenerative cerebelläre Atrophie auf, die mit Ataxie, Nystagmus und anderen vestibulocerebellären Augenproblemen ähnlich denen bei HPCA/EA einherging³⁴. Das Überlappen der Phänotypen dieser beiden Störungen führte zu der Hypothese, dass HPCA/EA und FHM Allelstörungen sind, die aufgrund der periodischen Natur der Symptome möglicherweise durch eine Mutation in einem Ionenkanalgen entstehen^32,34.
Kürzlich berichteten Ophoff et al.²⁴ über vier Missense-Mutationen im menschlichen Gen der α_1A-Ca²⁺-Kanaluntereinheit in Familien mit FHM und zwei Mutationen, die das Leseraster des Gens in zwei Familien mit EA unterbrachen. Diese Ergebnisse und die vorliegende Erfindung belegen, dass FHM, HPCA/EA und die progrediente SCA6 Allelstörungen sind. Die Natur der Mutation (CAG-Repeatexpansion in SCA6 versus Proteintrunkation in HPCA/EA) beeinträchtigt den klinischen Verlauf der Erkrankung. In SCA6 wurden dauerhafte und progrediente cerebelläre und Hirnstammfunktionsstörungen beobachtet, wohingegen bei HPCA/EA leichte und intermittierende cerebelläre Funktionsstörungen auftraten. Dies deutet darauf hin, dass die Glutaminexpansion die Funktion des Kanals in einer Weise beeinträchtigt, die einen progredienten neuronalen Untergang auslöst. Dies kann erfolgen, indem die Neurotransmitterfreisetzung verändert oder anomale intrazelluläre Ca²⁺-Spiegel erzeugt werden, was zum anschließenden Zelltod führt^21,35. Zu diesem Zeitpunkt kann die pathogene Wirkung dieser Mutationen bezüglich der periodischen neurologischen Funktionsstörung versus eine dauerhafte und progrediente Erkrankung nicht bestimmt werden; dafür sind Versuche mit transgenen Mäusen und neurophysiologische Studien notwendig. Zwar wurden andere Mutationen in dem CACNL1A4-Gen in SCA6-Familien nicht ausgeschlossen, doch die hochsignifikante Assoziation zwischen Expansion und Erkrankungsphänotyp (P<10^–5) in acht unabhängigen Ataxie-Familien und die unterschiedliche Anzahl von Repeats auf den expandierten Allelen in vier Familien (ohne Instabilität im Laufe der Generationen) sprechen stark dafür, dass diese Mutation die Krankheit verursacht. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Ophoff et al. bei den 50 normalen genotypisierten Personen keine expandierten Allele beobachteten.
Zwar stellte sich heraus, dass der Mutationsmechanismus bei SCA6 wie bei den anderen dominant vererbten progredienten Ataxien die Expansion eines translatierten CAG-Repeats beinhaltet, doch es ist nicht klar, ob auch der Pathogenesemechanismus ähnlich ist. Es gibt zwei entscheidende Unterschiede zwischen der Mutation in SCA6 und de_nen, die SCA1, SCA2, SCA3, HD, DRPLA und SBMA verursachen. Erstens sind die expandierten mutierten Allele in SCA6 (21–27 Repeats) erheblich kleiner als die expandierten Allele bei den anderen neurodegenerativen Erkrankungen (36–121 Repeats) und liegen im Normbereich für Glutamintrakte an anderen Genorten vieler nicht erkrankter Personen. Zweitens tritt die CAG-Repeatexpansion in der Codierregion eines Gens auf, das bekanntermaßen für die normale Funktion und das Überleben der Purkinje-Zellen wichtig ist^19,25. Dadurch entsteht die Möglichkeit, dass die CAG-Expansion ihre pathogene Wirkung ausübt, indem sie die normale Funktion des α_1A-Calciumkanals direkt stort.
Spannungsabhängige Calciumkanäle vermitteln die Aufnahme von Calcium in Neuronen und andere erregbare Zellen und spielen bei einer Vielzahl neuronaler Funktionen wie z.B. der Membranerregbarkeit, der Neurotransmitterfreisetzung und der Genexpression eine wichtige Rolle³⁶. Calciumkanäle sind Komplexe aus mehreren Untereinheiten, wobei die Kanalaktivität hauptsächlich durch die Porenbildung einer a₁-Untereinheit vermittelt wird, doch weitere Untereinheiten wie b, a₂/d und g dienen als Hilfsproteine zur Regulierung der Kanalaktivität^36,38. Die 6 a₁-Gene codierenden cDNAs wurden kloniert und α_1A,B,C,D,E,S genannt³⁹. Das in der vorliegenden Erfindung gekennzeichnete menschliche Gen ist zu den Kaninchen- und Ratten α_1A-Isoformen höchst homolog^19,20. Die Zuordnung zu dem menschlichen Chromosom 19 mittels Mapping stimmt mit der früheren Zuordnung der die α_1A-Isoform codierenden menschlichen Sequenz zu dem Chromosom 19p13 mittels Mapping überein^22-24. Eine Kombination elektrophysiologischer und pharmakologischer Eigenschaften definiert vier Hauptarten hochschwelliger Calciumkanäle in Neuronen des peripheren und zentralen Nervensystems von Säugetieren⁴⁰. Sie werden mit L, N, P und Q bezeichnet, wobei die Kanäle vom P-Typ der vorherrschende Calciumkanal in Purkinje-Zellen und die Kanäle vom Q-Typ der vorherrschende Calciumstrom in cerebellären Granulatzellen sind^25,38. Es hat sich gezeigt, dass aus der klonierten α_1A-Isoform Calciumströme vom P- und/oder Q-Typ entstehen^38,40. Die identifizierten zusätzlichen Isoformen können zur Lösung einiger der beobachteten funktionellen Unterschiede zwischen den Calciumströmen des P- bzw. Q-Typs beitragen. Aufgrund der pharmakologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften des α_1A-Kanals sowie seiner starken Expression im Rattencerebellum wird die Bedeutung für Calciumaufnahme und -homöostasie in Purkinje-Zellen unterstrichen^25,41.
Kürzlich wurde mittels einer Positionsklonierungsstrategie, die auf die Identifizierung des bei tg-Mäusen (tottering mice) und tg^la-Mäusen (leaner mice) mit Anfällen und cerebellärer Ataxie mutierten Gens zielt, das Mäusehomolog des Gens der spannungsabhängigen α_1A-Untereinheit identifiziert⁴². Dieser Genort befindet sich gemäß Mapping auf dem Mäusechromosom 8 in einer Region, die dem menschlichen 19p13 entspricht. Die tg-Mutation – ein T statt einem C an der Position 1802 – bewirkt eine nicht beständige Substitution von Prolin durch Leucin an einer Position, die sehr nah an der beständigen Porenauskleidungsdomäne in dem extrazellulären Segment der zweiten Transmembrandomäne liegt. Diese Mutation führt zu einer rezessiven neurologischen Störung mit Ataxie sowie motorischen und Absenzanfällen.
Die tg^la-Mutation besteht aus einem A statt einem G in der Splice-Spender-Consens-Sequenz am 5'-Ende eines Introns in der intrazellulären C-terminalen Domäne. Diese Mutation erzeugt zwei mittels RT-PCR nachgewiesene abweichende Splice-mRNAs; ein größeres Fragment, das bei misslungenem Heraussplicen des Introns entsteht, sowie ein kleineres Fragment, das bei Überspringen eines Exons entsteht. Beide Transkripte verschieben laut Voraussage das Leseraster und erzeugen anomale Proteine. Homozygote tg^la-Mäuse mit der Splicemutation weisen im Vergleich zu den tg-Mäusen eine stärkere Ataxie und cerebelläre Degeneration auf.
Die Ergebnisse, dass Mutationen des α_1A-Ca²⁺-Kanals mit cerebellärer Ataxie und Degeneration von Purkinje- und Granulatzellen bei Mäusen in Zusammenhang stehen, stützt die Hypothese, dass dieser Kanal für die normale Funktion der Purkinje- und Granulatzellen im Cerebellum kritisch ist. Die rezessive Natur der beiden Mutationen in den Mäusen und die Tatsache, dass die tg^la-Mutation laut Voraussage ein anomales Protein erzeugt, deuten darauf hin, dass diese Mutationen den Ataxiephänotyp durch einen Verlust des Funktionsmechanismus verursachen. Die Mutation der tg^la-Mäuse verändert den Carboxyendabschnitt des Kanals direkt oberhalb der Position des mutmaßlichen Glutamintrakts in dem menschlichen Gen. Diese Daten werfen interessante Fragen auf bezüglich des Mechanismus, nach dem eine mäßige Glutaminexpansion in der menschlichen α_1A-Ca²⁺-Kanal-Isoform zu cerebellärer Degeneration und Ataxie führt. Die dominante Natur dieser Erkrankung deutet auf drei Möglichkeiten: (1) einen Funktionsver lust infolge einer Haploinsuffizienz, (2) eine dominant-negative Wirkung infolge der Expansion oder (3) einen neuartigen Funktionszuwachs, wie er bei anderen, durch CAG-Repeatexpansionen verursachten Krankheiten für möglich gehalten wird. Das Fehlen des Ataxiephänotyps bei den bezüglich der Mutation heterozygoten tg- und tg^la-Mäusen würde gegen die Hypothese des Funktionsverlustes sprechen. Dieses Modell kann jedoch erst ausgeschlossen werden, wenn mittels sorgfältiger quantitativer Messungen bestätigt wird, dass eine Mutation in den Mäusen tatsächlich zu einem Funktionsverlust des α_1A-Ca²⁺-Kanals führt und heterozygote Mäuse weder eine Ataxie noch eine Degeneration der Purkinje-Zellen aufweisen. Angesichts der vorübergehenden und leichten Natur der Ataxie bei einigen Patienten könnte es äußerst schwierig sein, den Phänotyp einer leichten und intermittierenden Ataxie in den Mäusen zu bestimmen. Ein Modell, das von einem dominant-negativen Mechanismus ausgeht, stimmt mit dem Vererbungsmuster in den menschlichen Familien und den bislang erhältlichen Daten zu den tg-Mäusen überein. In diesem Modell könnte die geringe Expansion des Glutamintrakts die normale Funktion des Kanals entweder durch Beeinträchtigung seiner Bindung an Synapsenproteine oder durch Behinderung seiner Assoziierung mit anderen Hilfskanalproteinen, die bekanntermaßen seine Aktivität modulieren, stören. Angesichts der Tatsache, dass der α_1A-Ca²⁺-Kanal bekanntermaßen basierend auf elektrophysiologischen Daten⁴³ und Daten über die tg-Mäuse für die normale Funktion der Purkinje-Zellen wichtig ist, ist es schwer zu argumentieren, dass die Glutaminexpansion zu einem neuartigen Funktionszugewinn des Proteins führt. Die Glutaminexpansion führt höchstwahrscheinlich zu einer abweichenden Kanalfunktion wie z.B. der Möglichkeit einer konstitutiven Aktivierung. Für den ultimativen Beleg der verschiedenen Modelle ist die Erzeugung von Mäusen ohne das α_1A-Ca²⁺-Kanal-Gen und Mäusen, die ein Allel mit einer CAG-Expansion im Bereich der SCA6-Krankheit exprimieren, notwendig.
Die Genotyp/Phänotyp-Korrelation bei SCA6 deutet darauf hin, dass die Expansion angesichts des dramatischen Unterschieds bezüglich des Alters bei Einsetzen der Krankheit (28–31 Jahre) bei allen Mitgliedern der Familie mit 27 Repeats im Vergleich zu denen der anderen Familien (40–50 Jahre) mit einer Repeatzahl von 22–23 relativ schädlich ist. Zwar ist die Probengröße zu diesem Zeitpunkt zu klein, um klare Schlüsse über die Genotyp/Phänotyp-Korrelation zu ziehen, es wäre jedoch interessant zu sehen, ob manche Patienten mit HPCA/EA, einer sehr viel milderen Form als SCA6, sogar noch kleinere Expansionen aufweisen. Darüber hinaus wäre es wichtig zu bestimmen, ob verschiedene Mutationen in dem α_1A-Ca²⁺-Kanal zu SCA6 führen. Das CAG-Repeat in SCA6 ist ohne nachweisbare Mosaikbildung oder Allelgrößenveränderungen im Laufe der Generationen stabil. Dies ist angesichts der Tatsache, dass ähnlich große CAG-Repeats an vielen anderen Genorten erwiesenermaßen stabil übertragen werden, nicht überraschend. Die Größe des Repeats in der Allgemeinbevölkerung und die unterschied lichen Größen der expandierten Allele in verschiedenen SCA6-Familien deuten darauf hin, dass ein gewisser Grad der Instabilität an diesem Genort besteht, der zu Mutationsexpansionen in dem Krankheitsallelbereich geführt hat.
Zusammenfassend belegt die vorliegende Erfindung, dass eine relativ kleine Polyglutaminexpansion in der menschlichen α_1A-Untereinheit eines Purkinje-Zellen-Ca²⁺-Kanals zu einer Degeneration der Purkinje-Zellen und cerebellärer Ataxie führt. Die unmittelbaren Auswirkungen dieses Ergebnisses sind klinischer und biologischer Art. Die Beobachtung, dass eine relativ kleine CAG-Repeatexpansion in einer anomalen Proteinfunktion resultieren kann, liefert eine neue Vorstellung hinsichtlich der Auswirkungen solcher Repeats und der Notwendigkeit einer sorgfältigen Bewertung bezüglich möglicher pathogener Auswirkungen. Schließlich sollte die Expansion eines Polyglutamintrakts in einem menschlichen Calciumkanal mit Blick auf die Calciumhomöostasie und die mögliche Rolle solcher Mechanismen bei anderen glutamin-vermittelten neurodegenerativen Prozessen Einblicke in die Mechanismen der Neurodegeneration liefern.
Folgende Referenzen wurden hierin zitiert:

1. Warren, S.T. The expanding world of trinucleotide repeats. Science 271, 1374–1375 (1996).
2. The Huntington's disease collaborative research group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell72, 971–983 (1993).
3. LaSpada, A.R., Wilson, E.M., Lubahn, D.B., Harding, A.E. und Fischbeck, H. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature 352, 77–79 (1991).
4. Orr, H. et al. Expansion of an unstable trinucleotide (CAG) repeat in spinocerebellar ataxia type 1. Nature Genet. 4, 221–226 (1993).
5. Pulst, S.M. et al. Moderate expansion of a normally biallelic trinucleotide repeat in spinocerebellar ataxia type 2. Nature Genet. 14, 269–276 (1996).
6. Sanpei K. et al. Identification of the gene for spinocerebellar ataxia type 2 using a direct identification of repeat expansion and cloning technique, DIRECT. Nature Genet. 14, 277–284 (1996).
7. Imbert, G. et al. Cloning of the gene for spinocerebellar ataxia 2 reveals a locus with high sensitivity to expanded CAG/glutamine repeats. Nature Genet. 14, 285–291 (1996).
8. Kawaguchi, Y. et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nature Genet. 8, 221–235 (1994).
9. Koide, R. et al. Unstable expansion of CAG repeat in hereditary dentatorubralpallidoluysian atrophy (DRPLA). Nature Genet. 6, 9–13 (1994).
10. Zoghbi, H.Y. and Caskey, C.T. Inherited disorders caused by trinucleotide repeat expansions. Advances in Human Genetics. Band (im Druck) (Hrsg. Harris, H. and Hirschorn, K.H.) (Plenum, New York, 1996).
11. Verkerk, A.J.M.H. et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell 65, 905–914 (1991).
12. Gu, Y., Shen, Y., Gibbs, R.A. and Nelson, D.L. Identification of FMR2, a novel gene associated with the FRAXE CCG repeat and CpG island. Nature Genet. 13, 109–113 (1996).
13. Fu, Y.-H. et al. An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy. Science 225, 1256–1259 (1992).
14. Campuzano, V. et al. Friedreich's ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion. Science 271, 1423–1427 (1996).
15. Chong, S.S., McCall, A.E., Cota, J., Subramony, S.H., Orr, H.T., Hughes, M.R. and Zoghbi, H.Y. Gametic and somatic tissue-specific heterogeneity of the expanded SCA1 CAG repeat in spinocerebellar ataxia type 1. Nature Genet. 10, 344–353 (1995).
16. Telenius, H. et al. Molecular analysis of juvenile Huntington disease: the major influence on (CAG)n repeat length is the sex of the affected parent. Hunt. Mol. Genet. 2, 1535–1540 (1993).
17. Housman, D. Gain of glutamines, gain of function. Nature Genet. 10, 3–4 (1995).
18. Trottier, Y. et al. Polyglutamine expansion as a pathological epitope in Huntington's disease and four dominant cerebelua ataxias. Nature 378, 403–406 (1995).
19. Mori, Y. et al. Primary structure and functional expression from complementary DNA of a brain calcium channel. Nature 350, 398–402 (1991).
20. Starr, T.V.B., Prystay, W. and Snutch, T.P. Primary structure of a calcium channel that is highly expressed in the rat cerebellum. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 5621–5625 (1991).
21. Rettig, J., Sheng, Z.-H., Kim, D.K., Hodson, C.D., Snutch, T.P. and Catterall, W.A. Isoform-specific interaction of the α_1A subunits of brain Ca²⁺ channels with the presynaptic proteins syntaxin and SNAP-25. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7363–7368 (1996).
22. Diriong, S., Williams, M.E., Ellis, S.B., Harpold, M.M. and Taviaux, S. Chromosomal localization of the human genes for α_1A, α_1B and α_1E voltage-dependent Ca²⁺ channel subunits. Genomics 30, 605–609 (1995).
23. Margolis et al. Characterization of cDNA clones containing CCA trinucleotide repeats derived from human brain. Somat. Cell Mol. Genet. 21, 279–284 (1995).
24. Ophoff R.A. et al. Familial hemiplegic migraine and episodic ataxia type 2 are caused by mutations in the Ca²⁺ channel gene CACNLIA4. Cell 87, 543–552 (1996).
25. Llinas, R., Sugimori, M., Hillman, D.E. and Cherksey, B. Distribution and functional significance of the P-type, voltage-dependent Ca²⁺ channels in the mammalian central nervous system. Trends in Neurosci. 15, 351–355 (1992).
26. Cottingham, R.W., Idury, R.M. and Schaffer, A.A. Faster sequential genetic linkage computations. Am. J. Hum. Genet. 53, 252–263 (1993).
27. Lathrop, G.M., Lalouel, J.M., Julier, C. and Ott, J. Strategies for multilocus linkage analysis in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3443–3446 (1984).
28. Subramony, S.H., Fratkin, J.D., Manyam, B.V. and Currier, R.D. Dominantly inherited cerebello-olivary atrophy is not due to a mutation at the spinocerebellar ataxia-1, Machado-Joseph disease, or Dentato-Rubro-Pallido-Luysian Atrophy locus. Movement Disorders 11:2, 174–180 (1996).
29. Stevanin, G. et al. A third locus for autosomal dominant cerebellar ataxia type 1 maps to chromosome 14q24.3-qter evidence for the existence of a forth locus. Am. J.
Hum. Genet. 54, 11–20 (1994).
30. Twells, R. et al. Autosomal dominant cerebellar ataxia with dementia: evidence of a fourth disease locus. Hum. Mol. Genet. 1, 177–190 (1994).
31. Vahedi, K. et al. A gene for hereditary paroxysmal cerebellar ataxia maps to chromosome 19p. Annals of Neurology 37, 289–293 (1995).
32. Kramer, P.L. et al. A locus for the nystagmus-associated form of episodic ataxia maps to an 11-cM region on chromosome 19p. Am. J. Hum. Genet. 57, 182–185 (1995).
33. Joutel, A. et al. A gene for familial hemiplegic migraine maps to chromosome 19.
Nature Genet. 5, 41–45 (1993).
34. Elliott, M., Peroutka, S.J., Welch, S. and May, E.F. Familial hemiplegic migraine, nystagmus, and cerebellar atrophy. Annals of Neurology 39, 1, 100–106 (1996).
35. Koh, J.Y. and Cotmann, C.W. Programmed cell death: its possible contribution to neurotoxicity mediated by calcium channel antagonist. Brain Res. 587, 233–240 (1996).
36. Catterall, W.A. Structure and function of voltage-gated ion channels. Annu. Rev. Biochem. 64, 493–531 (1995).
37. Perez-Reyes, E., Yuan, W, Wei, X. and Bers, M. Regulation of the cloned L-type cardiac calcium channel by cyclic-AMP-dependent protein kinase. FEBS Lett. 342, 119–123 (1994).
38. Stea, A. et al. Localization and functional properties of a rat brain α_1A calcium channel reflect similarities to neuronal Q- and P-type channels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10576–10580 (1994).
39. Birnbaumer, L. et al. The naming of voltage-gated calcium channels. Neuron 13, 505–506 (1994).
40. Zhang, J.-F. et al. Distinctive pharmacology and kinetics of cloned neuronal Ca²⁺ channels and their possible counterparts in mammalian CNS neurons. Neuropharmacology 32, 1075–1088 (1993).
41. Mintz, I.M., Adams, M.E. und Bean, B.P. P-type calcium channels in rat and peripheral neurons. Neuron 9, 85–95 (1992).
42. Fletcher, C.F. et al. Absence epilepsy in Tottering mutant mice is associated with calcium channel defects. Cell 87, 607–617 (1996).
43. Mintz, I.M. Block of Ca channels in rat central neurons by the spider toxin omega-Aga-IIIA. J. Neurosci. 14, 2844–2853 (1994).
44. Gubler, U. und Hoffman, B.J. A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene 25, 263–269 (1983).
45. Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)

Die in dieser Spezifikation erwähnten Patente oder Veröffentlichungen stellen das Niveau des Fachmanns auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, dar.
Der Fachmann erkennt leicht, dass die vorliegende Erfindung sich gut eignet, die Aufgaben durchzuführen sowie die erwähnten und inhärenten Ziele und Vorteile zu erreichen. Die erfindungsgemäßen Beispiele stellen zusammen mit den hierin beschriebenen Verfahren, Prozeduren, Behandlungen, Molekülen un d spezifischen Verbindungen derzeit bevorzugte Ausführungsformen dar, sind beispielhaft und sollen den Umfang derErfindung nicht einschränken.
Sequenzliste
Sequenzliste
Zeichnungen:
1B: Reverser Strang
2A: Menschliche cDNA, Variation 1
2B: Menschliche cDNA, Variation 2, Variation 3, GGCAG-Insertion
3: Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskulatur, Niere, Bauchspeicheldrüse
4A: INSCA-Familie
4B: MS2SCA-Familie
4C: MDSCA-Familie
4D: SISCA-Familie

Claims

Verfahren zur Bestimmung, ob eine Person an spinocerebellärer Ataxie Typ 6 (SCA-6) leidet oder gefährdet ist, SCA-6 zu entwickeln, umfassend die Beurteilung, ob die Zahl der CAG-Nukleotid-Repeateinheiten im Gen der α_1A-Calciumkanal-Untereinheit von genannter Person größer als eine Kontrollzahl ist, wobei angezeigt wird, dass die genannte Person an SCA-6 leidet oder gefährdet ist, SCA-6 zu entwickeln.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Schritte von: Amplifikation einer als Probe dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz des genannten Gens der α_1A-Calciumkanal-Untereinheit durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines sich von einer Sequenz des genannten Gens herleitenden Oligonukleotid-Primers zur Herstellung amplifizierter genomischer DNA-Fragmente von der Probe; Elektrophorese der als Probe dienenden genannten amplifizierten genomischen DNA-Fragmente zur Herstellung eines Elektrophoresemusters von der Probe; Amplifikation einer als Kontrolle dienenden genomischen DNA-CAG-Repeatsequenz des genannten Gens durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung des genannten Oligonukleotid-Primers zur Herstellung amplifizierter genomischer DNA-Fragmente von der Kontrolle; Elektrophorese der als Kontrolle dienenden genannten amplifizierten genomischen DNA-Fragmente zur Herstellung eines Elektrophoresemusters von der Kontrolle; Vergleich des genannten Elektrophoresemusters von der Probe mit dem genanntem Elektrophoresemuster von der Kontrolle; und Bestimmung, ob die genannte zu testende Person gefährdet sein könnte, durch die Instabilität der CAG-Repeatsequenz des genannten Gens verursuchte SCA-6 zu entwickeln, worin – wenn das genannte genomische DNA-Elektrophoresemuster der Probe Fragmente enthält, die größer als Fragmente vom genannten genomischen DNA-Elektrophoresemuster der Kontrolle sind – die genannte Person an einer durch die Instabilität der CAG-Repeatsequenz des genannten Gens verursachten SCA-6 leidet oder-oder gefährdet ist, SCA-6 zu entwickeln.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der genannte Oligonukleotid-Primer von zwischen 15 und 25 Nukleotiden umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Oligonukleotid-Primer markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin der Oligonukleotid-Primer fluoreszierend markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Fluoreszenz-Markierung Fluoreszenn, Rhodamin, Auramin, Texasrot, AMCA-Blue oder Lucifer Yellow darstellt.
Verfahren nach Anspruch 4, worin, der Oligonukleotid-Primer radiomarkiert ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin der Oligonukleotid-Primer mit einem Enzym markiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, worin der genannte Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO:1 darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, worin der genannte Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO:2 darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin – wenn bestimmt wurde, dass die genannte Person mindestens 21 Repeateinheiten besitzt – die genannte Person dann an SCA-6 leidet oder gefährdet ist, SCA-6 zu entwickeln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin – wenn bestimmt wurde, das die genannte Person 16 oder weniger Repeateinheiten besitzt – die genannte Person dann nicht an SCA-6 leidet oder nicht gefährdet ist, SCA-6 zu entwickeln.