KR100575381B1

KR100575381B1 - 질병의 대규모 유전자형 식별방법 및 척수소뇌성 운동실조 타입 6의 진단방법

Info

Publication number: KR100575381B1
Application number: KR1019997006177A
Authority: KR
Inventors: 리쳉치
Original assignee: 리서치 디벨럽먼트 파운데이션
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1998-01-07
Publication date: 2006-05-03
Also published as: US20040023277A1; WO1998044155A1; IL130825A; EP1015628A1; US7329487B2; AU735756B2; RU2195497C2; KR20000062427A; CN1251616A; JP2001508311A; CA2277583A1; US6303307B1; DE69834127T2; IL130825A0; ATE322555T1; JP4164128B2; DE69834127D1; NZ336483A; AU6015898A; US5853995A

Abstract

본 발명은 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질병을 진행시킬 위험이 있는 개체를 선별하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 개체의 α_1A 칼슘 채널 유전자에서 트리뉴클레오타이드 CAG 반복 서열의 길이를 측정함으로써 상염색체 우성 척수소뇌 운동 실조 타입 6을 진행시킬 위험이 있는 개체를 선별하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 대규모 유전자형을 식별함으로써 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 기인하여 질병을 유발하는 유전자를 동정하는 방법을 제공한다.

척수 소뇌 운동 실조 타입 6, α1A칼슘 채널, CAG 트리뉴클레오타이드 반복 서열, 대규모 유전자형 식별방법

Description

질병의 대규모 유전자형 식별방법 및 척수소뇌성 운동실조 타입 6의 진단방법{Large scale genotyping of diseases and a diagnostic test for spinocerebellar ataxia type 6}

본 발명은 부분적으로 국방부의 승인을 통해 얻은 기금을 사용하여 이루어졌다. 따라서, 연방 정부는 본 발명의 권리를 일부 소유한다.

본 발명은 일반적으로 분자유전학 분야 및 유전자 질환의 진단 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 질병의 대규모 유전자형 식별방법 및 진단 시험방법과 이를 위한 키트에 관한 것이다.

트리뉴클레오타이드 CAG, CTG, CGG 또는 GAA를 포함하는 반복 서열의 신장은 여러 종류의 신경 질환을 유발하는 주요 원인인 것으로 밝혀져 있다¹. 이 중에서, CAG 반복 서열의 신장물은 헌팅톤병², 척수연수 근위축증³, 척수소뇌성 운동실조 타입 1(SCA1)⁴, 척수소뇌성 운동실조 타입 2(SCA2)^5-7, 척수소뇌성 운동실조 타입 3/마샤도-조세프병(SCA3/MJD)⁸ 및 덴타토루브럴-팔리도루이시안(dentatorubral-pallidoluysian) 근위축증/호-리버 증후군⁹을 비롯한 일군의 퇴행성 신경 질환과 관련되어 있다. 이들 모든 질환은 중추 신경계 중에 존재하는 뉴런의 퇴행을 유도하는 진행성 질병이다. 각 유전자 중에 존재하는 CAG 반복 서열은 통상 반복 서열 40개를 초과하지 않으면서 개인마다 길이의 다형성을 나타낸다. 하지만, 질환자는 신장된 대립유전자에 36개 내지 121개의 반복 서열이 포함되어 있다¹⁰.

CAG 반복 서열의 신장물은 CGG, CTG 및 GAA 신장물에 의한 질병^11-14에서 종종 관찰되는 수백 또는 수천개의 반복 서열보다는 훨씬 적다. 신장된 CAG 대립유전자는 배선 조직 및 체조직 모두에서 다양한 불안정성을 나타낸다^15,16. CAG 반복 서열 크기의 세대간 변화는 특히 부계에서 유전되는 경우 추가 신장되는 경향이 많아, 분자 기초를 예상할 수 있다. 상기 질병에서 CAG 반복 배열은 관련 유전자의 암호 영역내에 위치하고 단백질 생성물 중 폴리글루타민 트랙트로 해독된다¹⁷. 이러한 폴리글루타민 트랙트의 신장은 각 질환에서 우성 유전에 관여하는 단백질 생성물에서의 기능 증가를 유도하는 것으로 추정된다. CAG 반복 신장물에 의해 일어나는 질환의 특성은 비교적 균일하기 때문에, 임상 특성이 유사한 기타 다른 신경퇴행성 질환도 CAG 반복 서열의 신장물을 가질 수 있을 것으로 생각되었다. 실제로, 트로티어(Trottier)와 동료들은 SCA2 또는 척수소뇌성 운동 실조 타입 7(SCA7)에 걸린 환자의 조직에서 폴리글루타민 트랙트에 대한 항체를 사용하여 비정상적으로 큰 단백질을 검출하였고, 이것은 SCA2 및 SCA7의 원인이 되는 돌연변이가 폴리글루타민 반복 트랙트의 신장물¹⁸임을 암시한다고 주장하였다.

이와 같은 종래 기술은 유전자 질환을 대규모로 유전자형을 식별할 수 있는 효과적인 수단 및 유전자 질환의 진단 시험법과 진단용 키트에 대해서는 개발된 바 없다. 따라서, 본 발명은 당해 기술 분야에 오랜 염원을 실현하기 위한 것이다.

발명의 요약

사람의 α_1A 전압 의존적 Ca²⁺ 채널 서브유니트에서 다형성 CAG 반복 서열을 동정하였다. 이 CAG 반복 서열의 신장이 유전 진행성 운동실조의 원인일 수 있음을 입증하기 위하여, 다수의 무관련 대조군과 운동 실조 환자의 유전자형 식별을 실시하였다. 후발 개시성 운동 실조에 걸린 8명의 무관련 환자는 운동 실조에 걸리지 않은 475명의 개체에서 나타나는 반복 서열의 수(4개 내지 16개)에 비해 반복 서열의 수가 보다 많은(21개 내지 27개) 대립유전자를 갖고 있었다. 질환에 걸린 개체 군에서 나타나는 반복 서열 길이를 분석한 결과, 모든 환자에서 표현형과 함께 신장부가 분리된다는 것을 발견하였다. 사람의 α_1A 칼슘 채널 서브유니트는 6가지 이소형태가 동정되었다. CAG 반복 서열은 개방 판독 프레임내에 존재하고 3가지 이소형태에서 글루타민을 암호하는 것으로 예상된다. 따라서, 사람의 α_1A 칼슘 채널에서 작은 폴리글루타민 신장부는 새로운 부류의 상염색체 우성 척수소뇌성 운동 실조, SCA6의 원인일 가능성이 가장 크다.

본 발명의 제 1 목적은 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 개체 유래의 시료내의 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 증폭시키는 단계; 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 제한 효소로 분해하는 단계; 분해 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 전기영동으로 분리하여 시료의 전기영동 패턴을 얻는 단계; 상기 시료에서 상기 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 검출할 수 있는 프로브를 표지하는 단계; 분해 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 시료를 상기 표지된 프로브의 제1 일정량과 하이브리드화 조건하에서 하이브리드화하여 상기 시료의 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열에 대한 시료의 하이브리드화 패턴을 형성시키는 단계; 질환이 없는 개체 유래의 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 폴리머라제 연쇄 반응으로 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계; 상기 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 제한 효소로 분해하는 단계; 분해된 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 전기영동으로 분리하여 대조군 전기영동 패턴을 형성시키는 단계; 분해된 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 상기 프로브의 제2 일정량과 하이브리드화 조건하에서 혼합하여 상기 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열에 대한 대조군 하이브리드화 패턴을 형성시키는 단계; 상기 시료 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열에 대한 시료의 하이브리드화 패턴을 상기 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열에 대한 대조군 하이브리드화 패턴과 비교하는 단계; 및 상기 시험 개체가 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험에 있는지를 측정하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 시료의 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열이 상기 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열보다 큰 경우 상기 개체는 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험이 있을 수 있다는 것을 특징으로하는, 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험이 있는 개체를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 2 목적은 삼중자 염기 반복 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 라이브러리를 선별하는 단계; 상기 삼중자 염기 반복 서열을 갖는 클론을 동정하는 단계; 동정된 클론을 서열 분석하여 상기 삼중자 염기 반복 서열에 플랭킹된 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계; 상기 삼중자 염기 반복 서열에 플랭킹된 뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 프라이머를 합성하는 단계; 질환자 또는 무질환자를 포함하는 다량의 개체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리된 DNA를 상기 프라이머로 증폭시켜 증폭된 3중 염기 반복 영역을 형성시키는 단계; 상기 다량의 시료에서 각 개체의 상기 3중 염기 반복 영역에 존재하는 삼중자 염기 반복 서열의 수를 결정하는 단계; 3중 염기 반복 신장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되지만 비-질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰되는지를 측정하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 3중 염기 반복 신장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되지만 비-질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰되는 경우 질환 유발 대립형질이 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성 때문일 가능성이 있다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는, 질환 유발 대립형질이 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성 때문인 유전자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 양태, 특성 및 잇점은 이하 설명을 위해 기재하는 바람직한 양태의 상세한 설명을 통해 명백히 알 수 있을 것이다.

전술한 본 발명의 특징, 잇점 및 목적을 달성하는 기술 구성이 상세하게 이해될 수 있도록 이하 첨부되는 도면에 예시한 특정 양태를 참조로 하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 이 도면은 본 명세서의 일부를 구성한다. 하지만, 첨부 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 설명한 것이지 권리 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 주지해야 한다.

도 1은 사람 α_1A 전압 의존적 Ca²⁺ 채널의 이소형태를 도시한 것이다. 도 1A는 상이한 이소형태 모두가 2종 이상의 각 cDNA 클론에서 관찰됨을 도시한 것이다. "빗금친 굵은 막대"는 94개 염기쌍 뉴클레오타이드 변이를 나타낸 것이고, "빗금친 가는 막대"는 36 bp 결실부를 도시한 것이다. GGCAG 삽입 부위는 수직 막대로 나타내었고, 글루타민 트랙트(폴리 Q)의 위치는 "중간 굵기의 빗금친 막대"로 도시하였다. 이와 같은 변이에 의해 나타나는 아미노산 변화는 도 2에 도시하였다. GGCAG 삽입부를 가진 이소형태만이 신장된 개방 판독 프레임을 보유한다. 도 1B는 사람의 Ca²⁺ 채널 이소형태 BI-1 및 BI-1(GGCAG)의 종결 코돈에 플랭킹된 서열을 도시한 것이다. 상부 및 하부의 문자는 상기 서열에 의해 암호화된 각 아미노산을 나타낸 것이다. 종결 코돈은 TAN 뉴클레오타이드로 표시하였다. 뉴클레오타이드 "N"은 어플라이드 바이오시스템의 염료 종결인자 서열분석 화학에 사용된 FS Taq 효소의 특징인, "A" 피크 이후에 감소된 크기의 "G" 피크를 나타내는 "G" 뉴클레오타이드가다. 이것은 역방향 쇄의 서열 분석을 통해 "G" 뉴클레오타이드가 확실함을 확인하였다. TAG의 상보 서열인 CTA에 밑줄을 그어 표시하였다.

도 2는 토끼(BI-1)와 사람의 a₁ 전압 의존적 Ca²⁺ 채널 간의 서열 비교를 도시한 것이다. 부분 사람 cDNA 서열은 가장 큰 추론 개방 판독 프레임을 나타내는 3.6 kb인 2개의 중복 클론의 조합체이다. 동일 아미노산은 "-" 기호로 나타내고 정렬시의 갭은 "." 기호로 나타내었다. 사람과 래빗의 BI-1 cDNA는 이소형태에 따라 90 내지 94%의 아미노산 동일성을 공유하였다. 전체 길이 사람 α_1A 전압 의존적 Ca²⁺ 채널은 결정되지 않았기 때문에, 토끼 BI-1 서열내 아미노산 쇄가 참조(GenBank의 OCCCBI-1)로서 넘버링되었다. 가정적으로 토끼 BI-1 이소형태(승인번호 X57476)로 GGCAG 뉴클레오타이드를 삽입하면 추론되는 펩티드 판독 프레임은 237개의 아미노산 정도 신장되면서 종결 코돈이 래빗과 사람에서 동일 위치에 나타났다. 이와 같이 추론된 판독 프레임에서 사람과 토끼 cDNA 서열중 아미노산 2328 위치에서 개시되는 글루타민 반복 서열에 밑줄을 그어 표시하였다. 이러한 삽입부가 없는 경우, 토끼와 사람의 BI-1 이소형태 상의 판독 프레임 종결부는 "*"로 표시된 아미노산 2273 위치에 존재하는 것으로 추론된다(이 도면에서는 2개의 정렬 갭의 도입으로 인해 2275에 기재됨). V1, V2 및 V3 변이에 상응하는 이소형태마다 상이한 아미노산과 GGCAG 삽입부는 박스로 표시하였다. V3 이소형태는 폴리 A⁺ 트랙트를 가진 말단절단된 3' 영역을 보유한다. 각 이소형태의 서열은 GenBank에 기탁하였다(승인 번호 U79663, U79664, U79665, U79666, U79667 및 U79668).

도 3은 사람 α_1A 전압 의존적 Ca²⁺ 채널 발현을 노던 분석한 것이다. 하이브리드화는 프로브로서 S-5 cDNA를 사용하여 실시하였다. 뇌 mRNA에는 이 프로브에 특이적인 스미어(smear) 패턴과 함께 독특한 8.5 kb 밴드가 존재하였다. 뇌의 mRNA에서 나타나는 스미어링은 각종 선택적인 스플라이싱된 형태 또는 일부 분해물과의 교차 하이브리드화를 반영하는 것이다.

도 4는 소뇌 운동 실조 군에 존재하는 CAG 반복 서열에 플랭킹된 프라이머 S-5-F1 및 S-5-R1 프라이머를 사용하여 만든 PCR 증폭된 생성물의 분석 결과를 도시한 것이다. 도 4A는 무증후성 군에는 존재하지 않으나 INSCA 동족 유래의 4명의 질환자(I.2, II.3, II.5 및 II.7)에 존재하는 27개 반복부를 가진 신장된 대립형질을 도시한 것이다. 도 4B는 MS2SCA 동족에 속하는 총 5명의 질환자(II.1, II.2, II.3, III.1 및 III.2) 중에서 22개 CAG 반복 서열의 신장된 대립형질이 관찰된다는 것을 도시한 것이다. 도 4C는 MDSCA 동족 중에서 변이성 크기의 23 CAG 반복 서열의 대립형질이 임상적으로 운동 실조에 걸린 2명의 형제(II.1 및 II.3)와 여자 형제(II.2)에는 존재하지만 무증후성인 딸(II.1)에서는 존재하지 않는다는 것을 도시한 것이다. 도 4D는 5회의 감수분열 과정에 의해 분리된 2명의 질환자(IV.1 및 III.7)가 자신의 보다 큰 대립형질 상에 동일한 수의 22개 CAG 반복 서열을 공유하고 있는 SISCA군을 도시한 것이다. 이 대립형질을 계보를 통해 추적해보면 질환이 있는 후대(III.5, II.2, II.4 및 I.2)가 이러한 대립형질의 신장부를 보유할 가능성이 가장 크다는 것을 나타낸다.

본 발명은 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 시험될 개체 유래의 시료내의 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 증폭시키는 단계; 상기 시료에서 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 검출할 수 있는 프로브를 표지화하는 단계; 증폭된 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 시료를 상기 표지된 프로브의 제1 일정량과 하이브리드화 조건하에서 혼합하여 상기 시료의 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열에 대한 시료의 하이브리드화 패턴을 형성시키는 단계; 질환이 없는 개체 유래의 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 폴리머라제 연쇄 반응으로 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계; 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열을 상기 프로브의 제2 일정량과 하이브리드화 조건하에서 혼합하여 상기 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열에 대한 대조군 하이브리드화 패턴을 형성시키는 단계; 상기 시료 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열에 대한 시료의 하이브리드화 패턴을 상기 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열에 대한 대조군 하이브리드화 패턴과 비교하는 단계; 및 상기 시험 개체가 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험이 있을 수 있는지를 측정하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 시료의 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열이 상기 대조군 게놈 DNA 트리뉴클레오타이드 반복 서열보다 큰 경우 상기 개체는 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험이 있을 수 있다는 것을 특징으로 하는, 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 의해 유발되는 질환을 진행시킬 위험이 있는 개체를 선별하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 삼중자 염기 반복 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 라이브러리를 선별하는 단계; 상기 삼중자 염기 반복 서열을 갖는 클론을 동정하는 단계; 동정된 클론을 서열 분석하여 상기 삼중자 염기 반복 서열에 플랭킹된 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계; 상기 삼중자 염기 반복 서열에 플랭킹된 뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 프라이머를 합성하는 단계; 질환자 또는 무질환자를 포함하는 다량의 개체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리된 DNA를 상기 프라이머로 증폭시켜 증폭된 3중 염기 반복 영역을 형성시키는 단계; 상기 다량의 시료에서 각 개체의 상기 3중 염기 반복 영역에 존재하는 삼중자 염기 반복 서열의 수를 결정하는 단계; 3중 염기 반복 신장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되지만 무질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰되는지를 측정하는 단계를 포함하고, 이때, 상기 3중 염기 반복 신장부가 질환자에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되지만 무질환자에서는 전혀 나타나지 않거나 매우 적은 빈도로 관찰되는 경우 질환 유발 대립형질이 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성 때문일 가능성이 있다는 것을 나타내는 것을 특징으로하는, 질환 유발 대립형질이 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성 때문인 유전자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에는 당해 기술 분야에 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법을 이용할 수 있다. 이 기법은 다음과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예컨대, 문헌 참조[Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982); "DNA Cloning: A Practical Approach", Volumes I and II(D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait ed: 1984); "Nucleic Acid Hybridization"[B.D.Hamas & S.J.Higgins eds.(1985)]; "Transcription and Translation"[B.D. Hames & S.J.Higgins eds(1984)]; "Animal Cell Culture"[R.I. Freshney, ed(1986)]; "Immobilized Cells and Enzymes"[IRL Press(1986)]; B.Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984)].

따라서, 본 명세서에 사용된 용어의 정의는 다음과 같다.

"벡터"는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘으로, 부착되는 분절의 복제가 일어날 수 있도록 다른 DNA 분절이 부착될 수 있다. 벡터는 수용체 포유 동물에 대해 투여가 허용된다면 "약리학적 허용성"이라고 한다. 이와 같은 제제는 투여되는 양이 생리적으로 유의적이라면 "치료학적 유효량"으로 투여된다고 한다. 이 제제의 존재가 수용체 포유 동물의 생리학을 변화시킨다면 생리적으로 유의적인 것이다. 예컨대, 레트로바이러스 감염 치료시, 감염 정도 또는 감염에 의한 생리적 손상을 감소시키는 화합물은 치료착적으로 유효한 것으로 간주한다.

"DNA 분자"는 1본쇄 또는 2본쇄 나선 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신)의 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차 및 2차 구조를 의미하는 것이며, 특정 3차 형태를 의미하는 것이 아니다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 DNA 분자(예, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 2본쇄 DNA를 포함한다. 본 명세서에서 구조를 논하는 경우, 통상의 관례를 따라서 DNA의 비전사 쇄(즉, mRNA와 상동성인 서열을 가진 쇄)를 따라 5'에서 3' 방향으로의 서열만을 제시하였다.

DNA "암호화 서열"은 적당한 조절 서열의 조절하에 위치되는 경우 생체내에서 전사되고 생체내에서 폴리펩티드로 해독되는 2본쇄 DNA 서열이다. 암호화 서열의 경계는 5' 말단(아미노 말단) 쪽에 있는 개시 코돈과 3' 말단(카복실 말단) 쪽에 있는 해독 종결 코돈에 의해 결정된다. 암호화 서열로는 원핵 서열, 진핵 mRNA 유래의 cDNA, 진핵(예, 포유 동물) DNA 유래의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다. 폴리아데닐화 시그널과 전사 종결 서열은 보통 암호화 서열의 3' 쪽에 위치한다.

본 명세서에서 사용된 본 발명의 프로브를 의미하는 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 2종 이상의 리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 3종 이상의 리보뉴클레오타이드로 구성된 분자를 의미한다. 정확한 크기는 최종 기능 및 올리고뉴클레오타이드의 용도에 따라 변화하는 많은 인자에 따라 달라진다.

본 명세서에 사용된 "프라이머"라는 용어는 정제된 제한 분해물과 같은 자연 발생적이거나 합성적으로 제조된 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로서, 핵산 쇄에 상보적인 프라이머 신장 생성물의 합성이 유도되는 조건, 즉 DNA 폴리머라제와 같은 유도제와 뉴클레오타이드 존재하에 적합한 온도와 pH에 배치하는 경우 합성 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머는 1본쇄 또는 2본쇄일 수 있고, 유도제 존재하에 목적하는 신장 생성물의 합성을 개시하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 공급원 및 사용된 방법을 비롯하여 많은 인자에 따라 달라진다. 예컨대, 진단 용도시에, 표적 서열의 복잡성에 따라 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 보통 15개 내지 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 일반적이고, 물론 이보다 적은 수의 뉴클레오타이드도 포함할 수도 있다.

본 명세서에 사용된 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"라는 용어는 특정 뉴클레오타이드 서열이나 그 부근에서 2본쇄 DNA를 절단하는 세균 효소를 의미한다.

이와 같은 연구에 가장 일반적으로 사용되는 표지는 방사성 원소, 효소, 자외선에 노출시 형광성을 나타내는 화학물질 등이다. 형광성 물질은 다양한 종류가 알려져 있어, 표지로서 사용될 수 있다. 그 예로는, 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드, AMCA 블루 및 루시퍼 옐로우를 포함한다. 특정 검출 물질로는 염소에서 제조되고 이소티오시아네이트를 통해 플루오레세인에 접합되는 항-토끼 항체가 있다.

하기 실시예로 본 발명의 양태를 예시한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

실시예 1

S-5 cDNA의 분리

S-5 cDNA는 방사능표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브 (GCT)₇으로 일차 사람 뇌 cDNA 유전자군을 선별하여 분리하였다. 사람 뇌 cDNA는 클론텍(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)에서 구입한 mRNA로 구버(Guber)와 호프만(Hoffman) 방법⁴⁴을 사용하여 올리고-d(T) 프라이밍하였다. cDNA 라이브러리는 NotⅠ 제한 링커를 사용하여 IZAPⅡ 벡터내로 클로닝시켜 작제하였다. 상기 라이브러리를 150 밀리미터의 루리아 브로스(Luria broth) 한천 플레이트 당 1000개의 플라크 밀도로 도말하였다. 전체 150,000개의 일차 클론을 선별하였다. 방사능표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브 (GCT)₇과의 하이브리드화는 55℃에서 표준 하이브리드화 수용액을 사용하여 수행하였다⁴⁵. 필터를 55℃ 온도, 2 X SSC 및 0.1% SDS에서 매회 30분씩 3회 세척하였다. 하이브리드화된 클론을 플라스미드 추출을 위하여 정제하였다. 플라스미드 DNA를 오토겐 740 기기를 사용하여 분리하고, ABI-373A 서열분석기 상에서 ABI 키트 및 프로토콜을 사용하여 서열분석하였다. cDNA의 서열분석은 삼중 반복 서열의 존재 유무를 확인하기 위해 실시되었다. S-5 cDNA는 이와 같은 방법을 통하여 수득된 387개의 독특한 재조합 cDNA들중 하나이다. α_1A Ca²⁺ 채널의 부가적인 클론을 프로브로서 S-5 cDNA를 사용하여 분리하였다. 언급한 사람 뇌 cDNA 라이브러리 이외에도, EcoRⅠ 클로닝 부위를 함유한 시판중인 태아 뇌 cDNA 라이브러리(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라진)을 선별하고, 상기 라이브러리로부터 동정된 클론을 사용하여 NotⅠ 부위에서 폴리(A) 트랙트까지의 3＇영역을 작제하였다.

실시예 2

PCR 분석

α_1A Ca²⁺ 채널에서 CAG 길이 다형성의 정도는 하기의 프라이머로 결정하였다:

S-5-F1 (5＇-CACGTGTCCTATTCCCCTGTGATCC-3＇)(서열 번호 1) 및 S-5-R1 (5＇-TGGGTACCTCCGAGGGCCGCTGGTG-3＇)(서열 번호 2). 그러나, 이 목적을 위해 α_1A Ca²⁺ 채널 유전자의 서열에 기초한 어떠한 적절한 프라이머도 사용할 수 있다. 각 반응에서, 각각의 프라이머 5 피코몰을 0.05 유니트의 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여, 1 mCi의 [γ-³²P]ATP로 30분 동안 말단표지시켰다. 각 PCR 분석에는 0.25 유니트의 Taq 폴리머라제, 125 마이크로몰의 dNTP, pH 8.9인 10 밀리몰의 Tris, 2.5 밀리몰의 염화마그네슘, 30 밀리몰의 염화칼륨 및 3.5%(v/v)의 글리세롤이 포함된 25 ml 전체 용적에 5 피코몰의 방사능표지된 S-5-R1 및 S-5-F1 프라이머와 혼합된 20 나노그램의 게놈 DNA가 포함되었다. 시료를 95℃에서 3분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 25초 동안의 변성과정, 68℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 2분 동안의 신장을 1 주기로 하여 28회 반복하였다. 15 ml의 포름아미드 로딩 염료를 반응물에 첨가시킨 후, 혼합물을 95℃에서 20분 동안 변성시켰다. 혼합물 7 ml를 6% 폴리아크릴아미드/8몰 우레아 겔을 통해 전기영동시켰다. M13 시퀀싱 래더와의 상대적인 이동거리를 비교하여 대립유전자의 크기를 결정하였다. 사용된 대조군 DNA는 CEPH 패밀리에 속하는 65개 시료를 포함하고; 분자 및 사람 유전학과에서 125개의 서로 다른 대조군을 제공하였으며; 160개의 시료는 당뇨병 환자에게서 수득하였고; 41개는 산발성 유방암 환자에게서 수득하였고; 42개는 파킨슨 지침증례로부터 수득하였고; 24개의 근육긴장이상증 지침증례 및 18개의 산발성 알츠하이머 환자 시료를 추가로 수득하였다.

실시예 3

노던 (Northern) 분석

클론텍으로부터 다중 사람 조직의 폴리A⁺RNA를 함유하고 있는 노던 블롯을 구입하였다. 200 나노그램의 S-5 cDNA 삽입서열은 파마시아에서 구입한 랜덤 표지화 키트를 사용하여 [α-³²P]dCTP로 방사능표지시켰다. 프로브는 클론텍의 권장 프로토콜에 따라 65℃ 온도에서 밤새 하이브리드화시켰다. 필터는 0.1 X SSC 및 0.1% SDS에서 각각 68℃에서 30분 동안 3회 세척한 후, X-선 필름에 노출시켰다. 0.5 X SSC 및 0.1% SDS에서 68℃ 온도로 낮은 엄격성으로 세척을 하면 상이한 조직들에서 보다 많은 밴드가 검출되며, 이는 다른 Ca²⁺ 채널 유전자와의 교차 반응이 있음을 제시한다.

실시예 4

연관 분석

유전자형 데이타에 대한 검사결과는 증가된 수의 CAG 반복체와 운동실조 표현형 간의 상관성이 분명히 있음을 나타낸다. 133명의 운동실조 환자중 8명은 20개 이상의 보다 긴 길이의 반복 서열을 갖고 있으며, 반면 대조군의 경우 16개 이상의 반복 길이를 갖는 것은 하나도 없었다. 이와 같은 상관성은 2×2 표를 사용하여 운동실조 시료 대 대조군내의 신장물의 존재를 비교하여 통계적으로 측정하였다. 유의한 수준이 피셔의 이그젝트 시험법을 사용하여 결정되었다.

신장과 질병이 동시에 전이된다는 것을 증명하기 위하여 반수체형 분석을 사용하였다. 표현형(운동실조) 및 다형성(신장)을 모두 갖고 있는 단일 유전자위 상황을 모델링화하기 위하여, 완전하게 결합되고 완전한 연관 불균형 상태인 하나의 질병 유전자위 및 하나의 다형성으로 이루어진 두개의 유전자위를 사용하였다. 반수체형의 발생빈도를 몇종류의 우성유전성 운동실조병을 앓고 있는 133명의 환자 시료를 조사를 통하여 계산하였다. 그러므로, 각 경우에 대하여 돌연변이를 유발하는 하나의 질병이 있어야 한다. 이들 돌연변이중 8개(약 6%)는 CAG 반복 신장물에 의해 유발되고; 기타 94%는 이 유전자의 비신장 돌연변이 또는 이외의 유전자 돌연변이에 의하여 유발된다. 반수체형의 발생빈도를 계산하는데 필요한 추가적인 정보로는 미지의 유전자위에 존재하는 우성 운동실조 군집의 빈도이다. 이 발생빈도의 평가가 높을수록 로드 스코어가 낮아진다. 500개중 1개의 보존수가 1000개중 1개의 유전자 발생빈도를 분석하는 본 분석에 사용된다. 4개의 반수체형 발생빈도는 다음과 같다: 0.999(운동실조 및 신장이 모두 없음), 0.0(운동실조는 없고 신장만 발생됨), 0.00094(운동실조는 발생되고 신장은 없음) 및 0.00006(운동실조와 연장이 모두 발생됨). 이와 같은 반수체형 발생빈도는 패스트링크(FASTLINK) 3.0p 버전 프로그램을 사용하여 4개의 운동실조 패밀리내 로드 스코어를 계산하는데 사용한다. 모든 환자들에 대한 질병 상태 및 유전자형을 검사하였고, 건강하고 유전자형이 밝혀지지 않은 개인들은 미지의 질병 상태 및 미지의 유전자형으로 분류되었다.

CAG 반복 서열의 신장에 의해 유발되는 질병을 동정하기 위하여, 다형성 CAG 반복 서열과 후기 발병성 신경퇴행성 질환에 걸린 환자의 DNA 시료를 사용하여 대규모의 유전자형 조사를 수행하였다. 본 발명은 토끼의 α_1A 전압-의존성 Ca²⁺ 채널 BI-A 유전자의 사람 동족체가 상염색체 우성 소뇌 운동실조병으로 진단된 환자의 분획에서 신장된 다형성 CAG 반복 서열을 포함하고 있다는 것을 보고한다. 이 결과는 사람의 α_1A 전압-의존성 Ca²⁺ 채널 유전자내 폴리글루타민을 암호화하는 것으로 예견된 CAG 반복 서열의 신장이 하나의 소뇌 운동실조병의 명백한 유발원이라는 것을 나타낸다.

실시예 5

사람 α _1A Ca ²⁺ 채널 서브유니트에서의 CAG 반복 서열

트리뉴클레오타이드 반복 서열을 포함하는 유전자를 동정하기 위하여, 비증폭된 사람 뇌 cDNA 라이브러리를 (GCT)₇반복 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 사용하여 선별하였다. 이러한 선별로 서열분석을 기초로 각각 독립적인 것으로 결정된 387개의 cDNA 클론이 동정되었다. 이 클론내의 반복 크기는 4에서 21까지의 범위이며, 이러한 선별에서 덴타토루브럴-팔리돌루이시안 위축증/호-리버⁹ 및 마차도-조세프병⁸ 유전자에 상응하는 부분 cDNA 클론을 분리하였다. 이러한 선별에서 SCA1, SCA2에 상응하는 cDNA 클론 및 헌팅턴병 유전자는 분리되지 않았으며, 이는 이들 각 유전자내의 CAG 반복이 거대 전사물의 5＇영역에 위치하고, 선별된 cDNA 라이브러리가 올리고-d(T) 프라이밍을 사용하여 생성된다는 가정하에, 3＇cDNA 말단에 치우쳐 있기 때문인 것같다.

세밀하게 조사된 첫번째 클론은 13개의 CAG 반복 서열을 함유한 S-5로 명명된 cDNA이다. 1.2 kb cDNA의 추정 펩타이드 서열은 토끼의 α_1A 전압-의존성 Ca²⁺ 채널(또한 P/Q형 Ca²⁺ 채널로 알려짐)의 BI-1 이소형과 약 90%의 아미노산 동일성을 갖고 있으며, 이는 S-5 클론이 사람 동족체의 부분 cDNA라는 것을 제시한다. 또한 추정 사람 펩타이드 서열은 또한 쥐의 뇌 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트와 90% 동일성을 보인다²⁰. 토끼 BI-1 아미노산의 722-1036 위치에 상응하는 부분 사람 cDNA 서열은 토끼와 쥐의 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트와 각각 92% 및 82%를 공유하고 있다는 보고가 이전에 발표되었다. 본 발명의 cDNA는 아미노산 1325 위치에서 개시하는 토끼 단백질의 카복시 말단 영역에 상응하는 암호화 서열을 포함한다. 상기 서열 데이타는 분리된 cDNA가 사람 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트를 암호화하고 있다는 것을 의미한다.

코리엘에서 구입한 체세포 하이브리드 맵핑 패널 2번을 사용하여, 사람 α_1A Ca²⁺ 채널을 서열 태그 위치(STS) 맵핑을 통하여 사람 염색체 19번에 위치시켰다. 디리옹(Diriong)²²등은 부분 cDNA 클론을 사용하여 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트를 사람 염색체 19p13에 맵핑시키는 방법을 보고하였다. 이러한 유전좌위의 유전자 심볼은 CACNL1A4²²로 명명하였다. CACNL1A4 유전자의 부분 cDNA(토끼 BI-I 뉴클레오타이드 위치 6487-7165번에 해당함)는 마골리스(Margolis)등²³에 의해 보고되었으며, 19번 염색체에 맵핑한 것을 도시하였다. 사람 CACNL1A4 유전자의 전체 길이 서열을 기술한 보고가 최근에 오포프(Ophoff)²⁴등에 의해 발표되었다.

토끼의 경우, 두개의 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트 이소형(BI-1 및 BI-2)이 동정되었다¹⁹. 이들 이소형은 서로 카복시 말단 서열에서 상이하며, BI-2의 경우 151개의 부가적인 아미노산을 갖는다. 이들 이소형은 423개 뉴클레오타이드의 삽입-결실의 결과인 것으로 생각된다. BI-1내에서 423개의 뉴클레오타이드의 존재는 보다 짧은 길이의 2273개 아미노산 이소형을 유도시키는 종결 코돈을 도입시킨다. 쥐 뇌의 경우, α_1A Ca²⁺ 채널 유전자의 4개 이상의 선택적으로 스플라이싱된 이소형이 관찰되었으나, 하나의 이소형 서열만이 보고되었다²⁰.

토끼와 사람의 서열을 비교한 결과, CAG 반복 서열이 보존적이며, 토끼 α_1A Ca²⁺ 채널 BI-1 및 S-5 cDNA의 추정 3＇비해독 영역에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 토끼 BI-1 이소형의 3＇비해독 영역과 본 발명의 사람 S-5 클론의 3'비해독 영역 사이에서 높은 수준의 동일성(700개 뉴클레오타이드 상의 84% 동일성)이 있음을 발견한 것은 부가적인 스플라이스 변이체가 발생할 수 있으며, 몇몇은 CAG 반복 서열이 해독되는 개방 판독 프레임을 포함할 가능성을 증가시켰다. 이를 조사하기 위하여, 일차 사람 cDNA 라이브러리 및 태아 뇌 cDNA 라이브러리를 S-5 cDNA를 프로브로 사용하여 재선별을 실시하였다. 전체적으로 17개의 부가적인 클론이 분리되었으며, 이들 클론의 서열을 신중하게 분석함으로써 사람 α_1A Ca²⁺ 채널의 카복실 영역의 수 개의 선택적으로 스플라이싱된 이소형을 동정할 수 있었다(도 1A). 특히, 이들 cDNA중 5개는 S-5 cDNA의 TAG 종결 코돈에 앞서 5개의 염기쌍(GGCAG) 삽입체를 포함한다(도 1B). 이들 5개의 염기쌍 삽입체를 보유하고 있는 클론은 사람 유전자내에서 239개의 부가적인 아미노산의 신장된 추정 개방 판독 프레임을 갖는다. 이와 같은 5개의 염기쌍 서열의 토끼의 BI-1 Ca²⁺ 채널의 2273번 아미노산 위치로의 가정적인 삽입은 237개의 아미노산 정도로 추정 판독 프레임을 신장시키고, 사람 서열에 대한 아미노산 상동성은 매우 높은 보존성(80% 동일성)이 남아 있어, 토끼 뇌에서 상기 이소형의 존재를 입증한다(도 2). 이러한 BI-1 (GGCAG) 이소형에서, CAG 반복 서열은 사람 및 토끼의 α_1A 칼슘 채널 유전자내의 2328번 아미노산 위치에서 개시되는 폴리글루타민을 암호화한다.

또한, 사람 α_1A Ca²⁺ 채널 유전자의 부가적인 이소형이 다른 클론에서도 관찰되었다. 클로닝 인공물로부터 유발된 결과물이 없다는 것을 증명하기 위하여, 각 이소형에 대한 두 개 이상의 독립적인 클론을 분리하였으며, 이들의 서열을 분석하였다. 전체적으로, 사람에게도 BI-1으로 명명된 토끼의 BI-1 이소형과 동일한 변이체를 포함하여 6개의 변이체가 관찰되었다. BI-1(V1)으로 명명된 변이체는 BI-1과 뉴클레오타이드 수준에서는 다르지만, 아미노산 수준에서는 상동성을 갖는 94개의 염기쌍 서열을 갖고 있다. 또한, 이러한 변이체는 토끼에서도 기술되어 있다¹⁹. 본 연구에서 분리한 BI-1(V1) 이소형은 오포프(Ophoff)²⁴등에 의해 기술된 추정 펩티드 서열과 99.8%가 동일하다. 1460(알라닌에서 글리신), 1605(알라닌에서 발린), 및 1618(알라닌에서 발린) 위치의 아미노산과 관련된 세개의 차이점이 존재한다. 추정 서열내 이들 위치의 아미노산은 분석한 여러 클론과 일치하며 토끼와 쥐의 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트의 추정 아미노산과 동일하다. BI-1 및 BI-1(V1) 이소형은 GGCAG 삽입체와 함께 관찰되었다(각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4). 부가적인 스플라이스 변이체는 36개의 뉴클레오타이드 결실을 갖는 BI-1(V2)-GGCAG (서열 번호 5) 및 말단절단된 3＇영역 BI-1-(V2, V3)를 갖는 변이체를 포함한다(도 1A). 동정된 클론은 비변이 절편내의 동일한 플랭킹 서열을 갖고 이로인하여 클로닝 인공물을 통제할 수 있는 이들 변이체들의 상이한 조합들을 갖고 있다.

다중 이소형의 존재와 일치하여, S-5 cDNA를 이용하여 높은 하이브리드화 엄격성에서의 노던 분석을 수행한 결과, 뇌에서 우세한 크기의 mRNA의 위와 아래에서 얼룩이 생기게 하는 8.5 kb의 단일 밴드가 검출된다(도 3). 낮은 하이브리드화 엄격성에서는, 모든 조직에서 많은 수의 부가적인 밴드를 관찰하였으며, 이는 기타 Ca²⁺ 채널과 교차 하이브리드화한다는 것을 제시한다(데이타는 제시하지 않음). 크기가 1.2에서 3.1 kb까지인 이러한 사람 뇌 라이브러리로부터의 모든 클론들은 사람 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트의 카복실 영역만을 나타낸다. 하나의 사람 mRNA 공급원에서 유도된 성인 뇌 cDNA내의 CAG 반복서열은 11개 또는 13개의 반복을 포함하며, 이는 유사한 염색체 쌍으로부터 전사된 다형성 CAG 유전자를 나타냄을 제시한다.

실시예 6

신장된 CAG 반복 서열에 대한 대규모의 유전자형 조사

사람의 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트내 정상 길이의 다형성과 구별되는 특이한 길이의 CAG 반복 서열의 동정 가능성이 운동실조 환자에 대한 대규모 유전자형 조사를 통하여 시험되었다. 이 기술은 만일 트리뉴클레오타이드 신장이 SCA6에 관여하는 경우, 질병에 걸린 개인에 있어서는 신장이 상대적으로 높은 빈도로 관찰되지만 비질병성 대립형질에서는 매우 낮은 빈도로 발생하거나 전혀 발생하지 않을 것이라는 전제에 기초하고 있다.

일반적인 군집에서 475개의 무관련 비운동실조 개체로부터의 DNA 시료와 진행성 소뇌 운동실조에 걸린 것으로 알려진 무관련 지침증례로부터의 133개 DNA 시료를 분석하였다. 사람의 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트의 CAG 반복 서열을 플랭킹하는 한쌍의 방사능표지된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여, 각 시료의 CAG 반복 영역을 증폭시키고, CAG 반복 영역의 크기는 겔 전기영동을 통하여 결정하였다. 운동실조 그룹 시료의 반복 서열의 크기는 일반 군집 시료의 DNA로부터 수득된 그룹의 크기와 비교하였다.

표 1에서는 475개의 비운동실조 시료의 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트 유전자에서 CAG 반복 서열의 크기 분포 뿐만 아니라 소뇌 운동실조에 걸린 133명의 지침 환자의 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트 유전자에서 CAG 반복 서열 크기의 분포가 나타내고 있다. 대조군과 환자 군집의 인종적 배경은 코카시안, 아프리카계 미국인, 히스패닉 및 아시안 등을 포함한다. 일반적인 군집에 속하는 개인은 4에서 16개 CAG 반복 유니트 범위의 10개 대립 유전자와 71%의 이형접합성을 보인다. 소뇌 운동실조 환자의 경우, CAG 반복수는 74%의 이형접합성을 갖는 크기가 7에서 27개까지의 범위를 갖는다. 대립 유전자 크기 분포에서 나타난 바와 같이, 133개 운동실조 지침증례 중 8명의 무관련 환자(6%)들은 적어도 21개의 CAG 반복 유니트의 보다 큰 대립 유전자를 갖는다. 비록 신장이 상대적으로 작을지라도, 정상 길이의 다형성과 궁극적으로 상이하게 만드는 비운동실조 대조군의 475명에서는 관찰되지 않았다(피셔 이그젝트 시험을 사용하여 P<10^-5를 관찰).

운동실조와 비-운동실조 염색체상의 CAG 반복 유니트 수의 비교

CAG 반복 유니트 수	염색체의 비-운동실조 대조군수	염색체의 운동실조 지침 대조군 수
4	21	0
5	0	0
6	4	0
7	65	27
8	2	2
9	0	0
10	0	0
11	398	91
12	150	57
13	264	73
14	39	7
15	6	1
16	1	0
17	0	0
18	0	0
19	0	0
20	0	0
21	0	1
22	0	5
23	0	1
...	...	...
27	0	1

상기 8개 지침증례로부터의 게놈 DNA를 S-5 프라이머로 증폭시키고, 서브클로닝시켜 서열분석하였다. 서열분석을 통하여 수득된 CAG 반복 유니트 수는 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트내 순수한 CAG 반복 유니트 수의 증가와 일치하였다. 이렇게 신장된 대립 유전자내의 CAG 반복 유니트의 상이한 수는 희귀한 원조 대립 유전자들과 상반된 결과를 나타낸다. 운동실조 군집에서 신장된 크기의 이상 대립 유전자 및 일반 군집에서의 이들 유전자의 부재에 대한 관찰은 이들 신장된 대립 유전자가 분석한 운동실조 환자의 분획에서 돌연변이 기초를 나타내는 가능성과 일치하였다.

대규모 유전자형 식별 방법은 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트 유전자에서 CAG 신장을 동정하는데 효과적이었다. 그러므로, 이 개념을 삼중자 반복체 질병 현상과 관련된 이외의 돌연변이형을 탐색하는데 사용할 수 있다. 기본적으로, 트리뉴클레오타이드 반복 신장이 질병 표현형에서 높은 빈도를 나타내는 대립 유전자와 관련되어 있지만, 비질병 표현형에서는 낮은 빈도로 관련되거나 부재한다. 그러므로, 대규모 표현형 식별 방법은 위치적 클로닝 방법을 포함하여 다른 사람 질병 유전자를 동정하는데 사용되는 방법과는 다르다. 위치적 클로닝 방법에서, 특정 염색체 영역에 대한 유전적 연관은 후보 질병 유전자의 분리에 앞서 확립되어야 한다. 위치적 클로닝은 헌팅톤병, 척수연수 근육 위축증, 척수소뇌 운동실조형 1, 척수소뇌 운동실조형 2, 척수소뇌 운동실조형 3/마차도-조셉병, 및 유약 X 증후군(Fragile X) 및 근육긴장퇴행 위축병과 관련된 유전자의 동정에 사용하였다.

또한, 본 발명의 접근법은 체계적인 유전자 동정 전략이 세워지지 않은 사람 질병에 대한 무작위적인 후보 유전자 접근법과는 다르다. 무작위적 후보 유전자의 접근 방법은 덴타토루브럴-팔리돌루이시안 위축증/호-리버 증후군 유전자의 동정에 사용하였다. 본 발명의 전략은 질병 유전자내 삼중자 반복 서열이 대규모 유전자형 식별 조사에 적합한 길이의 다형성이라는 관찰에 기초하고 있다. 대규모 유전자형 식별 접근법은 비질병 군집과 비교하여 질병에 걸린 개인에서 이상 크기를 갖는 대립 유전자를 동정한다. 이러한 개념에서 유도된 전략은 위치적 클로닝에서 첫번째 단계로 사용하고 있는 가계혈통내의 특정유전자연결(연관)의 앞선 확립을 위해 요구되는 것들을 부정한다. 본 발명의 대규모 유전자형 식별 전략은 직접적인 유전자 대 질병상태의 접근 방법이다.

본 발명의 또 다른 목적으로는, 삼중자 염기 반복 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 라이브러리를 선별하는 단계; 전술한 삼중자 염기 반복 서열을 갖는 클론을 동정하는 단계; 삼중자 염기 반복 서열을 플랭킹하는 뉴클레오타이드의 서열을 결정하기 위해 동정된 클론을 서열분석하는 단계; 삼중자 염기 반복 서열을 플랭킹하는 뉴틀레오타이드 서열과 상보적인 프라이머를 합성하는 단계; 질병에 걸린 및 질병에 걸리지 않은 개체들을 포함한 개체들의 대규모 샘플링으로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리된 DNA를 프라이머로 증폭시켜 증폭된 삼중자 염기 반복 서열 영역을 생성시키는 단계; 대규모 샘플링중 각 개체에 대한 삼중자 염기 반복 서열 영역에서의 삼중자 염기 반복 서열수를 결정하는 단계; 삼중자 염기 반복 서열 신장물이 질병에 걸린 개체에서는 비교적 높은 빈도로 관찰되고, 질병이 없는 개인에서는 낮은 빈도로 관찰되거나 관찰되지 않는지를 결정하는 단계를 포함하고, 이때, 삼중자 염기 반복 서열 신장물이 질병에 걸린 개체에게서 비교적 높은 빈도로 관찰되고 질병이 없는 개체에서는 낮은 빈도로 관찰되거나 관찰되지 않는 경우, 질병 대립 유발 유전자는 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 기인한다는 것을 특징으로 하는, 질병을 유발시키는 대립 유전자가 트리뉴클레오타이드 반복 서열의 불안정성에 기인하는 유전자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

실시예 7

운동실조 환자에서 신장된 대립형질의 유전

4개의 지침증례는 추가로 질병에 걸린 구성원을 임상적으로 평가한 패밀리로부터 기인하며, 유전자형 식별 분석을 위해 DNA를 얻었다. 동의하에 연구에 참여한 패밀리 구성원 21명을 확보하였다. 21명 중 14명은 운동 실조인 것이 임상적으로 입증되었다. 이 패밀리들에서, 운동 실조는 각각 28세 내지 50세에 개시되면서 상염색체 우성 방식으로 유전되었다.

S-5 프라이머를 사용하여 상기 패밀리 구성원의 유전자형 식별 분석을 실시한 결과, 신장된 대립 형질이 각 패밀리에서 질환의 표현형에 따라 분리되는 것으로 확인되었다. 예컨대, 도 4A는 근연성이 먼 구성원(데이터는 도시하지 않음)을 비롯하여 무증후성 패밀리에서는 관찰되지 않으나 INSCA 동족 유래의 4명의 질환자에서 27개 반복 서열을 가진 신장된 대립형질을 도시한 것이다. 이 동족 중에서 개시 연령은 28세 내지 31세이었고, 무증후성 개체 중 3명의 개시 연령은 41세 이상이었다. 도 4B는 22개 반복 서열의 신장된 대립형질이 MS2SCA 동족에 속하는 5명의 질환자 모두에서 관찰된다는 것을 도시한 것이다. MDSCA 동족(도 4C) 중에서 임상적 운동 실조에 걸린 2명의 형제(II.1 및 II.3)와 여자 형제(II.2)에서는 이상 크기의 23개 CAG 반복 서열의 대립형질이 관찰되었지만, 무증후성 딸인 II.1에서는 관찰되지 않았다. 도 4D에 도시된 SISCA 패밀리에서는, 5회의 감수분열 과정에 의해 분리된 2명의 질환자(IV.1 및 III.7)가 보다 큰 대립형질 상에 동수의 22개 CAG 반복 서열을 공유하는 것으로 나타났다. 계보를 통해 이러한 대립형질을 추적해 본 결과, 질환에 걸린 후대(III.5, II.2, II.4 및 I.2)가 상기 신장된 대립형질을 보유할 가능성이 가장 크다는 것을 알 수 있었다. 이러한 패밀리 중에서 질환에 걸린 신장된 대립형질의 분리율은, FASTLINK 컴퓨터 프로그램(전술함)^{26, 27} 버젼 3.0P를 사용하여 질환자의 유전자형 데이터를 분석하였을 때 재조합 빈도 0에서 5.08의 누적 반수체형 로드(lod) 값으로 알 수 있듯이 매우 유의적이었다. 각 동족의 로드 값은 표 2에 요약하였다. 종합해 보면, 신장된 대립형질이 475명의 비운동 실조 대조군에서는 관찰되지 않고 소뇌 운동 실조로 진단된 환자에서만 관찰된다는 통계적으로 유의적인 발견과 이러한 신장된 대립 형질과 질환의 명백한 연관성은 α_1A 전압-의존성 Ca²⁺ 채널 서브유니트 중의 폴리글루타민 신장부가 후발 개시성이며 우성적으로 유전되는 운동 실조의 원인임을 입증하는 것이다.

반수체형 분석에 의한 로드(lod) 값

패밀리	θ= 0 에서의 로드 값
INSCA	1.20
MDSCA	0.90
MS2SCA	1.49
SISCA	1.49
총	5.08

실시예 8

CAG 반복 서열 신장부를 보유한 환자에서 나타나는 임상 및 병리적 특징

전술한 패밀리에 속하는 환자의 임상적 특징은 서로 매우 유사하며, 주로 진행 속도가 중간 내지 느린 사지 및 보행의 소뇌 운동 실조, 눌어증, 안진 및 중간 진동성 감각 상실과 고유수용 감각 상실로 구성된다. 이 질환은 매우 잠행성이며, 대부분의 환자들은 초기에 느끼지 못하고, 갑작스럽게 회전하거나 신속하게 움직였을 때 순간 불균형과 "머리가 띵함"을 느낀다. 일반적으로, 이와 같은 초기 증상 후 환자가 영구적인 균형과 조정의 어려움을 느끼는 것은 수년이 지난 후이다. 이 질환은 보통 20년 내지 30년간 진행되어 보행 장애를 초래하고 환자가 휠체어에 의존하게 만든다. 몇몇 노인 환자 중에서는 뇌간의 관련성을 암시하는 질식이 관찰되었고, MDSCA 및 MS2SCA 동족의 몇몇 구성원에서는 이 질환이 사망의 원인이었다. 일반적으로 증후는 반복 서열의 수가 22개 내지 23개인 MDSCA, SISCA 및 MS2SCA 패밀리에 속하는 환자가 40대가 되면 진행하지만, 신장된 대립형질이 27개의 반복 서열을 포함하는 INSCA 동족인 경우에는 질병 개시가 모든 질환자에서 28세 내지 31세에 이루어졌다. 질환자의 뇌를 자기공명영상화 기법으로 조사한 결과 분리된 소뇌 근위축이 관찰되었다. SISCA 동족 중 2명의 사망자에 대하여 세밀한 신경병리적 연구를 실시한 결과 소뇌 근수축은 현저하고 뇌간 근수축은 보통 정도인 것으로 관찰되었다²⁸. 현미경 조사 결과 소뇌 푸르키니에 세포의 손실은 심각하였고 과립 세포 및 치상 핵 뉴런의 손실은 중간 정도이었으며, 하올리브에서의 신경 손실은 중간 내지 중간 이하이었다.

유전성 소뇌 운동 실조는 소뇌 및 이것의 구심성 및 원심성 연결체의 기능부전과 연관된 신경 질환의 임상적 및 유전적 이종 그룹이다. 지금까지, 사람 염색체 6, 12, 14, 16, 11 및 3에 대해 6개의 상염색체 우성 척수소뇌 운동 실조(SCA)가 맵핑되었고, 그 좌위는 각각 SCA1, SCA2, SCA3, SCA4, SCA5 및 SCA7로 표시하였다¹⁰. 우성 유전성이고 진행성인 운동 실조에 걸린 다수의 패밀리 중에서 이 유전자들의 유전자 지도의 위치는 알려져 있지 않다. 사람 염색체 19p13에 대한 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트의 맵핑 및 4개 패밀리 중의 돌연변이 메카니즘에 의한 상기 채널내 CAG 반복 서열 신장부의 동정 결과, 사람 염색체 19p13에 SCA6으로 표시될 수 있는 새로운 SCA 좌위를 발견하였다.

과거에 SCA6이라는 용어는 공지된 좌위로 맵핑되지 않은^29,30 우성 유전성 SCA를 나타내는 것이었다. 이러한 맵핑 명명법이 SCA6 좌위를 염색체 19p13(HGM 명명 위원회)의 우성 유전성 운동 실조 맵핑에 지정하기 위해 개정되었다. 유전성 발작 소뇌 운동 실조(HPCA) 또는 우연적 운동 실조(EA)가 또한 19p13 영역^31-32에 맵핑되었다. 다른 우연적 질환인 가족성 편마비성 편두통(FHM)³³의 좌위도 HPCA/EA의 유전자가 지정된 영역에서 19p13에 위치되었다. HPCA 또는 EA에 걸린 환자는 일반적으로 발작 사이 정상적인 공조가 뚜렷한 주기적 운동 실조를 나타낸다. 이것은 운동 실조가 영구적으로 관찰되기 수년 전에 환자가 느끼는 우연적 감각의 불규칙성을 암시한다. HPCA/EA에 대한 신경학적 검사시 유일한 영구적 이상은 모든 환자에서 관찰되는 안진이다. 뇌 영상화 연구를 통해 일부 HPCA/EA 환자는 소뇌 근수축에 걸리는 것으로 관찰되었다³¹. 흥미로운 사실은 여러 FHM 환자 패밀리 중에서, 질환자 구성원들은 HPCA/EA에서 관찰되는 것과 유사한 운동 실조, 안진 및 기타 전정 소뇌 안구 이상과 관련이 있는 퇴행성 소뇌 근위축을 나타내었다. 이 두 질환의 표현형이 중복되는 것으로부터 HPCA/EA 및 FHM이 증후의 주기성 때문에 이온 채널 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 가능성이 있는 대립형질 질환이라는 가설을 얻을 수 있다^32,34.

최근, 오포프 등(Ophoff et al.)은 FHM 환자에서는 사람 α_1A Ca²⁺ 채널 서브유니트 유전자에서 4개의 미스센스 돌연변이가 존재하고, 2명의 EA 환자에서는 동일 유전자의 판독 프레임을 붕괴시키는 2개의 돌연변이가 존재한다고 보고하였다²⁴. 이러한 결과와 본 발명은 FHM, HPCA/EA 및 진행성 SCA6이 대립형질 질환임을 증명한다. 돌연변이의 특성(SCA6에서 CAG 반복 서열 신장 대 HPCA/EA에서 단백질 말단절단)은 이 질환의 임상적 과정에 영향을 미친다. SCA6에서는 영구적이고 진행성인 소뇌 및 뇌간 이상이 관찰되는 반면 HPCA/EA에서는 약하거나 간헐적인 소뇌 이상이 관찰되었다. 이와 같은 사실은 글루타민 신장부가 진행성 신경 손상을 자극하는 방식으로 채널의 기능에 영향을 미친다는 것을 암시한다. 이것은 신경전달물질 방출의 변화를 통해 일어나거나, 세포 사멸을 유도하는 세포내 Ca²⁺의 농도를 비정상적으로 변화시켜 일어날 수 있다^{21, 35}. 이 시점에서 주기적 신경 이상 대 영구적이며 진행성인 질환과 관련된 각 돌연변이의 병인성 효과를 측정할 수는 없으며, 돌연변이 마우스 모델과 신경생리학적 연구를 실시해야만 할 것이다. SCA6 패밀리에서 CACNL1A4 유전자 중의 다른 돌연변이가 배제되지는 않지만, 8개의 각 운동 실조 패밀리에서 신장부와 질환 표현형(P<10^-5)과 4개의 패밀리에서 신장된 대립형질 상의 반복체의 상이한 수(세대간 불안정성 부재하에) 간의 고도로 유의적인 관련성은, 이것이 돌연변이 유발 질환이라는 것을 강력하게 지지하는 것이다. 또한, 오포프와 동료²⁴가 유전자형 식별된 50명의 정상 개체에서는 어떠한 신장된 대립형질도 관찰하지 못하였다는 것을 주지하는 것이 중요하다.

SCA6 중의 돌연변이 메카니즘이 다른 우성적으로 유전되고 진행성인 운동 실조와 같이 해독된 CAG 반복체의 신장부를 포함하는 것으로 증명될지라도, 병원성 메카니즘이 유사한지는 명확하지 않다. SCA6 중의 돌연변이와 SCA1, SCA2, SCA3, HD, DRPLA 및 SBMA를 유발하는 돌연변이간에는 2가지 주요 차이가 있다. 첫번째는 SCA6 중의 신장된 돌연변이 대립형질(21개 내지 27개 반복 서열)이 다른 신경퇴행성 질환에서 관찰되는 신장된 대립형질(36개 내지 121개 반복 서열) 보다 현저히 작고 많은 무질환자 중의 다른 좌위에서 관찰되는 폴리글루타민 트랙트의 정상 범위 이내라는 점이다. 두 번째는 정상 푸르키니에 세포 기능과 생존에 중요한 것으로 알려진 유전자의 암호화 영역에서 CAG 반복 서열 신장부가 나타난다는 점이다^19,25. 이것은 CAG 신장부가 α_1A Ca²⁺ 채널의 정상 기능을 직접 방해하여 병원성 효과를 발휘할 것이라는 가능성을 제기하는 것이다.

전압-의존성 칼슘 채널은 신경원 및 기타 자극성 세포 중으로 칼슘의 유입을 매개하고, 막 흥분성, 신경전달물질 방출 및 유전자 발현을 비롯한 다양한 신경원 기능에 중요한 역할을 한다³⁵. 칼슘 채널은 주로 기공 형성 a₁ 서브유니트에 의해 매개되는 채널 활성이 있는 다중서브유니트 복합체이지만, b, a₂/d 및 g를 비롯한 부가 서브유니트도 채널 활성을 조절하는 부속 단백질로서 작용한다^36-38. 6개의 a₁ 유전자를 암호화하는 cDNA가 클로닝되었으며 α_1A,B,C,D,E 및 S³⁹라고 표시하였다. 본 발명의 특징인 사람 유전자는 토끼와 쥐의 α_1A 이소형태와 상동성이 가장 크다^19,20. 사람 염색체 19에 대한 맵핑 위치는 염색체 19p13에 대한 α_1A 이소형태를 암호화하는 사람 서열의 종래 맵핑과 일치한다^22-24. 전기생리학적 성질과 약리학적 성질의 조합으로 포유 동물의 말초 및 중추 신경원에서 4가지 주요 형태의 고한계치 Ca²⁺ 채널이 정의된다⁴⁰. 이것을 L, N, P 및 Q로 표시하였고, P형 채널은 푸르키니에 세포에 존재하는 주요 칼슘 채널이고, Q형 채널은 소뇌 과립 세포에 존재하는 주요 칼슘 흐름이다^25,38. 클로닝된 α_1A이소형태는 P형 및/또는 Q형 칼슘 흐름을 유도한다는 것이 밝혀진 바 있다^38,40. 동정된 또 다른 이소형태는 P/Q형 칼슘 흐름에서 관찰되는 기능적 차이의 일부를 규명하는데 도움이 될 수 있다. α_1A 채널의 약리학적 성질 뿐만 아니라 전기생리학적 성질은 쥐의 소뇌에서의 풍부한 발현과 함께 푸르키니에 세포 중의 항상성 및 칼슘 도입에 있어 이의 중요성을 역설하는 것이다^25,41.

최근, α_1A전압-의존성 서브유니트 유전자의 마우스 동족체가 급발작과 소뇌 운동 실조를 보이는 비틀거리는(tg) 마우스와 기대는(tg^la) 마우스내의 돌연변이된 유전자를 동정하는 것을 목적으로 하는 위치 클로닝 전략을 사용하여 동정하였다. 이러한 좌위는 사람 19p13과 신테닉한 영역내 마우스 염색체 8에 위치하였다. 위치 1802번에서 C가 T로 변화한 tg 돌연변이는 제2 경막 도메인의 세포외 분절에서 보존적 기공 내부 도메인과 매우 근접한 위치에서 비보존적인 프롤린의 루이신으로의 치환을 야기시킨다. 이러한 돌연변이는 운동 실조, 운동형 발작 및 결여형 발작을 나타내는 열성 신경 질환을 초래한다.

tg^la 돌연변이는 C 말단 세포내 도메인에 위치한 인트론의 5' 말단에 있는 스플라이스 공여체의 콘센서스 서열 중의 단독 G가 A로 변화한 것이다. 이 돌연변이는 RT-PCR에 의해 검출되는 2가지 이상 스플라이싱된 mRNA, 즉 인트론의 스플라이싱 제거의 실패로 얻어지는 보다 큰 단편과 1개의 엑손을 누락하여 생기는 보다 작은 단편을 생성한다. 이 두 전사체는 판독 프레임을 이동시켜 이상 단백질을 생성하는 것으로 추정된다. 스플라이스 돌연변이가 있는 동형접합성 tg^la 마우스는 tg 마우스에 비해 보다 분명한 운동 실조와 소뇌 변성을 나타낸다.

α_1ACa²⁺ 채널 중의 돌연변이가 마우스 중 푸르키니에 세포 및 과립 세포 변성과 소뇌 운동 실조에 관련이 있다는 발견은 이 채널이 소뇌에서의 정상 푸르키니에 세포 및 과립 세포 기능에 중요하다는 가설을 지지하는 것이다. 이 돌연변이의 마우스 중 열성 성질과 tg^la 돌연변이가 이상 단백질을 생성하는 것으로 예상된다는 사실은 이와 같은 돌연변이가 기능 메카니즘의 상실을 통해 운동 실조 표현형을 나타낸다는 것을 암시하는 것이다. tg^la 마우스 중의 돌연변이는 사람 유전자에 존재하는 추정상의 글루타민 트랙트의 위치로부터 바로 상류에 있는 상기 채널의 카복시 말단부를 변화시킨다. 이러한 데이터는 사람 α_1ACa²⁺ 채널 이소형태 중의 적당한 글루타민 신장부가 소뇌 변성 및 운동 실조를 유도하는 메카니즘에 대한 관심을 불러일으킨다. 이 질병의 우성 성질은 3가지 가능성을 제시한다. (1) 반수체부족에 의한 기능 상실, (2) 신장부에 의한 우성의 반작용 효과, 또는 (3) CAG 반복 서열 신장부에 의해 유발되는 기타 질환에서 제시된 바와 같은 신규 기능 획득. 돌연변이가 이종접합된 tg 및 tg^la 마우스에서는 운동 실조 표현형이 결실된다는 것은 기능 상실 가설에 반대되는 주장이다. 하지만, 마우스내 어떤 돌연변이가 α_1ACa²⁺ 채널 기능의 상실을 유도하고 이종접합성 마우스가 운동실조를 나타내지 않거나 푸르키니에 세포 변성을 나타내지 않는다는 것을 세밀한 정량적 방법으로 확인할 때까지는 상기 모델을 배제할 수는 없다. 일부 환자 중에서 일시적이며 약한 운동 실조의 성질을 가정하는 경우, 마우스에서 약한 간헐적 운동 실조 표현형을 확인하기는 매우 어렵다. 우성의 반작용 메카니즘을 자극하는 모델은 사람 패밀리 중의 유전성 패턴 및 tg 마우스에 대해 지금까지 입수용이한 데이터와 일치한다. 이 모델에서, 글루타민 트랙트의 작은 신장부는 시냅스 단백질에 대한 이의 결합에 영향을 미치거나 활성을 조절하는 것으로 알려진 다른 부속 채널 단백질에 대한 이의 결합을 방해하여 채널의 정상 기능을 저해할 수 있다. tg 마우스 중의 데이터와 전기생리학적 데이터⁴³에 근거해 볼 때 α_1ACa²⁺ 채널이 정상 푸르키니에 세포 기능에 중요한 것으로 알려져 있는 바, 글루타민 신장부가 단백질에 신규 기능을 부여한다고 주장하기는 어렵다. 글루타민 신장부는 구성적 활성화의 가능성을 비롯하여 이상 채널 기능을 유도할 가능성이 가장 크다. 각종 모델의 최종 시험을 위해서는 α_1ACa²⁺ 채널 유전자가 결실된 마우스와 SCA6 질환 범위에서 CAG 신장부를 가진 대립형질을 발현하는 마우스의 생산을 기다려야 할 것이다.

SCA6에 있어 유전자형/표현형 상관관계는 반복 크기가 22개 내지 23개 범위인 패밀리(40세 내지 50세)에 비해 27개 반복체를 보유하는 패밀리의 모든 구성원에서 개시 연령(28세 내지 31세)에 큰 차이를 제공하는 바 신장부가 매우 유해하다는 것을 암시한다. 시료 크기가 유전자형/표현형 상관관계에 대한 확고한 결론을 유도하기에 지나치게 작더라도, SCA6보다는 훨씬 약한 HPCA/EA에 걸린 일부 환자의 신장부가 훨씬 작은지를 관찰하기에는 바람직할 것이다. 또한, α_1ACa²⁺ 채널에서 상이한 돌연변이가 SCA6을 유도하는지를 측정하는 것도 중요할 것이다. SCA6 중의 CAG 반복 서열은 세대간 대립형질 크기의 변화 또는 검출가능한 모자이크화 없이 안정적이다. 이것은 기타 다른 많은 좌위에서 유사한 크기의 CAG 반복 서열이 안정적인 방식으로 유전되는 것에 비추어 놀라운 것이 아니다. 하지만, 일반 군집에서 반복 서열의 크기와 상이한 SCA6 패밀리에서 관찰되는 신장된 대립형질의 상이한 크기는 이러한 좌위에서 약간의 불안정성이 일어나고 이와 같은 불안정성이 질환 대립형질 범위내의 돌연변이 신장부를 만든다는 것을 시사한다.

결론적으로, 본 발명은 푸르키니에 세포형 Ca²⁺ 채널의 사람 α_1A 서브유니트에서 비교적 작은 폴리글루타민 신장부가 푸르키니에 세포 변성과 소뇌 운동 실조를 유도한다는 것을 입증한다. 이와 같은 발견의 직접적인 영향은 임상적이고 생물학적인 것이다. 비교적 작은 CAG 반복 서열 신장부가 이상 단백질 기능을 유도할 수 있다는 관찰은 상기 반복체의 효과에 대한 새로운 개념과 가능한 병원성 효과에 대해 각각 주의깊은 평가 필요성을 불러일으킨다. 마지막으로, 사람 Ca²⁺ 채널에서 폴리글루타민 트랙트의 신장부는 칼슘 항상성에 관련된 신경퇴행성 메카니즘과 다른 글루타민 매개의 신경퇴행성 과정에 대한 상기 메카니즘의 가능한 역할에 관한 통찰력을 제공할 것이다.

다음과 같은 참조 문헌을 본 발명에 참고 인용하였다.

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본 명세서에 기재된 모든 특허 또는 공보는 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 통상의 기술 수준을 나타내는 것이다. 이들 특허와 공보는 개개의 전체 내용이 본 명세서에 참고 인용된다.

당업자는 본 발명이 본 명세서에 기재된 고유의 것은 물론 기재된 목적을 실시하고 최종 결과와 잇점을 얻기 위하여 적절히 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 기재된 방법, 절차, 처리, 분자 및 특정 화합물과 함께 본 발명의 실시예는 예시적인 것이지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다. 다른 변형과 용도는 첨부되는 청구의 범위에 의해 제한되는 바와 같은 본 발명의 취 지내에 포함되는 한 당업자에 의해 실시가능하다.

<110> RESEARCH DEVELOPMENT FOUNDATION <120> Large scale genotyping of diseases and a diagnostic test for spin ocerebellar Ataxia Type 6 <130> 5-1998-064579-4 <150> US 08/779,801 <151> 1997-01-07 <160> 5 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 1 cacgtgtcct attcccctgt gatcc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 2 tgggtacctc cgagggccgc tggtg 25 <210> 3 <211> 3632 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human brain cDNA <400> 3 gaattcttcc actcgacttc atagtggtca gtggggccct ggtagccttt gccttcactg 60 gcaatagcaa aggaaaagac atcaacacga ttaaatccct ccgagtcctc cgggtgctac 120 gacctcttaa aaccatcaag cggctgccaa agctcaaggc tgtgtttgac tgtgtggtga 180 actcacttaa aaacgtcttc aacatcctca tcgtctacat gctattcatg ttcatcttcg 240 ccgtggtggc tgtgcagctc ttcaagggga aattcttcca ctgcactgac gagtccaaag 300 agtttgagaa agattgtcga ggcaaatacc tcctctacga gaagaatgag gtgaaggcgc 360 gagaccggga gtggaagaag 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ggggccgccg ccagctcccc cagaccccct 2940 ccaccccccg gccacacgtg tcctattccc ctgtgatccg taaggccggc ggctcggggc 3000 ccccgcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca ggcggtggcc aggccgggcc 3060 gggcggccac cagcggccct cggaggtacc caggccccac ggccgagcct ctggccggag 3120 atcggccgcc cacggggggc cacagcagcg gccgctcgcc caggatggag aggcgggtcc 3180 caggcccggc ccggagcgag tcccccaggg cctgtcgaca cggcggggcc cggtggccgg 3240 catctggccc gcacgtgtcc gaggggcccc cgggtccccg gcaccatggc tactaccggg 3300 gctccgacta cgacgaggcc gatggcccgg gcagcggggg cggcgaggag gccatggccg 3360 gggcctacga cgcgccaccc cccgtacgac acgcgtcctc gggcgccacc gggcgctcgc 3420 ccaggactcc ccgggcctcg ggcccggcct gcgcctcgcc ttctcggcac ggccggcgac 3480 tccccaacgg ctactacccg gcgcacggac tggccaggcc ccgcgggccg ggctccagga 3540 agggcctgca cgaaccctac agcgagagtg acgatgattg gtgctaagcc cgggcgaggg 3600 aattcctttt tttttttttt tttttttttt tt 3632 <210> 4 <211> 3632 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human brain cDNA <400> 4 gaattcttcc actcgacttc atagtggtca gtggggccct 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ccaggactcc ccgggcctcg ggcccggcct gcgcctcgcc ttctcggcac ggccggcgac 3480 tccccaacgg ctactacccg gcgcacggac tggccaggcc ccgcgggccg ggctccagga 3540 agggcctgca cgaaccctac agcgagagtg acgatgattg gtgctaagcc cgggcgaggg 3600 aattcctttt tttttttttt tttttttttt tt 3632 <210> 5 <211> 3596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human brain cDNA <400> 5 gaattcttcc actcgacttc atagtcgtca gtggggccct ggtagccttt gccttcactg 60 gcaatagcaa aggaaaagac atcaacacga ttaaatccct ccgagtcctc cgggtgctac 120 gacctcttaa aaccatcaag cggctgccaa agctcaaggc tgtgtttgac tgtgtggtga 180 actcacttaa aaacgtcttc aacatcctca tcgtctacat gctattcatg ttcatcttcg 240 ccgtggtggc tgtgcagctc ttcaagggga aattcttcca ctgcactgac gagtccaaag 300 agtttgagaa agattgtcga ggcaaatacc tcctctacga gaagaatgag gtgaaggcgc 360 gagaccggga gtggaagaag tatgaattcc attacgacaa tgtgctgtgg gctctgctga 420 ccctcttcac cgtgtccacg ggagaaggct ggccacaggt cctcaagcat tcggtggacg 480 ccacctttga gaaccagggc cccagccccg ggtaccgcat ggagatgtcc attttctacg 540 tcgtctactt tgtggtgttc cccttcttct ttgtcaatat ctttgtggcc ttgatcatca 600 tcaccttcca ggagcaaggg gacaagatga tggaggaata cagcctggag aaaaatgaga 660 gggcctgcat tgatttcgcc atcagcgcca agccgctgac ccgacacatg ccgcagaaca 720 agcagagctt ccagtaccgc atgtggcagt tcgtggtgtc tccgcctttc gagtacacga 780 tcatggccat gatcgccctc aacaccatcg tgcttatgat gaagttctat ggggcttctg 840 ttgcttatga aaatgccctg cgggtgttca acatcgtctt cacctccctc ttctctctgg 900 aatgtgtgct gaaagtcatg gcttttggga ttctgaatta tttccgcgat gcctggaaca 960 tcttcgactt tgtgactgtt ctgggcagca tcaccgatat cctcgtgact gagtttggga 1020 ataacttcat caacctgagc tttctccgcc tcttccgagc tgcccggctc atcaaacttc 1080 tccgtcaggg ttacaccatc cgcattcttc tctggacctt tgtgcagtcc ttcaaggccc 1140 tgccttatgt ctgtctgctg atcgccatgc tcttcttcat ctatgccatc attgggatgc 1200 aggtgtttgg taacattggc atcgacgtgg aggacgagga cagtgatgaa gatgagttcc 1260 aaatcactga gcacaataac ttccggacct tcttccaggc cctcatgctt ctcttccgga 1320 gtgccaccgg ggaagcttgg cacaacatca tgctttcctg cctcagcggg aaaccgtgtg 1380 ataagaactc tggcatcctg actcgagagt 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cgcccacggg gggccacagc agcggccgct 3120 cgcccaggat ggagacgcgg gtcccaggcc cggcccggag cgagtccccc agggcctgtc 3180 gacacggcgg ggcccggtgg ccggcatctg gcccgcacgt gtccgagggg cccccgggtc 3240 cccggcacca tggctactac cggggctccg actacgacga ggccgatggc ccgggcagcg 3300 ggggcggcga ggaggccatg gccggggcct acgacgcgcc accccccgta cgacacgcgt 3360 cctcgggcgc caccgggcgc tcgcccagga ctccccgggc ctcgggcccg gcctgcgcct 3420 cgccttctcg gcacggccgg cgactcccca acggctacta cccggcgcac ggactggcca 3480 ggccccgcgg gccgggctcc aggaagggcc tgcacgaacc ctacagcgag agtgacgatg 3540 attggtgcta agcccgggcg agggaattcc tttttttttt tttttttttt tttttt 3596

Claims

개체의 게놈성 DNA 시료 내의 CAG 반복 서열들을 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 수득하는 단계;

상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 시료의 게놈성 DNA CAG 반복 서열을 증폭시켜 증폭된 시료의 게놈성 DNA 단편들을 생성시키는 단계;

시료의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수를 측정하는 단계;

상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 대조군의 게놈성 DNA CAG 반복 서열을 증폭시켜 증폭된 대조군의 게놈성 DNA 단편들을 생성시키는 단계;

대조군의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수를 측정하는 단계; 및

시료의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수를 대조군의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수와 비교하는 단계(여기서, 시료의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수가 대조군의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수보다 더 큰 경우에 개체가 CAG 반복 서열 불안정에 의해 유발되는 척수소뇌성 운동실조증 타입 6(SCA-6)에 걸렸거나 SCA-6이 발병될 위험에 있다)를 포함하여, 개체가 SCA-6에 걸렸거나 SCA-6이 발병될 위험에 있는지 여부를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 시료의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수를 측정하는 단계가 전기영동에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 대조군의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수를 측정하는 단계가 전기영동에 의해 수행되는 방법.
삭제
삭제
삭제
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 표지화되어 있는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 15 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 형광물질로 표지화되어 있는 방법.
개체의 게놈성 DNA 시료 내의 CAG 반복 서열들을 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 수득하는 단계;

상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 시료의 게놈성 DNA CAG 반복 서열을 증폭시켜 증폭된 시료의 게놈성 DNA 단편들을 생성시키는 단계; 및

시료의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수를 측정하는 단계(여기서, 개체가 21개 이상의 반복 단위들을 갖는 것으로 측정되는 경우에 상기 개체가 CAG 반복 서열 불안정에 의해 유발되는 SCA-6에 걸렸거나 SCA-6이 발병될 위험에 있다)를 포함하여, 개체가 SCA-6에 걸렸거나 SCA-6이 발병될 위험에 있는지 여부를 결정하는 방법.
개체의 게놈성 DNA 시료 내의 CAG 반복 서열들을 증폭시킬 수 있는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 수득하는 단계;

상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 시료의 게놈성 DNA CAG 반복 서열을 증폭시켜 증폭된 시료의 게놈성 DNA 단편들을 생성시키는 단계; 및

시료의 게놈성 DNA 단편들 내의 CAG 반복 단위들의 수를 측정하는 단계(여기서, 상기 개체가 7개 미만의 반복 단위들을 갖는 것으로 측정되는 경우에 상기 개체가 CAG 반복 서열 불안정에 의해 유발되는 SCA-6에 걸리지 않았거나 SCA-6이 발병될 위험이 없다)를 포함하여, 개체가 SCA-6에 걸리지 않았거나 SCA-6이 발병될 위험이 없는지 여부를 결정하는 방법.
제9항에 있어서, 형광물질 표지가 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드, AMCA 블루 또는 루시퍼 옐로우인 방법.
제7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 방사능 표지화되어 있는 방법.
제7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 효소로 표지화되어 있는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 서열번호 1을 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 서열번호 2를 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 시료의 게놈성 DNA CAG 반복 서열을 증폭시키는 단계가 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 시료의 게놈성 DNA CAG 반복 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 대조군의 게놈성 DNA CAG 반복 서열을 증폭시키는 단계가 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 대조군의 게놈성 DNA CAG 반복 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는 방법.