KR100727318B1

KR100727318B1 - 삼핵산 반복서열 증가로 인한 유전성 뇌신경 퇴화질환진단용 디엔에이 칩

Info

Publication number: KR100727318B1
Application number: KR1020040082456A
Authority: KR
Inventors: 진동규
Original assignee: 사단법인 삼성생명공익재단삼성서울병원
Priority date: 2004-10-15
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2007-06-12
Also published as: KR20040097012A

Abstract

본 발명은 ⅰ) 유전성 뇌신경 퇴화질환 관련 유전자의 삼핵산(CAG)n 반복서열의 마이크로어레이를 고착시킨 플레이트; ⅱ) 검체의 게놈 DNA의 특정 삼핵산 반복서열 부위를 증폭시키는 프라이머; ⅲ) 중합효소 연쇄반응용 완충용액 및 중합효소로 구성된 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단용 DNA 칩을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 삼핵산 반복서열을 지닌 유전성 뇌신경 퇴화질환을 신속하고 효율적으로 진단할 수 있는 DNA 칩을 개발한 것으로, 간단하고 정확한 PCR 방법을 이용하면서 환자 및 보인자의 진단을 위한 신뢰성이 우수한 DNA 칩을 제공하는 것이다.

유전성, 뇌신경, 퇴화질환, DNA 칩, 마이크로어레이, 프로브

Description

삼핵산 반복서열 증가로 인한 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단용 디엔에이 칩{DNA chip for diagnosing genetic neurodegenerative diseases caused by increasing of trinucleotide repeat}

도 1은 본 발명의 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단을 위한 DNA 칩에 사용되는 마이크로어레이 프로브를 제조하기 위한 각 샘플들의 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단을 위한 DNA 칩에 사용되는 마이크로어레이 프로브를 제조하기 위한 타겟 유전자의 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단을 위한 DNA 칩에 사용되는 마이크로어레이 프로브를 제조하기 위한 또 다른 타겟 유전자의 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

본 발명은 삼핵산 반복서열 증가로 인한 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단용 DNA 칩에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 간단하고 정확한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하면서 환자 및 보인자의 진단은 물론 일반적인 선별검사에도 간단하게 이용할 수 있는 삼핵산 반복서열 증가로 인한 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단용 DNA 칩 및 진단방법에 관한 것이다.

신경관련질환들은 대부분의 경우 그 원인이나 발생기작이 정확히 밝혀져 있지 않지만, 최근 일부 질환은 유전자가 직접적인 원인으로 작용하는 것으로 밝혀져 이에 관한 연구가 활발해지고 있다.

특히, 1991년 프래절엑스증후군(Fragile X syndrome) 환자에서 (CGG)n 반복서열이 증가되어 있음이 보고된 이후 지금까지 모두 13개 이상의 신경질환들이 삼핵산 반복서열 증가질환으로 알려지고 있다.

삼핵산 반복서열 증가질환이란 게놈DNA(genomic DNA)에서 존재하는 CAG, GAA, CGG 등의 삼핵산 단위로 반복되는 염기서열들이 증가하여 생기는 유전질환으로, 정상인의 DNA에도 반복서열이 존재하기는 하지만, 환자의 경우에는 정상인의 비해 수배에서 수백 배까지 증가되는 것이 보고되어 있다.

이 질환들은 크게 두 가지 그룹으로 나눌 수 있는데, 첫 번째 그룹은 코딩서열(coding sequence)내에 (CAG)n 반복서열이 증가되어 있는 것으로 정상인의 경우 10∼30 반복을 가지고 있지만, 유전질환을 지닌 사람의 경우에는 40∼200 반복을 가지고 있는 질환들로, 헌팅턴병(Huntington disease), 케네디병(Kennedy disease), 척수소뇌성 운동실조증타입(Spinocerebellar ataxia type) 1,2,3,6,7, 덴테이토루부럴 팔리도루이시안 위축증(Dentato-rubral-pallidoluysianatrophy, DRPLA) 등이 있다.

반면 두 번째 그룹의 질환들은 CGG, CTG, GAA, CCG 등 다양한 종류의 반복서열이 증가되어 있고 증가범위도 수백 배에서 수천 배로 훨씬 크며, 모계의 영향을 받는 질환들로써, 프래절엑스증후군(Fragile X Syndrome), 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy), 프리드리히 운동실조증(Friedreich ataxia), 척수소뇌성 운동실조증 타입8 등이 있다.

표 1에 삼핵산 반복서열 증가가 원인이 되는 질환들의 종류와 확장된 반복서열(CAG)의 크기 및 단백질 위치, 가장 많이 침범된 뇌 부위를 나타내었다.

질환명	유전자 생성물	정상 CAG(n)	확장된 CAG(n)	단백질 위치	가장 많이 침범된 뇌 부위
케네디병(SBMA)	안드로겐 수용체	9∼36	38∼62	핵 및 세포질	전각 및 구형 뉴런, 척수신경절
헌팅턴병(HD)	헌팅턴	6∼34	36∼121	세포질	선조체, 대뇌피질
척수소뇌성 운동실조증 1(SCA1)	Ataxin-1	6∼44	39∼82	뉴런 내의 핵	소뇌 푸르킨에 세포, 치상핵; 뇌간
척수소뇌성 운동실조증 2(SCA2)	Ataxin-2	15∼31	36∼63	세포질	소뇌 푸르킨에 세포, 뇌간, 프론토-측두엽
척수소뇌성 운동실조증 3(SCA3)	Ataxin-3	12∼41	62∼84	세포질	소뇌 치상 뉴런, 대뇌핵, 뇌간, 척수
척수소뇌성 운동실조증 6(SCA6)	CACNA1A	4∼18	21∼33	세포막	소뇌 푸르킨에 세포, 치상핵
척수소뇌성 운동실조증 7(SCA7)	Ataxin-7	4∼35	37∼306	핵	소뇌, 뇌간, 황반, 시피질
DRPLA	Atrophin-1	6∼36	49∼84	세포질	소뇌 대뇌 피질, 대뇌핵

상기 질환들 모두 매우 드문 질환들이기는 하나 일부 질환들은 우성질환이기 때문에 유전자에 변이가 일어난 경우, 그 다음 세대의 50% 정도가 이환될 수 있다. 또 헌팅턴병이나 근긴장성 이영양증 등 몇몇 질환들은 발병시기로 보아 2세가 태어난 후에야 자신이 이환되었음을 알게 되므로 증세가 나타나기 전에 진단하는 일은 중요하다.

이와 같은 질환들은 거의 100%가 삼핵산 반복서열의 증가라는 단일 기작에 의해 일어나기 때문에 이를 이용한 분자유전학적 진단이 확진이나 환자검출에 매우 효과적이고 필수적이다. 또한, 삼핵산 반복서열증가 정도는 발병되는 나이와 질환 의 중증도에 밀접하게 관련되어 있고, 대를 거듭할 수록 위험도도 증가하는 것으로 알려져 있다. 보인자의 경우, 삼핵산 반복서열이 정상과 환자의 중간 정도를 나타내어 자신은 증상이 없으나 다음 세대에 영향을 주기도 한다. 따라서, 삼핵산 반복서열의 증가정도만을 정확하게 조사하면 확실히 상기 질환들을 진단할 수 있고 예후도 예상할 수도 있다.

종래에는 환자의 혈액을 이용한 특수한 염색체 검사를 시행하기도 하였으나 이러한 세포유전학적인 방법을 이용한 진단은 가음성 및 가양성의 가능성을 내재하고 있고 사실상 보인자의 진단은 불가능한 문제점이 있었다.

삼핵산 반복서열의 증가가 이들 질환들을 유발한다는 사실이 밝혀진 이후, 분자유전학적 방법을 이용하여 삼핵산 반복서열의 길이를 예측함으로써 질병을 진단하고 있는데 매우 효율적이고 정확하다.

그 중 서던블라팅(Southern blotting)은 매우 정확한 진단이 가능하지만, 시간과 비용이 많이 들고 방법이 복잡하고 일반적인 검사법(screening)으로 사용하기에는 부적절하다.

본 발명자는 대한민국 특허 제330,374호 '비특이적 삼핵산 반복서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 키트'에서 비특이적 삼핵산 반복서열을 이 용한 유전성 신경정신 질환의 새로운 진단 방법, 진단 키드 및 이에 이용되는 플라스미드 벡터를 개시한 바 있다.

그러나 더욱 간단하고 정확한 PCR 방법을 이용하면서 환자 및 보인자의 진단은 물론 일반적인 선별검사에도 간단하게 이용할 수 있는 새로운 진단방법 및 이를 위한 DNA 칩이 요구되고 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 삼핵산 반복서열을 지닌 유전성 뇌신경 퇴화질환을 신속하고 효율적으로 진단할 수 있는 DNA 칩을 개발하기 위한 것으로 본 발명의 목적은 간단하고 정확한 PCR방법을 이용하면서 환자 및 보인자의 진단은 물론 일반적인 선별검사에도 간단하게 이용할 수 있고, 신뢰성이 우수한 DNA 칩을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 ⅰ) 유전성 뇌신경 퇴화질환 관련 유전자의 삼핵산(CAG)n 반복서열의 마이크로어레이를 고착시킨 플레이트; ⅱ) 검체의 게놈 DNA의 특정 삼핵산 반복서열 부위를 증폭시키는 프라이머; ⅲ) 중합효소 연쇄반응용 완충용액 및 중합효소로 구성된 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단용 DNA 칩을 제공하는 것이다.

상기 유전성 뇌신경 퇴화질환은 삼핵산반복서열의 증가에 의한 헌팅턴병, 케네디병(SBMA), 척수소뇌성 운동실조증 1(SCA1), 척수소뇌성 운동실조증 2(SCA2), 척수소뇌성 운동실조증 3(SCA3), 척수소뇌성 운동실조증 6(SCA6), 척수소뇌성 운동실조증 7(SCA7), DRPLA 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 프라이머는 헌팅턴병의 경우 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 케네디병(SBMA)의 경우 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 1(SCA1)의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 2(SCA2)의 경우 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 3(SCA3)의 경우 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 6(SCA6)의 경우 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 7(SCA7)의 경우 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, DRPLA의 경우 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드임을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

헌팅턴씨 병은 정상인의 경우 염색체 내에 13 내지 20 배수의 반복 서열이 존재하나 환자의 경우는 34 배수 이상으로 반복 서열이 증가하는 특징을 가진다.

SCA1 증후군은 정상인의 경우 염색체 내에 25 내지 31 배수의 반복 서열이 존재하나 환자의 경우는 35 배수 이상으로 반복 서열이 증가하며, SCA2 증후군은 정상인의 경우 염색체 내에 16 내지 22 배수의 반복서열이 존재하나 환자의 경우는 34 내지 55 배수까지 반복 서열이 증가한다.

SCA3 증후군은 폴리글루타민 트랙(polyglutamine tract) 유전자에 삼핵산 반복 서열인 (CAG)n 반복 서열이 증가됨으로 유발되는 신경정신 질환으로, 정상인의 경우 염색체 내에 13 내지 34 배수의 반복 서열이 존재하나 환자의 경우는 68 내지 79 배수까지 반복 서열이 증가하며, SCA6 증후군은 정상인의 경우 염색체 내에 4 내지 16 배수의 반복서열이 존재하나 환자의 경우는 30 배수 이상으로 반복 서열이 증가하고 DRPLA은 정상인의 경우 염색체 내에 9 내지 19 배수의 반복 서열이 존재하나 환자의 경우는 52 내지 70 배수까지 반복 서열이 증가하는 특징을 갖는다.

상기의 여러 질환을 진단하는데 있어서 공통적으로 (CAG)n 반복 서열이 증가되는 현상을 이용하여 비특이적인 (CAG)n 반복 서열을 포함하는 프로브를 제조하여 사용한다.

본 발명은 헌팅턴병, 케네디병(SBMA), 척수소뇌성 운동실조증 1(SCA1), 척수소뇌성 운동실조증 2(SCA2), 척수소뇌성 운동실조증 3(SCA3), 척수소뇌성 운동실조증 6(SCA6), 척수소뇌성 운동실조증 7(SCA7), DRPLA 등의 유전성 뇌신경 퇴화질환의 (CAG)n 반복서열의 게놈 유전자 내 존재여부를 측정하기 위해 인간 검체의 게놈 유전자의 특정 부위를 하기 프라이머를 이용하여 증폭한다.

또한 이때 검체의 유전자 증폭을 위한 PCR 반응에 사용되는 프라이머의 종류와 그 염기서열은 다음과 같다.

ⅰ) 헌팅턴병

센스 5' ATG AAG GCC TTC GAG TCC CTC 3' (서열번호 1)

안티센스 5' CAG CAG CGG CTG TGC CTG 3' (서열번호 2)

ⅱ) 케네디병

센스 5' TCC AGA ATC TGT TCC AGA GCG 3' (서열번호 3)

안티센스 5' GTG AAG GTT GCT GTT CCT CAT 3' (서열번호 4)

ⅲ) SCA1

센스 5' CCA GCG CTC CCA GCT GGA 3' (서열번호 5)

안티센스 5' TGG TTC TGC TGG GCT GGT G 3' (서열번호 6)

ⅳ) SCA2

센스 5' GCC CGG CGT GCG AGC CGG TGT ATG 3' (서열번호 7)

안티센스 5' CTT GCG GAC ATT GGC AGC CGC GGG 3' (서열번호 8)

ⅴ) SCA3

센스 5' GTC TAG .ATT TCC TAA GAT CAG CAC 3' (서열번호 9)

안티센스 5' AAG TGC TCC TGA ACT GGT GGC TGG 3' (서열번호 10)

ⅵ) SCA6

센스 5' CCT ATT CCC CTG TGA TCC GTA AGG 3' (서열번호 11)

안티센스 5' CTG GGC GAG CGG CCG CTG CTG TGG 3' (서열번호 12)

ⅶ) SCA7

센스 5' GTT ACA TTG TAG GAG CGG A 3' (서열번호 13)

안티센스 5' ACG ACT GTC CCA GCA TCA.CTT C 3' (서열번호 14)

ⅷ) DRPLA

센스 5' ATG GCC GCC TCT TAG CCA ACA GCA 3' (서열번호 15)

안티센스 5' CAT GGC GTA AGG GTG TGC GTG GTG 3' (서열번호 16)

상기 프라이머 세트를 이용하여 검체의 게놈 DNA의 특정 부위를 증폭시킨다. 이때 중합효소 연쇄반응은 다음 조건에 의해 행한다.

중합효소 연쇄반응은 게놈 DNA 100 ng, 0.5μM의 상기 서열의 프라이머 세 트, 200μM의 dATP, dGTP, dTTP, 50μM dCTP 및 0.3μCi[α-³²P]-dCTP, 1×PCR 완충용액(50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스-염산, pH 8.3, 1.5 mM 염화마그네슘)의 조성으로 반응 혼합액을 부피 20㎕가 되도록 하였다. 상기의 반응 혼합액을 95℃에서 5분 동안 변성(denature)시킨 다음 2 U의 Taq 폴리머라제를 넣어 핫 스타트(hot start)하고 95℃에서 1분 동안 변성, 55℃에서 1분 동안 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 동안 익스텐션(extension)의 사이클을 30회 반복한다.

본 발명에 사용하는 DNA 칩은 플레이트에 삼핵산 반복서열을 지니는 다수의 마이크로어레이를 고착시켜 제조한 것이다. 이때 플레이트에 부착시킨 마이크로어레이의 제조방법은 다음과 같다.

마이크로어레이에 사용되는 DNA 프로브는 다음과 같이 작성된다. 한국정상인을 대상으로 ERDA1 유전자의 CAG 반복의 수를 조사한 후 이중 CAG 반복수가 22, 30, 45, 58, 65를 클로닝한다. 클로닝 후에 각 벡터에 포함된 CAG 반복수를 ABI 377 DNA 시퀀서로 확인한다.

pCR 2.1 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 내에 가지고 있는 클로닝 위치 5'(M13 포워드 또는 T3)와 3'(M13 리버스 또는 T7) 말단의 서열 M13 을 이용한 프라이머에 아미노기(-NH2)를 붙여 디자인한 후 각각 PCR에 이용해 생성물을 증폭 하고(-NH2가 말단 라벨된 생성물임) 매뉴얼 스포팅 혹은 스포터를 이용한 스포팅과 하이브리디제이션을 수행한다.

표 2는 인체 게놈 유전자를 증폭시켜 얻어진 ERDA1 유전자 단편의 25 종류 및 크기를 나타낸 표이다. 프라이머 5'-ATG/GAT/TGT/TCC/AAG/GAG-3'(서열번호17)과 프라이머 5'-AGG/TGG/AAG/GAA/GGT/CTT-3'(서열번호 18)을 사용하여 PCR을 수행한다.

ERDA1 유전자 25 종류(약 83∼371 bp)

샘플	PCR 단편크기
A	(107)	(371)
(B)	(245)	(350)
C	(83)	(335)
(D)	(254)	(326)
E	(83)	(338)
F	(113)	(308)
(G)	(257)	(311)
H	(284)	(314)
I	(113)	(269)
J	(113)	(272)
K	(197)	251
L	(218)	257
M	122	(191)
N	(221)	233
O	83	(161)

* ( ): 타겟 생성물 예상 크기

표 3은 인체 게놈 유전자를 증폭시켜 얻어진 SEF 유전자 단편의 3 종류 및 크기를 나타낸 표이다. 프라이머 5'-AAT/CCA/AAC/CGC/CTT/CCA/AGT-3'(서열번호 19)와 프라이머 5'-GCA/AAA/CTT/CCG/AAA/GCC/ATT/TCT-3'(서열번호 20)을 사용하여 PCR을 수행하였다.

SEF 유전자 3 종류 (약 149∼251 bp)

샘플	PCR 단편 크기	CAG 반복 확인
P	149(203)	71 [90]
Q	149(209)	78 [96]
R	188(251)	132 [138]

* ( ): 타겟 생성물 예상 크기

[ ]: 타겟 CAG 반복 수치

상기 샘플들의 PCR 생성물을 전기영동시킨 결과를 도 1에 나타낸 것이다.

위의 샘플들을 정제한 후 TA 클로닝을 실시하였다. TA 클로닝후 클로닝 상태를 확인하기 위해서 M13 프라이머를 사용하여 PCR 했다. 예상 단편 크기는 각 타겟 유전자 크기에 200 bp 내외의 수를 합한 크기 이내이다.

그 후 하기 프라이머 M13R 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC -3'(서열번호 21), M13F 5'-GTA AAA CGA CGG CCA G -3'(서열번호 22)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭조건은 94℃에서 10분, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분, 72℃에서 10분을 1 사이클로 하여 30사이클을 수행한다.

본 발명의 DNA 칩에 사용하는 마이크로어레이 프로브를 수득하기 위한 타겟 유전자의 전기영동 사진을 도 2에 나타내었다. 또한 표 4는 수득된 타겟 유전자의 레인과 샘플 종류 및 크기를 나타낸 것이다.

수득된 타겟 유전자의 크기

레인	샘플	타겟 유전자 크기(bp)
1	A	107
2	M	122
3	P	203
4	P	149
5	Q	209
6	Q	149
7	M	191
8	C	83
9	E	83
10	F	113
11	I	113
12	J	112
13	R	188

또한 본 발명의 DNA 칩에 사용하는 마이크로어레이 프로브를 수득하기 위한 또 다른 타겟 유전자의 전기영동 사진을 도 3에 나타내었다. 또한 표 5는 수득된 또 다른 타겟 유전자의 레인과 샘플 종류 및 크기를 나타낸 것이다.

수득된 또 다른 타겟 유전자의 크기

레인	샘플	타겟 유전자 크기(bp)
1	A	371
2	B	245
3	D	254
4	F	308
5	G	311
6	G	259
7	H	314
8	H	284
9	I	269
10	J	272
11	L	257
12	L	218
13	N	233
14	N	221
15	R	251

위의 클론 중에서 A107, A371, B245, C83, D254, E83, F308, F113, G311, G254, H314, H284, I113, I269, J272, J113, L257, L218, M191, M122, N233, P203, P149, Q149, Q209, R118, R251 총 27개를 사용하여 최종적으로 DNA 칩을 제작한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

(실시예 1)

DNA 칩의 실용성을 검증하기 위해서 타겟 DNA로는 SCA2 유전자를 사용하였다. SCA2 유전자는 정상인은 20∼30개의 CAG 반복서열을 지니는 반면 발병시에서는 40개 이상의 CAG 반복을 지닌다. 본 발명자는 CAG 반복을 다양하게 제작하여 그 중에서 CAG22, CAG58 그리고 CAG100 세 가지 클론에서 CAG 반복부분을 FITC 라벨링 하여 PCR 증폭하였다.

이때 DNA 칩에 PCR 증폭 생성물과의 하이브리디제이션을 위한 조건은 다음과 같다. 스포팅을 한 후 37℃ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 고착시킨다. 그후 하이브리디제이션 전에 세적시킨고 0.2% SDS 에서 2분 동안 2번 세척한 후 3차 증류수에서 2분 동안 2번 세척한다. 다시 100℃에서 2∼3분 동안 끓여준 후 실온에서 5분 동안 식힌 후 소듐 보로하이드라이드로 수퍼알데하이드 슬라이드를 5분 동안 블로킹한다. 다시 0.2% SDS에서 1분씩 3번 세척한 후 3차 증류수로 1분씩 2번 세척한 후 500g로 1분간 원심분리하여 건조시킨다.

하이브리디제이션은 하이브리디제이션 버퍼를 이용하여 42℃에서 4시간 동안 수행하고 하이브리디제이션 후 세척하며 이때 2X SSC와 0.2% SDS에서 10분 동안 세척한 후 3차 증류수로 세척한다. 그후 TMAC 세척을 70℃에서 수행하고 간단히 원심분리하여 건조시킨다. 최종적으로 스케닝한다.

(실시예 2)

DNA 칩에서 피검 게놈 DNA와 마이크로어레이 프로브간의 최적의 하이브리디제이션을 위한 완충액, 시간, 온도, 세척 등을 살펴보았다.

1. 하이브리디제이션 완충액

본 발명에서 칩 하이브리디제이션 완충액으로 SSC 완충액을 사용하여 농도별로 하이브리디제이션을 시행하였다. SSC를 농도별로 2.5X와 5X로 하여 하이브리디제이션을 시행해 보고, 상용화 완충액(Arrayir제품)인 unihyb. 완충액을 시행해 본 결과 같은 상황에서 TNR 칩에는 Unihyb. 완충액이 제일 적합한 것으로 판명되었다.

2. 하이브리디제이션 시간

일반적인 하이브리디제이션 시간인 4시간으로는 시그널이 강하지 못한 것으로 판단되어 시간을 늘려 하룻밤(약 20시간) 동안 시행하였으나 4시간과 약 20시간의 하이브리디제이션 시간차에 따른 실험에서 크게 다른 시그널차이를 보이지 않아 4시간으로 조건을 정하였다.

3. 하이브리디제이션 온도

하이브리디제이션 온도는 42℃에서 수행하던 것을 62℃로 올려 보았다. 그 결과 본 조건을 수행하면서 타겟으로 사용하는 CAG22, 58, 100 DNA를 다시 준비하였고, 농도도 높여서 수행하였다. 시그널 이 이전 실험보다 높게 나왔다. 42℃ 와 62℃를 병행하여 실험하였다.

4. 하이브리디제이션 후 세척(TMAC 세척)

하이브리디제이션의 스트린전시(stringency)를 높이기 위해 세척하는 단계에서 TMAC 세척 단계를 추가하여 보다 세밀하게 정확한 하이브리디제이션을 한 결과 1분 30초에서 10분까지 TMAC 세척을 70℃에서 수행해 본 결과 크게 다른 시그널의 차이를 보이지 않아서 세척 시간을 늘려 보았다.

결론적으로 본 발명의 ERDA1 유전자의 삼핵산 반복서열을 클로닝하여 4x6 올리고-칩을 제작하였고 하이브리디제이션의 최적 조건을 결정하였다. 3종의 spinocerebellar ataxia2 환자의 c-DNA(타겟)를 이용하여 하이브리디제이션 한 결과 높은 CAG 카피(51, 53, 67)와 중간 CAG 카피(33, 46, 47)를 프로브로 하는 경우에도 타겟 카피 58, 100에 하이브리디제이션 간에는 차이가 없었다. 그러나 환자의 경우 CAG의 반복 카피가 대개 33 이상 반복되므로 정상인과 구별을 위해 중간 CAG 카피(33, 46, 47) 프로브가 환자 진단에 가장 유용하다. 즉 중간 CAG 카피 프로브는 정상인에게는 하이브리디제이션되지 않고 환자의 유전자에만 하이브리디제이션된다.

본 발명의 효과는 삼핵산 반복서열을 지닌 유전성 뇌신경 퇴화질환을 신속하 고 효율적으로 진단할 수 있는 DNA 칩을 개발한 것으로, 간단하고 정확한 PCR방법을 이용하면서 환자 및 보인자의 진단을 위한 신뢰성이 우수한 DNA 칩을 제공하는 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

ⅰ) 유전성 뇌신경 퇴화질환 관련 유전자의 삼핵산(CAG)n 반복서열의 마이크로어레이를 고착시킨 플레이트; ⅱ) 검체의 게놈 DNA의 특정 삼핵산 반복서열 부위를 증폭시키는 프라이머; ⅲ) 중합효소 연쇄반응용 완충용액 및 중합효소로 구성된 핵산반복서열의 증가에 의한 헌팅턴병, 케네디병(SBMA), 척수소뇌성 운동실조증 1(SCA1), 척수소뇌성 운동실조증 3(SCA3), 척수소뇌성 운동실조증 6(SCA6), 척수소뇌성 운동실조증 7(SCA7), 덴테이토루부럴 팔리도루이시안 위축증(DRPLA)중에서 선택되는 하나 이상인 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단용 DNA 칩에 있어서, 상기 프라이머는 헌팅턴병의 경우 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 케네디병(SBMA)의 경우 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 1(SCA1)의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 3(SCA3)의 경우 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 6(SCA6)의 경우 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, 척수소뇌성 운동실조증 7(SCA7)의 경우 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드이고, DRPLA의 경우 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드임을 특징으로 하는 유전성 뇌신경 퇴화질환 진단용 DNA 칩
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