CN112553299A - Notch2nlc基因ggc重复序列扩增的方法 - Google Patents

Notch2nlc基因ggc重复序列扩增的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法，所述NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的PCR反应程序为：98℃下反应10分钟；然后进行9个循环：98℃反应30秒，66℃反应15秒，每个循环下降1℃，72℃下反应4分钟；接着是30个循环：98℃反应30秒，58℃反应15秒，72℃反应4分钟；最后延伸步骤72℃，10分钟；上述PCR反应程序大大缩短了PCR时间，将总时间从10个小时缩短至4.5小时，且可重复性高、使用方便、成本略低，极大地提高了RP‑PCR技术在NIID疾病临床基因诊断的应用性，能够满足大规模样品的扩增。

Description

NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法、试剂盒及用途。
背景技术
神经元核内包涵体病(neuronal intranuclear inclusion disease，NIID)是一种罕见的神经退行性疾病，以中枢和周围神经系统，以及多器官组织内的嗜酸性透明包涵体为特征。包涵体主要分布于中枢神经系统、周围神经系统以及非神经组织，在中枢神经系统中广泛存在于大脑皮质、基底节区、脑干、小脑和脊髓的神经元和星形胶质细胞中，在周围神经系统中存在于交感神经节、背根神经节、肠肌丛神经节、施旺氏细胞，在非神经组织中为除骨骼肌、肝细胞外的很多体细胞。由于NIID属于异质性疾病，临床症状多变，无特异性，使得医生难以诊断。
国外实验室的两篇《Nature Genetics》文章，以及国内湘雅医院《AmericanJournal of Human Genetics》，和申请人已经发表的《Journal of medical genetics》文章相继揭示了神经元核内包涵体病致病机制与NOTCH2NLC基因中GGC异常重复扩增相关。四篇文章中，都运用了重复引物PCR技术(RP-PCR)对致病基因NOTCH2NLC的GGC重复扩增进行检测和验证，证明可以通过RP-PCR的方法对该致病基因进行验证，可用于NIID疾病的临床基因诊断。
然而在上述4篇文章中使用的RP-PCR技术均存在一些缺陷，分别有：扩增时间长，效率低，重复性不高、使用成本略高的缺陷，如日本团队Sone等的RP-PCR技术中，其扩增程序所用的总时间为10个小时，效率低，可重复性低，且成本略高，不能满足大规模样品的扩增，难以广泛的应用于NIID疾病临床基因诊断。申请人发表的文章(Deng et al.,Journalof medical genetics.2019)所使用技术改良自Sone等研究团队的技术，也存在扩增时间长，效率低等问题。因此，本发明在已发表文章基础上对RP-PCR的扩增条件进行了优化，把扩增时间缩减到4.5小时，并大大的提高了效率，方便使用于NIID的临床基因诊断。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增时间长、效率低，不能满足大规模样品的扩增，难以广泛的应用于NIID疾病临床基因诊断的缺陷，从而提供一种NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法、试剂盒及用途，NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增时间短、效率高，能够满足大规模样品的扩增。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法，包括所述NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的PCR反应程序为：98℃下反应10分钟；然后进行9个循环：98℃反应30秒，66℃反应15秒，每个循环下降1℃，72℃下反应4分钟；接着是30个循环：98℃反应30秒，58℃反应15秒，72℃反应4分钟；最后延伸步骤72℃，10分钟。
在所述的方法中，所有循环步骤的变温速率为1℃/秒。
在所述的方法中，还包括NOTCH2NLC基因GGC重复序列的PCR扩增反应体系：
Prime STAR GXL DNA聚合酶，0.25U；
5×PrimeSTAR GXL缓冲液，浓度为1x；
dATP，dTTP和dCTP，各200μM；
7-Deaza-dGTP，200μM；
二甲基亚砜，体积比5％；
甜菜碱，1M；
引物NOTCH2NLC-F，0.3μM；
引物M13-LINKER-R，0.3μM；
引物M13-(GGC)4(GGA)2-R，0.15μM。
在所述的方法中，所述引物NOTCH2NLC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物M13-LINKER-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物M13-(GGC)4(GGA)2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在所述的方法中，7-Deaza-dGTP采用New England Biolabs N0445S。
本发明提供了一种用于NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的试剂盒，包括所述的NOTCH2NLC基因GGC重复序列的PCR扩增反应体系和/或所述的引物。
本发明提供了所述的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法或所述的用于NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的试剂盒在检测NOTCH2NLC基因或制备检测NOTCH2NLC基因制剂中的用途。
在所述的用途中，为检测NOTCH2NLC基因中重复序列GGC或制备检测NOTCH2NLC基因中重复序列GGC制剂中的用途。
本发明提供了一种检测NOTCH2NLC基因中重复序列GGC的方法，包括利用所述的NOTCH2NLC基因重复序列GGC扩增的方法或所述的用于NOTCH2NLC基因重复序列GGC扩增的试剂盒。
在所述的方法中，包括如下步骤：
获得待测样品基因组DNA；
利用所述的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法或所述的用于NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的试剂盒PCR扩增NOTCH2NLC基因；
检测所得的扩增产物中重复序列GGC。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法，所述NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的PCR反应程序为：98℃下反应10分钟；然后进行9个循环：98℃反应30秒，66℃反应15秒，每个循环下降1℃，72℃下反应4分钟；接着是30个循环：98℃反应30秒，58℃反应15秒，72℃反应4分钟；最后延伸步骤72℃，10分钟；申请人对NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增方法进行了优化，尤其是NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的PCR反应程序，上述PCR反应程序大大缩短了PCR时间，相比于日本团队Sone等的NOTCH2NLC基因PCR扩增时间，将总时间从10个小时缩短至4.5小时，且可重复性高、使用方便、成本略低，极大地提高了RP-PCR技术在NIID疾病临床基因诊断的应用性，能够满足大规模样品的扩增。
2.本发明提供的一种NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法，提供了NOTCH2NLC基因GGC重复序列的PCR扩增反应体系：Prime STAR GXL DNA聚合酶，0.25U；5×PrimeSTARGXL缓冲液，工作浓度为1x；dATP，dTTP和dCTP，各200μM；7-Deaza-dGTP，200μM；二甲基亚砜，体积比5％；甜菜碱，1M(mol/L)；引物NOTCH2NLC-F，0.3μM；引物M13-LINKER-R，0.3μM；引物M13-(GGC)4(GGA)2-R，0.15μM；上述PCR扩增反应体系中，使用的M13-(GGC)4(GGA)2-R引物工作浓度为0.15μM，相对日本团队Sone等的NOTCH2NLC基因PCR扩增中的M13-(GGC)4(GGA)2-R引物浓度，降低了一半，有效地降低了成本，且生成的结果具有优化效果，即生成结果为锯齿峰样的毛细管荧光电泳图，优化后信号更强，读长更长，节省时间和试剂成本。
3.本发明提供的一种NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法，7-Deaza-dGTP采用New England Biolabs N0445S，相比于sone团队的sigma试剂，价格较为便宜，对结果无不良影响，节约了试剂成本。
4.本发明提供的所述的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法或所述的用于NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的试剂盒在检测NOTCH2NLC基因GGC重复序列或制备检测NOTCH2NLC基因GGC重复序列制剂中的用途，相对于常规的皮肤活检，具有更好的实用性、对患者创伤更小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例3中的正常人的毛细管电泳荧光检测结果；
图2是本发明实施例3中的NIID患者的毛细管电泳荧光检测结果。
具体实施方式
下述实施例中涉及的试剂均为市售产品，其中5％二甲基亚砜由Sigma-Aldrich提供，甜菜碱由Sigma-Aldrich提供，7-Deaza-dGTP由New England Biolabs N0445S提供。下述实施例中的NIID患者的基因组DNA和正常人的基因组DNA由北京大学第一医院神经内科基因标本库提供。
实施例1NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增方法
(1)获得人的基因组DNA；
(2)取100ng上述的基因组DNA加入至NOTCH2NLC基因GGC重复序列的PCR扩增反应体系中，如下表1；
表1：PCR扩增反应体系
Figure BDA0002198019410000061
Figure BDA0002198019410000071
(3)将步骤(2)中的PCR反应液放到PCR仪中进行PCR(BioRad MyCycler ThermalCycler)反应，所有循环步骤的变温速率为1℃/秒，PCR反应程序如下：
Figure BDA0002198019410000072
(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测。
实施例2 NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增试剂盒
本实施例所述的试剂盒包括NOTCH2NLC基因GGC重复序列的PCR扩增反应体系，如下表2所示。
表2：PCR扩增反应体系
Figure BDA0002198019410000073
Figure BDA0002198019410000081
进一步的，所述引物NOTCH2NLC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物M13-LINKER-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物M13-(GGC)4(GGA)2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。上述引物NOTCH2NLC-F的5’端具有荧光基团FAM，即NOTCH2NLC-F为：5'-FAM-GGCATTTGCGCCTGTGCTTCGGACCGT-3'。
实施例3检测NOTCH2NLC基因中重复序列GGC
分别取NIID患者的基因组DNA和正常人的基因组DNA按照实施例1的方法进行扩增NOTCH2NLC基因GGC重复序列。将获得的PCR反应产物通过毛细管电泳荧光检测方法(Denget al.,Journal of medical genetics.2019)鉴定NOTCH2NLC基因的GGC重复次数是否达到致病的异常重复次数。
鉴定结果如图1-2所示，一方面上述结果表明本实施例的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增方法能够对NOTCH2NLC基因GGC重复序列进行特异性扩增，大大缩短了扩增时间，有效地降低了成本，另一方面表明NIID患者的NOTCH2NLC基因出现异常的GGC重复序列，并且重复次数大于50次，具有致病性，说明本发明的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增方法或试剂盒可以扩增出含有重复序列GGC的NOTCH2NLC基因，进而可以用于检测NIID患者的致病基因NOTCH2NLC是否具有致病性，更加方便，成本低，相对于常规的皮肤活检，具有更好的实用性、对患者创伤更小。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学第一医院
<120> NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法
<130> HA201902720
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成（NOTCH2NLC-F）
<400> 1
ggcatttgcg cctgtgcttc ggaccgt 27
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成（M13-Linker-R）
<400> 2
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成（M13-（GGC）4（GGA）2-R）
<400> 3
caggaaacag ctatgacctc ctccgccgcc gccgcc 36

Claims (10)

1.一种NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法，其特征在于，所述NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的PCR反应程序为：98℃下反应10分钟；然后进行9个循环：98℃反应30秒，66℃反应15秒，每个循环下降1℃，72℃下反应4分钟；接着是30个循环：98℃反应30秒，58℃反应15秒，72℃反应4分钟；最后72℃延伸，10分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括NOTCH2NLC基因GGC重复序列的PCR扩增反应体系：
Prime STAR GXL DNA聚合酶，0.25U；
5×PrimeSTAR GXL缓冲液，浓度为1x；
dATP，dTTP和dCTP，各200μM；
7-Deaza-dGTP，200μM；
二甲基亚砜，体积比5％；
甜菜碱，1M；
引物NOTCH2NLC-F，0.3μM；
引物M13-Linker-R，0.3μM；
引物M13-(GGC)4(GGA)2-R，0.15μM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述引物NOTCH2NLC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物M13-LINKER-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物M13-(GGC)4(GGA)2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，7-Deaza-dGTP采用New EnglandBiolabs N0445S。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所有循环步骤的变温速率为1℃/秒。
6.一种用于NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2中的NOTCH2NLC基因GGC重复序列的PCR扩增反应体系和/或权利要求3中的引物。
7.权利要求1-5任一项所述的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法或权利要求6所述的用于NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的试剂盒在检测NOTCH2NLC基因或制备检测NOTCH2NLC基因制剂中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，为检测NOTCH2NLC基因中重复序列GGC或制备检测NOTCH2NLC基因中重复序列GGC制剂中的用途。
9.一种检测NOTCH2NLC基因中重复序列GGC的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-5任一项所述的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法或权利要求6所述的用于NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得待测样品基因组DNA；
利用权利要求1-5任一项所述的NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的方法或权利要求6所述的用于NOTCH2NLC基因GGC重复序列扩增的试剂盒PCR扩增NOTCH2NLC基因；
检测所得的扩增产物中重复序列GGC。
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