CN101560565B

CN101560565B - 一种21-三体综合征产前筛查试剂盒

Info

Publication number: CN101560565B
Application number: CN2009100835999A
Authority: CN
Inventors: 迟洪滨; 乔杰; 程利南
Original assignee: Peking University Third Hospital
Current assignee: Peking University Third Hospital
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2011-08-24
Anticipated expiration: 2029-05-12
Also published as: CN101560565A

Abstract

本发明公开了一种21-三体综合征产前筛查试剂盒。本发明提供的试剂盒包括引物对甲、引物对乙、引物对丙和引物对丁；引物对甲由序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成；引物对乙由序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成；引物对丙由序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成；引物对丁由序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸组成。应用本发明的试剂盒进行21-三体综合征产前筛查，具有如下优点：标本取材创新；提前产前诊断起始时间；减少标本的采集数量，缩短进行诊断的时间；可以判断额外染色体来源。本发明对于找到染色体病的发病原因，及时针对性预防有很深远的意义。

Description

一种21-三体综合征产前筛查试剂盒

技术领域

本发明涉及一种21-三体综合征产前筛查试剂盒。

背景技术

据统计，我国每年出生约2000万个婴儿中1.3％有先天出生缺陷，其中80％为遗传性疾病，染色体疾病是导致新生儿出生缺陷最多见的一类遗传性疾病。染色体病通常包括染色体数目异常和染色体结构异常，大多数染色体病都属于染色体数目异常，染色体数目异常以染色体非整倍体中的三体型和单体型常见。各条染色体的三体型都可以出现，95％以上的染色体三体都在出生前流产。活产新生儿中最常见的三体综合征包括21-三体综合征(Down’Syndrome)、18-三体综合征(EdwardsSyndrome)、13-三体综合征(Patau Syndrome)，Klinefilter综合征。

21-三体又称唐氏综合征，发病率最高，约占1/700，是一种严重的先天性智力障碍，又称先天愚型，是临床最常见的染色体异常疾病。由于胎儿出生后均为不同程度的智力低下和组织器官畸形，给家庭和社会造成极大的精神痛苦和经济负担，至今还无有效的预防治疗措施，唯一可采取的措施就是进行产前诊断，尽早发现该病中止妊娠。据估计我国目前大约有60万以上的21-三体综合征患儿，按目前的出生率，我国平均20分钟就有1例21-三体综合征患儿出生，全国每年出生的21-三体综合征患儿达27000例左右，每个病儿一生增加的社会经济负担约为10万元人民币以上，共要增加社会经济负担25亿。如果能在孕妇妊娠的早期、中期阶段诊断出患病胎儿，即有可能防止患病胎儿的出生，这对减轻家庭及社会负担，尤其对提高人口素质无疑有着非常重大的意义。国家计生委自1999年开始实施“出生缺陷干预工程”，将减低唐氏综合征患儿的出生率作为重要内容在全国开展，其中强调了早期筛查、早期诊断对于减少缺陷患儿出生的意义。因此建立早期、简便、可行的产前诊断染色体病的方法对提高人口素质意义重大，具有广阔的社会应用前景。

产前遗传学诊断方法有多种，如绒毛活检、羊水穿刺、脐血穿刺等，目前以羊膜腔穿刺进行染色体核型分析最常用。羊膜腔穿刺术诞生于1956年，经过多次改进，现已成为当今世界各地最常用且安全可靠的产前诊断取材方法。羊膜腔穿刺通常于孕中期进行，以孕18～20周为最佳。此法通常抽取20ml左右的羊水离心后弃去上清，留取沉淀里的羊水细胞成份进行细胞培养，利用分裂中期的细胞核制备染色体核型，进行分析以明确诊断。在孕18～20周进行羊水穿刺是因为此期间采集的羊水细胞数量多、体外培养生长活力强，故成功率高、效果好。利用羊水细胞培养进行遗传学诊断所需时间较长，一般为14d-21d左右。当然也可以用间期羊水细胞不需培养进行荧光原位杂交，从而提供快速的产前诊断，但是FISH技术要求高，费用相对较高，因此不适于临床推广使用。因此，发展普及一种快速、准确、早期的产前诊断方法变得非常重要和必要，是产前诊断发展的趋势。

在人类DNA中，大约有216万～319万个基因，在人类每个个体间千差万别，即遗传多态性。短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称微卫星序列，是2～6bp的重复序列，其多态性来源于串联片段重复数量的变化，是定量检测染色体数目常最有力的遗传标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种21-三体综合征产前筛查试剂盒。

本发明提供的21-三体综合征产前筛查试剂盒，包括引物对甲(D21S11)、引物对乙(D21S1411)、引物对丙(D21S1412)和引物对丁(D21S1435)；

所述引物对甲由序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述引物对乙由序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成；所述引物对丙由序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成；所述引物对丁由序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸组成。

所述四对引物的信息见表1。

表1四对引物的信息

	引物序列	产物大小	染色体定位	荧光标记
					D21S11	5’-TAT GTG AGT CAA TTC CCC CAA GTG A-3’(F)5’-GTT GTA TTA GTC AAT GTT CTC CAG(R)	225-280bp	21q21.3	FAM
D21S1411	5’-GTA GAT ACA TAC ATA TGA TGA ATG C-3’(F)5’-TAT TAA TGT GTG TCC TTC CAG GC-3’(R)	256-340bp	21q22.3	FAM
					D21S1412	5’-CGG AGG TTG CAG TGA GTT G-3’(F)5’-GGG AAG GCT ATG GAG GAG A-3’(R)	384-414bp	21q22.2	FAM
D21S1435	5’-CCC TCT CAA TTG TTT GTC TAC C-3’(F)5’-GCA AGA GAT TTC AGT GCC AT-3’(R)	163-187bp	21q21.1	FAM

所述引物对中的引物进行了荧光基团标记，常规荧光基团均可，如FAM。

所述试剂盒还可包括引物对以外的其它PCR试剂，如Taq酶、dNTP、PCR缓冲液和MgCl₂等。

本发明还保护引物对甲、引物对乙、引物对丙和引物对丁组成的引物组合物在制备21-三体综合征产前筛查试剂盒中的应用。

本发明还保护一种用于21-三体综合征产前筛查的引物组合物，包括引物对甲、引物对乙、引物对丙和引物对丁。所述引物组合物具体可由引物对甲、引物对乙、引物对丙和引物对丁组成。

STR用于产前基因诊断的优点有：(1)具有高度多态性和杂合度，其多态性主要源于个体间核心序列重复次数的差异，STR均匀地分布于人类基因组，并且遵循孟德尔共显性遗传规律。由于STR的高度多态性和杂合度，不同个体之间具有相同基因型的可能性很小；(2)灵敏度高，对于非常少量的DNA也可进行扩增和分析；(3)可在同一条件下进行多对引物的复合扩增，不需要放射性标记；(4)基因扫描时设有内标(Genescan)，简化了分析步骤，使结果标准化，不同实验室的结果具有可比性；(5)STR扩增片段一般仅在100～300bp，扩增的成功率高；(6)STR序列重复单位的碱基数目少(2～6bp)，因此等位基因片段长度的差异小；(7)STR绝大多数位于非编码区，不转录，不编码蛋白质和RNA，不受选择压力的影响，其两条带的扩增产量相等，不存在优先扩增和漏带现象。

定量荧光PCR(Quantitative fluorescent PCR，QF-PCR)是近年来发展起来的一种通过对多态性位点的短串联重复序列(STR)进行扩增，以对染色体数目异常进行快速产前诊断的有效方法。QF-PCR可以在较短时间内完成，一般情况下，多个样品可以在24h内完成包括DNA抽提、PCR、结果分析等全部过程，从而可以大大减轻病人等待的焦虑。它具有操作简捷、迅速准确、价格低廉等优点，因而是目前理想的产前诊断方法。

运用STR位点定量荧光PCR进行21-三体综合征产前筛查的原理如下：21-三体患儿羊水核型为47，XX(XY)，+21，其产生原因是父亲或母亲配子减数分裂时发生了21号染色体不分离，使得某一配子带有两条21号染色体，当这一配子与正常配子受精结合后，发育起来的个体就带有3条21号染色体。额外染色体来源于父亲的非常少，约为1％左右。21-三体患儿三条21号染色体的STR位点具有3个等位基因。当这些等位基因如果为不同的基因型时，其荧光定量PCR扩增产物显示荧光峰面积比为1∶1∶1的三个峰(一般为两条来自于母亲一条来自父亲)；当其中两个等位基因是同一基因型时，其荧光定量PCR扩增产物显示荧光峰面积比为2∶1的两个峰；如果3个等位基因均是同一基因型时；其荧光定量PCR扩增产物显示为1个峰。大多数正常胎儿具有两个不同等位基因，即杂合型(一条来自于母亲一条来自父亲)，荧光定量PCR产物对应的STR位点显示的荧光峰面积比是1∶1；极少数正常胎儿具有两个相同的等位基因，即纯和型(因其父母具有相同的等位基因)，表现为1个峰。因此，荧光峰面积比1∶1∶1的三个峰及2∶1的两个峰均可诊断21-三体，其中以3个峰的荧光峰面积比为最可靠的诊断指标，而1个峰的纯和型情况不能提供诊断信息。

只有筛选出在人群中杂合频率高，多态性信息含量大的多个STR基因位点，才有很大的概率在患者标本中检测到3个峰的荧光峰面积比。选用同一染色体多个特异的STR位点，它们同时为纯合子的可能性很小，因此可以提高诊断的准确性。本发明的四对引物针对的四个STR位点累计个人识别概率大于0.9999，夫妻双方同时为纯合子的可能性极小。

应用本发明的四对引物对对孕妇的羊水上清进行定量荧光PCR检测，如果四对引物的检测结果均表现为荧光峰面积比为1∶1∶1的三个峰或荧光峰面积比为2∶1的两个峰，表明胎儿为21-三体综合征患者。

应用本发明的试剂盒进行21-三体综合征产前筛查，具有如下优点：

(1)标本取材创新：可应用羊水穿刺后进行细胞培养染色体核型分析时丢弃的羊水上清提取游离胎儿DNA进行产前诊断，将以往认为废弃的标本重新发挥作用，且易于获得。

(2)提前了产前诊断起始时间：传统的产前诊断在孕18-20周左右进行羊水穿刺及羊水细胞培养，因为此时羊水细胞较丰富且易于培养成功，所以在孕早期筛查发现异常也要等到孕中期才能进行羊水穿刺取样，孕妇及家属承担了巨大的心理和生理的压力；本发明的试剂盒可在孕8-10周进行羊水穿刺提取2ml羊水上清进行产前分子遗传学诊断，将产前诊断的时间提前两个半月，如发现异常可以尽早终止妊娠，减轻了孕妇不必要的等待时间。

(3)减少了标本的采集数量，缩短了进行诊断的时间：由于不需细胞培养，只进行羊水上清游离DNA的STR-PCR检测，羊水抽吸量可从20ml减至2ml即足够DNA提取，诊断时间由原来的14-21天缩短为1-2d左右，极大减轻了孕妇心理及身体的负担。

(4)应用本发明的试剂盒进行筛查，不仅可以判断胎儿是否患有21-三体综合征，且可以判断该额外染色体的来源。因为对于杂合子的正常胎儿具有荧光强度比为1∶1的两个等位基因必定一个来自母亲，一个来自父亲，而患儿具有荧光强度比1∶1∶1的三个等位基因或者2∶1的两个等位基因与父母的基因型相比较，即可得知额外染色体是来源于父亲还是母亲，这对于找到染色体病的发病原因，及时针对性预防有很深远的意义。

附图说明

图1为夫妇I采用引物对甲进行扩增的PCR产物的检测结果。

图2为夫妇I采用引物对乙进行扩增的PCR产物的检测结果。

图3为夫妇I采用引物对丙进行扩增的PCR产物的检测结果。

图4为夫妇I采用引物对丁进行扩增的PCR产物的检测结果。

图5为夫妇IV采用引物对甲进行扩增的PCR产物的检测结果。

图6为夫妇IV采用引物对乙进行扩增的PCR产物的检测结果。

图7为夫妇IV采用引物对丙进行扩增的PCR产物的检测结果。

图8为夫妇IV采用引物对丁进行扩增的PCR产物的检测结果。

图9为孕妇I羊水的核型分析图。

图10为孕妇IV羊水的核型分析图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例中用到的仪器如下：

PCR扩增仪：PCR system 9700；PE Applied Biosystems；

3730DNA序列检测仪：AB Applied Biosystems/HITACHI。

实施例中的样本来自六对夫妇志愿者：夫妇I、夫妇II、夫妇III、夫妇IV、夫妇V、夫妇VI。

实施例1、21-三体综合征产前筛查试剂盒的制备

试剂盒由四对引物和辅助组分组成：

引物对甲：5’-TAT GTG AGT CAA TTC CCC CAA GTG A-3’(上游引物)；

5’-GTT GTA TTA GTC AAT GTT CTC CAG(下游引物)。

引物对乙：5’-GTA GAT ACA TAC ATA TGA TGA ATG C-3’(上游引物)；

5’-TAT TAA TGT GTG TCC TTC CAG GC-3’(下游引物)。

引物对丙：5’-CGG AGG TTG CAG TGA GTT G-3’(上游引物)

5’-GGG AAG GCT ATG GAG GAG A-3’(下游引物)。

引物对丁：5’-CCC TCT CAA TTG TTT GTC TAC C-3’(上游引物)

5’-GCA AGA GAT TTC AGT GCC AT-3’(下游引物)。

四对引物的上游引物的5′端均用FAM报告荧光基团标记。

辅助组分：10×PCR缓冲液、MgCl₂、Taq酶、dNTP、ddH₂O。

实施例2、21-三体综合征产前筛查试剂盒的应用

一、应用实施例1制备的试剂盒进行21-三体综合征产前筛查

分别对6个孕妇进行羊水穿刺(孕8-10周)，从羊水上清中提取游离胎儿DNA。分别抽取夫妇双方的外周血提取基因组DNA。应用实施例1制备的试剂盒对父亲、母亲基因组DNA及羊水上清中胎儿游离DNA进行快速定量荧光PCR检测。每对引物为一个PCR体系，除了引物对，四个PCR体系完全相同，PCR反应体系见表2。

表2STR-PCR反应体系

试剂	体积(μl)	终浓度
			10×PCR缓冲液	0.5	10mmol/L Tris-Hcl，pH8.3；50mmol/L KCl；0.1mg/ml明胶
25mmol/LMgCl₂	0.6	3.0mmol/L
			5U/μl hot star(Taq酶)	0.04	0.2U(0.04U/μl)
5μmol/L上游引物(F)	0.06	0.06mol/L
			5μmol/L下游引物(R)	0.06	0.06mol/L
20ng/μl基因组DNA	1.0	4ng/μl
			dNTP(10mmol/L)	0.1	0.2mmol/L
ddH₂O	加至5μl

TouchDown PCR(递减PCR)反应程序如下：

95℃15min

15个循环

25个循环

72℃10min

4℃

PCR产物里加80％乙醇35ul，静置，4℃4000rpm，45min，倒置甩干，加10ulHi-Di(去离子甲酰胺)，短暂离心，目的是混匀，以防产物蒸干。取1ul乙醇沉淀产物，加0.1ul ROX500(marker)，加ddH₂O至10ul。90℃，1min变性解链，迅速置冰水中，冷却后离心上样，用DNA序列检测仪进行检测。

夫妇I采用引物对甲进行扩增的PCR产物的检测结果见图1。父亲外周血DNA中21号染色体定量荧光PCR扩增出235bp及237bp两个峰，母亲外周血DNA为227bp及241bp两个峰，羊水上清游离DNA出现227bp和237bp两个峰。夫妇I采用引物对乙进行扩增的PCR产物的检测结果见图2。父亲外周血DNA中21号染色体定量荧光PCR扩增出303bp及307bp两个峰，母亲外周血DNA为296bp及316bp两个峰，羊水上清游离DNA出现296bp和307bp两个峰。夫妇I采用引物对丙进行扩增的PCR产物的检测结果见图3。父亲外周血DNA中21号染色体定量荧光PCR扩增出384bp及406bp两个峰，母亲外周血DNA为410bp及418bp两个峰，羊水上清游离DNA出现384bp和410bp两个峰。夫妇I采用引物对丁进行扩增的PCR产物的检测结果见图4。父亲外周血DNA中21号染色体定量荧光PCR扩增出172bp及181bp两个峰，母亲外周血DNA为168bp及181bp两个峰，羊水上清游离DNA出现168bp和172bp两个峰。结果表明，该胎儿为正常胎儿，染色体一条来自母亲，一条来自父亲。

夫妇II和夫妇III的检测结果同夫妇I，胎儿为正常胎儿，染色体一条来自母亲，一条来自父亲。

夫妇IV采用引物对甲进行扩增的PCR产物的检测结果见图5；父亲外周血DNA中21号染色体定量荧光PCR扩增出231bp及239bp两个峰，母亲外周血DNA为227bp及242bp两个峰，羊水上清游离DNA出现227bp、231bp和242bp三个峰；结果表明，该胎儿为21-三体患儿，额外的21号染色体来自母亲。夫妇IV采用引物对乙进行扩增的PCR产物的检测结果见图6；父亲外周血DNA中21号染色体定量荧光PCR扩增出299bp及307bp两个峰，母亲外周血DNA为307bp及311bp两个峰，羊水上清游离DNA出现307bp和311bp处荧光峰面积比为2∶1的两个峰；说明胎儿为21-三体患儿，遗传父母亲各一条307bp的染色体及母亲311bp的染色体，额外染色体来源于母亲。夫妇IV采用引物对丙进行扩增的PCR产物的检测结果见图7；父亲外周血DNA中21号染色体定量荧光PCR扩增出384bp及395bp两个峰，母亲外周血DNA为406bp及410bp两个峰，羊水上清游离DNA出现384bp、406bp和410bp三个峰；结果表明，该胎儿为21-三体患儿，额外的21号染色体来自母亲。夫妇IV采用引物对丁进行扩增的PCR产物的检测结果见图8；父亲外周血DNA中21号染色体定量荧光PCR扩增出172bp及185bp两个峰，母亲外周血DNA为172bp及181bp两个峰，羊水上清游离DNA出现172bp、181bp和185bp三个峰。结果表明，该胎儿为21-三体患儿，额外的21号染色体来自母亲或父亲。根据四对引物的PCR产物的检测结果，可以判断，该胎儿为21-三体患儿，额外染色体来源于母亲。

夫妇V和夫妇VI的检测结果同夫妇IV，胎儿为21-三体患儿，额外的21号染色体为来自母亲。

二、采用羊膜腔穿刺术进行21-三体综合征产前筛查(验证试验)

分别对6个孕妇进行羊水穿刺(孕18-20周)，抽取20ml左右的羊水离心后弃去上清，留取沉淀里的羊水细胞成份进行细胞培养，利用分裂中期的细胞核制备染色体核型，进行分析以明确诊断。

孕妇I羊水的核型分析图见图9。夫妇II和夫妇III的检测结果同夫妇I。

孕妇IV羊水的核型分析图见图10。夫妇V和夫妇VI的检测结果同夫妇IV。

验证实验结果表明，本发明提供的试剂盒的检测结果准确。

序列表

<110>北京大学第三医院

<120>一种21-三体综合征产前筛查试剂盒

<130>CGGNARY92274

<160>8

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tatgtgagtc aattccccca agtga 25

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gttgtattag tcaatgttct ccag 24

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gtagatacat acatatgatg aatgc 25

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tattaatgtg tgtccttcca ggc 23

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

cggaggttgc agtgagttg 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gggaaggcta tggaggaga 19

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ccctctcaat tgtttgtcta cc 22

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gcaagagatt tcagtgccat 20

Claims

1.一种21-三体综合征产前筛查试剂盒，包括引物对甲、引物对乙、引物对丙和引物对丁；

所述引物对甲由序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成；

所述引物对乙由序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成；

所述引物对丙由序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成；

所述引物对丁由序列表的序列7所示核苷酸和序列表的序列8所示核苷酸组成。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对中的引物进行了荧光基团标记。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括引物对以外的其它PCR试剂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂包括Taq酶和dNTP。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂包括PCR缓冲液和MgCl₂。

6.引物对甲、引物对乙、引物对丙和引物对丁组成的引物组合物在制备21-三体综合征产前筛查试剂盒中的应用；

7.用于21-三体综合征产前筛查的引物组合物，由引物对甲、引物对乙、引物对丙和引物对丁组成；