CN103173556B

CN103173556B - 用于21三体综合征检测的扩增组合物及快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN103173556B
Application number: CN201310116753.4A
Authority: CN
Inventors: 陈初光; 吕悦心; 宋欣欣
Original assignee: BEIJING MICROREAD GENE TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING MICROREAD GENE TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2013-04-07
Filing date: 2013-04-07
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2033-04-07
Also published as: CN103173556A

Abstract

本发明涉及用于21三体综合征检测PCR扩增组合物及快速检测试剂盒，在一个PCR体系中同时扩增10个21号染色体上短串联重复序列（D21S1437、D21S2052、D21S11、D21S2055、D21S1411、D21S1432、D21S1435、LFG21、Penta D和D21S1413）及2个非21号染色体上短串联重复序列（Penta E和FGA）。该体系可以用于人类21号染色体数目异常诊断，由于各个位点采用荧光标记的引物，得到的产物带有荧光标记，可以在遗传分析仪等仪器上进行检测，得到的片段长度更精确，可重复性更高。本发明操作简单、便于大规模推广，全部过程自动化，整个检测只需6小时左右。

Description

用于21三体综合征检测的扩增组合物及快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及21三体综合征检测PCR扩增组合物，共涉及10对特异性引物，及其快速检测试剂盒。

背景技术

唐氏综合征（Down’s syndrome），也称为21三体综合征（Trisomy21syndrome）是由于21号染色体数目增多一条引起的疾病，是人类最常见的染色体疾病，1866年英国医生LangdonDown首次对此病例做过临床描述，因此称为唐氏综合征。在活产婴儿中其发病率约为1/600-1/800，我国21三体的总患病率为0.47‰，其中城市为0.26‰，农村为0.56‰（张致详等，中国21三体综合征流行病学研究，《中国临床心理学杂志》，1996年03期）。21三体患儿往往生长迟缓、体力和智力障碍、生活不能自理等症状，生活状态差，并且给家庭造成很大负担。由于至今还没有有效预防和治疗方法，因此，在产前及时诊断21号染色体异常并终止妊娠对降低出生缺陷、提高人口素质有重要意义。

目前，21三体临床确诊的方法是染色体核型分析。首先要进行羊膜穿刺取羊水，然后培养羊水中胎儿细胞，再进行核型分析。整个周期需要2-3周，操作复杂，需要有经验的检测人员操作。另外近几年应用的技术为荧光原位杂交（FISH），这一方法较核型分析速度稍快，不需细胞培养，利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交。再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。这两种方法都具有成本较高，周期长，对操作人员要求较高的特点，同时结果为图片，需要人工判读或干预，难以实现自动化和高通量分析。

QF-PCR技术是，通过荧光引物对样本DNA的不同区域进行PCR扩增（因此荧光信号变量与扩增产物变量成正比），随后采用高分辨率胶电泳（如用于测序的毛细管电泳）对扩增片断进行分离，通过荧光检测系统确定扩增片断的长度并实现对多态位点的分型，通过扫描软件对预期大小的扩增产物对应的峰面积定量，实现对原始模板量的定量。定量荧光PCR体系（Quantitative Fluorescent PCR，QF-PCR）中同时扩增多个21号染色体上的短串联重复序列（Short Tandem Repeats，STR）基因座，利用STR基因座的多态性来判断21号染色体数目。唐氏综合征是由于21号染色体数目增多一条引起的疾病，因此对21号染色体上的STR位点经过QF-PCR扩增、检测会得到1:1:1的三个峰、2:1的两个峰或一个峰，其中前两种情况是三体综合征样本相对于正常样本所特有的。STR位点多态性越高则出现单一峰的几率越小，出现前两种情况比例越大。对多个特定染色体上的STR位点进行检测，综合考量各个位点峰数量和峰面积即可判定检测样本是否为三体综合征。

1993年Mansfield首次报道应用STR（Short Tandem Repeats，短串联重复序列）进行QF-PCR，成功检测21三体综合征（Mansfield，Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidiesusing quantitative PCR and small tandem repeat polymorphisms.Hum Mol Genet.1993;2:43–50.）。此后越来越多的研究者采用STR基因座联合检测的方法来诊断。如：专利200810152923.3，一种快速诊断唐氏综合征的方法，通过一个QF-PCR体系检测3个21号染色体的STR位点和两个对照位点；专利200710050287.9，唐氏综合征诊断试剂盒，共使用两个QF-PCR体系，每个体系包含6个21号染色体的STR位点；专利200810027138.5，定量荧光PCR快速检测常见染色体三体的方法及试剂盒，通过3个QF-PCR体系检测12个位点，包括3个21号染色体的STR位点；专利201010019380.5，一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCR STR检测体系，共使用三个QF-PCR体系检测25个位点，包括7个21号染色体的STR位点。上述专利往往采用的STR位点不合理或数目较少，且每个QF-PCR扩增体系中包含的位点数量少，导致检测效率和准确性不够高。

发明内容

本发明的目的是提供21三体综合征检测PCR扩增组合物，在高度复合的扩增体系中可以扩增多至10个与21三体综合征检测相关的STR位点，且通过定量荧光PCR（QF-PCR）技术扩增21三体综合征检测相关的STR位点，对21号染色体数目异常进行检测。

本发明的另一个目的在于提供一种21三体综合征检测试剂盒。该试剂盒利用多重定量荧光PCR扩增体系，通过该试剂盒可实现仅以一个扩增检测反应完成对样品简便、稳定、准确、精细和高效地检测。

21三体综合征检测PCR扩增组合物，其特征在于：所述扩增组合物中包括10对引物，可同时扩增10个与21三体综合征检测相关的STR位点：D21S1437、D21S2052、D21S11、D21S2055、D21S1411、D21S1432、D21S1435、LFG21、Penta D和D21S1413，所述引物分别为：

扩增D21S1437的引物如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示，

扩增D21S2052的引物如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示，

扩增D21S11的引物如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示，

扩增D21S2055的引物如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示，

扩增D21S1411的引物如SEQ ID NO21和SEQ ID NO22所示，

扩增D21S1432的引物如SEQ ID NO23和SEQ ID NO24所示，

扩增D21S1435的引物如SEQ ID NO25和SEQ ID NO26所示，

扩增LFG21的引物如SEQ ID NO27和SEQ ID NO28所示，

扩增Penta D的引物如SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示，

扩增D21S1413的引物如SEQ ID NO31和SEQ ID NO32所示。

所述引物分为四组，四组引物分别在每一对引物的其中一条引物的5’末端带有不同颜色的荧光标记物，所述第一组为D21S1437、D21S2052和D21S11的引物，第二组为D21S2055和D21S1411的引物，第三组为DS21S1432、D21S1435和LFG21的引物，第四组为Penta D和D21S1413的引物。

所述第一组、第二组、第三组和第四组分采用下列四种荧光标记：FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC和ROX或PET。

所述扩增组合物中还包括两对引物，该两对引物分别扩增非21号染色体位点Penta E和FGA；

扩增Penta E的引物如SEQ ID NO33和SEQ ID NO34所示，

扩增FGA的引物如SEQ ID NO35和SEQ ID NO36所示。

所述Penta E的引物分为第三组，FGA的引物分为第四组。

所述的扩增组合物还包括：PCR反应缓冲液、dNTP混合物、模板DNA和Taq酶。

21三体综合征检测试剂盒，包括上述扩增组合物。

所述位点扩增引物的用量体积比为：

位点名称	引物的体积（μl）
		D21S1437	2.0μl
D21S2052	0.6μl
		D21S11	1.6μl
D21S2055	1.5μl
		D21S1411	1.6μl
D21S1432	0.6μl
		D21S1435	0.5μl
LFG21	1.2μl
		Penta D	1.5μl
D21S1413	0.7μl
		Penta E	1.2μl
FGA	1.2μl

上述试剂盒在检测21三体综合征中的应用。

本发明选取10个21号染色体上短串联重复序列（D21S1437、D21S2052、D21S11、D21S2055、D21S1411、D21S1432、D21S1435、LFG21、Penta D和D21S1413），对21号染色体数目异常进行检测。所选取的位点经过大量群体数据筛选，具有高度多态性和遗传稳定性，适用于染色体数目异常检测。各位点在染色体上分布均匀，并且在唐氏综合征关键区域及其附近设置位点，这样不仅使检测结果更稳定、可信，也可对易位型唐氏综合征进行有效检测。

同时，我们在扩增体系中增加了2个非21号染色体上短串联重复序列（Penta E和FGA）用来排除样本是否有污染。如果发生样本污染，检测结果有可能出现三等位或两个等位基因失衡的结果，这在一定程度上与21三体综合征检测预期结果一致，有可能造成误判。因此，只检测多个21号染色体位点的检测方法是有风险的，一定要增加多个非21号染色体STR位点以验证是否存在污染并避免由于污染造成的误判。

本发明的优势在于：

1.检测周期短，获得样本后5小时就可以可得到结果。我们采用了羊水细胞提取直接扩增，扩增加检测时间共计5小时，能够在1-2天内出具报告，大大加快了速度。

2.灵敏度高，每次检测只需纳克级别的DNA，相当于100个细胞所含的DNA量，因此需要的样本量少，需要1-2ml的羊水即可满足需求。

3.准确性高，这一方法准确性超过目前任何检测唐氏综合征的技术。同FISH相比，本技术对人员操作要求较低，发生污染的几率更小。由于采用了可靠的PCR技术和遗传分析仪检测，能够实现自动化和数字化分析数据，无需人工干预，结果更加客观和准确。

4.可清晰判断样本污染情况，在体系中含有2个高度多态性的非21号染色体基因座，可以指示样本是否来自同一个体，避免母体细胞污染的问题。

5.对于部分易位和嵌合体有更好的检出率。我们采用的10个基因座覆盖范围包括了21号染色体多个区段，对于部分易位的情况检出率更大，另外由于灵敏度较高，三体细胞占10%以上的嵌合体就可以被检出。

本发明的技术思路

1、引物组合的设计

首先，我们选择了具有高度灵敏性及扩增特异性的21号染色体STR位点，选择的位点包括D21S1437、D21S2052、D21S11、D21S2055、D21S1411、D21S1432、D21S1435、LFG21、Penta D和D21S1413，以及非21号染色体位点Penta E和FGA。我们从人类的基因组数据中筛选了这些STR位点，具有高度多态性和遗传稳定性等特点。根据候选的位点所在基因的GenBank序列号从NCBI核酸数据库下载基因序列，各位点所在基因的部分序列见序列表。

用于扩增D21S1437的引物对是由位于SEQ ID NO1中157～176位20个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO1中260～280位的互补序列的21个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D21S2052的引物对是由位于SEQ ID NO2中1～23位23个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO2中100～125位的互补序列的26个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D21S11的引物对是由位于SEQ ID NO3中126～143位18个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO3中308～329位的互补序列的22个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D21S2055的引物对是由位于SEQ ID NO4中57～80位24个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO4中171～194位的互补序列的24个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D21S1411的引物对是由位于SEQ ID NO5中25～49位25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO5中246～266位的互补序列的21个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D21S1432的引物对是由位于SEQ ID NO6中129～164位25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO6中247～276位的互补序列的20个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D21S1435的引物对是由位于SEQ ID NO7中43～64位22个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO7中184～203位的互补序列的20个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增LFG21的引物对是由位于SEQ ID NO8中501～520位20个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO8中705～724位的互补序列的20个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增Penta D的引物对是由位于SEQ ID NO9中89～100位22个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO10中204～233位的互补序列的30个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D21S1413的引物对是由位于SEQ ID NO10中1～20位20个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO11中154～172位的互补序列的19个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增Penta E的引物对是由位于SEQ ID NO11中159～178位20个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO9中452～477位的互补序列的26个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增FGA的引物对是由位于SEQ ID NO12中117～136位20个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO12中409～432位的互补序列的24个连续碱基构成的引物的组合。

通过分型图（见图1）可知，对于正常个体，21号染色体各基因座为正常的杂合（双峰）或纯合（单峰），非21号染色体2个基因座也为正常的杂合（双峰）或纯合（单峰）。通过分型图（见图2，图3）可知，对于21三体综合征个体，21号染色体各基因座会出现三等位或者两个等位基因失衡的现象。

以上引物由Primer3、Primer Premier5和NCBI Blast等软件设计而成。设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在（60±2）℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差100bp以上。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。

选用任一人类DNA模板，分别用12对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5～2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到12对引物共同的扩增条件。最终要达成的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。

然后，将满足要求的12对引物，分为四组进行荧光标记。每组采用一种荧光素，分别可以是FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC和ROX或PET。获得荧光标记引物后，用与之相配对的非荧光引物组合后分别进行单重扩增，将扩增产物置于ABI3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。

其后，将同一荧光素标记的2对至4对引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于ABI3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率以及此2对至4对引物的混合扩增是否引起非特异扩增。

最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将12对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率（反应在电泳结果的峰高上）基本一致为准。最终确定的12对引物序列分别见序列表。

2.扩增体系及条件的建立

2.1Taq酶的选择

Taq酶是扩增体系的重要组分，多种Taq酶都满足本发明的需要，如Takara公司的rTaq酶和HS Taq酶、KAPA Biosystems公司的Taq酶和Roche公司的AmpliTaq Gold酶等均能得到较好的扩增效率和特异性，采用热启动Taq酶比非热启动酶的扩增特异性要好。

2.2Mg²⁺浓度的选择

我们摸索了在不同Mg²⁺浓度梯度下复合扩增的效果，其中在1.0-2.5mM的浓度范围内均能得到较好的扩增。

2.3反应体积的选择

我们分别采用了50μl、20μl和10μl体系进行了复合扩增，结果显示：50μl与20μl的体系效果基本相当，优于10μl体系的扩增效果。

2.4反应程序的优化

退火及延伸温度：我们摸索了退火温度从55℃到62℃之间各温度下的扩增情况，结果显示在59-61℃范围内均能得到较好结果。扩增循环数在28-32个之间有较好的效果。

我们摸索了在以下变性、退火及延伸温度下各时间范围内（见表1）的扩增可以得到较好的结果：表1温度与时间

附图说明

图1正常人检测结果，

图2样品1的检测结果，

图3样品2的检测结果，

具体实施方式

实施例1

以下是我们采用本发明对2例21三体综合征患者和1例正常人的DNA样本进行检测的具体实施情况。

1.DNA提取

采用Chelex-100、DNA提取试剂盒（天根生化）进行DNA提取，操作步骤依照说明书，DNA提取完毕用紫外分光光度计定量，并稀释成2ng/μl。

2.PCR

2.1反应体系：

将Penta E和FGA位点和10个21号染色体STR位点的共12对引物分别溶解并配成浓度为10μM的工作液，然后按表2体积比配成引物混合液（Primer mix）：引物序列见附录中序列表。

表2各引物体积比

位点名称	体积（μl）
		D21S1437	2.0μl
D21S2052	0.6μl
		D21S11	1.6μl
D21S2055	1.5μl
		D21S1411	1.6μl
D21S1432	0.6μl
		D21S1435	0.5μl
LFG21	1.2μl
		Penta D	1.5μl
D21S1413	0.7μl

Penta E	1.2μl
		FGA	1.2μl

将各反应试剂（Buffer、Primer Mix、dNTP等）振荡混合后按表3体积比（模板除外）配成PCR反应混合液，分装19μl于PCR反应管中，最后往各反应管加入1μl模板，离心后进入下一步。

表3标准扩增反应体系

H₂O	6.8μl
		2.5×Buffer	8μl
Primer mix	4μl
		Taq	0.2μl
DNA	1μl
		总计	20μl

2.2PCR反应程序：

将PCR反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃变性10分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火1分钟，第4步：70℃延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60℃延伸60分钟。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。

3.毛细管电泳检测

3.1取上一步得到的PCR扩增产物，点样于1.5-2.0%琼脂糖凝胶上，电泳20min后观察结果，若在100-450bp处出现明亮的阶梯条带则可上机检测。

3.2根据电泳胶图上的样品的条带亮度，确定样品稀释倍数，按稀释倍数将扩增产物稀释待用。将LIZ500内标和甲酰胺按比例20：1000混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入稀释过的样品1μl，混合静置数分钟，写上板号，离心后放入ABI3130xl测序仪上，准备检测。

3.3打开ABI3130xl测序仪数据采集软件，编辑上机检测的板标，导入检测程序。

3.4点击运行，即开始检测。

3.5检测完毕后，将数据拷贝至光盘。

4.数据分析

4.1导入原始数据，在主页面的File菜单选择Add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在Project窗口；

4.2选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard。浏览样本电泳的原始数据，任一样本文件名，在“Sample”菜单下选择“Raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧（第一个橙色的内标峰之前），以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysis method分析参数中的起始点；

4.3点击绿色分析按钮，出现Save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。

4.4采用GeneMapper v3.2软件分析得到的数据并生成图谱，见图1-3。

5.结果分析

5.1通过分型图（见图1）可知，对于正常个体，21号染色体各基因座为正常的杂合（双峰）或纯合（单峰），非21号染色体2个基因座也为正常的杂合（双峰）或纯合（单峰）。通过分型图（见图2，图3）可知，对于21三体综合征个体，21号染色体各基因座会出现三等位或者两个等位基因失衡的现象。

Claims

1.用于21三体综合征检测PCR扩增组合物，其特征在于：所述扩增组合物中包括10对引物，可同时扩增10个与21三体综合征检测相关的STR位点：D21S1437、D21S2052、D21S11、D21S2055、D21S1411、D21S1432、D21S1435、LFG21、Penta D和D21S1413，所述引物分别为：

扩增D21S1437的引物如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示，

扩增D21S2052的引物如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示，

扩增D21S11的引物如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示，

扩增D21S2055的引物如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示，

扩增D21S1411的引物如SEQ ID NO21和SEQ ID NO22所示，

扩增D21S1432的引物如SEQ ID NO23和SEQ ID NO24所示，

扩增D21S1435的引物如SEQ ID NO25和SEQ ID NO26所示，

扩增LFG21的引物如SEQ ID NO27和SEQ ID NO28所示，

扩增Penta D的引物如SEQ ID NO29和SEQ ID NO30所示，

扩增D21S1413的引物如SEQ ID NO31和SEQ ID NO32所示。

2.根据权利要求1所述的用于21三体综合征检测PCR扩增组合物，所述引物分为四组，四组引物分别在每一对引物的其中一条引物的5’末端带有不同颜色的荧光标记物，所述第一组为D21S1437、D21S2052和D21S11的引物，第二组为D21S2055和D21S1411的引物，第三组为DS21S1432、D21S1435和LFG21的引物，第四组为Penta D和D21S1413的引物。

3.根据权利要求2所述的用于21三体综合征检测PCR扩增组合物，所述第一组、第二组、第三组和第四组分别采用下列四种荧光标记：FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC、和ROX或PET。

4.根据权利要求1－3任一所述的用于21三体综合征检测PCR扩增组合物，所述扩增组合物中还包括两对引物，该两对引物分别扩增非21号染色体位点Penta E和FGA；

扩增Penta E的引物如SEQ ID NO33和SEQ ID NO34所示，

扩增FGA的引物如SEQ ID NO35和SEQ ID NO36所示。

5.根据权利要求4所述的用于21三体综合征检测PCR扩增组合物，所述引物分组为Penta E的引物为第三组，FGA的引物为第四组。

6.根据权利要求1所述的用于21三体综合征检测PCR扩增组合物，所述的扩增组合物还包括：PCR反应缓冲液、dNTP混合物、模板DNA和Taq酶。

7.一种用于21三体综合征检测试剂盒，包括权利要求1-3任一用于21三体综合征检测PCR扩增组合物。

8.一种用于21三体综合征检测试剂盒，包括权利要求4-5任一用于21三体综合征检测PCR扩增组合物。

9.根据权利要求8所述的用于21三体综合征检测试剂盒，其中各位点引物用量体积为：

位点名称引物的体积 D21S1437 2.0μl D21S2052 0.6μl D21S11 1.6μl D21S2055 1.5μl D21S1411 1.6μl D21S1432 0.6μl D21S1435 0.5μl LFG21 1.2μl Penta D 1.5μl D21S1413 0.7μl Penta E 1.2μl FGA 1.2μl

10.根据权利要求7或8或9所述的用于21三体综合征检测试剂盒，还包括PCR反应缓冲液、dNTP混合物和Taq酶。