CN108866175A

CN108866175A - 一种检测染色体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN108866175A
Application number: CN201710326037.7A
Authority: CN
Inventors: 梁丹军; 耿娟; 郑昭璟
Original assignee: Hangzhou Sino Han Jin Nuo Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Sino Han Jin Nuo Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种检测染色体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒。本发明主要针对中国人群18三体综合征、13三体综合征和性染色体非整倍体异常的临床诊断进行设计。与现有发明专利或同类型试剂盒相比，其优势在于：1. 检测通量高；2. 检测周期短；3. 灵敏度高；4. 准确性高；5. 产前诊断中可排除母体污染，体系中STR位点多态性高，根据STR产物大小，可以判断样本是否来自同一个体，避免母体细胞污染的问题；6. 对于嵌合体有更好的检出率。

Description

一种检测染色体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种检测染色体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒。

背景技术

染色体病是导致出生缺陷常见的一类遗传性疾病，约占活产儿的1/120～1/150左右，主要表现为染色体数目异常和染色体结构异常。染色体非整倍体异常是指细胞中个别染色体增多或减少形成的染色体数目异常。患儿通常具有智力低下、器官畸形或第二性征发育异常等临床表现，给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。

最常见的染色体非整倍体异常包括21三体综合征(Down’s syndrome)、18三体综合征(Edward syndrome)、13三体综合征(Patau syndrome)、45,X(Turner综合征)、47,XXY(Klinefelter综合征)、三倍体和嵌合体等，其中13、18、21及X/Y染色体异常占新生儿染色体数目异常的95％。这类疾病目前尚无有效的治疗方案，只能通过产前筛查或产前诊断来减少或避免该类患儿的出生。

目前，临床上以染色体核型分析为诊断金标准，进行产前诊断时，要进行羊膜穿刺取羊水，在体外培养羊水中的胎儿细胞，再进行核型分析。该方法准确、可靠，但需要进行细胞培养，检测周期长(2-3周)，操作复杂，依赖人工分析和经验积累等诸多局限性。另一种临床常用的技术为荧光原位杂交(FISH)，该技术一般用于染色体异常的辅助检测，可在48小时内快速诊断，但该方法手工操作繁琐、对操作人员要求较高、费用昂贵，均不能满足大规模检测的需要。

QF-PCR技术是一种通过对相应染色体上的短串联重复序列(short tandemrepeat，STR)进行扩增，从而对染色体拷贝数目进行判断的一种有效方法。STR具有稳定性和多态性，不同物种具有不同的长度，取决于重复序列的重复次数，是第二代遗传标记，遵循孟德尔显性遗传规律。QF-PCR技术主要利用荧光标记引物对染色体上STR位点进行扩增，通过毛细管电泳荧光检测系统确定扩增片段的长度并实现对多态位点的分型，通过扫描软件对预期大小的扩增产物对应的峰面积定量，实现对原始模板量的定量。通过定性、定量分析STR的多态性，能诊断出99.2～100％目标染色体的非整倍体异常(21、18、13、X和Y等5种染色体)，还可根据判别多余染色体的来源、鉴别母体组织污染，为临床提供更多遗传咨询信息。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种检测染色体数目异常的扩增组合物，对目标染色体，选取在中国人群中杂合率较高的STR位点，对21号、18号、13号以及X、Y染色体非整数倍数目异常进行检测。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种检测染色体数目异常的扩增组合物，所述扩增组合物包括18对引物，同时扩增21号、18号、13号以及X、Y染色体数目异常检测相关的STR位点：AMEL、D21S1270、DXYS267、D21S1412、D18S535、D13S305、D21S1432、DXYS22、D21S11、D18S386、D13S634、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、DXS1187、D18S977和SRY；21号染色体的STR位点为D21S1270、D21S1412、D21S1432、D21S11；18号染色体的STR位点为D18S535、D18S386、D18S1002、D18S977；13号染色体的STR位点为D13S305、D13S634、D13S258、D13S742；性染色体的STR位点及性别基因为DXYS267、DXYS22、DXS6809、DXS1187、AMEL、和SRY；所述引物分别为：

扩增AMEL的引物：

引物1：CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，

引物2：AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG；

扩增D21S1270的引物：

引物1：AGTCTGTCTATCTATCTATCTATCT，

引物2：GATGGCCTGTGTCTATCCCACT；

扩增DXYS267的引物：

引物1：TCCTAATGTGGTCTTCTACTTGTG，

引物2：AGGGAGAGTAAAAGCAAAATCAATT；

扩增D21S1412的引物：

引物1：GTGACAAGAGTGAAACTCTGTCAA，

引物2：GTGTCTTGGTCAGTTCAGAAGTCACTTA；

扩增D18S535的引物：

引物1：CTACAGCAAACTTCATGTGACAA，

引物2：GTTTCTACTTTTCAGGCACCTCA；

扩增D13S305的引物：

引物1：TGAGGACCTGTCGTTACGAATG，

引物2：GAGGAAATTTGTGGTTATAGAGCA；

扩增D21S1432的引物：

引物1：GTCAAGGTTTTCTTAGAGGGACAGA，

引物2：TGTCTTTGTGATCGTAAATACTTAAT；

扩增DXYS22的引物：

引物1：GGAAAGAAAAGGAAAGCAAGGG，

引物2：TACTTGAGACTTGGTGGGCT；

扩增D21S11的引物：

引物1：GTTCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGT，

引物2：ATGGTCTGTTATGGGACTTTTCTCA；

扩增D18S386的引物：

引物1：ATCACTTGGAACCCCCAGCCT，

引物2：CTTCCATGAAGTAGCTAAGCAGG；

扩增D13S634的引物：

引物1：GTCTTAGATATGATAATTTCCATTGCC，

引物2：ATTTGAATGTTGCCACACTACTGG；

扩增D18S1002的引物：

引物1：TTATAGATACTCATTTATACCCCAGG，

引物2：CCTTTCTCTTCAGGCATGGG；

扩增D13S258的引物：

引物1：GAGCAAGCAATTCAGTAAATACACG，

引物2：AAAGCAGCAAACAGAGAGAGTAGTG；

扩增DXS6809的引物：

引物1：AGTTGGGTTCACATTCTCAAACTAC，

引物2：CAATTTTGCTTTAGGCTGATGTGAG；

扩增D13S742的引物：

引物1：TCTTATTCCAGATAACTGGGCTAGGAA，

引物2：GAAGGATGCTGGTTATAAAACACTCTTC；

扩增DXS1187的引物：

引物1：TAGAGGGTGATATGGGGGAC，

引物2：CTTGTCAACACCTTTCCTCCA；

扩增D18S977的引物：

引物1：CTTGGCTTTGCATTTTCTAGCTGT，

引物2：GAACCACAGTGCTTGGCTATATC；

扩增SRY的引物：

引物1：ACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGA，

引物2：TTGAGTGTGTGGCTTTCGTACAGT。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

所述引物分为四组，第一组为：AMEL、D21S1270、DXYS267、D21S1412、D18S535和D13S305；第二组：D21S1432、DXYS22、D21S11、D18S386和D13S634；第三组：D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742和DXS1187；第四组：D18S977和SRY；每组引物带有不同的荧光标记物，四组引物分别在每一对引物的其中一条引物的5’末端带有荧光标记物。

每组引物分别采用FAM、HEX、TAMRA、ROX中的任一种标记，且每组之间的标记色都不相同。

STR位点均为已知的序列，可在人类基因组数据库找到，引物的荧光标记的选择基于扩增得到的片段的长度，扩增得到的片段长度相近的引物需使用不同的荧光标记，从而使扩增得到的片段得以区别。所述引物分为四组，四组引物分别在每一对引物的其中一条引物的5’末端带有荧光标记物。所述第一组：AMEL、D21S1270、DXYS267、D21S1412、D18S535和D13S305，用FAM荧光标记；第二组：D21S1432、DXYS22、D21S11、D18S386和D13S634，用HEX荧光标记；第三组：D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742和DXS1187，用TAMRA荧光标记；第四组：D18S977和SRY，用ROX荧光标记。

所述的18对引物的核苷酸序列和对应的18对基因座分别是：AMEL：SEQ ID NO.33～34、D21S1270：SEQ ID NO.7～8、DXYS267：SEQ ID NO.29～30、D21S1412：SEQ ID NO.3～4、D18S535：SEQ ID NO.17～18、D13S305：SEQ ID NO.9～10、D21S1432：SEQ ID NO.5～6、DXYS22：SEQ ID NO.31～32、D21S11：SEQ ID NO.1～2、D18S386：SEQ ID NO.19～20、D13S634：SEQ ID NO.11～12、D18S1002：SEQ ID NO.23～24、D13S258：SEQ ID NO.13～14、DXS6809：SEQ ID NO.25～26、D13S742：SEQ ID NO.15～16、DXS1187：SEQ ID NO.27～28、D18S977：SEQ ID NO.21～22和SRY：SEQ ID NO.35～36。

本发明还提供了用于同时扩增上述18个STR基因座所对应的引物，具体如表1所示。

表1

所述扩增组合物还包括：2×Multiplex PCR Buffer、dNTP、MgCl₂、Multiplex PCREnzyme Mix、Taq DNA聚合酶、模板DNA。

本发明的另外一个目的在于，提供一种染色体数目异常的快速检测试剂盒。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种染色体数目异常的快速检测试剂盒，包括前面所述的扩增组合物。

所述扩增组合物的用量体积比为：

本发明的技术思路：

1.STR位点选择

从21、18、13号和性染色体的STR基因座中选择易于扩增和分析的STR位点。对选择的STR基因座进行遗传多态性研究，在目前已应用的STR基因座中，4～6个核苷酸碱基重复的STR基因座因突变率低、结果准确、稳定性好，常作为高信息的遗传标记。因此，本发明筛选出以下18个具有高度多态性、遗传稳定性、四核苷酸碱基重复等特点的基因座：AMEL、D21S1270、DXYS267、D21S1412、D18S535、D13S305、D21S1432、DXYS22、D21S11、D18S386、D13S634、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、DXS1187、D18S977和SRY。

2.STR基因座引物设计与验证

根据候选的位点所在基因的GenBank序列号从NCBI核酸数据库下载基因序列。用Primer3、Primer Premier 5、MFEprimer-2.0和NCBI Blast等软件设计引物，PCR产物大小在500bp以内。分别对18对引物进行单重扩增，所有的引物对均能出现单一的目的条带。然后，将同一荧光素标记的5～6对引物混合置于同一管中进行多重PCR扩增，根据毛细管电泳检测结果来确定扩增效率和引物特异性。最后，将18对引物混合置于同一管中扩增，进一步优化反应体系与反应程序。

3.扩增体系及条件的建立

通过优化反应体系中的Mg²⁺浓度，扩增酶的比例，引物的浓度后，本发明的扩增反应体系为：2×Multiplex PCR Buffer 12.5μl、dNTP(2.5mM)2.0μl、MgCl₂(25mM)1.0μl、Multiplex PCR Enzyme Mix 0.125μl、Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.125μl、引物混合物(100μM)1.8μl、ddH₂O补足至25.0μl；所述的扩增反应液中各组分终浓度为3mM Mg²⁺、200μM dNTP、引物终浓度0.2μM。

通过优化反应程序中退火温度，延伸温度和延伸时间后，本发明的反应程序如表2所示。

表2

本发明主要针对中国人群18三体综合征、13三体综合征和性染色体非整倍体异常的临床诊断进行设计。与现有发明专利或同类型试剂盒相比，其优势在于：

1.检测通量高，采用了五色荧光标记技术，能在同一个PCR管中对18个基因座进行扩增、检测，同FISH相比，本技术对人员操作要求较低，发生污染的几率更小。由于采用了可靠的PCR技术和遗传分析仪检测，能够实现自动化和数字化分析数据，无需人工干预，结果更加客观和准确。

2.检测周期短，获得样本后，进行DNA提取，PCR扩增，最后再毛细管电泳检测，即可以得到结果，检测周期较染色体核型分析和FISH检测有了大大的缩短。

3.灵敏度高，每次检测只需纳克级别的DNA，可用于定性检测外周静脉全血、脐血、羊水和绒毛组织等样本中的21、18、13号和性染色体非整倍体数目异常。

4.准确性高，所采用的18个STR基因座包含21号、18号、13号染色体各4个基因座，性染色体的4个基因座，以及2个性别基因。这些STR基因座在中国汉族人群中均具有较高的多态性，能够达到准确诊断目标染色体数目的目的。

5.产前诊断中可排除母体污染，体系中STR位点多态性高，根据STR产物大小，可以判断样本是否来自同一个体，避免母体细胞污染的问题。

6.对于嵌合体有更好的检出率。采用的STR位点多态性高，可检测出嵌合比例在20％及以上的三体嵌合体。

附图说明

图1是正常等位基因分型图谱。

图2是染色体数目异常的一种分型图谱，即一个基因座在目标片段范围内出现面积比约为1:1:1的三个峰(峰比值落在正常峰范围内)；

图3是染色体数目异常的另一种分型图谱，即在目标片段范围内出现面积比为2:1的两个峰，峰面积比值在0.45-0.68或1.8-2.4。

图4a正常男性性别基因AMEL基因分型图谱。

图4b正常男性性别基因SRY基因分型图谱。

图5正常女性性别基因AMEL基因分型图谱。

图6样本多余染色体污染特征峰型。

图7a和7b是21三体综合征胎儿样本在D21S1270和D21S11基因座的特征性STR等位基因型，其中图7a是D21S1270分型结果；图7b是D21S11分型结果。

图8a和8b是18三体综合征胎儿样本在D18S1002和D18S535基因座的特征性STR等位基因型，其中图8a是D18S1002分型结果；图8b是D18S535分型结果。

图9a和9b是13三体综合征胎儿样本在D13S305和D13S634基因座的特征性STR等位基因型，其中图9a是D13S305分型结果；图9b是D13S634分型结果。

图10是三倍体69XXY基因分型结果。

图11是三倍体69XXX基因分型结果。

图12是胎儿样本D21S1412、D18S535、D13S305基因座的基因分型以及多余染色体来源分析。

具体实施方式

参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。

实施例1：本发明应用于多种类型样本的21、18、13号，以及性染色体非整倍体异常的检测

1.核酸提取

(1)胎儿绒毛组织DNA提取

把流产组织置于培养皿中，倒入生理盐水清洗多次；洗干净后，倒入生理盐水，漫过组织，可看到白白的、毛状的绒毛，若看不到需剪开孕囊，仔细挑选绒毛；剪下一定量的绒毛，放入一新的装有生理盐水的培养皿中，在显微镜下观察，正常绒毛在显微镜下呈现中空、树枝状、枝子上有突起的形状；挑选后的绒毛组织用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN，货号69504)提取组织DNA。最后用Nanodrop2000测定DNA的浓度及纯度。

(2)羊水DNA提取

将羊水样本于3000rpm离心10min，用无菌吸管吸去上清；加入1～1.5ml生理盐水，用无菌吸管吹打混匀(将试管底部的细胞吹打起来)，再将细胞悬液移到1.5/2ml新的离心管中，3000rpm离心10min去掉上清；用试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN，货号51104)提取细胞DNA，最后用Nanodrop2000测定DNA的浓度及纯度。

(3)新鲜EDTA抗凝全血DNA提取

用厦门致善Lab-Aid824核酸提取仪自动提取全血DNA。最后用Nanodrop2000测定DNA的浓度及纯度。

2.反应体系配制与扩增

(1)将样本稀释至40ng/μl，按下表(表3)配制QF-PCR扩增反应体系：

表3

(2)在ABI Veriti PCR仪上按表2设置反应程序，并放入PCR反应体系进行PCR扩增。

3.扩增产物毛细管电泳分析

扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μl产物或Allelic Ladder与0.5μl分子量内标和12μl去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟，冰浴3分钟。瞬时离心混合物，在ABI3130遗传分析仪上进行检测，最后用GeneMarker V2.2.0软件进行基因分型。

4.结果判断标准

(1)STR等位基因比率＝基因座内短等位基因峰面积/基因座内长等位基因峰面积。

(2)正常峰的判断：杂合子表现为峰面积之比约为1:1的两个峰，峰面积比值为0.8-1.4，对于等位基因间隔在24bp以上的，比值在1.5也可被认为是在正常峰范围。如图1。

(3)异常峰型的判断(三体的判断)：任何一个基因座在目标片段范围内出现面积比约为1:1:1的三个峰(峰比值落在正常峰范围内)，如图2；或在目标片段范围内出现面积比为2:1的两个峰，峰面积比值在0.45-0.68或1.8-2.4，如图3。

(4)染色体数目异常的诊断(三体或三倍体)：每条染色体至少有2个或2个以上的STR基因座出现异常峰才能诊断为相应的染色体异常。三倍体诊断需要2个以上染色体STR符合三体特征。

(5)性别判断：正常男性AMEL基因显示面积比为1:1的双峰，SRY基因显示单峰，如图4a、4b，所有X染色体和Y染色体STR基因座为单峰。正常女性AMEL基因显示单峰，所有X染色体上STR基因座为正常峰型，SRY基因和Y染色体基因座无扩增，如图5。

(6)性染色体多倍体的判断标准：峰面积比值范围在>2.4或<0.45时，性染色体异常多于3个拷贝。

(7)当峰面积比落在1.4-1.8或0.65-0.8的范围内时为中间值范围，该比值不能用于得出结论。

(8)嵌合体的计算：用流产物STR基因座中母体特有的等位基因峰面积除以杂合峰(母子重叠的峰)面积。任取3-5个STR基因座计算平均值。如图6，母体嵌合比例为7372/32179＝33％。

实施例2：用本发明快速产前诊断目标染色体异常和三倍体异常综合征

采用产前不明原因反复流产的胎儿羊水、绒毛样本158例，其中羊水取样10-20ml，绒毛取样10-25mg，按照实例1最终确定的实验方法进行检测与结果分析。本发明在158份样本中共检测出6例21三体，2例18三体，4例13三体，16例45,X，15例三倍体(69,XXY/69XXX)。同时采用染色体芯片分析进行了结果验证，证明本方法的检测准确性达100％。

按照染色体数目异常的诊断标准：每条染色体至少有2个或2个以上的STR基因座出现异常峰才能诊断为相应的染色体异常。

对21三体综合征，四个STR基因座D21S1270、D21S1412、D21S1432、D21S11中D21S1270片段范围内出现面积比为2:1的两个峰，峰面积比值为8845/13859＝0.64，如图7a；D21S11片段范围内出现面积比约为1:1:1的三个峰(峰比值落在正常峰范围内)，如图7b。

对18三体综合征，四个STR基因座D18S535、D18S386、D18S1002、D18S977中D18S1002片段范围内出现面积比为2:1的两个峰，峰面积比值为29590/44757＝0.66，如图8a；D18S535片段范围内出现面积比约为1:1:1的三个峰(峰比值落在正常峰范围内)，如图8b。

对13三体综合征，四个STR基因座D13S305、D13S634、D13S258、D13S742中D13S305片段范围内出现面积比为2:1的两个峰，峰面积比值为42735/19759＝2.16，如图9a；D13S634片段范围内出现面积比约为1:1:1的三个峰(峰比值落在正常峰范围内)，如图9b。

三倍体诊断需要2个以上染色体STR符合三体特征。69XXY如图10，69XXX如图11。21、18、13号以及性染色体STR均符合三体特征，故判断为三倍体。

实施例3：计算母体细胞嵌合比例

羊水标本离心后如肉眼可见红色血液污染，则需将羊水标本同孕妇外周血标本同时检测，判断有无母体细胞污染；所有的绒毛标本均需将胎儿标本同孕妇外周血标本同时检测，以排除母体细胞的污染。依据嵌合体的计算依据：用流产物STR基因座中母体特有的等位基因峰面积除以杂合峰(母子重叠的峰)面积。任取3-5个STR基因座计算平均值。如图12所示，母体细胞嵌合比例为：(3092/10770+5608/21368+3893/19388)/3＝25％。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

<110> 杭州中翰金诺医学检验所有限公司

<120> 一种检测染色体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒

<160> 36

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

GTTCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGT 28

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ATGGTCTGTTATGGGACTTTTCTCA 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

GTGACAAGAGTGAAACTCTGTCAA 24

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

GTGTCTTGGTCAGTTCAGAAGTCACTTA 28

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

GTCAAGGTTTTCTTAGAGGGACAGA 25

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

TGTCTTTGTGATCGTAAATACTTAAT 26

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

AGTCTGTCTATCTATCTATCTATCT 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

GATGGCCTGTGTCTATCCCACT 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

TGAGGACCTGTCGTTACGAATG 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>

<400> 10

GAGGAAATTTGTGGTTATAGAGCA 24

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

GTCTTAGATATGATAATTTCCATTGCC 27

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

ATTTGAATGTTGCCACACTACTGG 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

GAGCAAGCAATTCAGTAAATACACG 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

AAAGCAGCAAACAGAGAGAGTAGTG 25

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

TCTTATTCCAGATAACTGGGCTAGGAA 27

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

GAAGGATGCTGGTTATAAAACACTCTTC 28

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

CTACAGCAAACTTCATGTGACAA 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

GTTTCTACTTTTCAGGCACCTCA 23

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

ATCACTTGGAACCCCCAGCCT 21

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

CTTCCATGAAGTAGCTAAGCAGG 23

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

CTTGGCTTTGCATTTTCTAGCTGT 24

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

GAACCACAGTGCTTGGCTATATC 23

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

TTATAGATACTCATTTATACCCCAGG 26

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

CCTTTCTCTTCAGGCATGGG 20

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 25

AGTTGGGTTCACATTCTCAAACTAC 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 26

CAATTTTGCTTTAGGCTGATGTGAG 25

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 27

TAGAGGGTGATATGGGGGAC 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 28

CTTGTCAACACCTTTCCTCCA 21

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 29

TCCTAATGTGGTCTTCTACTTGTG 24

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 30

AGGGAGAGTAAAAGCAAAATCAATT 25

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 31

GGAAAGAAAAGGAAAGCAAGGG 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 32

TACTTGAGACTTGGTGGGCT 20

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 33

CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG 22

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 34

AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG 21

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 35

ACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGA 23

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 36

TTGAGTGTGTGGCTTTCGTACAGT 24

Claims

1.一种检测染色体数目异常的扩增组合物，其特征在于，所述扩增组合物包括18对引物，同时扩增21号、18号、13号以及X、Y染色体数目异常检测相关的STR位点：AMEL、D21S1270、DXYS267、D21S1412、D18S535、D13S305、D21S1432、DXYS22、D21S11、D18S386、D13S634、D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、DXS1187、D18S977和SRY，所述引物分别为：

扩增AMEL的引物：

引物1：CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG，

引物2：AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG；

扩增D21S1270的引物：

引物1：AGTCTGTCTATCTATCTATCTATCT，

引物2：GATGGCCTGTGTCTATCCCACT；

扩增DXYS267的引物：

引物1：TCCTAATGTGGTCTTCTACTTGTG，

引物2：AGGGAGAGTAAAAGCAAAATCAATT；

扩增D21S1412的引物：

引物1：GTGACAAGAGTGAAACTCTGTCAA，

引物2：GTGTCTTGGTCAGTTCAGAAGTCACTTA；

扩增D18S535的引物：

引物1：CTACAGCAAACTTCATGTGACAA，

引物2：GTTTCTACTTTTCAGGCACCTCA；

扩增D13S305的引物：

引物1：TGAGGACCTGTCGTTACGAATG，

引物2：GAGGAAATTTGTGGTTATAGAGCA；

扩增D21S1432的引物：

引物1：GTCAAGGTTTTCTTAGAGGGACAGA，

引物2：TGTCTTTGTGATCGTAAATACTTAAT；

扩增DXYS22的引物：

引物1：GGAAAGAAAAGGAAAGCAAGGG，

引物2：TACTTGAGACTTGGTGGGCT；

扩增D21S11的引物：

引物1：GTTCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGT，

引物2：ATGGTCTGTTATGGGACTTTTCTCA；

扩增D18S386的引物：

引物1：ATCACTTGGAACCCCCAGCCT，

引物2：CTTCCATGAAGTAGCTAAGCAGG；

扩增D13S634的引物：

引物1：GTCTTAGATATGATAATTTCCATTGCC，

引物2：ATTTGAATGTTGCCACACTACTGG；

扩增D18S1002的引物：

引物1：TTATAGATACTCATTTATACCCCAGG，

引物2：CCTTTCTCTTCAGGCATGGG；

扩增D13S258的引物：

引物1：GAGCAAGCAATTCAGTAAATACACG，

引物2：AAAGCAGCAAACAGAGAGAGTAGTG；

扩增DXS6809的引物：

引物1：AGTTGGGTTCACATTCTCAAACTAC，

引物2：CAATTTTGCTTTAGGCTGATGTGAG；

扩增D13S742的引物：

引物1：TCTTATTCCAGATAACTGGGCTAGGAA，

引物2：GAAGGATGCTGGTTATAAAACACTCTTC；

扩增DXS1187的引物：

引物1：TAGAGGGTGATATGGGGGAC，

引物2：CTTGTCAACACCTTTCCTCCA；

扩增D18S977的引物：

引物1：CTTGGCTTTGCATTTTCTAGCTGT，

引物2：GAACCACAGTGCTTGGCTATATC；

扩增SRY的引物：

引物1：ACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGA，

引物2：TTGAGTGTGTGGCTTTCGTACAGT。

2.根据权利要求1所述的一种检测染色体数目异常的扩增组合物，其特征在于，所述引物分为四组，第一组为：AMEL、D21S1270、DXYS267、D21S1412、D18S535和D13S305；第二组：D21S1432、DXYS22、D21S11、D18S386和D13S634；第三组：D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742和DXS1187；第四组：D18S977和SRY；每组引物带有不同的荧光标记物，四组引物分别在每一对引物的其中一条引物的5’末端带有荧光标记物。

3.根据权利要求2所述的一种检测染色体数目异常的扩增组合物，其特征在于，每组引物分别采用FAM、HEX、TAMRA、ROX中的任一种标记，且每组之间的标记色都不相同。

4.根据权利要求1所述的一种检测染色体数目异常的扩增组合物，其特征在于，所述扩增组合物还包括：2×Multiplex PCR Buffer、dNTP、MgCl₂、Multiplex PCR Enzyme Mix、Taq DNA聚合酶、模板DNA。

5.一种染色体数目异常的快速检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4中任意一项所述的扩增组合物。

6.根据权利要求5所述的一种染色体数目异常的快速检测试剂盒，其特征在于，所述扩增组合物的用量体积比为：