CN112760365B - 一种适用于产前无创的poag基因检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于产前无创POAG基因检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括针对下述11个SNP位点进行设计的特异性引物组和特异性荧光探针组：rs290487、rs10830963、rs17802111、rs7420812、rs3754648、rs10904012、rs12635144、rs2964283、rs3747926、rs59306779和rs6135530。本发明具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，可以同时最多检测、明确多个致病/易感基因的各种类型突变，因此本发明的探针组和试剂盒可应用于患病个体的分子遗传学诊断，同时还可用筛查POAG患者家属中的发病高危人群，以及进行相应的遗传咨询或产前干预提供参考。有助于及早进行治疗或干预，对于优生优育具有极其重要的价值，符合精准医疗的发展趋势。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种适用于产前无创的POAG基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
青光眼是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，病理性眼压升高是其主要危险因素。是现今世界第二大的致盲性眼病，位居不可逆盲目的第一位。据统计，2013 年全球有6.43亿人患有青光眼，到2020年大约有7.60亿人将患有青光眼，2040年青光眼患病人数将上升至11.18亿人。青光眼以高发病率及高致盲率，严重威胁人类的生活质量。
临床上通常根据前房角的解剖改变，青光眼可分为原发性闭角型青光眼(PACG)和原发性开角型青光眼(POAG)。原发性开角型青光眼是最常见的青光眼，其临床特征是虹膜角膜前角开放且正常，占所有青光眼病例的74％。POAG属于多基因病，具有遗传异质性、基因多效性、外显率降低及多基因联合效应等特征，然而流行病学调查发现30％-56％的低龄POAG患者具有阳性家族史，其一级亲属罹患率较普通人群高10倍，说明遗传因素在低龄POAG发病中具有非常突出的作用。目前临床明确诊断POAG，POAG的病程已不在早期，POAG是不可逆的致盲病，所以早期诊断、早期治疗具有重大意义。
遗传学权威数据库OMIM中POAG的基因座信息，其中MYOC/TIGR基因已在我国 POAG人群中得到证实，而其余基因或基因座有待更多研究。鉴于已知基因或基因座仅能解释我国一小部分低龄POAG的发病原因，而绝大部分低龄POAG的致病因素尚未可知，因此采用基于全基因组(包括外显子、内含子、调控区及修饰组等)变异的检测手段针对我国低龄POAG人群致病基因是该病的研究热点之一。
而针对现有技术的产前检测，又存在一定的检测危险。现有技术的产前检测主要是通过胎儿绒毛或羊膜穿刺等方式来检测胎儿是否携带有致病基因，这种方式的产前检测对于胎儿和孕妇来说都存在一定的风险，因此在临床上也限制了这种有创产前检测的方式。因此，寻找一种检测准确度高，对检测POAG检测方法及其设备迫在眉睫。随着现代分子生物学技术的发展，游离核苷酸被广泛研究并被应用为重要分子标记物。游离核酸又称为胞外核酸，是广泛存在于血浆、唾液、肺泡灌洗液、尿液、精液、胸腹水等体液以及细胞培养液中的细胞外游离DNA(cell free DNA，cfDNA)和RNA(cell free RNA，cfRNA)。研究发现，孕妇的血浆中含有胎儿来源cfDNA和cfRNA，使无创产前检测技术得到了快速的发展，避免了创伤性产前检测引起的流产、致畸风险。
多项研究已证实可以使用高度关联的生物标志物进行疾病风险，特别是遗传病风险的预测，但到目前为止POAG发病风险的精准预测在中国人群的胎儿风险预测方面准确性仍需要提升，故继续增加样本量发掘更多的风险位点，阐明遗传因素对POAG发病风险的贡献具有重要意义。
发明内容
针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的之一在于检测SNP位点特异性引物组在制备POAG基因检测试剂或试剂盒中的应用，目的之二在于提供一种适用于产前无创的POAG 基因检测试剂盒，通过检测与POAG遗传易感性密切相关的11个基因的SNP位点，综合分析判断，筛查出POAG遗传易感高危人群或胎儿，从而为及早进行干预和治疗提供重要依据。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
1、检测SNP位点特异性引物组在制备POAG基因检测试剂或试剂盒中的应用，所述SNP 位点为rs290487、rs10830963、rs17802111、rs7420812、rs3754648、rs10904012、rs12635144、 rs2964283、rs3747926、rs59306779和rs6135530中的一种或多种。
进一步，检测SNP位点特异性引物组包括具有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的引物对。
进一步，所述SNP位点为rs290487、rs10830963、rs17802111、rs7420812、rs3754648、 rs10904012、rs12635144、rs2964283、rs3747926、rs59306779和rs6135530中的一种或多种。
进一步，检测SNP位点的特异性荧光探针组包括具有SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:44所示核苷酸序列的Taqman探针对。
2、一种适用于产前无创的POAG基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括针对SNP位点进行设计的特异性引物组或/和特异性荧光探针组，所述SNP位点为rs290487、rs10830963、rs17802111、rs7420812、rs3754648、rs10904012、rs12635144、rs2964283、rs3747926、rs59306779 和rs6135530中的一个或多个。
进一步，所述特异性引物组包括具有SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的引物对。
进一步，所述特异性荧光探针组包括具有SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:44所示核苷酸序列的Taqman探针对。
进一步，所述试剂盒还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括Taq酶、dNTP 混合液、MgCl2溶液、缓冲液和稀释剂。
进一步，所述试剂盒检测反应时，PCR反应程序为：93-96℃1min；93-96℃30s，50-63℃ 30s，68-72℃1min，共10-25个循环。
进一步，所述试剂盒检测反应时，PCR反应体系包括：2μL 10X荧光定量PCR反应缓冲液；0.2μL 25mM dNTP混合液；1.2μL 25mM MgCl2溶液；0.05μL 5uni ts/μL的Taq DNA聚合酶；20μM特异性引物对，每条引物各0.225μL；20μM特异性荧光探针对，每条探针各0.25μL；去离子水10.65μL。
作为优选的，所述试剂盒还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括Taq 酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、缓冲液和稀释剂。
本发明的另一个目的在于提供一种适用于产前无创的POAG基因检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1：获取孕早期胎儿母亲的离体生物样品，提取游离DNA；
S2：分装检测液，其中所述检测液包括针对所述样品基因的特异性引物对，特异性荧光探针对以及混合液；
S3：添加所述样品基因至一检测液中形成一检测反应液，添加对应的质控品至另一检测液中形成一对照反应液；
S4：PCR扩增所述检测反应液以及所述对照反应液，分析并确定所述孕早期胎儿患POAG 的概率高低。
作为优选的，所述离体生物样品选自孕妇的全血、血浆或血清。
作为优选的，所述孕早期离体生物样本取自4-22孕周。
作为优选的，所述分析包含使用多基因遗传评分、弹性网络算法、随机森林算法、支持向量机算法和神经网络算法中的一种或多种预测模型将所述可测量特征与参考特征进行比较，获得风险得分或风险高低。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：本发明通过对2个大型低龄POAG家系和10 余个小型POAG家系全基因组测序样本进行多方面比对，鉴定到11个与POAG显著相关的遗传位点(P value<5.0×10-8)，并研发POAG致病位点的特异性引物组和Taqman基因分型探针，进一步开发适用于产前无创的POAG基因检测的试剂盒。本发明提供的用于检测 POAG的致病/易感基因的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点，可以同时最多检测、明确多个致病/易感基因的各种类型突变，因此本发明的探针组和试剂盒可应用于患病个体的分子遗传学诊断，同时还可用筛查POAG患者家属中的发病高危人群，以及进行相应的遗传咨询或产前干预提供参考。本发明的试剂盒可通过采集怀孕初期孕妇的外周血进行检测，操作简单有效。本发明试剂盒准确率高，预测精确，基本可精确到 80％左右，使得孕妇能够及早知道胎儿情况，有助于及早进行治疗或干预，对于优生优育具有极其重要的价值，符合精准医疗的发展趋势。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为M氏大型低龄POAG家系。
图2为L氏大型低龄POAG家系。
图3为双胞胎不同位点分布图。
图4为去掉双胞胎中表型正常的样本，两个家系一起分析的SNP分布图。
图5为所有样本分析筛选后的部分SNP结果展示。
图6为L氏去掉双胞胎中表型正常样本分析的部分SNP结果展示。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
以下实施例所有核酸序列由上海生物有限公司合成，并采用高效液相色谱进行纯化。所用试剂无特别说明均为普通市售。
在一些实施方式中，分离的生物标志物组包含一种、两种、三种或多种分离的生物标志物，所述分离的生物标志物包括下述11个SNP位点：rs290487、rs10830963、rs17802111、 rs7420812、rs3754648、rs10904012、rs12635144、rs2964283、rs3747926、rs59306779和rs6135530。
应注意除非内容中明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用的“一个”和“所述”包括多个对象。因此，例如，对"生物标志物"的提及包括两种或更多种生物标志物等的混合物。如本文所使用的，术语“孕早期”是指怀孕开始至怀孕第22周。本研究实施方案中所采用的孕早期为怀孕8-12周。本发明专利的使用范围包括(但不限于)孕早期，怀孕其他时期亦可采用本发明提供的生物标志物和方法来检测胎儿患POAG的概率。
如本文所使用的，术语“包含”、“包括”、“含有”及其任何变化旨在涵盖非排他的包括，如包含、包括或含有元素或元素列表的过程、方法、过程产物或物质组合物不仅包括这些成分，但是可以包括这些过程、方法、过程产物或物质组合物中未明确列出或固有的其他成分。
如本文所使用的，术语“组”是指包含一个或多个生物标志物的组合物，如阵列或集合。该术语还可以表示本文所述的一种或多种生物标志物的表达类型的谱图或指数。用于生物标志物组的生物标志物的数目基于生物标志物值的特定组合的灵敏度和特异性值。
如本文所使用的并且除非另作说明，术语“分离”通常描述以从其天然环境(例如，如果它是天然存在的，自然环境)中除去并因此通过人手从其自然状态改变的物质组合物。分离的蛋白质或核酸不同于其自然存在的方式。
术语“生物标志物”是指生物分子或生物分子基因型，其变化与样本特征有关。在整个发明公开中，术语“标志物”和“生物标志物”是可互换使用的。例如，本发明的生物标志物与POAG发生可能性提高有关。这些生物标志物包括(但不限于)变异位点、蛋白质变异。
本发明还提供了检测上述生物标志物的方法，其包括测定得自所述孕早期胎儿母亲的生物样品中所述11个SNP位点的生物标志物中的每一种的可测量特征，并分析所述可测量特征以确定所述所怀胎儿发生POAG的概率。所述方法包括芯片、试剂盒、捕获测序、全基因组测序产品。其中，所述芯片包括基因芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、捕获试剂盒，所述测序包括一代、二代等通过获取DNA序列的方式获取生物标志物可测量特征的方法，可测量特征包括生物标志物的基因型，但不限于基因型。
在一些实施方式中，本发明使用基因芯片来检测生物标志物的可测量特征，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测至少 2种分离的生物标志物组的可测量特征的探针。
生物芯片用于本发明的生物标志物的捕获和检测。在本领域中，多种基因生物芯片是已知的。这些包括(例如)通过Illumina、Affymatix、华联(中国台湾)、博奥生产的基因生物芯片。一般地，基因生物芯片包含具有表面的基底。将捕获试剂或吸附剂连接至基底表面。通常，所述表面包括多个可寻址地址，每个地址具有在此结合的捕获试剂。所述捕获试剂可以是生物分子，如核酸、探针，其以特异性方式捕获其他生物标志物。
生物样品中mRNA的测量可以用作生物样品中相应基因生物标志物的基因型检测的替代。因此，还可以通过检测适当的RNA来检测本文所述的任何生物标志物或生物标志物组。
在一些实施方式中，本发明使用基因检测试剂盒来检测一组生物标志物的可测量特征，所述基因检测试剂盒包含用于检测至少2种分离的生物标志物组的可测量特征的引物或芯片。
所述试剂盒可以包括用于检测生物标志物的一种或多种试剂，用于容纳分离自孕早期胎儿母亲的生物样品的容器。
所述测序产品试剂盒可以包含用于包含在所述试剂盒内的组合物的一个或多个容器。组合物可以处于液体形式或者可以是冷冻干燥的。
POAG的诊断标准：依据《中华眼科学》(第2版，李凤鸣主编，人民卫生出版社)，本研究低龄POAG诊断标准具体如下：a IOP>21mmHg；b青光眼特征性视盘损害和/或视网膜神经纤维层缺损；c青光眼特征性视野损害；d房角开放；e年龄≤30岁。
实施例1：易感基因的筛选
一、样本：在家系层面，收集到2个大型低龄POAG家系(见图1M氏和图2L氏)和10余个小型POAG家系，成功建立28例高龄患者的永生细胞株10和328例样本的基因组 DNA库。采用基于候选位点克隆结合连锁分析的策略，采用精细定位的方法将2个低龄POAG 家系的候选基因锁定在2p15-p16.3，其LODs可高达6.23811–13，该区域优于Suriyapperuma SP 等人报道的7个欧裔POAG家系致病基因的连锁区域，因范围更小(7.4Mb vs 8.3Mb)，为克隆和鉴定新的POAG致病基因奠定了良好基础。所有选取的样本均经本人签署知情及自愿协议，并经第三军医大学第三附属医院伦理委员会批准。本发明样本信息见表1，其挑选原则：患者间遗传距离最远，患者与非患者之间遗传距离最近。
表1
| 样本名 | L氏编号 | M氏编号 | 备注 | 测序深度 |
| TSY | 310 | - | 第一次测序 | 20X |
| LJ | 432 | - | 第一次测序 | 20X |
| LX | 434 | - | 第一次测序 | 20X |
| LQW | - | 402 | 第一次测序 | 20X |
| MZS | - | 417 | 第一次测序 | 20X |
| LYC | - | 518 | 第一次测序 | 20X |
| LXW | 410 | - | 第二次测序 | 30X |
| LDY | 413 | - | 第二次测序 | 30X |
| LF | 418 | - | 第二次测序 | 30X |
| YRY | 425 | - | 第二次测序 | 30X |
| LSH | 503 | - | 第二次测序 | 30X |
| LC | 510 | - | 第二次测序 | 30X |
全基因组样本测序数据下机信息如表2所示，测序仪器：Hiseq X Ten，测序方式：PE1 50，读长：150bp，所有的样本测序数据较好，满足条件1、整体比对率>95％，2、双端比对率>95％。
表2
所有的样本测序数据收集后，将样本分别进行全部样本分析和家系分开分析，全部样本分析时，考虑到同卵双胞胎表型不同，又分成全部样本分析(12个样本)、双胞胎分析、全部样本去掉双胞胎表型正常后分析(11个样本)和全部样本去掉双胞胎后分析(10个样本)三个方向分析；家系分开分析分成L氏所有样本分析、L氏去掉双胞胎表型正常后分析和M氏所有样本分析三个方向分析。
二、生物信息学分析流程及结果输出：
(1)SNP分析流程
①获取原始短序列；
②去除测序数据中的接头和低质量数据等；
③把短序列用SOAPaligner软件定位到人MHC3.6M基因组数据相应的位置上，所用到参数：soap2.20-a-b-t-v 3-l 42-s 63-m100-x 400，其中序列错配数为3，具体参数含义参考： http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html；
④统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；
⑤SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：soapsnp-i-d-o-r0.00005-e 0.0001-M-t-u-L-s-2–T，具体参数含义参考：http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html；
⑥过滤低质量值(质量值>＝20)和低覆盖度(深度>＝10)的SNP；
⑦利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；
⑧根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人MHC3.6M基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs；
(2)InDel分析流程
①把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人MH C3.6M基因组上，所用到参数：bwa aln-L-l 31-i 10-k2-t 7-e 40，具体参数含义参考：http:// bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；
②用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息；
③利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)。
在两个家系的全部样本分析中显性遗传模式筛选后剩余57个位点，用其染色体号和物理位置做Haploreg注释，该57个SNP中有13个在2号染色体上。进一步对双胞胎的样本进行分析，并确认双胞胎为同卵双胞胎，图3为双胞胎不同位点分布图。图4为去掉双胞胎中表型正常的样本，两个家系一起分析的SNP分布图，丢弃双胞胎中表型正常的样本，然后经过显性遗传模式过滤，得到1023个SNP位点，其中558个位点在2号染色体上。去掉双胞胎样本，两个家系一起分析(共10个样本)，根据显性遗传模型过滤，然后过千人数据库，m erged数据库后，还剩118个SNP，部分结果(全部SNP分析数据太过繁多，无法全部展示) 展示如图5所示。将两个家系分开分析，先L氏全部分析，再去掉双胞胎中表型正常样本分析，去掉双胞胎中正常样本后，经过显性遗传模式过滤得到6436个SNP位点，其中1567个位于2号染色体上，部分筛选结果如图6所示。继续对M氏样本分析，再综合将L氏和M 氏样本数据分析比较。
最后结果：本次分析总共鉴定到11个与POAG显著相关的遗传位点(P value<5.0×10-8)，分别为rs290487、rs10830963、rs17802111、rs7420812、rs3754648、rs10904012、rs12635144、 rs2964283、rs3747926、rs59306779和rs6135530。
三、特异性引物组和探针组的制备：
根据上述致病和/或易感基因的基因组序列，本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计并合成特异性引物组和特异性荧光探针组序列，本实施例中对合成的探针序列具体如表3所示。
表3
实施例2：基于机器学习预测POAG发生风险
模型构建：我们选取四种机器学习算法进行风险预测模型构建：弹性网络算法,随机森林算法，支持向量机算法和神经网络算法。利用R语言中机器学习的R包caret进行各个算法模型最优参数的确定。利用10×10交叉验证的方式，我们选取各个模型最优参数分别为： Elnet(alpha＝.1,gamma＝0.027)，RF(mtry＝2)，SVM(cost＝2,gamma＝0.8)，ANN(size＝3, decay＝0.1)。
模型比较：利用构建好的机器学习模型，我们将其应用于实施例1中的验证样本，并计算了受试者特征曲线(ROC)以及AUC值，用以评判各个模型之间的优劣。
最优模型：依据各个机器学习模型的预测准确度，依据ROC曲线计算最佳阈值。在最佳机器学习模型和最佳阈值之下，我们计算了其预测POAG发生风险的敏感度(Sensitivity)、特异性(Specificity)、阳性预测值(PPV)，阴性预测值(NPV)。
结果：ROC曲线以及AUC值表明随机森林算法(RF)在预测POAG发生风险中是最优的。以构建的随机森林为疾病预测模型，其PPV和NPV分别可以达到63.6％和77.0％。
实施例3：一种用于无创产前风险评估POAG的试剂盒。
(1)样品制备：
采集孕妇血液，提取血液中的胎儿游离DNA。
1)准备洗涤液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，配制洗涤液A和洗涤液B；
洗涤液A：取21ml洗涤液则加入9ml无水乙醇；若取42ml洗涤液则加入18ml无水乙醇。
洗涤液B：取9ml洗涤液则加入21ml无水乙醇；若取18ml洗涤液则加入42ml无水乙醇。
2)取1.5ml离心管，加入200ul所采集的孕妇血液样本，4ul DNA Carrier(DNA载体，购买厂家：常州百代生物科技有限公司)混合均匀，加入300ul裂解液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，以及20ul消化液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，振荡混匀，56℃水浴10分钟。
3)向2)中的离心管中加入1000ul无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响DNA的提取与后续实验。
4)将吸附柱放入收集管内，将760ul步骤S3中所得到的溶液转入吸附柱内，静置2分钟，将含有收集管的吸附柱在12,000rpm，4℃离心1分钟，拿出吸附柱，弃收集管内的废液，并将吸附柱重新放回收集管内，将剩余760ul溶液转移至吸附柱内，重复一次该步骤。
5)将重复步骤中收集管内所得到的液体除去，并将吸附柱再放回收集管内，加500ul洗涤液A至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液，将吸附柱放回收集管内。
6)加500ul洗涤液B至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液，并将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液。
7)取出吸附柱，放入新的1.5ml离心管内，加入30-50ul洗脱液，静置3分钟，12,000rpm 4℃离心2分钟，收集DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存。
(2)实时荧光定量q-PCR反应
实时荧光定量RT-PCR反应体系为：包含浓度为20ng/μL的DNA模板2μL、1μL 10X荧光定量PCR反应缓冲液0.1μL，25mM dNTP混合液、0.6μL 25mM MgCl2溶液、 0.025μL(5units/μL)Taq DNA聚合酶、20μM的正义引物和反义引物各0.225μL、10μM的带VIC 荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μL，去离子水5.325μL。
实时荧光定量RT-PCR反应程序为：在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为 50℃、2min，95℃、10min，进行60个循环的95℃、30s，60℃、1min。反应结束后在ABI9700型PCR仪上读取样品荧光量。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定检测样品的SNP位点的基因型。
3)结果判定：
检测结果均与Sanger测序结果一致，证明了本发明的taqman探针试剂盒检测POAG基因突变时具备特异性。对于taqman探针所显示的最终结果，通过每一个变异位点以及多个变异位点协同作用研究和大数据案例验证，结果发现，携带风险等位基因位点越多，则患有 POAG的风险越大，具体地，若受检样本同时携带11个位点的风险等位基因时，胎儿至少具有一个POAG的特征表现的风险在90％以上，至少具有2个POAG的风险在80％以上。例如：当受检样本同时携带8-10个风险等位基因时，则至少具有一个POAG特征表现的风险在80％以上；当受检样本同时携带5～7个风险等位基因时，则具有至少一个POAG特征表现的风险在60-80％；当受检样本同时携带3～4个风险等位基因时，则具有至少一个POAG特征表现的风险在40-60％；当受检样本携带1-2个风险等位基因时，则具有至少一个POAG的风险在15％以下。
对于孕妇，最早于怀孕8-12周便可进行该疾病的筛查，即通过本发明的试剂盒，使得采集怀孕8-12周孕妇的外周血便能评估判断胎儿具有POAG的可能性，若检测结果为阳性，则胎儿患有POAG的可能性极高，可进行提早干预。
在本实施例中，11组物探针组可在一次实时荧光定量RT-PCR中同时扩增，也可以分成多次进行扩增，具体可根据实验条件和实际需要而定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军特色医学中心
<120> 一种适用于产前无创POAG基因检测试剂盒
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgagtcttc caacccagta caaa 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggatcaaac acctttctca ttttc 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccccagtg atgctaagaa 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcagaatat tcccatcagg aa 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccacgtctt ctccaaatct g 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaagccttg ggaatataca gttga 25
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcccaccat aaattatagc agcata 26
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaatatcaa ctgttgctag tggca 25
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcccaccat aaattatagc agcata 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caaatatcaa ctgttgctag tggca 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctcagagcc atgtagaaaa agcta 25
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccggccttgc gtgttg 16
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
actcaagtcc tatcatagct acct 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaaagtgtg agatgagata atgca 25
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccctgttta ggacacaatt cttatag 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgagttggag gtgctttaat atgtatg 27
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tccaatttta ctaaaggata cagcactt 28
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaaatggact ttcatcctgg aaa 23
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgactttcct catgctccat tatg 24
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaccaaggca gaggcagtgt 20
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccaactgaaa cagtcaccta tcttaa 26
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tttgaccata atccctgttt ctca 24
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgacaccatg caaaa 15
<210> 24
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caccacgcaa aat 13
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcacaccatc tgct 14
<210> 26
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcacaccatc tcct 14
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtacagcag tgtaac 16
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tacagcagtg caacc 15
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cactccacca tatat 15
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cactccacca tatata 16
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cactcgcatt cacacg 16
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cactccacca tatata 16
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctggtctgtc agagga 16
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tggtctatca gaggaa 16
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acagtgtggt gtctctac 18
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agggacagtg cggtg 15
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cagaatgtct agaaatgta 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cagaatgtct agaaatata 19
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cattttcaat gttttatttt ta 22
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
attttcaatg ttttcttttt 20
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cccagtctct ctggaa 16
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccccagtctc tctaga 16
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
accttagtct tcccc 15
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
accttagtct ccccc 15
Claims (5)
1.检测SNP位点特异性引物组在制备POAG基因检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述SNP位点包括rs290487、rs10830963、rs17802111、rs7420812、rs3754648、rs10904012、rs12635144、rs2964283、rs3747926、rs59306779和rs6135530；检测SNP位点特异性引物组包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的引物对。
2.检测SNP位点的特异性荧光探针组在制备POAG基因检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述SNP位点包括rs290487、rs10830963、rs17802111、rs7420812、rs3754648、rs10904012、rs12635144、rs2964283、rs3747926、rs59306779和rs6135530；检测SNP位点的特异性荧光探针组包括SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:44所示核苷酸序列的Taqman探针对。
3.一种适用于产前无创的POAG基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对SNP位点进行设计的特异性引物组和特异性荧光探针组，所述SNP位点包括rs290487、rs10830963、rs17802111、rs7420812、rs3754648、rs10904012、rs12635144、rs2964283、rs3747926、rs59306779和rs6135530；所述特异性引物组包括SEQ ID NO:1～ SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的引物对；所述特异性荧光探针组包括SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:44所示核苷酸序列的Taqman探针对。
4.根据权利要求3所述适用于产前无创的POAG基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于DNA扩增所需要的添加剂；所述添加剂包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、缓冲液和稀释剂。
5.根据权利要求4所述适用于产前无创的POAG基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测反应时，PCR反应体系包括：20ng/μL 的DNA模板2μL ；1μL 10 ×荧光定量PCR反应缓冲液；0.1μL 25mM dNTP 混合液；0.6μL 25mM MgCl2溶液；0.025μL 5units/μL的Taq DNA聚合酶；20μM特异性引物对，每条引物各0.225μL；10μM特异性荧光探针对，每条探针各0.25μL；去离子水5.325μL。
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