CN110229876A - 一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒，其包括同时检测TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。本发明的有益效果是：本发明首次提出同时检测TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点的基因型，且这两个位点多态性与膳食因素存在交互作用，综合评估，能够有效预测妊娠糖尿病发病风险，从而可在孕前及早对妊娠糖尿病发病高危人群进行精准营养干预或采取其他治疗措施。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒。
背景技术
妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期发生或首次发现的糖耐量异常，是最常见的妊娠并发症之一。全球范围内妊娠期糖尿病发病率随着人群超重、肥胖发病率的增加呈逐年增加的趋势。2018年报道的中国孕妇的妊娠期糖尿病患病率已高达14.8％。随着我国生育政策的变化，高龄产妇的增加，我国孕妇妊娠期糖尿病的风险会进一步增加。妊娠期血糖异常会增加妊娠高血压、先兆子痫、早产、羊水过多等妊娠并发症以及巨大儿、难产等不良妊娠结局的风险，严重影响母婴健康。同时，妊娠期糖尿病对孕妇和后代也有长远影响，妊娠期糖尿病孕妇产后2型糖尿病的发生风险是普通人群的7倍，后代发生糖尿病、肥胖的几率也大大增加。妊娠期糖尿病高发病率将带来巨大的医疗资源和医疗费用的压力。
妊娠糖尿病是遗传和环境因素共同作用引起的临床综合征。其发病机制尚未完全阐明，目前认为妊娠期糖尿病除了与超重肥胖、膳食摄入、生活方式等环境因素有关外，研究者还注意到家族糖尿病史等家族遗传倾向与妊娠期糖尿病的反生密切相关。有研究者认为，妊娠期糖尿病可能与2型糖尿病具有相似的遗传变异，但是与2型糖尿病遗传易感的100多个遗传位点仅有不到20％发现与妊娠期糖尿病有关。
TCF7L2基因位于人类染色体10q25.2-10q25.3，由20个外显子构成，包含DNA结合机构域的转录因子，编码高迁移率组盒中的一个转录因子-T细胞转录因子4(Tcelltranscription fact 4,TCF-4)。研究表明TCF7L2可通过经典Wnt信号转导通路在胰岛β细胞增殖与分化、胰岛素分泌及维持血浆葡萄糖稳态等多方面其重要作用。在我国孕妇人群研究中，回园敕等研究中国北方地区无血缘关系的糖耐量受损孕妇158例、妊娠期糖尿病孕妇335例作为病例组，正常妊娠妇女647例作为对照组，发现TCF7L2rs290487位点SNP可能在妊娠期糖尿病中起重要作用，CC基因型是其发生妊娠期糖尿病的危险因素。这与Ye等对556名妊娠期糖尿病汉族孕妇与500名正常对照汉族孕妇的研究结果一致，发现每携带一个C等位基因，增加GDM风险1.68倍。中国人群的TCF7L2rs290487位点SNP的最小等位基因频率为0.3464。
MTNR1B基因位于人类染色体11q14.3，由4个外显子构成，编码褪黑激素受体MT2，该受体属于G蛋白偶联受体。褪黑素受体主要在脑内表达，在β细胞中也发现了MTNR1B，这提示MTNR1B的遗传变异，可能会影响胰腺的葡萄糖感应、胰岛素分泌以及葡萄糖耐量，MTNR1B的遗传变异可能引起胰岛素分泌失调和糖代谢紊乱，最终导致2型糖尿病或妊娠期糖尿病的发生。在我国孕妇人群研究中，祁娟等在南京地区110例孕妇的病例对照研究中发现MTNR1B基因的rs10830963位点SNP多态性与妊娠期糖尿病有关，GG基因型可能是妊娠期糖尿病的危险因素。邓志凤等在衢州178例孕妇的病例对照研究中发现MTNR1B基因的rs10830963位点SNP多态性与妊娠期糖尿病遗传易感性有关，GG基因型为妊娠期糖尿病发生的遗传风险因子。Liu等在湖北宜昌对674名妊娠期糖尿病汉族孕妇与690名正常对照孕妇的研究发现MTNR1B基因rs10830963位点多态性与妊娠期糖尿病孕妇遗传易感性有关，并在荟萃分析中得到证实，发现相比CC基因型，GG基因型可增加62％的GDM风险，OR为1.62(95％CI，1.34-1.94)。中国人群的MTNR1B基因rs10830963位点SNP的最小等位基因频率为0.4137。
现有技术中虽然有分别针对TCF7L2基因和MTNR1B基因的多态性位点与GDM的风险性关联的研究，但其只是针对单一基因的多态性位点进行的，其分别单独用于检测GDM遗传易感性的灵敏度不高，而且现有技术中也缺乏可用于检测GDM遗传易感性的试剂盒，无法及时筛查出GDM易感高危人群，故无法提前做好GDM预防措施。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，通过检测与GDM遗传易感性密切相关的两个基因的单核苷酸位点基因型，综合分析判断，筛查出GDM遗传易感高危人群，从而为及早进行精准营养干预和治疗提供重要依据。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒，其包括同时检测TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。
在上述技术方案的基础上，本发明还有如下进一步的具体或最佳选择。
具体的，所述特异性引物对是指针对TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这上述两个SNP位点的DNA片段的引物对。
具体的，所述特异性荧光探针对是指对TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出上述两个SNP位点基因型的Taqman探针对。
需要说明的是，设计这类引物对及探针对是本领域技术人员能够轻易完成的。荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这两对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估孕妇妊娠期糖尿病遗传易感性的2个SNP位点的探针均在本发明范围内。
优选的，所述特异性引物对包括具有SEQ ID NO:1和2所示核苷酸序列的引物对以及具有SEQ ID NO:3和4所示核苷酸序列的引物对。
优选的，所述特异性荧光探针对包括具有SEQ ID NO:5和6所示核苷酸序列的Taqman探针对以及具有SEQ ID NO:7和8所示核苷酸序列的Taqman探针对。
具体的，所述试剂盒的每一人份包括:2μL 10X荧光定量PCR反应缓冲液；0.2μL25mM dNTP混合液；1.2μL 25mM MgCl2溶液；0.05μL 5units/μL的Taq DNA聚合酶；20μM特异性引物对，每条引物各0.225μL；20μM特异性荧光探针对，每条探针各0.25μL；去离子水10.65μL；所述试剂盒的保存温度为-20℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
现有技术中缺乏针对妊娠糖尿病遗传易感性的试剂盒，而且针对单个SNP位点进行分析评估GDM发病风险的敏感性和特异性差，没有实用性，本发明首次提出同时检测TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点的基因型，且这两个多态性位点与膳食因素存在交互作用，综合评估，能够有效预测GDM发病风险，从而可在孕前及早对GDM发病高危人群进行精准营养干预或采取其他治疗措施。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明提供的技术方案做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
以下实施例中用到的药品若无特别说明则均为市售产品，用到的方法若无特别说明则均为常规方法。
实施例1
通过对335例GDM患者和410例正常孕妇进行基因分型，同时检测TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点组成的单体型在病例组和正常组的频率，结果发现同时携带TCF7L2rs290487位点C等位基因和MTNR1B基因rs10830963位点G等位基因的个体，GDM发病风险增加2-3倍(即两个基因位点同时出现与GDM相关的变异时，患病风险最高)。
实施例2
本发明提供的检测妊娠糖尿病遗传易感性的试剂盒的使用步骤如下：
步骤1：DNA模板的提取
用硅胶吸附法提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，其中，含有下列引物对和荧光探针对：
有义引物1：5’-GTGAGTCTTCCAACCCAGTACAAA-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物1：5’-TGGATCAAACACCTTTCTCATTTTC-3’(SEQ ID NO：2)
有义引物2：5’-GCCCCCAGTGATGCTAAGAA-3’(SEQ ID NO：3)
反义引物2：5’-GGCAGAATATTCCCATCAGGAA-3’(SEQ ID NO：4)
带VIC荧光基因探针1：TGACACCATGCAAAA(SEQ ID NO：5)
带FAM荧光基团探针1：CACCACGCAAAAT(SEQ ID NO：6)
带VIC荧光基因探针2：TCACACCATCTGCT(SEQ ID NO：7)
带FAM荧光基团探针2：TCACACCATCTCCT(SEQ ID NO：8)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基因探针1、带FAM荧光基团探针1特异地针对检测TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点多态性；
有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基因探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点多态性；
2个SNPs位点分别进行2次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10μL，包含浓度为20ng/μL的DNA模板2μL、1μL 10X荧光定量PCR反应缓冲液0.1μL 25mM dNTP混合液、0.6μL 25mM MgCL2溶液、0.025μL(5units/μL)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μL、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μL，去离子水5.325μL。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2min，95℃、10min，进行60个循环的95℃、30s，60℃、1min。反应结束后在ABI9700型PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3：SNP基因型分析
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定岁检测的SNP位点的基因型。
实施例3
进行孕妇妊娠期糖尿病遗传易感风险检测的服务
步骤1：DNA模板的提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提(也可以用血样和其他生物样品)。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的检测试剂盒，对被检测者基因组DNA的TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这2个SNP位点的基因型。
步骤3：妊娠期糖尿病遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具妊娠期糖尿病遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者妊娠期糖尿病遗传易感性的高低，并由医生向被检测者详细说明和解读遗传易感性分析报告单。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉正轩宇生物科技有限公司
<120> 一种检测妊娠糖尿病遗传易感性的试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgagtcttc caacccagta caaa 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggatcaaac acctttctca ttttc 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccccagtg atgctaagaa 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcagaatat tcccatcagg aa 22
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgacaccatg caaaa 15
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccacgcaa aat 13
<210> 7
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcacaccatc tgct 14
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcacaccatc tcct 14
Claims (6)
1.一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒，其特征在于，包括同时检测TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。
2.根据权利要求1所述的一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对是指针对TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这上述两个SNP位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性荧光探针对是指对TCF7L2基因上的rs290487号SNP位点和MTNR1B基因上的rs10830963号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出上述两个SNP位点基因型的Taqman探针对。
4.根据权利要求2所述的一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对包括具有SEQ ID NO:1和2所示核苷酸序列的引物对以及具有SEQ ID NO:3和4所示核苷酸序列的引物对。
5.根据权利要求3所述的一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性荧光探针对包括具有SEQ ID NO:5和6所示核苷酸序列的Taqman探针对以及具有SEQ ID NO:7和8所示核苷酸序列的Taqman探针对。
6.根据权利要求1至5任一项所述的一种检测妊娠期糖尿病遗传易感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的每一人份包括:2μL 10 X荧光定量PCR反应缓冲液；0.2μL 25mM dNTP混合液；1.2μL 25mM MgCl2溶液；0.05μL 5uni ts/μL的Taq DNA聚合酶；20μM特异性引物对，每条引物各0.225μL；20μM特异性荧光探针对，每条探针各0.25μL；去离子水10.65μL；所述试剂盒的保存温度为-20℃。
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| CN112760365A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-05-07 | 中国人民解放军陆军特色医学中心 | 一种适用于产前无创的poag基因检测试剂盒及其检测方法 |
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-
2019
- 2019-05-09 CN CN201910383683.6A patent/CN110229876A/zh active Pending
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