CN106191299A - 用于检测scn1a基因5’端非编码区突变的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

用于检测scn1a基因5’端非编码区突变的引物、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测SCN1A基因5'端非编码区突变的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及检测SCN1A基因5'端非编码区突变的方法。本发明针对SCN1A基因5'端非编码区序列，设计了能够高效特异性地扩增h1u‑1962T>G突变的引物，具有高度的特异性。本发明所呈现的测序峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，并且本发明设计的引物、试剂盒以及检测方法成本经济，特异性强。

Description

用于检测SCN1A基因5′端非编码区突变的引物、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于检测SCN1A基因5′端非编码区突变的引物、试剂盒和方法。
背景技术
癫痫是一组由不同病因引起的、脑部神经元高度同步化异常放电所导致的，以发作性、短暂性、刻板性、重复性为临床特征的综合征。它的患病率达到了4‰～7‰，占到了神经系统疾病的第二位，是除脑血管疾病以外最常见的疾病。癫痫的发病机制非常复杂，涉及到了一系列生理、生化、免疫或者遗传等方面的变化，多数癫痫属于症状性癫痫，即继发于明确的大脑损伤或其他疾病，另外约40％的癫痫无明显器质性改变，属于特发性癫痫，已普遍认为是由基因异常所导致。
与热性惊厥相关的癫痫称为癫痫伴热性惊厥附加症(epilepsy with antecedentfebrile seizures plus,EFS+)，最早由Ito.M等人于2006年提出，EFS+具有广泛的临床表型谱，包括热性惊厥附加症(febrile seizures plus,FS+)、FE+伴失神、肌阵挛或者失张力性等全面性癫痫伴热性惊厥附加症(generalized epilepsy with febrile seizuresplus,GEFS+)、FS+相关性颞叶癫痫、部分性癫痫伴热性惊厥附加症(partial epilepsywith febrile seizures plus,PEFS+)、婴儿严重肌阵挛癫痫(severe myoclonicepilepsy in infancy/Dravet Syndrome,SMEI/DS)、边缘型婴儿严重肌阵挛癫痫(Borderline SME,SMEB)、肌阵挛猝倒发作性癫痫(myoclonic-astaticepilepsy，MAE)和顽固性儿童强直阵挛性癫痫(intractable childhood epilepsies with generalizedtonic-clonic seizures,ICEGTC)。
EFS+是一类常染色体显性遗传的与热性惊厥相关的癫痫综合症，其患者约占癫痫患者总数的20％，表现为复杂的遗传模式，具有遗传异质性，其病因复杂。目前为止，与之相关的基因包括SCN1A、SCN2A、SCN9A、SCN1B、GABRG2、GABRD和STX1B，其中SCN1A、SCN2A、SCN9A、SCN1B分别编码电压门控Na离子通道α1，α2，α9，β1亚基；GABRG2、GABRD分别编码异五聚体配体门控Cl-离子通道γ-氨基丁酸(GABAA)受体γ2亚基和δ亚基，STX1B基因编码突触融合蛋白1B。
电压门控钠通道的分子结构是一种跨膜糖蛋白,当细胞膜去极化时,它选择性地对钠离子通透,而在静息状态下通常关闭。在中枢神经系统中对动作电位的起始和传播起着非常重要的作用，同时又是众多抗癫痫药物作用的关键靶点。钠通道通常由一个α型大亚基(260KD)和一个或多个β型小亚基(32～37KD)组成。α亚基是钠通道的功能性单位,由四个高度同源性的结构域(Ⅰ～Ⅳ)通过胞内连接环(loop)相连而成。每个结构域含有6个跨膜片段(S1～S6),其中S5和S6片段之间的连接环构成通道孔壁,其决定着通道离子选择性。S4片段富含正电荷残基,可充当通道的电压感受器(voltage sensor),当膜电位去极化时可使S4片段跨膜移动，激活通道,而当结构域上Ⅲ和Ⅳ之间的胞内连接环堵塞通道内口时,便导致通道关闭，被称为“失活闸门”。现已明确，编码α亚基的SCN1A和SCN2A基因都定位于2q24～q33，它们的基因产物均在中枢神经系统高度表达，SCN1A主要在大脑皮质和海马，SCN2A在神经元轴突处，这些部位均为癫痫发生的重要区域。SCN1A、SCN2A的突变可使钠通道失活延缓，从而在静息状态下产生持续性的钠内流,使膜电位慢性去极化，细胞兴奋性增高。不同基因位点的突变不仅产生多样的临床表型，而且影响了某些作用于该基因或某位点的抗癫痫药物的药理作用。SCN1A是目前在EFS+发现突变位点最多的基因，从FS+、GEFS+、到SME,临床表型即从预后良好的癫痫综合征到严重癫痫性脑病，都与SCN1A基因密切相关，其突变形式在不同类型的EFS+中也不同。迄今为止，在EFS+患者中发现涉及SCN1A基因编码区，有1012个杂合突变和染色体微缺失/重复(http://www.gzneurosci.com/scn1adatabase/index.php)。SCN1A基因编码区突变阴性的EFS+患者，可能存在非编码区的突变。我们前期报道3′端非编码区的点突变，可下调SCN1A转录活性导致EFS+。SCN1A 5′端序列包括3个非编码外显子(h1u,h2u,h3u)及7个非编码的保守区(Non-coding conserved regions，CNR)，h1u上游2.5kb基因片段(即h1u上游-2541bp至下游9bp)在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中能显著增强SCN1A基因的表达，具有启动子功能。日本学者报道SCN1A基因5′端序列的微小缺失导致严重EFS+表型DS。但目前未见SCN1A基因5′非编码区点突变的报道。
总之，热性惊厥相关性癫痫发作多样的临床表型、显著的遗传异质性和复杂的药物反应已成为癫痫专科医师、癫痫遗传学者以及遗传药理学者们共同关注及研究的热点。在表型较轻的EFS+患者中，利用常规测序筛查SCN1A基因5′非编码区新的突变，对其分子诊断、遗传咨询及用药指导具有重要的意义。因此，目前亟需一种快速、灵敏、成本经济的对SCN1A基因5′非编码区突变进行检测的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，从SCN1A基因5′非编码区序列出发，设计了检测SCN1A基因5′非编码区点突变的引物，并在此基础上设计了对SCN1A基因5′非编码区点突变进行检测的方法。本发明的方法快速、简便、准确、灵敏、直观，且实验成本低。
为此，本发明一方面提供了一种用于检测SCN1A基因5′端非编码区突变的引物组合，其由序列2和序列3所示的引物组成，所述SCN1A基因5′端非编码区突变为h1u-1962T>G。
在本发明优选的实施方案中，每条引物的浓度均为10μM。
本发明另一方面提供了一种用于检测SCN1A基因5′端非编码区突变的试剂盒，其包含本发明所述的引物组合，所述SCN1A基因5′端非编码区突变为h1u-1962T>G。
在本发明优选的实施方案中，每条引物的浓度均为10μM。
在本发明进一步优选的实施方案中，本发明的试剂盒还包含PCR扩增反应液和测序体系，测序体系更加优选包括PCR产物消化反应液、测序反应液、测序纯化液和变性剂。
本发明另一方面提供了本发明所述的引物组合在制备检测SCN1A基因5′端非编码区突变的试剂盒中的应用，所述SCN1A基因5′端非编码区突变为h1u-1962T>G。
本发明再一方面提供了本发明所述的引物组合，或者本发明所述的试剂盒在检测SCN1A基因5′端非编码区突变中的应用，所述SCN1A基因5′端非编码区突变为h1u-1962T>G。
本发明最后一方面提供了一种检测SCN1A基因5′端非编码区突变的方法，其包含以下步骤：
1、获取待测样品DNA。
2、采用本发明所述的引物组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行PCR扩增。
3、对PCR扩增产物进行Sanger测序。
4、得到测序峰图后，进行结果判读，判断待测样品中SCN1A基因5′端非编码区是否发生突变；
所述SCN1A基因5′端非编码区突变为h1u-1962T>G。
在本发明优选的实施方案中，步骤2中每条引物的浓度均为10μM。
在本发明进一步优选的实施方案中，步骤3中还包括测序反应后进行纯化以及进行变性处理的步骤。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
1、本发明采用常规测序检测SCN1A基因5′非编码区，发现非编码外显子h1u上游-1962位置杂合点突变即h1u-1962T>G，在110例正常对照组中均未发现该位点突变，且未在SNPs数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html)报道。通过构建突变质粒，利用双荧光素酶活性测定，发现该突变在SH-SY5Y细胞中，可以显著降低SCN1A基因的转录活性，携带该突变的患者，表型为轻型的部分性癫痫伴热性惊厥(PEFS+)，服用奥卡西平加重癫痫发作。这一结果将会为PEFS+发病机制的研究奠定重要基础，也有可能为PEFS+患者治疗提供全新的理论依据，为开发有效的早期致病基因筛查和干预治疗措施提供科学依据。
2、本发明丰富了SCN1A基因的致病突变谱，对开展针对PEFS+的研究以及分子诊断具有重要意义。
3、本发明针对SCN1A基因5′非编码区，设计了能够高效特异性地扩增h1u-1962T>G突变的引物，具有高度的特异性。
4、本发明采用Sanger测序法，可检测SCN1A基因5′非编码区突变，将测得的序列与标准序列进行比对，不仅可以检测是否存在h1u-1962T>G突变，还可以用于发现新的突变。
综上所述，本发明所呈现的测序峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，并且本发明设计的引物、试剂盒以及检测方法成本经济，特异性强。
附图说明
图1：PEFS+家系及测序图。
A：PEFS+家系图。其中，空白圆形：正常女性；空白方形：正常男性；二分之一阴影圆形：有PEFS+女性患者；箭头所示为家族先证者。
B：PEFS+家系内患者与正常对照测序峰图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：对一个中国汉族PEFS+家庭进行SCN1A基因5′非编码区测序分析
1、受试人群
本实施例采用Sanger测序技术，针对一个中国汉族PEFS+家庭进行测序。父母无病，女儿为PEFS+患者，17岁。在2岁发烧时出现第一次热性惊厥(温度，38.5℃)。每年出现热性惊厥约两次，最后一次热性惊厥发生在7岁一个月，患者期间未服用任何抗癫痫药物。7岁9个月时第一次出现无热惊厥，开始出现为复杂部分惊厥(CPS)，每天超过10次，服用奥卡西平(OXC)(8mg/kg/d)后，患者病情逐渐恶化，停用奥卡西平5天后，病情得到缓解。从九岁开始，联合服用妥泰(2mg/kg/d)和丙戊酸(VPA)(15mg/kg/d)，CPS发作为每年2-3次。服用VPA20mg/kg/d和TPM3mg/kg/d，五年五个月未发作。
2、样本采集
PEFS+家庭包含3名成员，其中患者1名(参见附图1A)。所有受试人群，每个样本采集外周血样品2ml，加入EDTA抗凝，-80℃保存。
3、实验技术流程
(1)DNA提取
使用Quickgene DNA抽提试剂盒及配套的Quickgene-610LDNA提取机提取人外周血白细胞DNA，步骤按操作说明进行。具体步骤如下：
A、向15ml离心管加入300μl蛋白酶(EDB)、2ml人外周血标本、2.5mL裂解缓冲液(Lysis Buffer,LDB)；
B、上下颠倒混匀10-15次；
C、漩涡混合器2500rpm/分×15秒；
D、56℃水浴5分钟；
E、加入无水乙醇2.5mL；
F、上下颠倒混匀10-15次；
G、漩涡混合器2500rpm/分×15秒；
H、将混合物倒入Quickgene 20ml纯化柱管；
I、第一次运行“DNA WHOLE BLOOD”模式，第二次运行“ISOLATE A”模式，可得两管所需的人外周血白细胞DNA；
J、充分混匀后采用分光光度计测定DNA的浓度和OD值；所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，DNA浓度不少于50ng/ul，总量不少于10μg。
K、置于-20℃冰箱保存。
(2)引物设计及PCR反应
参考人类ensemble GRCh37基因组数据库，采用Primer5.0设计得到SCN1A基因5′非编码区序列特异性引物，具体参见表1。
表1：引物序列
于96孔反应板中，分别按照表2配制各基因组DNA样本的PCR反应体系，并进行PCR反应。
表2：PCR扩增体系(总体系50ul)
于ABI9700热循环仪上，采用以下反应条件进行PCR反应：第一阶段，95℃预变性5min。第二阶段，变性温度95℃，30s；退火温度60℃，30s；延伸温度72℃，30s；循环33次。第三阶段，72℃，10min。第四阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
(3)Sanger测序
PCR扩增的片段使用ABI3730(Applied Biosystems,Foster City,CA)遗传分析仪，采用ABI BigDye Terminator cycle sequencing kit v3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行测序。
每个PCR反应体系(25μL)加入1μL消化酶，依靠Alkaline Phosphatase水解残余的dNTP，Exonuclease I水解单链核酸从而去除双链DNA以外的杂质。其反应条件参见表3。
表3：消化反应条件
得到PCR消化产物后，进行Sanger测序反应，其反应体系参见表4。
表4：Sanger测序反应体系
Sanger测序反应条件参见表5。
表5：Sanger测序反应条件
(4)测序反应后纯化
纯化操作前，需预冷离心机至4℃。此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能去除，以减少之后3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。
每5μL反应体系加入0.125mol/L EDTA-Na2溶液2μL，85％无水乙醇30μL，盖上硅胶垫，充分振荡3～5分钟，3000g，4℃，离心30分钟。EDTA作为金属离子螯合剂，能与测序PCR反应体系里的离子结合从而去除离子。
离心结束后，倒离心至185g时立即停止。每孔加入50μL 70％无水乙醇，DNA片段在70％乙醇中溶解度低，能通过离心沉淀下来。盖上硅胶垫，充分振荡3分钟，3000g，4℃，离心15分钟，离心结束后再次倒离心。然后将离心后产物放置避光通风处20分钟。
(5)变性处理
20分钟后，在生物安全柜中操作，每孔加入8μL HI-DI甲酰胺进行变性处理，变性反应程序参见表6。
表6：变性反应程序
变性结束并冷却离心后，上ABI3730测序仪测序。
(6)结果分析
得到测序峰图后，经严格改名后加载入软件Variant ReporterTM software v1.1，自动与Genbank中相关基因野生型序列比对，并同时有阴性对照进行控制，检测是否存在基因突变。基于测序结果(参见附图1B)，并与100名无h1u-1962T>G突变的正常对照相比，发现患者及其无病母亲携带h1u-1962T>G突变，存在外显不全。结合生物信息分析及体外实验，发现SCN1A基因5′非编码区的突变h1u-1962T>G变与PEFS+有关，该突变显著下调该基因的转录活性。
实施例2：制备用于检测SCN1A基因h1u-1962T>G突变的试剂盒
将合成的序列2和序列3所示的引物，PCR扩增反应液和测序体系进行分装后包装，组成本发明试剂盒。
其中，PCR扩增反应液包括，10×PCR Buffer、10mMdNTPs、Taq DNA Polymerase、ddH2O等。
测序体系包括，(1)PCR产物消化反应液：虾碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatas(Shrimp))和外切酶(Exonuclease I)按1:1进行混合；(2)测序反应液：ABIBigdyeTerminator cycle Sequencing Kit V3.1、5×Bigdye buffer、ddH2O；(3)测序纯化液：EDTA(125mM)；(4)85％无水乙醇；(5)70％无水乙醇；(6)HI-DI(高度去离子甲酰胺)。
利用上述试剂盒检测突变SCN1A基因h1u-1962T>G突变的具体步骤为：按照实施例1的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述SCN1A基因的外显子特异性引物进行PCR反应，反应体系和反应条件如实施例1所示，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后基于测序序列是否具有h1u-1962T>G突变，有效地检测本发明SCN1A基因突变的生物标志物在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患遗传性癫痫伴热性惊厥附加症。
通过测序报告可发现本发明所呈现的峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突变的分析难度，且本发明设计的引物、试剂盒与检测方法的检测成本经济，特异性强。

Claims (10)

1.一种用于检测SCN1A基因5'端非编码区突变的引物组合，其由序列2和序列3所示的引物组成，所述SCN1A基因5'端非编码区突变为h1u-1962T>G。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其中每条引物的浓度均为10μM。
3.一种用于检测SCN1A基因5'端非编码区突变的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的引物组合，所述SCN1A基因5'端非编码区突变为h1u-1962T>G。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中每条引物的浓度均为10μM。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其还包含PCR扩增反应液和测序体系，测序体系优选包括PCR产物消化反应液、测序反应液、测序纯化液和变性剂。
6.权利要求1或2所述的引物组合在制备检测SCN1A基因5'端非编码区突变的试剂盒中的应用，所述SCN1A基因5'端非编码区突变为h1u-1962T>G。
7.权利要求1或2所述的引物组合，或者权利要求3至5中任一项所述的试剂盒在检测SCN1A基因5'端非编码区突变中的应用，所述SCN1A基因5'端非编码区突变为h1u-1962T>G。
8.一种检测SCN1A基因5'端非编码区突变的方法，其包含以下步骤：
(1)获取待测样品DNA；
(2)采用权利要求1或2所述的引物组合，或采用权利要求3至5中任一项所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行Sanger测序；
(4)得到测序峰图后，进行结果判读，判断待测样品中SCN1A基因5'端非编码区是否发生突变；
所述SCN1A基因5'端非编码区突变为h1u-1962T>G。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(2)中每条引物的浓度均为10μM。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中步骤(3)中还包括测序反应后进行纯化以及进行变性处理的步骤。
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