CN110923312A

CN110923312A - 一种检测CYP1A2基因rs762551位点的实时荧光PCR方法及其引物探针组合

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Publication number: CN110923312A
Application number: CN201911367022.0A
Authority: CN
Inventors: 王会娟; 康星; 韩敏
Original assignee: Shaan Xi Lifegen Co Ltd
Current assignee: Shaanxi Lifegen Co Ltd; Shaan Xi Lifegen Co Ltd
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-03-27

Abstract

本发明属于基因诊断领域，公开了一种检测CYP1A2基因rs762551位点的实时荧光PCR方法及其引物探针组合。其中：上游引物FpG:5’‑GGTGAGCTCTGTGGGGC‑3’，上游引物FpG:5’‑GGTGAGCTCTGTGGGGA‑3’，下游引物Rp：5’‑GCTGAGGGTTGAGATGGAGAC‑3’，探针Probe：5’‑Cy5‑ACGCATGGTAGATGGAGCTTAG‑BHQ2‑3’。PCR反应完成后，可通过扩增曲线的有无并结合Ct值分析结果。采用本发明所提供的检测方法进行rs762551位点多态性的检测，具有操作简便、分辨率高、无污染、高通量等优点。

Description

一种检测CYP1A2基因rs762551位点的实时荧光PCR方法及其引物探针组合

技术领域

本发明属于药物基因组学和基因检测领域，具体涉及一种针对CYP1A2基因rs762551位点(CYP1A2*1F，-163C>A)的特异性引物及探针设计、以及检测方法。

背景技术

精神类疾病指严重的心理障碍，患者的认识、情感、意志、动作行为等心理活动均可出现持久的明显的异常，不能正常的生活。在我国精神疾病患者具有不可小觑的数量，截至2017年底，全国精神障碍患者达约2.4亿，总患病率高达17.5％；严重精神障碍患者超1600万人，发病率超过1％。并且这一数字还在逐年增长。目前我国的精神疾病以药物治疗为主，但是仍然处于试误法的阶段，药物疗效和不良反应也呈现出显著的个体差异。在精神分裂患者中，有30％～50％的患者对典型和非典型抗精神病药物的反应不佳。导致药物治疗出现巨大个体化差异的原因，除了传统上的病理、性别、年龄、身高、体重等方面外，遗传因素是影响药物反应差异的重要因素。近年来，药物基因组学得到了飞速发展，不断有研究提出应该通过对药物疗效和不良反应的相关基因检测指导药物的选择和剂量调整，达到个体化治疗的目的。

细胞色素P450 1A2(cytochrome P450 1A2，CYP1A2)是人体内一类重要的药物代谢酶，主要介导抗精神药物氯丙嗪、奥氮平、氯氮平、氟奋乃静在体内的生物转化过程。不同个体，由于其CYP1A2基因的多态性，会影响CYP1A2代谢酶的活性，从而影响抗精神药物在体内的清除，最终导致药物浓度不同，致使药效产生差异。CYP1A2*1F(-163C>A，rs762551)是中国人群中较为常见的变异基因。它可以导致CYP1A2酶活性增强，增加抗精神药物的代谢清除率，降低其血药浓度，可从而使抗精神药物在同等剂量下不能达到有效的治疗效果。rs76255等位基因对抗精神药物的应答及不良反应有影响，携带A等位基因的患者血清药物浓度降低，药物无应答风险增高；C等位基因携带者致使血药浓度升高，发生不良反应的风险增加。Laika B等(2010年)研究显示，相较于野生型基因携带者，CYP1A2*1F/*1F基因型携带者奥氮平药物的血药浓度显著降低。Eap CB等(2004年)研究发现CYP1A2*1F携带者对氯氮平无应答的风险增高(p<0.01)。此外，Tay JK等(2007年)研究表明，在使用氯丙嗪、氟奋乃静时，携带C等位基因的精神分裂症患者发生QT间期延长的风险增高(p＝0.007)。因此，开发一种简便、快速、灵敏的CYP1A2基因rs762551位点的基因分型方法，根据患者的基因型制定个体化的用药方案，对于提高精神分裂症患者的药物疗效，降低药物不良反应，具有重要的临床价值。

扩增阻滞突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)，又称为等位基因特异性聚合酶链反应(allele-specificpolymerase chain reaction，ASPCR)或特定等位基因的PCR扩增，是一种简单，快速且可靠的方法，用于检测涉及单碱基变化或小缺失的任何突变。ARMS基于序列特异性PCR引物的使用，这些引物仅在样品中包含目标等位基因时才允许扩增，而不会扩增非目标等位基因。在发生ARMS反应后，PCR产物的存在与否可诊断出目标等位基因的存在与否。

目前，针对CYP1A2 rs762551位点分型的基因检测技术以及商业化的试剂盒产品比较少见，因此开发一种快速简便可靠的CYP1A2 rs762551位点的基因分型技术非常具有非常重要的临床意义和价值。对于基因检测领域技术人员来说，目前应用基于TaqMan探针实时荧光PCR法，主要是在特异性和灵敏度方面存在困难；因为并不仅仅是简单地将引物与探针结合，而是需要针对CYP1A2 rs762551位点设计出一组特异性的引物和TaqMan探针，以高效快速准确的检测待测样本的基因型。

发明内容

本发明的目的是在现有的PCR技术基础上，提供一种灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行CYP1A2基因rs762551等位基因的检测体系。

为解决上述技术问题提出的一种技术方案：

本发明基于ARMS技术并结合TaqMan探针，确定检测rs762551等位基因的引物探针和反应条件的最佳组合，以从目标等位基因生成可检测的ARMS产物，同时最大程度地减少非目标等位基因的错误引物。该CYP1A2基因rs762551等位基因检测体系，主要包括一组特异性的引物和一条探针。

具体而言，本发明主要设计了以下特异性引物及探针组合：

上游引物FpG:5’-GGTGAGCTCTGTGGGGC-3’，

上游引物FpG:5’-GGTGAGCTCTGTGGGGA-3’，

下游引物Rp：5’-GCTGAGGGTTGAGATGGAGAC-3’，

探针Probe：5’-Cy5-ACGCATGGTAGATGGAGCTTAG-BHQ2-3’。

其中，Cy5为Cyaine5；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

基于上述特异性引物及探针组合，可制备相应的检测试剂盒；也可构建针对CYP1A2基因rs762551位点等位基因的检测模块(可结合计算机信息处理)乃至基因分型检测仪器。

其中，对于检测试剂盒，其中除了包含有上述特异性引物及探针组合外，还可以附有其应用基于TaqMan探针实时荧光PCR法的使用说明。

对于检测模块和基因分型检测仪器，可以利用计算机/控制技术，通过处理器加载存储器上的程序指令(例如配置控制算法、输入输出参数等)，来实现基于TaqMan探针实时荧光PCR法的执行。

本发明所提供的检测rs762551位点等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，包括以下步骤：

(1)设计目的基因的三条特异性引物，包括两条上游引物、一条下游引物以及一条特异性探针，即取上述特异性引物探针组合；

(2)提取待测样本的基因组DNA；

(3)配置反应体系

分别在两个反应管中构建各自的反应体系(用于Cy5通道和HEX通道进行双通道荧光采集)，两个反应体系的区别仅在于从所述特异性引物探针组合中选取了不同的上游引物(即一个反应管选择上游引物FpC，另一个反应管选择上游引物FpT)；其他内容均相同，包括被测样本的基因组DNA、特异性引物探针组合中的下游引物和探针、内参基因的引物及探针、5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)、Solution I(10×)、dNTP(2.5mM)、HotstartHiTaq DNApolymerase；两个反应体系各自进行混合(Mix)；

(4)PCR反应

将配置好的反应体系在实时荧光PCR仪ViiA^TM7上进行扩增，PCR完成后很久扩增曲线的有无判断被测样本的基因型。

质控样本和检测样本的制备：

(1)质控样本类型

选取经一代测序检测rs762551位点的样本，基因型为CC、CA、AA的样本分别作为质控样本。

(2)检测样本的准备

用DNA提取试剂盒提取血液样本或组织样本得到基因组DNA，并用紫外分光光度计NanoDrop检测DNA的浓度和质量；将质量合格的DNA稀释至50ng/μl或10ng/μl，备用。

为了取得最佳的效果，本发明还做了以下优化限定。

以单管反应体系10μl计，反应管中加入特异性的上游引物250nM，通用下游引物200nM，荧光探针100nM，内参基因上下游引物各150～200nM，探针100nM，被测样本基因组DNA10～50ng，HotstartHiTaq DNA polymerase 0.1375μl，5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)2μl、Solution I(10×)1μl、dNTP(2.5mM)1μl、ddH₂O补充至终体积10μL。

上述PCR反应参数设置如下：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火40sec；共计40个循环。

本发明与现有技术相比具有明显的优点：

1、特异性强。在本发明中，针对rs762551位点设计的特异性的ARMS引物和探针组合具有很高的特异性，二者共同保证了检测的特异性。

2、灵敏度高。在本发明中，使用的ARMS引物在其基础功能之外，并且结合探针，起到了阻碍其它基因型模板的扩增。同时只需10ng-20ng基因组DNA便可进行准确的rs762551位点等位基因检测。

3、节省时间和耗材

本发明在很大程度上节省时间和耗材，同时操作简单，再结合设计的反应程序，其检测过程只需要50min-1h，整个实验可以在2h内全部完成。

4、结果分析简单

本发明相对于传统的PCR检测方法，更容易进行实验结果分析：对每个样本只需观察其扩增曲线的有无并结合Ct值，就可判断其基因型。

附图说明

图1为rs762551位点基因型为CC的样本扩增结果。该样本中，内参基因ACTB正常扩增，且C反应体系中的Cy5通道呈现正常扩增，而在A反应体系的Cy5通道无扩增(或该样本在C反应体系和A反应体系中的FAM通道均有扩增，但Ct(A反应)-Ct(C反应)>3)，则表明该样本基因型为CC(互补链GG)纯合型。

图2为rs762551位点基因型为CA的样本扩增结果。该样本中内参基因ACTB正常扩增，且C反应体系和A反应体系中的Cy5通道均表现出正常扩增，两个反应Ct的值差的绝对值<3，则该样本为基因型为CA(互补链GT)杂合型。

图3为rs762551位点基因型为AA的样本扩增结果。该样本中，内参基因ACTB正常扩增，且A反应体系中的Cy5通道呈现正常扩增，而在C反应体系的Cy5通道无扩增(或该样本在C反应体系和A反应体系中的Cy5通道均有扩增，但Ct(C反应)-Ct(A反应)>3)，则表明该样本基因型为AA(互补链TT)纯合型。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进一步详细说明。

具体实施例：TaqMan探针实时荧光PCR法检测rs762551位点等位基因。

1、提取及稀释DNA样本

按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，分别测得104例布依族DNA样本浓度，然后使用PCR等级的H₂O将样本稀释至10ng/μl。

2、设计引物和探针

特异性的上游引物：C等位基因：5’-GGTGAGCTCTGTGGGGC-3’；A等位基因：5’-GGTGAGCTCTGTGGGGA-3’；

通用下游引物：5’-GCTGAGGGTTGAGATGGAGAC-3’；

探针：5’-Cy5-ACGCATGGTAGATGGAGCTTAG-BHQ2-3’。；

其中，Cy5为Cyaine5；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

委托上海某公司合成。

3、样本检测

在实时荧光PCR仪ViiA^TM7上，对于同一个样本，分别将两种特异性的上游引物，通用下游引物和探针，以及内参基因的引物和探针，分别利用Cy5通道和HEX通道进行双通道荧光采集，反应体系包括：上游引物(等位基因C或A)250nM，下游引物200nM，荧光探针100nM，内参基因上下游引物各150～200nM，探针100nM，被测样本基因组DNA10～50ng，HotstartHiTaq DNApolymerase(菲鹏生物科技有限公司)0.1375μl，5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)2μl、Solution I(10×)1μl、dNTP(2.5mM)1μl、ddH₂O补充至终体积10μL。

4、实验结果分析

内参基因作为质控，必须出现扩增曲线，代表DNA样本质量合格。

若C反应体系中的Cy5通道呈现正常扩增，而在A反应体系的Cy5通道无扩增(或该样本在C反应体系和A反应体系中的Cy5通道均有扩增，但Ct(A反应)-Ct(C反应)>3)，则表明该样本基因型为CC(互补链GG)纯合型，如图1所示；

若C反应体系和A反应体系中的Cy5通道均表现出正常扩增，两个反应Ct的值差的绝对值<3，则该样本为基因型为CA(互补链GT)杂合型，如图2所示；

若A反应体系中的Cy5通道呈现正常扩增，而在C反应体系的Cy5通道无扩增(或该样本在C反应体系和A反应体系中的Cy5通道均有扩增，但Ct(C反应)-Ct(A反应)>3)，则表明该样本基因型为AA(互补链TT)纯合型，如图3所示。

验证实验：100例样本进行Massary测序与rs762551位点等位基因TaqMan探针检测方法比较

随机抽取100例样本进行Massary测序，并且测序结果用Excel表格进行展示，以便对本发明实验结果进行复核。将Massary测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1)，发现两者之间的阴、阳性符合率均为100％。

表1

本实施例在前期还准备了已知为CC、AA等位基因纯合型和CA杂合型的标准品，作为检测体系的阳性对照，进一步提高了待测样本rs762551位点等位基因纯合型或杂合型判断的准确度。

本实施例可适用于人体外周血全基因组DNA样本的rs762551等位基因的检测，对于提高抗精神药物的药物疗效，降低药物不良反应，制定个体化的治疗方案，具有重要的临床价值。

<110>陕西佰美基因股份有限公司

<120>一种检测CYP1A2基因rs762551位点的TaqMan探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合

<160>7

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400> 1

GGTGAGCTCTGTGGGGC

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

GGTGAGCTCTGTGGGGA

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

GCTGAGGGTTGAGATGGAGAC

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

ACGCATGGTAGATGGAGCTTAG

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

CAGCAGATGTGGATCAGCAAG

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

GCATTTGCGGTGGACGAT

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC

Claims

1.一种应用于检测CYP1A2基因rs762551位点等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR法的特异性引物探针组合，其特征在于，包括以下特异性的上游引物(ARMS)、通用下游引物和探针序列：

上游引物FpG:5’-GGTGAGCTCTGTGGGGC-3’；

上游引物FpG:5’-GGTGAGCTCTGTGGGGA-3’；

下游引物Rp：5’-GCTGAGGGTTGAGATGGAGAC-3’；

探针Probe：5’-Cy5-ACGCATGGTAGATGGAGCTTAG-BHQ2-3’；

其中，Cy5为Cyaine5；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

2.权利要求1所述的特异性引物探针组合在制备针对CYP1A2基因rs762551位点等位基因的检测试剂盒方面的用途。

3.权利要求1所述的特异性引物探针组合在构建针对CYP1A2基因rs762551位点等位基因的检测模块或基因分型检测仪器方面的用途。

4.一种检测CYP1A2基因rs762551位点等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤：

(1)取权利要求1所述特异性引物探针组合；

(2)提取待测样本的基因组DNA；

(3)配置反应体系

分别在两个反应管中构建各自的反应体系，两个反应体系的区别仅在于从所述特异性引物探针组合中选取了不同的上游引物；其他内容均相同，包括被测样本的基因组DNA、所述特异性引物探针组合中的下游引物和探针、内参基因的引物及探针、5×HS HiTaqBuffer(Mg²⁺Plus)、Solution I(10×)、dNTP、HotstartHiTaq DNA polymerase；两个反应体系各自进行混合(Mix)；

(4)PCR反应

将配置好的反应体系在实时荧光PCR仪ViiA^TM7上进行扩增，PCR完成后，根据扩增曲线的有无判断被测样本的基因型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

选择的内参基因为ACTB，设计的内参基因引物和探针为：

上游引物ACTB-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’；

下游引物ACTB-R：5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’；

探针ACTB-P：5’-HEX-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’；

其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

以单管反应体系10μl计，反应管中加入特异性的上游引物250nM，通用下游引物200nM，荧光探针100nM；内参基因上下游引物各150～200nM，探针100nM，被测样本基因组DNA10～50ng，HotstartHiTaq DNA polymerase 0.1375μl，5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)2μl、Solution I(10×)1μl、2.5mM dNTP 1μl、ddH₂O补充至终体积10μL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

PCR反应参数设置如下：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火40sec；共计40个循环。