CN110951864A

CN110951864A - 一种检测ANNK1基因rs1800497位点的实时荧光PCR方法及其引物探针组合

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Publication number: CN110951864A
Application number: CN201911367047.0A
Authority: CN
Inventors: 王会娟; 康星; 韩敏
Original assignee: Shaan Xi Lifegen Co Ltd
Current assignee: Shaanxi Lifegen Co Ltd; Shaan Xi Lifegen Co Ltd
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-04-03

Abstract

本发明属于基因诊断领域，公开了一种检测ANKK1基因rs1800497位点的实时荧光PCR方法及其引物探针组合。其中：上游引物FpC:5’‑AGCTGGGCGCCTGCCGC‑3’，上游引物FpT:5’‑AGCTGGGCGCCTGCCGT‑3’，下游引物Rp：5’‑GCAAATGTCCACGCCCGCA‑3’，探针Probe：5’‑FAM‑AGCACTTTGAGGATGGCTGTGT‑BHQ2‑3’。PCR反应完成后，可通过扩增曲线的有无并结合Ct值分析结果。本发明采用本发明所提供的检测方法进行rs1800497位点多态性的检测，具有操作简便、分辨率高、无污染、高通量等优点。

Description

一种检测ANNK1基因rs1800497位点的实时荧光PCR方法及其引物探针组合

技术领域

本发明属于药物基因组学和基因检测领域，具体涉及一种针对ANNK1基因rs1800497位点(ANNK1，c.2137G>A)等位基因的特异性引物及探针设计，以及检测方法。

背景技术

抑郁症是现代人常见的精神疾病，严重影响患者的心理健康和生命安全。在临床上，抑郁症的主要症状有情绪失落、闷闷不乐、记忆力下降等，严重的患者会有自杀行为。抑郁症患者可能用吸烟自我治疗，形成烟草依赖。但是在精神病状态时，一些幻觉妄想等精神症状能导致焦虑紧张抑郁等负性情绪，间接导致病人吸烟量增加。调查结果表明精神分裂症病人吸烟显著高于(可达80％以上)正常人群(30～35％)和一般精神障碍(35～54％)。虽然戒烟过程的实施比较复杂，但可以依靠戒烟药的帮助提高其戒断率。抗抑郁药安非他酮是近年进入戒烟药领域的新品种。1997年美国食品药品管理局(FDA)已批准安非他酮作为戒烟的一线治疗，非尼古丁戒烟的首选。其作用机制可能是安非他酮能较弱的阻断尼古丁受体，通过对患者中枢神经系统中的多巴胺及去甲肾上腺素的再摄取，从而促进相应功能的激发发挥戒烟作用，达到抗抑郁效果。

安非他酮在临床应用时发现其具有良好的帮助戒烟作用，然而戒烟效果却不尽相同。研究发现可能与遗传因素有关。多巴胺D2受体(DRD2)基因位于11q23.2，编码G蛋白偶联受体，其多态性Taq1A(c.2137G>A，rs1800497)位于DRD2基因3’-端非编码区(3-UTR)，虽然在既往的研究中“DRD2 Taq1A多态性”这种提法很常见，但是实际上Taq1A位于和DRD2基因邻近的ANKK1(Ankyfin repeat and kinase domain containing 1，锚蛋白重复和激酶域)基因，严格讲并非在DRD2基因上。Taq1A变体可能通过改变DRD2基因的功能，进而影响DRD2的合成。Taq1A基因多态性与尼古丁依赖以及安非他酮辅助戒烟的疗效之间的关联已经得到了证明。David等(2007年)征集722名欧洲成人吸烟志愿者接受10周安慰剂或安非他酮进行药物辅助戒烟治疗，研究发现在6个月和12个月随访时，与使用安慰剂的戒烟者相比，使用安非他酮携带Taq1 A2/A2基因型的吸烟者戒烟的比安慰剂高了3倍(35.2％vs.15.1％；OR＝3.25)，而在任何时间点，A1/A1或A1/A2基因型参与者中，安非他酮相对于安慰剂在戒烟结局方面均无明显益处。这些数据表明，安非他酮可能仅对具有DRD2Taq1 A2/A2基因型的吸烟者亚组有效。另外，Swan GE等(2005年)研究报道携带有A1基因型的女性戒烟者因发生药物毒副作用而停药的风险显著高于Taq1 A2/A2基因型戒烟者(OR＝1.91，P＜0.04)。因此，开发一种简便、快速、灵敏的ANKK1 rs1800497位点基因多态性的检测方法，对于确定戒烟者的遗传特征，以便预测戒烟者对于安非他酮的应答，制定个体化的治疗方案，具有重要的临床价值。

基于实时定量的TaqMan探针及ARMS(Amplification refractory mutationsystem)技术已广泛应用于基因多态性分型检测。首先ARMS技术即扩增阻滞突变系统，其基本原理是在引物的3’端倒数第二位引入一个与模板序列不匹配的碱基，若引物最末端的碱基也与模板序列不互补，则不能延伸；若引物最末端的碱基与模板链互补，则在末端只有一个碱基不互补的情况下，引物可以进行延伸，这样就可以大大增加引物的特异性。其次TaqMan探针在5’端标记荧光报告基团，3’端标记猝灭基团，只有当与目标模板特异性的结合后发出荧光。将ARMS技术和TaqMan探针结合的实时荧光PCR结合是目前最常用的基因分型方法，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、能实现多重反应、反应后不需要开盖避免了二次污染等诸多优点。

目前，针对ANKK1 rs1800497位点分型的基因检测技术以及商业化的试剂盒产品比较少见，因此开发一种快速简便可靠的ANKK1 rs1800497位点的基因分型技术非常具有非常重要的临床意义和价值。对于基因检测领域技术人员来说，目前应用基于TaqMan探针实时荧光PCR法，主要是在特异性和灵敏度方面存在困难；因为并不仅仅是简单地将引物与探针结合，而是需要针对ANKK1 rs1800497位点设计出一组特异性的引物和TaqMan探针，以高效快速准确的检测待测样本的基因型。

发明内容

本发明的目的是在现有的PCR技术基础上，提供一种更加简便、快速、高通量、特异性高的实时荧光PCR方法来检测人ANNK1基因rs1800497位点等位基因，以改善现有技术上所存在的缺陷；相应得出特异性引物及探针组合。

具体而言，本发明主要设计了以下特异性引物及探针组合：

上游引物FpC:5’-AGCTGGGCGCCTGCCGC-3’，

上游引物FpT:5’-AGCTGGGCGCCTGCCGT-3’，

下游引物Rp：5’-GCAAATGTCCACGCCCGCA-3’，

探针Probe：5’-FAM-AGCACTTTGAGGATGGCTGTGT-BHQ2-3’。

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

基于上述特异性引物及探针组合，可制备相应的检测试剂盒；也可构建针对ANNK1基因rs1800497位点等位基因的检测模块(可结合计算机信息处理)乃至基因分型检测仪器。

其中，对于检测试剂盒，其中除了包含有上述特异性引物及探针组合外，还可以附有其应用基于TaqMan探针实时荧光PCR法的使用说明。

对于检测模块和基因分型检测仪器，可以利用计算机/控制技术，通过处理器加载存储器上的程序指令(例如配置控制算法、输入输出参数等)，来实现基于TaqMan探针实时荧光PCR法的执行。

本发明所提供的检测rs1800497位点等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，包括以下步骤：

(1)设计目的基因的三条特异性引物，包括两条上游引物、一条下游引物以及一条特异性探针，即取上述特异性引物探针组合；

(2)提取待测样本的基因组DNA；

(3)配置反应体系

分别在两个反应管中构建各自的反应体系，两个反应体系的区别仅在于从所述特异性引物探针组合中选取了不同的上游引物(即一个反应管选择上游引物FpC，另一个反应管选择上游引物FpT)；其他内容均相同，包括被测样本的基因组DNA、特异性引物探针组合中的下游引物和探针、内参基因的引物及探针、5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)、SolutionI(10×)、dNTP(2.5mM)、HotstartHiTaq DNA polymerase；两个反应体系各自进行混合(Mix)；

(4)PCR反应

将配置好的反应体系在实时荧光PCR仪ViiA^TM7上进行扩增，PCR完成后很久扩增曲线的有无判断被测样本的基因型。

质控样本和检测样本的制备：

(1)质控样本类型

选取经一代测序检测rs1800497位点的样本，基因型为GG、GA、AA的样本分别作为质控样本。

(2)检测样本的准备

用DNA提取试剂盒提取血液样本或组织样本得到基因组DNA，并用紫外分光光度计NanoDrop检测DNA的浓度和质量；将质量合格的DNA稀释至50ng/μl或10ng/μl，备用。

为了取得最佳的效果，本发明还做了以下优化限定。

以单管反应体系10μl计，反应管中加入特异性的上游引物200～250nM，通用下游引物200nM，荧光探针100nM，内参基因上下游引物各150～200nM，探针100nM，被测样本基因组DNA10～50ng，HotstartHiTaq DNA polymerase 0.1375μl，5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)2μl、Solution I(10×)1μl、dNTP(2.5mM)1μl、ddH₂O补充至终体积10μL。

上述PCR反应参数设置如下：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火40sec；共计40个循环。

本发明与现有技术方法方法相比具有明显的优点：

1、特异性强。在本发明中，针对rs1800497位点设计的特异性的ARMS引物和探针组合具有很高的特异性，保证了模板的特异性扩增。

2、灵敏度高。在本发明中，使用的ARMS引物在其基础功能之外，并且结合探针，起到了阻碍其它基因型模板的扩增。同时只需10ng-20ng基因组DNA便可进行准确的rs1800497位点等位基因检测。

3、节省时间和耗材

本发明在很大程度上节省时间和耗材，同时操作简单，再结合设计的反应程序，其检测过程只需要50min-1h，整个实验可以在2h内全部完成。

4、高通量

使用本发明方法，结合当前仪器配置情况，可一次同时进行96例或384例样本的检测，进行高通量检测rs1800497位点等位基因检测，提高了检测效率。

5、结果分析简单

本发明相对于传统的PCR检测方法，更容易进行实验结果分析：对每个样本只需观察其扩增曲线的有无，就可判断其基因型。

附图说明

图1为rs1800497位点基因型为GG的样本扩增结果。该样本中，内参基因ACTB正常扩增，且G反应体系中的FAM通道呈现正常扩增，而在A反应体系的FAM通道无扩增(或该样本在G反应体系和A反应体系中的FAM通道均有扩增，但Ct(A反应)-Ct(G反应)>3)，则表明该样本基因型为GG(互补链CC)纯合型。

图2为rs1800497位点基因型为GA的样本扩增结果。该样本中内参基因ACTB正常扩增，且G反应体系和A反应体系中的FAM通道均表现出正常扩增，两个反应Ct的值差的绝对值<3，则该样本为基因型为GA(互补链CT)杂合型。

图3为rs1800497位点基因型为AA的样本扩增结果。该样本中，内参基因ACTB正常扩增，且A反应体系中的FAM通道呈现正常扩增，而在G反应体系的FAM通道无扩增(或该样本在G反应体系和A反应体系中的FAM通道均有扩增，但Ct(G反应)-Ct(A反应)>3)，则表明该样本基因型为AA(互补链TT)纯合型。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进一步详细说明。

具体实施例：TaqMan探针实时荧光PCR法检测rs1800497位点等位基因。

1、提取及稀释DNA样本

按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，分别测得104例布依族DNA样本浓度，然后使用PCR等级的H₂O将样本稀释至10ng/μl。

2、设计引物和探针

特异性的上游引物：G等位基因：5’-AGCTGGGCGCCTGCCGC-3’；A等位基因：

5’-AGCTGGGCGCCTGCCGT-3’；

通用下游引物：5’-GCAAATGTCCACGCCCGCA-3’；

探针：5’-FAM-AGCACTTTGAGGATGGCTGTGT-BHQ2-3’；

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

委托上海某公司合成。

3、样本检测

在实时荧光PCR仪ViiA^TM7上，对于同一个样本，分别将两种特异性的上游引物，通用下游引物和探针，以及内参基因的引物和探针，分别利用FAM通道和HEX通道进行双通道荧光采集，反应体系包括：上游引物(等位基因C或T)200～250nM，下游引物200nM，荧光探针100nM，内参基因上下游引物各150～200nM，探针100nM，被测样本基因组DNA10～50ng，HotstartHiTaq DNA polymerase(菲鹏生物科技有限公司)0.1375μl，5×HSHiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)2μl、Solution I(10×)1μl、dNTP(2.5mM)1μl、ddH₂O补充至终体积10μL。

4、实验结果分析

内参基因作为质控，必须出现扩增曲线，代表DNA样本质量合格。

若G反应体系中的FAM通道呈现正常扩增，而在A反应体系的FAM通道无扩增(或该样本在G反应体系和A反应体系中的FAM通道均有扩增，但Ct(A反应)-Ct(G反应)>3)，则表明该样本基因型为GG(互补链CC)纯合型；如图1所示；

若G反应体系和A反应体系中的FAM通道均表现出正常扩增，两个反应Ct的值差的绝对值<3，则该样本为基因型为GA(互补链CT)杂合型；如图2所示；

若A反应体系中的FAM通道呈现正常扩增，而在G反应体系的FAM通道无扩增(或该样本在G反应体系和A反应体系中的FAM通道均有扩增，但Ct(G反应)-Ct(A反应)>3)，则表明该样本基因型为AA(互补链TT)纯合型；如图3所示。

验证实验：100例样本进行Massary测序与rs1800497位点等位基因TaqMan探针检测方法比较

随机抽取100例样本进行Massary测序，并且测序结果用Excel表格进行展示，以便对本发明实验结果进行复核。将Massary测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1)，发现两者之间的阴、阳性符合率均为100％。

表1

本实施例在前期还准备了已知为GG、AA等位基因纯合型和GA杂合型的标准品，作为检测体系的阳性对照，进一步提高了待测样本rs1800497位点等位基因纯合型或杂合型判断的准确度。

本实施例可适用于人体外周血全基因组DNA样本的rs1800497等位基因的检测，对于提高安非他酮疗效具有着重要的指导意义，有利于rs1800497等位基因下指导的戒烟者对安非他酮的有效利用。

<110>陕西佰美基因股份有限公司

<120>一种检测ANKK1基因rs1800497位点的TaqMan探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合

<160>7

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400> 1

AGCTGGGCGCCTGCCGC

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

AGCTGGGCGCCTGCCGT

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

GCAAATGTCCACGCCCGCA

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

AGCACTTTGAGGATGGCTGTGT

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

CAGCAGATGTGGATCAGCAAG

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

GCATTTGCGGTGGACGAT

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC

Claims

1.一种应用于检测ANNK1基因rs1800497位点等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR法的特异性引物探针组合，其特征在于，包括以下特异性的上游引物(ARMS)、通用下游引物和探针序列：

上游引物FpC:5’-AGCTGGGCGCCTGCCGC-3’，

上游引物FpT:5’-AGCTGGGCGCCTGCCGT-3’，

下游引物Rp：5’-GCAAATGTCCACGCCCGCA-3’，

探针Probe：5’-FAM-AGCACTTTGAGGATGGCTGTGT-BHQ2-3’，

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

2.权利要求1所述的特异性引物探针组合在制备针对ANNK1基因rs1800497位点等位基因的检测试剂盒方面的用途。

3.权利要求1所述的特异性引物探针组合在构建针对ANNK1基因rs1800497位点等位基因的检测模块或基因分型检测仪器方面的用途。

4.一种检测ANNK1基因rs1800497位点等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的，包括以下步骤：

(1)取权利要求1所述特异性引物探针组合；

(2)提取待测样本的基因组DNA；

(3)配置反应体系

分别在两个反应管中构建各自的反应体系，两个反应体系的区别仅在于从所述特异性引物探针组合中选取了不同的上游引物；其他内容均相同，包括被测样本的基因组DNA、所述特异性引物探针组合中的下游引物和探针、内参基因的引物及探针、5×HS HiTaqBuffer(Mg²⁺Plus)、Solution I(10×)、dNTP、HotstartHiTaq DNA polymerase；两个反应体系各自进行混合(Mix)；

(4)PCR反应

将配置好的反应体系在实时荧光PCR仪ViiA^TM7上进行扩增，PCR完成后，根据扩增曲线的有无判断被测样本的基因型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

选择的内参基因为ACTB，设计的内参基因引物和探针为：

上游引物ACTB-F:5’-CAGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’；

下游引物ACTB-R：5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’；

探针ACTB-P：5’-HEX-AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC-BHQ2-3’；

其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

以单管反应体系10μl计，反应管中加入特异性的上游引物200～250nM，通用下游引物200nM，荧光探针100nM；内参基因上下游引物各150～200nM，探针100nM，被测样本基因组DNA10～50ng，HotstartHiTaq DNA polymerase 0.1375μl，5×HS HiTaq Buffer(Mg²⁺Plus)2μl、Solution I(10×)1μl、2.5mM dNTP1μl、ddH₂O补充至终体积10μL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

PCR反应参数设置如下：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火40sec；共计40个循环。