CN106868173A - 一种TaqMan‑MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物及其应用 - Google Patents

一种TaqMan‑MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种TaqMan‑MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物，包括如下核酸序列：扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物对和检测用的TaqMan‑MGB探针。本发明还公开了上述引物和探针在检测扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的应用。本发明可以快速检测ADH1B基因rs1229984位点多态性，结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理，PCR扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了PCR产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。

Description

一种TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物及 其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物及其应用。
背景技术
酒精(乙醇)代谢相关基因是分子进化和群体遗传学研究的热点之一。酒精一般通过口腔、食管、胃、肠粘膜等吸收到体内的各种组织器官中，并于5分钟即可出现于血液中，待到30-60分钟时，血液中的酒精浓度就可以达到最高点。酒精在人体内代谢缓慢，绝大多的酒精主要在肝脏中代谢，且与ADH1B相关。ADH1B基因编码乙醇脱氢酶1B，能够把乙醇迅速降解为乙醛，乙醇脱氢酶是人体内重要的代谢酶，它与乙醛脱氢酶(ALDH2)构成了乙醇脱氢酶系统，参与体内乙醇代谢。其中，ADH1B基因在编码48位置发生了从精氨酸(ADH1B*1，Arg)到组氨酸(ADH1B*2，His)的非同义替换。具有该突变的ADH1B活性大为增强，使得摄入的酒精迅速转化成乙醛，容易导致酗酒。同时，携带ADH1B*1基因型者，上消化道肿瘤高风险。携带ADH1B*2基因型，易产生酒精依赖、酒精中毒；与早发冠心病也有一定关系。因此检测ADH1B具有重要意义：(1)揭示个体酒精代谢能力的不同：不同的基因型对酒精的耐受不同。(2)健康风险提示：提示受检者避免对酒精产生依赖，降低上消化道肿瘤的发生风险。
Taqman探针法可用于基因荧光定量分析、甲基化检测、SNP分型、miRNA定量分析等。Taqman探针法SNP分型技术的核心就是特异性的MGB探针技术，已证实的Taqman探针，3’段结合MGB技术，能更好的进行等位基因的区分。MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验。这种超强的稳定性可使短至13个碱基的探针提高错配的辨别力，并为困难多变的序列设计提供更高的灵活性。所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团(NFQ)，它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。其具体方法是：针对同一SNP位点的不同基因型设计两条不同的TaqMan-MGB探针，把它们同时加入到PCR反应体系中，只有与靶序列完全匹配的探针才能被水解并释放出荧光信号。两条探针分别标记不同的荧光基团，分别用实时荧光定量PCR仪中对应的荧光检测通道检测荧光信号。某种基因型对应的荧光探针能够释放荧光信号，说明在原始DNA样本中含有该种基因型。如果只有一条探针能释放荧光信号，那么检测到SNP位点上是纯合子，如果两条探针都有荧光信号，那么在该SNP位点上是杂合子。该方法可以直接在实验结果中读出每个样本中SNP的基因型，不需要再对序列进行分析，具有直观性。该技术不仅实现了对核酸特异性扩增的实时监测，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物。
本发明还要解决的技术问题是提供上述引物在检测人类ADH1B基因多态性中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物，包括如下核酸序列：
(1)扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物对，其核苷酸序列SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示；
(2)用于检测ADH1B基因rs1229984多态性位点的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：4所示，其中SEQ ID NO.：3在5末端标记Fam信号，SEQ ID NO.：4在5末端标记VIC信号；
上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。
上述TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物在检测ADH1B基因多态性中的应用在本发明的保护范围之内。
一种TaqMan-MGB探针法用于检测人类ADH1B基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
作为优选，该试剂盒包括2x PCR反应混合液，阳性标准品。
所述2x PCR反应混合液的配方如下：10mM Tris-HCL、2mM MgCl2、50mM KCL、0.2mMdNTPs、2U/μL Taq DNA聚合酶。
所述阳性标准品为GG基因型质粒和AA基因型质粒，其中，GG基因型质粒的插入序列如SEQ ID NO.：5所示，AA基因型质粒的插入序列如SEQ ID NO.：6所示。
一种TaqMan-MGB探针法用于检测人类ADH1B基因多态性的方法，包括如下步骤：
(1)提取人外周血基因组DNA；
(2)分别以提取的人外周血基因组DNA和阳性标准品为模板、权利要求1和2中的引物、探针、PCR反应混合液，进行实时荧光定量PCR反应；
(3)根据检测到的荧光信号值对rs1229984位点进行基因型判定。
步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应的扩增体系为：总体积20μL，2x PCR反应混合液10uL，SEQ ID NO.：1 0.2uM，SEQ ID NO.：2，0.2uM，SEQ ID NO.：1 0.2uM，SEQ ID NO.：10.2uM，模板DNA 50ng。
步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，40个循环。
有益效果：
本发明提供了一种TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物和试剂盒，采用TaqMan-MGB探针法实现了对ADH1B基因rs1229984位点进行快速、简单的检测。本发明检测结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理，PCR扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了PCR产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。
附图说明
图1为10例标本的检测结果图示。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
步骤1：DNA提取
取200μL外周血，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自杭州新捷生物科技有限公司)，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：定量PCR扩增和检测
(1)扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物对，其核苷酸序列SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示；
(2)用于检测ADH1B基因rs1229984多态性位点的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：4所示，其中SEQ ID NO.：3在5末端标记Fam信号-，SEQ IDNO.：4在5末端标记VIC信号。
在96孔板中，配制如下反应体系：2x PCR反应混合液10μL，SEQ ID NO.：1 0.2μM，SEQ ID NO.：2 0.2μM，SEQ ID NO.：3 0.2μM，SEQ ID NO.：4 0.2μM，模板DNA 50ng，加水补足至总体积20μL，同时设立阳性标准品和阴性对照。
所述2x PCR反应混合液的配方如下：10mM Tris-HCL，2mM MgCl2，50mM KCL，0.2mMdNTPs，2U/μL Taq DNA聚合酶，在制备试剂盒是也可以将SEQ ID NO.：1～4所示的序列加入混合液中。实时荧光定量PCR反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，40个循环。阳性标准品为GG基因型质粒和AA基因型质粒，其中，GG基因型质粒的插入序列如SEQ ID NO.：5所示，AA基因型质粒的插入序列如SEQ ID NO.：6所示。
步骤3：结果分析反应结束后，应用仪器自带软件进行数据分析。根据扩增结果，对标本基因型进行判定，具体检测结果图见图1。
步骤4：结果统计
10例标本的基因型结果统计如下：
编号 结果 编号 结果
1001 A/A 1006 G/G
1002 A/G 1007 A/A
1003 A/A 1008 A/G
1004 A/G 1009 A/G
1005 A/A 1010 G/G
以上所述，是本发明较佳的实施例，并非本发明任何形式上或实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明的范围前提下，还可以对之做一些修改和改进，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 黑龙江迪安医学检验所有限公司
<120> 一种TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物及其应用
<130> SG20161222001
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增ADH1B基因 rs1229984多态性位点的上游引物
<400> 1
tctgaatctg aacagcttct ct 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增ADH1B基因 rs1229984多态性位点的下游引物
<400> 2
ggtcaccagg ttgccacta 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测ADH1B基因 rs1229984多态性位点的TaqMan-MGB探针
<400> 3
aggaatctgt cacacaga 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测ADH1B基因 rs1229984多态性位点的TaqMan-MGB探针
<400> 4
aggaatctgt cacgcaga 18
<210> 5
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GG基因型标准品质粒的插入序列
<400> 5
tctgaatctg aacagcttct ctttattctg tagatggtgg ctgtaggaat ctgtcgcaca 60
gatgaccacg tggttagtgg caacctggtg acc 93
<210> 6
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AA基因型标准品质粒的插入序列
<400> 6
tctgaatctg aacagcttct ctttattctg tagatggtgg ctgtaggaat ctgtcacaca 60
gatgaccacg tggttagtgg caacctggtg acc 93

Claims (8)

1.一种TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物，其特征在于，包括如下核酸序列：
(1)扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物对，其核苷酸序列SEQ ID NO.：1和SEQID NO.：2所示；
(2)用于检测ADH1B基因rs1229984多态性位点的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列SEQID NO.：3和SEQ ID NO.：4所示，其中SEQ ID NO.：3在5’末端标记Fam信号，SEQ ID NO.：4在5’末端标记VIC信号；
上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。
2.权利要求1所述的TaqMan-MGB探针法检测人类ADH1B基因多态性的引物在检测ADH1B基因多态性中的应用。
3.一种TaqMan-MGB探针法用于检测人类ADH1B基因多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的TaqMan-MGB探针法用于检测人类ADH1B基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括2x PCR反应混合液，阳性标准品。
5.根据权利要求4所述的TaqMan-MGB探针法用于检测人类ADH1B基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述2x PCR反应混合液的配方如下：10mM Tris-HCL、2mMMgCl2、50mM KCL、0.2mM dNTPs、2U/μL Taq DNA聚合酶。
6.一种TaqMan-MGB探针法用于检测人类ADH1B基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取人外周血基因组DNA；
(2)分别以提取的人外周血基因组DNA和阳性标准品为模板、权利要求1和2中的引物、探针、PCR反应混合液，进行实时荧光定量PCR反应；
(3)根据检测到的荧光信号值对rs1229984位点进行基因型判定。
7.根据权利要求5所述的TaqMan-MGB探针法用于检测人类ADH1B基因多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应的扩增体系为：总体积20μL，2x PCR反应混合液10uL，SEQ ID NO.：1 0.2uM，SEQ ID NO.：2，0.2uM，SEQ ID NO.：1 0.2uM，SEQ ID NO.：10.2uM，模板DNA 50ng。
8.根据权利要求5所述的TaqMan-MGB探针法用于检测人类ADH1B基因多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中，实时荧光定量PCR反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，40个循环。
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