CN106701918A - 一种rs8099917基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒 - Google Patents

一种rs8099917基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于rs8099917位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，本发明通过重新设计了引物和TaqMan‑MGB探针，优化反应体系，双组分热启动DNA聚合酶构成酶活自动调节系统、ROX Reference Dye可消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，从而实现准确、扩增效率高，灵敏度高、特异性好、重复性好、操作简便且检测用时更短，使该技术能够实现临床上的应用与推广。

Description

一种rs8099917基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地指一种基于rs8099917位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒。
背景技术
丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播。现有研究中表明人类IL-28B基因的rs8099917位点多态性与抗病毒治疗的疗效具有相关性。
目前，rs8099917位点基因多态性的鉴别方法有多种，主要采用基因测序、基因芯片、高分辨率溶解曲线(HRM)和酶切等方法，但多数操作繁杂、耗时较长、所需仪器设备昂贵、特异性较差，难以在普通医院开展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种IL28B基因rs8099917位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、操作简便、耗时短等特点，可高效地监测rs8099917的T和G等位基因。
为实现上述目的，本发明所设计的rs8099917基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，包括DNA提取液和双色荧光PCR反应液；
所述双色荧光PCR反应液包含以下组分：
(1)基于rs8099917位点的引物探针组
正向引物F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
T荧光探针S1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
G荧光探针S2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)PCR扩增体系
PCR 10×buffer、25mM的MgCl2、dNTPs含dUTP、双组分热启动DNA聚合酶、50×ROXReference Dye、RNase-Free ddH2O；
所述PCR 10×buffer内含100mM pH8.8的Tris-HCl、500mM的KCl、0.8％v/v的Nonidet；所述PCR 10×buffer不含有Mg2+；
所述双组分热启动DNA聚合酶为化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶。
优选地，上述试剂盒中各个引物及探针在扩增体系中的浓度如下：
优选地，上述试剂盒的荧光定量PCR扩增条件为95℃5min预热，95℃3s、60℃30s、25个循环，60℃开始收集荧光信号。
优选地，上述试剂盒中T荧光探针S1为MGB探针，其5'荧光为FAM；所述G荧光探针S2为MGB探针，其5'荧光为VIC。
本发明的有益效果：通过重新设计了引物和TaqMan-MGB探针，优化反应体系，双组分热启动DNA聚合酶构成酶活自动调节系统、ROX Reference Dye可消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，从而实现准确、扩增效率高，灵敏度高、特异性好、重复性好、操作简便且检测用时更短，使该技术能够实现临床上的应用与推广。
附图说明
图1为DNA测序法检测的IL28B基因rs8099917位点的测序结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种rs8099917位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒
一、试剂盒组成与配制
1)引物及探针组
基于rs8099917位点的引物探针组
正向引物F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
5'TGTTTTCCTTTCTGTGAGCA 3'；
反向引物R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
5'GTAAGACATAAAAAGCCAGCTA 3'；
T荧光探针S1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
5'FAM-TGAGCAATTTCACCC-NFQ 3'-MGB，FAM探针；
G荧光探针S2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
5'VIC-TGTGAGCAATGTCAC-NFQ 3'-MGB，VIC探针
上述引物及探针均委托上海生工生物人工合成。
2)DNA提取液
DNA提取液可以采用市售DNA提取试剂盒，也可以自行配制。
本实施例中DNA提取液配方：(1)3％明胶；(2)配制200mmol/L NaCl，100mmol/LTris-HCl；(3)10％SDS 3mg/ml蛋白酶K(临用前加入)；(4)pH7.8饱和酚；(5)无水乙醇；(6)70％乙醇；(7)RNase-Free ddH2O。
3)双色荧光PCR的反应体系如下：
试剂 终浓度或单位体积中含量
PCR 10×buffer 5μl
MgCl2 4mmol/L
dNTP(含dUTP) 0.48mmol/L
Taq DNA聚合酶 0.5U
正向引物F 1.5μl
反向引物R 1.5μl
T荧光探针S1 1.0μl
G荧光探针S2 1.0μl
DNA模板 5μl
ddH2O 加至50μl
总反应体积 50μl
使用上述试剂盒时，双色荧光PCR的反应程序为：95℃5min预热，95℃3s、60℃30s、25个循环，60℃开始收集荧光信号。
试验例1 DNA测序验证
1、将实施例1中的双色荧光PCR试剂盒，针对50例丙肝患者的全血样本DNA进行双色荧光PCR，结果见表1。
将上述稀释品利用双色荧光PCR的反应体系扩增，扩增条件为95℃5min预热，95℃3s、60℃30s、25个循环，60℃开始收集荧光信号。
表1 rs8099917位点SNP类型测试结果比较
2、设计测序引物对50份样本DNA的rs 8099917位点的3种基因型进行测序，与上述试剂盒检测结果一致。图1所示为DNA测序法检测的rs8099917位点的G/T和T/T型的两种基因型。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 一种rs8099917基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgttttcctt tctgtgagca 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtaagacata aaaagccagc ta 22
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgagcaattt caccc 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgtgagcaat gtcac 15

Claims (4)

1.一种rs8099917位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒包括DNA提取液和双色荧光PCR反应液；
所述双色荧光PCR反应液包含以下组分：
(1)基于rs8099917位点的引物探针组
正向引物F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
T荧光探针S1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
G荧光探针S2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)PCR反应体系
PCR 10×buffer、25mM的MgCl2、dNTPs含dUTP、双组分热启动DNA聚合酶、50×ROXReference Dye、RNase-Free ddH2O；
所述PCR 10×buffer内含100mM pH8.8的Tris-HCl、500mM的KCl、0.8％v/v的Nonidet；所述PCR 10×buffer不含有Mg2+；
所述双组分热启动DNA聚合酶为化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的rs8099917位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：
各个引物及探针在扩增体系中的浓度如下：
3.根据权利要求2所述的rs8099917位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的荧光定量PCR扩增条件为95℃5min预热，95℃3s、60℃30s、25个循环，60℃开始收集荧光信号。
4.根据权利要求1～3任一项所述的rs8099917位点基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述T荧光探针S1为MGB探针，其5'荧光为FAM；
所述G荧光探针S2为MGB探针，其5'荧光为VIC。
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