CN112852933A - 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112852933A CN112852933A CN202110228752.3A CN202110228752A CN112852933A CN 112852933 A CN112852933 A CN 112852933A CN 202110228752 A CN202110228752 A CN 202110228752A CN 112852933 A CN112852933 A CN 112852933A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cyp2c19
- probe
- mutant
- wild
- final concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 101150003340 CYP2C19 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 26
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 137
- 108010026925 Cytochrome P-450 CYP2C19 Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000019057 Cytochrome P-450 CYP2C19 Human genes 0.000 claims abstract 18
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 9
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 9
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 9
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 claims description 9
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 claims description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 9
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 claims description 9
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 dNTPs Proteins 0.000 claims description 6
- 229950007002 phosphocreatine Drugs 0.000 claims description 5
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 102100029363 Cytochrome P450 2C19 Human genes 0.000 description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 108010012052 cytochrome P-450 CYP2C subfamily Proteins 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 101150016096 17 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 2
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 2
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 2
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 2
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 2
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- WSEQXVZVJXJVFP-HXUWFJFHSA-N (R)-citalopram Chemical compound C1([C@@]2(C3=CC=C(C=C3CO2)C#N)CCCN(C)C)=CC=C(F)C=C1 WSEQXVZVJXJVFP-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 1
- SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-2-{[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfinyl}-1H-benzimidazole Chemical compound N=1C2=CC(OC)=CC=C2NC=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005552 B01AC04 - Clopidogrel Substances 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001653 citalopram Drugs 0.000 description 1
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 229960003009 clopidogrel Drugs 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 150000002243 furanoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001853 liver microsome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960000381 omeprazole Drugs 0.000 description 1
- 229960002790 phenytoin sodium Drugs 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- FJPYVLNWWICYDW-UHFFFAOYSA-M sodium;5,5-diphenylimidazolidin-1-ide-2,4-dione Chemical compound [Na+].O=C1[N-]C(=O)NC1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FJPYVLNWWICYDW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法；所述引物和探针组分为两组，A组为检测CYP2C19*2和CYP2C19*3的引物对、野生型探针和突变型探针；B组为检测CYP2C19*17的引物对、野生型探针和突变型探针；所述试剂盒包括含扩增反应试剂A的检测管、含扩增反应试剂B的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。
Description
技术领域
本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法。
背景技术
CYP2C19酶是人体重要的药物代谢酶，主要存在于肝微粒体中，目前已证实的由CYP2C19酶参与代谢并明显影响其临床应用的药物多达几十种，包括氯吡格雷、奥美拉唑、西酞普兰、苯妥英钠等。CYP2C19酶的编码基因为CYP2C19基因，位于人类10号染色体上。CYP2C19基因含有42个等位基因，CYP2C19基因的遗传变异导致CYP2C19酶活性的个体差异，使人群出现4种不同的代谢表型：快代谢型(RM，*1/*1)、中间代谢型(IM，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3)、慢代谢型(PM，*2/*2，*2/*3，*3/*3)、超快代谢型(UM，*17/*17)。其中，CYP2C19*1为野生型等位基因，其编码的酶具有正常活性；CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)编码的CYP2C19酶活性降低，是中国人群中存在的2种主要的等位基因，在中国人群的发生频率分别约为30％和8.9％；CYP2C19*17(rs12248560，c.-806C>T)编码的CYP2C19酶活性增强，在中国人群的发生频率约为0.7％。通过CYP2C19基因多态性检测，可将服药人群分为上述4类表型的代谢患者，从而用于相关药物的用药指导。
目前，针对CYP2C19基因多态性的检测方法很多，如荧光定量PCR法、限制性片段长度多态性分析法、直接测序、基因芯片等。但是这些方法基本上都操作复杂、检测周期长，且需要复杂的仪器设备、成本也较高。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平。锁核酸(LockedNucleic Acid，LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其结构中核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了扩增反应中DNA分子的稳定性和亲和力。研究发现，在错配位点修饰1-3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。LNA修饰的探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低的探针浓度，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。
本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)进行CYP2C19基因多态性检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的引物探针组，所述引物和探针组分为两组，A组为检测CYP2C19*2和CYP2C19*3的引物对、野生型探针和突变型探针；B组为检测CYP2C19*17的引物对、野生型探针和突变型探针；其中，A组的CYP2C19*2引物和探针序列为：
正向引物：5’-AGCATTACTCCTTGACCTGTTAAACATCCGTAG-3’；
反向引物：5’-CAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCT-3’；
野生型探针：
突变型探针：
A组的CYP2C19*3引物和探针序列为：
正向引物：5’-ATCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTC-3’；
反向引物：5’-CATGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGTATTCAA-3’；
野生型探针：
突变型探针：
B组CYP2C19*17的引物和探针序列为：
正向引物：5’-AGTTTCTCAAGCCCTTAGCACCAAATTCTCTG-3’；
反向引物：5’-GAACTGGGATTTGAGCTGAGGTCTTCTGATG-3’；
野生型探针：
突变型探针：
优选的，所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述猝灭基团修饰在THF 3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上。
优选的，所述荧光基团用FAM、HEX、ROX或CY5修饰，所述淬灭基团用BHQ1、BHQ2修饰。
优选的，所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
优选的，所述探针覆盖SNP位点，在探针的SNP位点上做锁核酸(LNA)修饰。
一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括含扩增反应试剂A的检测管、含扩增反应试剂B的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。
优选的，所述扩增反应试剂A包括CYP2C19*2上下游引物、CYP2C19*2野生型和突变型探针、CYP2C19*3上下游引物、CYP2C19*3野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
所述扩增反应试剂B包括CYP2C19*17上下游引物、CYP2C19*17野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。
优选的，所述阳性对照为CYP2C19*2野生型质粒和突变型质粒、CYP2C19*3野生型质粒和突变型质粒、CYP2C19*17野生型质粒和突变型质粒。
优选的，所述阴性对照为无菌双蒸水。
优选的，所述试剂盒可以检测的样品为人全血或外周血样本。
一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本DNA作为模板；
(2)设计用于CYP2C19基因多态性检测的引物对及探针；
(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的反应试剂进行RMA扩增反应；扩增反应条件为在实时恒温荧光检测器中39℃下扩增20分钟；
(4)检测结果判定：
对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。
有益效果：RMA反应可以在37～42℃进行，对仪器设备的要求不高，操作简单，在30min内即可得到结果；能够在两个反应管内同时检测三种突变位点，提高检测的简便性，降低检测成本；整个反应过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能；扩增反应试剂采用冻干工艺，提高试剂稳定性，降低运输成本；用锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变的检测特异性，比传统的DNA探针有更高的灵敏度，适用于基因分型检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 CYP2C19*2野生纯合型样本检测结果；
图2 CYP2C19*2突变纯合型样本检测结果；
图3 CYP2C19*2突变杂合型样本检测结果；
图4 CYP2C19*3野生纯合型样本检测结果；
图5 CYP2C19*3突变纯合型样本检测结果；
图6 CYP2C19*3突变杂合型样本检测结果；
图7 CYP2C19*17野生纯合型样本检测结果；
图8 CYP2C19*17突变纯合型样本检测结果；
图9 CYP2C19*17突变杂合型样本检测结果。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、引物和探针的设计
基于CYP2C19基因突变序列或其互补序列设计的LNA-RMA检测引物和探针如下表1所示；
表1 CYP2C19基因引物与探针序列
注：LNA修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示；*2野生型探针的荧光基团用FAM修饰；*2突变型探针的荧光基团用HEX修饰；*2野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ1修饰；*3野生型探针的荧光基团用ROX修饰；*3突变型探针的荧光基团用CY5修饰；*3野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ2修饰；*17野生型探针的荧光基团用FAM修饰；*17突变型探针的荧光基团用HEX修饰；*17野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ1修饰。
2、样本的提取
采用血液基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的DNA作为模板
3、RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有扩增反应试剂A的检测管中，混匀，并向检测管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀；将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有含有扩增反应试剂B的检测管中，混匀，并向检测管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀；将两个检测管在实时恒温荧光检测器中39℃扩增20分钟；
其中，所述扩增反应试剂A包括CYP2C19*2上下游引物、CYP2C19*2野生型和突变型探针、CYP2C19*3上下游引物、CYP2C19*3野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；
所述扩增反应试剂B包括CYP2C19*17上下游引物、CYP2C19*17野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；
所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；
所述阳性对照为CYP2C19*2野生型质粒和突变型质粒、CYP2C19*3野生型质粒和突变型质粒、CYP2C19*17野生型质粒和突变型质粒；
所述阴性对照为无菌双蒸水；
4、检测结果判定：
通过实时恒温荧光检测器上显示的荧光信号判断所检测的CYP2C19基因多态性位点。图1显示该样本为CYP2C19*2野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图2显示该样本为CYP2C19*2突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图3显示该样本为CYP2C19*2突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图4显示该样本为CYP2C19*3野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图5显示该样本为CYP2C19*3突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图6显示该样本为CYP2C19*3突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号；图7显示该样本为CYP2C19*17野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图8显示该样本为CYP2C19*17突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图9显示该样本为CYP2C19*17突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
<120> 一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒及检测方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> CYP2C19*2基因(CYP2C19*2)
<400> 1
agcattactc cttgacctgt taaacatccg tag 33
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> CYP2C19*2基因(CYP2C19*2)
<400> 2
caaccagagc ttggcatatt gtatctatac ct 32
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> CYP2C19*2基因(CYP2C19*2)
<400> 3
caaggttttt aagtaatttg ttatgggttc ccgggaaata atcaatgata gt 52
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> CYP2C19*2基因(CYP2C19*2)
<400> 4
caaggttttt aagtaatttg ttatgggttc ctgggaaata atcaatgata gt 52
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> CYP2C19*3基因(CYP2C19*3)
<400> 5
atcatttagc ttcaccctgt gatcccactt tc 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> CYP2C19*3基因(CYP2C19*3)
<400> 6
catggctgtc taggcaagac tgtagtattc aa 32
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> CYP2C19*3基因(CYP2C19*3)
<400> 7
tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg gatccaggta aggccaagt 49
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> CYP2C19*3基因(CYP2C19*3)
<400> 8
tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg aatccaggta aggccaagt 49
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> CYP2C19*17基因(CYP2C19*17)
<400> 9
agtttctcaa gcccttagca ccaaattctc tg 32
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> CYP2C19*17基因(CYP2C19*17)
<400> 10
gaactgggat ttgagctgag gtcttctgat g 31
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> CYP2C19*17基因(CYP2C19*17)
<400> 11
aatttgtgtc ttctgttctc aaagcatctc tgatgtaaga gata 44
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> CYP2C19*17基因(CYP2C19*17)
<400> 12
aatttgtgtc ttctgttctc aaagaatctc tgatgtaaga gata 44
Claims (10)
1.一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的引物探针组，其特征在于，所述引物和探针组分为两组，A组为检测CYP2C19*2和CYP2C19*3的引物对、野生型探针和突变型探针；B组为检测CYP2C19*17的引物对、野生型探针和突变型探针；其中，A组的CYP2C19*2引物和探针序列为：
正向引物：5’-AGCATTACTCCTTGACCTGTTAAACATCCGTAG-3’；
反向引物：5’-CAACCAGAGCTTGGCATATTGTATCTATACCT-3’；
野生型探针：
5’-CAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGT(FAM-dT)CCCGGGAAA(THF)AA(BHQ1-dT)CAATGATAGT(C3spacer)-3’；
突变型探针：
5’-CAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGT(HEX-dT)CCTGGGAAA(THF)AA(BHQ1-dT)CAATGATAGT(C3spacer)-3’；
A组的CYP2C19*3引物和探针序列为：
正向引物：5’-ATCATTTAGCTTCACCCTGTGATCCCACTTTC-3’；
反向引物：5’-CATGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGTATTCAA-3’；
野生型探针：
5’-TGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCC(ROX-dT)GGA(THF)CCAGG(BHQ2-dT)AAGGCCAAGT(C3spacer)-3’；
突变型探针：
5’-TGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCC(CY5-dT)GAA(THF)CCAGG(BHQ2-dT)AAGGCCAAGT(C3spacer)-3’。
B组CYP2C19*17的引物和探针序列为：
正向引物：5’-AGTTTCTCAAGCCCTTAGCACCAAATTCTCTG-3’；
反向引物：5’-GAACTGGGATTTGAGCTGAGGTCTTCTGATG-3’；
野生型探针：
5’-AATTTGTGTCTTCTGTTC(FAM-dT)CAAAGCA(THF)C(BHQ1-dT)CTGATGTAAGAGATA(C3spacer)-3’；
突变型探针：
5’-AATTTGTGTCTTCTGTTC(HEX-dT)CAAAGAA(THF)C(BHQ1-dT)CTGATGTAAGAGATA(C3spacer)-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的引物探针组，其特征在于，所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述猝灭基团修饰在THF 3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上。
3.如权利要求2所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团用FAM、HEX、ROX或CY5修饰，所述淬灭基团用BHQ1、BHQ2修饰。
4.如权利要求3所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的引物探针组，其特征在于，所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团；所述探针覆盖SNP位点，在探针的SNP位点上做锁核酸(LNA)修饰。
5.如权利要求4所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含扩增反应试剂A的检测管、含扩增反应试剂B的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。
6.如权利要求5所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂A包括CYP2C19*2上下游引物、CYP2C19*2野生型和突变型探针、CYP2C19*3上下游引物、CYP2C19*3野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；
所述扩增反应试剂B包括CYP2C19*17上下游引物、CYP2C19*17野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
7.如权利要求6所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。
8.如权利要求7所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为CYP2C19*2野生型质粒和突变型质粒、CYP2C19*3野生型质粒和突变型质粒、CYP2C19*17野生型质粒和突变型质粒；所述阴性对照为无菌双蒸水。
9.如权利要求8所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可以检测的样品为人全血或外周血样本。
10.如权利要求9所述的一种基于锁核酸修饰的RMA法检测CYP2C19基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样本DNA作为模板；(2)设计用于CYP2C19基因多态性检测的引物对及探针；(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的反应试剂进行RMA扩增反应；扩增反应条件为在实时恒温荧光检测器中39℃下扩增20分钟；(4)检测结果判定：对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110228752.3A CN112852933A (zh) | 2021-03-02 | 2021-03-02 | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110228752.3A CN112852933A (zh) | 2021-03-02 | 2021-03-02 | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112852933A true CN112852933A (zh) | 2021-05-28 |
Family
ID=75990783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110228752.3A Pending CN112852933A (zh) | 2021-03-02 | 2021-03-02 | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112852933A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114150058A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-08 | 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 | 一种检测cyp2c19基因多态性的引物组及试剂盒 |
| CN114410768A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-29 | 广州白云山拜迪生物医药有限公司 | 检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用 |
| CN114410756A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-29 | 广州白云山拜迪生物医药有限公司 | 检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用 |
| CN114672548A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-06-28 | 华捷生物科技(青岛)有限公司 | 人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用 |
| CN114410756B (zh) * | 2021-12-22 | 2024-06-07 | 广州白云山拜迪生物医药有限公司 | 检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1671841A (zh) * | 2002-05-31 | 2005-09-21 | 宝生物工程株式会社 | 基因多态性分型方法 |
| CN103184265A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 协和干细胞基因工程有限公司 | Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 |
| CN107217107A (zh) * | 2017-08-03 | 2017-09-29 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种快速检测cyp2c19基因多态性的方法和试剂盒 |
| CN107287339A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-10-24 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种用于检测cyp2c19基因多态性的组合物及其应用 |
| CN107937506A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-04-20 | 南京迪安医学检验所有限公司 | 一种分子信标探针法检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒、方法及其应用 |
| CN108486231A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-09-04 | 山东维真生物科技有限公司 | 用于检测人类cyp2c19基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用 |
| CN112029837A (zh) * | 2020-10-13 | 2020-12-04 | 济南国益生物科技有限公司 | 一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点的试剂盒及其检测方法 |
-
2021
- 2021-03-02 CN CN202110228752.3A patent/CN112852933A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1671841A (zh) * | 2002-05-31 | 2005-09-21 | 宝生物工程株式会社 | 基因多态性分型方法 |
| CN103184265A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 协和干细胞基因工程有限公司 | Cyp2c19基因检测试剂盒及其扩增方法和检测方法 |
| CN107217107A (zh) * | 2017-08-03 | 2017-09-29 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种快速检测cyp2c19基因多态性的方法和试剂盒 |
| CN107287339A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-10-24 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种用于检测cyp2c19基因多态性的组合物及其应用 |
| CN107937506A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-04-20 | 南京迪安医学检验所有限公司 | 一种分子信标探针法检测人类cyp2c19基因多态性的试剂盒、方法及其应用 |
| CN108486231A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-09-04 | 山东维真生物科技有限公司 | 用于检测人类cyp2c19基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用 |
| CN112029837A (zh) * | 2020-10-13 | 2020-12-04 | 济南国益生物科技有限公司 | 一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点的试剂盒及其检测方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114410768A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-29 | 广州白云山拜迪生物医药有限公司 | 检测cyp2c19*2基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用 |
| CN114410756A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-29 | 广州白云山拜迪生物医药有限公司 | 检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用 |
| CN114410756B (zh) * | 2021-12-22 | 2024-06-07 | 广州白云山拜迪生物医药有限公司 | 检测cyp2c19*3基因单核苷酸多态性的试剂、试剂盒及应用 |
| CN114150058A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-08 | 上海美吉逾华生物医药科技有限公司 | 一种检测cyp2c19基因多态性的引物组及试剂盒 |
| CN114672548A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-06-28 | 华捷生物科技(青岛)有限公司 | 人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用 |
| CN114672548B (zh) * | 2022-03-10 | 2024-04-19 | 华捷生物科技(青岛)有限公司 | 一种人类静脉血栓风险基因pai-1，thbd和proc基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112852933A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及检测方法 | |
| US20060110765A1 (en) | Detection of nucleic acid variation by cleavage-amplification (CleavAmp) method | |
| US9809846B2 (en) | Compositions, kits, uses and methods for amplified detection of an analyte | |
| CN108251522A (zh) | 人类mthfr和mtrr基因检测试剂盒及其用途 | |
| JP5224526B2 (ja) | 遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む遺伝子増幅用試薬およびその用途 | |
| KR20080100429A (ko) | Ｃｙｐ2ｃ19 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을포함하는 ｃｙｐ2ｃ19 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 | |
| CN112029837A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点的试剂盒及其检测方法 | |
| WO2011062258A1 (ja) | Ｍｔｈｆｒ遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｍｔｈｆｒ遺伝子増幅用試薬およびその用途 | |
| EP3064596B1 (en) | Method for analysing cyp2c19 gene polymorphism, kit and use thereof for analysing the cyp2c19 gene polymorphisms and to evaluate drug efficacy. | |
| JPWO2008066163A1 (ja) | Ｃｙｐ２ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｃｙｐ２ｃ９遺伝子増幅用試薬およびその用途 | |
| KR101119417B1 (ko) | 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 비만 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 | |
| US7485425B2 (en) | Methods for amplification of nucleic acids using spanning primers | |
| CN108060213A (zh) | 基于探针导向的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点用探针和试剂盒 | |
| CN108949967B (zh) | 用液相芯片技术检测心血管疾病药物基因多态性的特异性引物及试剂盒 | |
| KR102293402B1 (ko) | 회전환 증폭을 이용한 표적핵산 검출 방법 및 표적핵산 검출용 조성물 | |
| CN112899361A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒 | |
| CN111621553A (zh) | 一种能够用于检测npc1l1突变基因分型的试剂及其应用 | |
| CN112852951A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ApoE和SLCO1B1基因多态性的试剂盒 | |
| CN109371113A (zh) | 一种检测人类apoe和slco1b1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用 | |
| CN106399565A (zh) | 一种rs12979860基因分型双色荧光PCR快速检测试剂盒 | |
| JP2003510011A (ja) | カップル性ポリメラーゼ連鎖反応−制限エンドヌクレアーゼ消化−リガーゼ検出反応法 | |
| WO2019231287A1 (ko) | 회전환 증폭을 이용한 표적핵산 검출 방법 및 표적핵산 검출용 조성물 | |
| CN112029851A (zh) | 一种氯吡格雷用药基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用 | |
| CN111705120A (zh) | 一种检测人类mif基因catt重复序列纯合子的试剂盒及步骤 | |
| CN112852952A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测aldh2基因多态性的试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210528 |