CN111705120A - 一种检测人类mif基因catt重复序列纯合子的试剂盒及步骤 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒及步骤，该试剂盒由探针结合预混液、酶促反应预混液、信号放大预混液、纯合子阳性对照品、阴性对照以及标准品组成。本发明含有MIF基因CATT5重复特异性结合环锁探针的探针结合预混液、酶促反应预混液、信号检测预混液、阴性标准品和阳性标准品，通过环锁探针结合、酶促反应、等温扩增信号放大，可区分MIF基因CATT五段重复序列纯合子和非CATT五段重复序列杂合子，为精神分裂症患者治疗方案的用药选择提供了个性化的指导设计不依赖昂贵仪器、繁琐操作的快速检测试剂盒，避免非典型抗精神病药物用药副作用发生，首次实现精神疾病的个性化用药和精准快速床旁检测POCT。
Description
技术领域
本发明涉及串联重复序列检测、等温扩增等技术领域，尤其是涉及一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒及步骤。
背景技术
非典型抗精神病药物如处方药奥氮平对精神分裂症有显著的疗效，但部分巨噬细胞转移抑制因子（MIF）高表达的基因表型患者用药后会出现胰岛素拮抗等代谢异常情况，而MIF低表达的基因表型（即MIF基因启动子区域微卫星串联重复序列CATT为五段重复的纯合子基因型）的患者服用奥氮平后几乎不产生副作用，MIF对药物代谢具有重要的影响，因此决定MIF表达的MIF基因启动子区域的微卫星CATT串联重复序列可作为非典型抗精神病药物用药指导的生物靶标。
目前市面上检测微卫星简单串联重复序列的方法主要是PCR结合毛细管电泳，先设计重复序列外围两端特异性结合的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，再通过毛细管电泳精确确定扩增产物的长度和浓度比例，来区分基因型。也有基于荧光定量PCR平台设计不同重复序列的特异性结合引物探针，每种引物用一种荧光标记，通过qPCR的荧光信号来确定基因型。两种方法有较高的灵敏度和特异性检测目的片段的基因型，但两者都需要借助昂贵的仪器、复杂的操作来实现，而且对于杂合子检测都会存在信号干扰的风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述背景技术中的技术问题，因此提供一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒及步骤，从而解决上述问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由探针结合预混液、酶促反应预混液、信号放大预混液、纯合子阳性对照品、阴性对照以及标准品组成；
所述探针结合预混液包括含有特异性识别MIF基因启动子区域的带有特定修饰的环锁核酸探针、RecA蛋白、单链结合蛋白以及促进探针结合的缓冲液A；
所述酶促反应预混液包括能够在室温条件下反应且不具有3’-5’外切酶活性的聚合酶、在37 ℃下具有活性的高保真连接酶、四种随机脱氧核糖核苷酸dNTP以及促进酶反应活性的缓冲液B；
所述信号放大预混液包括具有链置换活性的等温扩增酶、链置换等温扩增的引物、dNTP、结合双链DNA的SYBR® Green荧光染料、促进酶反应活性的缓冲液C；
所述纯合子阳性对照品为与探针结合预混液中环锁核酸探针结合但不促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；
所述阴性对照品为与探针结合预混液中环锁核酸探针结合且促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；
所述标准品为用于荧光计检测的双链DNA片段，有低浓度DNA和高浓度DNA两管组分组。
作为本发明的一种优选技术方案，缓冲液A包括但不局限于Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、EDTA和甘油，缓冲液A的pH为7.6。
作为本发明的一种优选技术方案，缓冲液B包括但不局限于Tris-HCl、醋酸钾、醋酸镁、NADⅠ型辅酶、DTT、Triton X-100和甘油，缓冲液B的pH为7.6。
作为本发明的一种优选技术方案，缓冲液C包括Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT和甘油，缓冲液C的pH为7.5。
本发明还提供一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒的操作步骤，其特征在于，
第一步，探针结合反应：在干净的无核酸酶反应管中用移液器加入30-100ng纯化的样本人源基因组DNA或对照组样品分别与一次反应所需的探针结合预混液，37℃反应15min，人源基因组须从体细胞采样，比如抽提自全血白细胞基因组DNA、口腔上皮细胞DNA；
第二步，酶促反应：等体积在各反应管中用移液器加入一次反应所需的酶促反应预混液，移液器至少10次吹打混匀后，37℃反应25min；
第三步，信号放大：按照稀释倍数对应的体系再各反应管中用移液器加入一次反应所需的预混液C，37℃反应2h。
第四步，信号检测：按照荧光计操作说明书，配制工作液，先测定标准品荧光值定两点法的标曲，再读取各样本的荧光值，根据荧光值判定检测结果是否为CATT5纯合子。
与目前技术相比，本发明的有益效果是：本发明含有MIF基因CATT5重复特异性结合环锁探针的探针结合预混液、酶促反应预混液、信号检测预混液、阴性标准品和阳性标准品，通过环锁探针结合、酶促反应、等温扩增信号放大，可区分MIF基因CATT五段重复序列纯合子和非CATT五段重复序列杂合子（CATT5-8重复序列杂合子、CATT6-8重复序列纯合子），为精神分裂症患者治疗方案的用药选择提供了个性化的指导设计不依赖昂贵仪器、繁琐操作的快速检测试剂盒，避免非典型抗精神病药物用药副作用发生，首次实现精神疾病的个性化用药和精准快速床旁检测POCT。
具体实施方式
显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒，该试剂盒由探针结合预混液、酶促反应预混液、信号放大预混液、纯合子阳性对照品、阴性对照以及标准品组成；
所述探针结合预混液包括含有特异性识别MIF基因启动子区域的带有特定修饰的环锁核酸探针、RecA蛋白、单链结合蛋白以及促进探针结合的缓冲液A；
所述酶促反应预混液包括能够在室温条件下反应且不具有3’-5’外切酶活性的聚合酶、在37 ℃下具有活性的高保真连接酶、四种随机脱氧核糖核苷酸dNTP以及促进酶反应活性的缓冲液B；
所述信号放大预混液包括具有链置换活性的等温扩增酶、链置换等温扩增的引物、dNTP、结合双链DNA的SYBR® Green荧光染料、促进酶反应活性的缓冲液C；
所述纯合子阳性对照品为与探针结合预混液中环锁核酸探针结合但不促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；
所述阴性对照品为与探针结合预混液中环锁核酸探针结合且促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；
所述标准品为用于荧光计检测的双链DNA片段，有低浓度DNA和高浓度DNA两管组分组。
缓冲液A包括但不局限于Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、EDTA和甘油，缓冲液A的pH为7.6。
缓冲液B包括但不局限于Tris-HCl、醋酸钾、醋酸镁、NADⅠ型辅酶、DTT、Triton X-100和甘油，缓冲液B的pH为7.6。
缓冲液C包括Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT和甘油，缓冲液C的pH为7.5。
本发明还提供一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒的操作步骤，
第一步，探针结合反应：在干净的无核酸酶反应管中用移液器加入30-100ng纯化的样本人源基因组DNA或对照组样品分别与一次反应所需的探针结合预混液，37℃反应15min，人源基因组须从体细胞采样，比如抽提自全血白细胞基因组DNA、口腔上皮细胞DNA；
第二步，酶促反应：等体积在各反应管中用移液器加入一次反应所需的酶促反应预混液，移液器至少10次吹打混匀后，37℃反应25min；
第三步，信号放大：按照稀释倍数对应的体系再各反应管中用移液器加入一次反应所需的预混液C，37℃反应2h。
第四步，信号检测：按照荧光计操作说明书，配制工作液，先测定标准品荧光值定两点法的标曲，再读取各样本的荧光值，根据荧光值判定检测结果是否为CATT5纯合子。
下方为环锁探针引物序列（*代表DNA分子上各种修饰基团，不限于磷酸基团、未完整磷酸基团、羟基、未完整羟基、突变碱基、损伤碱基或化学基团、异常DNA双链结构等化学结构信息）；
5/p-G*AATG*AATGGGTG*AAAGAAGATAAGCCTCATGCTTCTTCGGTGCCCATTACGAGCGCGCAGACACGATAGTCTGACTAATACTGC*TGAATGAATG*AATG*A*A-3/。
环锁探针引物包含与MIF基因启动子区域可结合部分和非特异结合部分，非特异结合部分不与人基因组任何片段互补，在RecA蛋白的带领下，环锁探针引物可以与基因组MIF基因特异区域结合形成杂交链。在CATT五段重复（CATT5）纯合子样本中由于环锁探针引物不能与模板完全互补，从而不能成环，而在CATT六段及以上重复的基因型存在时，环锁探针引物自身与模板互补，或在酶促反应完成后与模板互补，并能够进一步收尾连接成环。
本发明含有MIF基因CATT5重复特异性结合环锁探针的探针结合预混液、酶促反应预混液、信号检测预混液、阴性标准品和阳性标准品，通过环锁探针结合、酶促反应、等温扩增信号放大，可区分MIF基因CATT五段重复序列纯合子和非CATT五段重复序列杂合子（CATT5-8重复序列杂合子、CATT6-8重复序列纯合子），为精神分裂症患者治疗方案的用药选择提供了个性化的指导设计不依赖昂贵仪器、繁琐操作的快速检测试剂盒，避免非典型抗精神病药物用药副作用发生，首次实现精神疾病的个性化用药和精准快速床旁检测POCT。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒，其特征在于，该试剂盒由探针结合预混液、酶促反应预混液、信号放大预混液、纯合子阳性对照品、阴性对照以及标准品组成；
所述探针结合预混液包括含有特异性识别MIF基因启动子区域的带有特定修饰的环锁核酸探针、RecA蛋白、单链结合蛋白以及促进探针结合的缓冲液A；
所述酶促反应预混液包括能够在室温条件下反应且不具有3’-5’外切酶活性的聚合酶、在37 ℃下具有活性的高保真连接酶、四种随机脱氧核糖核苷酸dNTP以及促进酶反应活性的缓冲液B；
所述信号放大预混液包括具有链置换活性的等温扩增酶、链置换等温扩增的引物、dNTP、结合双链DNA的SYBR® Green荧光染料、促进酶反应活性的缓冲液C；
所述纯合子阳性对照品为与探针结合预混液中环锁核酸探针结合但不促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；
所述阴性对照品为与探针结合预混液中环锁核酸探针结合且促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；
所述标准品为用于荧光计检测的双链DNA片段，有低浓度DNA和高浓度DNA两管组分组。
2.根据权利要求1所述的一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒，其特征在于，缓冲液A包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、EDTA和甘油，缓冲液A的pH为7.6。
3.根据权利要求1所述的一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒，其特征在于，缓冲液B包括Tris-HCl、醋酸钾、醋酸镁、NADⅠ型辅酶、DTT、Triton X-100和甘油，缓冲液B的pH为7.6。
4.根据权利要求1所述的一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒，其特征在于，缓冲液C包括Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT和甘油，缓冲液C的pH为7.5。
5.一种检测人类MIF基因CATT重复序列纯合子的试剂盒的操作步骤，其特征在于，
第一步，探针结合反应：在干净的无核酸酶反应管中用移液器加入30-100ng纯化的样本人源基因组DNA或对照组样品分别与一次反应所需的探针结合预混液，37℃反应15min，人源基因组须从体细胞采样，比如抽提自全血白细胞基因组DNA、口腔上皮细胞DNA；
第二步，酶促反应：等体积在各反应管中用移液器加入一次反应所需的酶促反应预混液，移液器至少10次吹打混匀后，37℃反应25min；
第三步，信号放大：按照稀释倍数对应的体系再各反应管中用移液器加入一次反应所需的预混液C，37℃反应2h。
6.第四步，信号检测：按照荧光计操作说明书，配制工作液，先测定标准品荧光值定两点法的标曲，再读取各样本的荧光值，根据荧光值判定检测结果是否为CATT5纯合子。
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