CN112301114A - 用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒 - Google Patents
用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112301114A CN112301114A CN201910691195.1A CN201910691195A CN112301114A CN 112301114 A CN112301114 A CN 112301114A CN 201910691195 A CN201910691195 A CN 201910691195A CN 112301114 A CN112301114 A CN 112301114A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- tacrolimus
- primer
- sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 43
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 title claims abstract description 25
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 title claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 9
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 102000004328 Cytochrome P-450 CYP3A Human genes 0.000 description 10
- 108010081668 Cytochrome P-450 CYP3A Proteins 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 101150052538 CYP3A5 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 4
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 2
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N Dapsone Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 229960000860 dapsone Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N midazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NC=C2CN=C1C1=CC=CC=C1F DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003793 midazolam Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001597 nifedipine Drugs 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针,该探针的序列如SEQ ID NO.:1所示,或者在SEQ ID NO.:1的序列两端加以基团修饰。本发明还提供了一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的引物,该引物的序列如SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:3所示。本发明的用于他克莫司个体化用药基因多态性的探针和引物,在检测他克莫司个体化用药基因多态性时,具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体的说涉及用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒。
背景技术
他克莫司(tacrolimus,FK506)为大环内酯类免疫抑制剂,临床上广泛用于肝、肾、心、肺、胰等器官移植患者的免疫抑制治疗,其主要不良反应包括继发性感染、肾毒性、神经毒性、胃肠反应、代谢障碍以及淋巴增生性疾病和肿瘤等。器官移植患者应用他克莫司后血药浓度偏低可导致急性排斥反应和药物敏感性降低;血药浓度偏高则容易发生肾毒性、神经毒性、糖尿病、高血脂症、高血压和胃肠道紊乱等不良反应。导致他克莫司毒副作用的发生。CYP3A5在他克莫司的代谢中起重要作用,其活性降低可导致他克莫司的血药浓度升高,不良反应增加。CPIC指南建议携带CYP3A5*3/*3基因型的移植患者减少他克莫司的用药剂量,以避免发生药物不良反应[1]。
CYP3A5参与他克莫司、咪达唑仑、氨苯砜、可的松、尼菲地平等多种药物的代谢。CYP3A5基因第3内含子内22893位存在6986A>G的突变(rs776746,CYP3A5*3),该SNP可导致CYP3A5mRNA异常剪接,引起终止密码子过早剪切CYP3A5蛋白,从而使其失去酶的活性,因此CYP3A5*3纯合子个体肝脏和肠道CYP3A5蛋白表达和活性显著下降。CYP3A5*1等位基因频率存在显著种族差异,白种人群中为10%--15%,中国人群中为28%,而黑种人群则高达60%--80%。
目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法,PCR产物直接进行DNA序列分析,可以明确突变位点,但存在费时费力,成本较昂贵,不适用于对大量样本进行检测等缺点。因此,需要开发一种适合大批量样本检测的方法。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针,该探针的序列如SEQ ID NO.:1所示,或者在SEQ ID NO.:1的序列两端加以基团修饰;
其中修饰基团为:5′的修饰基团为荧光基团,如HEX;3′的修饰基团为淬灭基团,如BHQ1;
具体的说,本发明提供的用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针为:5’-HEX-CGGGGTGTCTTTCANTATCTCTTCCCCG-BHQ1-3’BHQ1;
其中N为变异碱基,具体为A>G;
所述的探针包括环序列和茎序列,其中环序列为第5~23bp(5′-TGTCTTTCANTATCTCTT-3′),其两侧是两个反向互补的茎序列,茎序列为(5′-CGGGG……CCCCG-3)。
该探针的设计原理为:根据CYP3A5基因多态性rs776746,设计探针和引物,需要保证在退火温度下DNA模板不存在时,探针呈茎环状态。探针所采用的淬灭基团为BHQ1,其淬灭空间范围很小,搭配短发射波长的荧光基团,如HEX,只有当分子信标呈茎环结构时,荧光才会被很好地淬灭。环序列与靶DNA序列互补时,确定最佳PCR引物为40-45bp大小,PCR产物长度100-180bp。
本发明还提供了一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的引物,该引物的序列如SEQ ID NO.:2(引物1)和SEQ ID NO.:3(引物2)所示:
引物1 5’-AGGTGACACTATAGAATAACCACCCAGCTTAACGAATG-3’
引物2 5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGCAAGAGTCTCACACAGGA-3’。
本发明还提供了一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒,该试剂盒包含如上所述的探针和/或引物;
该试剂盒还包含还有Taq酶、dNTP、和/或Mg2+,以及使用说明书。
本发明还提供一种了用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的方法该方法包括如下步骤:
(1)采集样本,抽提DNA;
(2)应用上述探针和引物进行荧光定量PCR反应;
(3)应用PCR仪配套软件分析结果,根据扩增曲线,规定合适基线和阈值,基于形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型;
其中Tm值58℃时为野生型,Tm值66℃时为突变型。
其中PCR反应的总体系为15ul(包括PCR Mix 7.5ul、正向引物溶液0.5ul及反向引物溶液0.5ul,探针0.1ul,样本DNA 2ul,灭菌重蒸馏水4.4ul);在荧光定量PCR仪上进行反应,PCR反应条件为92-97℃预变性5-15分钟;92-97℃变性10-30秒,57-65℃退火10-30秒,70-75℃延伸10-30秒,40-50个循环;62℃延伸10分钟;92-97℃变性1分钟,40℃复性1分钟,熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号,每升温1℃记录5次。
本发明对CYP3A5基因多态性进行检测,可实现对CYP3A5基因多态性的快速筛查,有利于建立对个体叶酸代谢能力进行评估,辅助临床对患者进行危险分层和指导叶酸的个体化服用。
本发明利用一种可以特异识别核酸序列的荧光探针,通过与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料,根据杂交后产生不同温度的峰图判定分型结果。在没有靶DNA存在的情况下,荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起,检测不到荧光信号;当有靶DNA存在时,荧光标记探针结构被破坏,荧光基团与淬灭基团相互分离,即可检测到荧光信号。该方法与其他遗传分型技术相比,操作简单,2-3小时可以完成96例检测,具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点,通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果,基因分型清晰,不需要PCR后处理或电泳检测,可实现真正的闭管操作。
附图说明
图1、rs776746位点的三种峰型(AA型、GG型、AG型)
图2、精密度实验结果(其中两个峰的为AG型,单峰的为AA型)
图3、多样本的熔解曲线图
具体实施方式
实施例1:探针及引物设计
本发明是针对CYP3A5 677A>G SNP位点设计探针及引物序列。具体原理是利用荧光探针与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料,根据杂交后产生不同温度的峰图及Tm值判断基因分型结果。在没有靶DNA存在的情况下,荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起,检测不到荧光信号;当有靶DNA存在时,荧光标记探针结构被破坏,荧光基团与淬灭基团相互分离,即可检测到荧光信号。
设计探针和引物,实现在退火温度下模板不存在时,探针呈茎环状态,包括环序列及其两侧呈反向互补的茎序列,总长度为28bp,其中环序列为18bp(5′-TGTCTTTCANTATCTCTT-3′),两端各5个碱基构成茎序列;且两端的茎序列正好形成互补;采用的淬灭基团为BHQ1,配短发射波长的荧光基团HEX。环序列与靶DNA序列互补,确定PCR引物为38-42bp大小,PCR产物长度158bp。
引物和探针序列如下:
引物1的序列:5’-AGGTGACACTATAGAATA ACCACCCAGCTTAACGAATG-3’;
引物2的序列:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA CAGCAAGAGTCTCACACAGGA-3’;
探针的序列:5’-HEX-CGGGGTGTCTTTCANTATCTCTTCCCCG-BHQ1-3’。
其中N为变异碱基,具体为A>G;
上述探针和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例2:检测不同基因型标准品
1、用质粒CYP3A5 6986构建并制备含有目的基因rs776746位点的野生型标准品质粒和突变型标准品质粒(质粒来源,以及含目的基因质粒的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通过sanger测序确定序列的准确性,野生型标准品质粒rs776746基因型为AA;突变型标准品质粒rs776746基因型为GG。标准品质粒DNA浓度标化到10ng/ul。
2、采用实施例1中的探针及引物。
3、PCR反应体系:
1)在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Mix 7.5ul,引物1溶液0.5uM及引物2溶液0.5uM,探针0.1uM,然后在3个不同的PCR反应孔中分别加入野生型标准品质粒DNA、突变型标准品质粒DNA、混合型DNA(野生型标准品质粒和突变型标准品质粒按照1:1比例混合)各2ul,用灭菌重蒸馏水补足15ul;
2)在荧光定量PCR仪上进行反应,PCR反应条件为95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,60℃退火30秒,62℃延伸30秒,45个循环;62℃延伸10分钟;95℃变性1分钟,40℃复性1分钟,熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号,每升温1℃记录5次。
4、应用PCR仪配套软件SLAN分析结果,基于形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。rs776746位点峰出现在58℃为AA基因型,出现在66℃为GG基因型,两个位置都有峰为AG基因型(图1)。
实施例3:检测方法性能分析实验
1、精密度实验
取野生型标准品质粒DNA和混合型DNA(野生型标准品质粒和突变型标准品质粒按照1:1比例混合)各一份,每天检测3次,连续检测5天,扩增反应程序采用实施例2中方法,结果见图2。表明本发明的荧光PCR扩增反应重复性好(符合率大于95%,检测结果AG值变异系数CV小于5%)。
2、符合率实验
选取20例上海地区健康志愿者DNA样本,应用实施例2的方法进行rs776746位点检测,同时应用sanger测序法进行验证,比较两种方法检测结果的一致性,结果表明实施例2方法的分型结果与sanger测序法的符合率实验一致程度百分比为100%,一致性优秀。
3、检出限实验
取已知浓度的混合型DNA(野生型标准品质粒和突变型标准品质粒按照1:1比例混合)一份,稀释至10ng/ul、5ng/ul、2ng/ul、1ng/ul四个浓度,每个浓度平行检测3管。结果表明样本浓度为10ng/ul、5ng/ul、2ng/ul、1ng/ul时均可检出对应基因型,即最低可检出浓度为1ng/ul。
实施例4:口腔上皮细胞样本DNA的检测
1、采用硅胶吸附法抽提92例上海地区健康志愿者口腔上皮细胞基因组DNA,电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测,待测样本DNA浓度标化到10ng/ul。
2、检测方法如下:在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Mix 7.5ul,正向引物溶液0.5uM及反向引物溶液0.5uM,探针0.1uM,同时进行弱阳性对照(基因型为AG)、阴性对照(基因型为AA)和待测样本的检测,每个反应孔加入DNA 2ul,用灭菌重蒸馏水补足15ul;在荧光定量PCR检测仪上进行反应,PCR反应条件为95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,60℃退火30秒,62℃延伸30秒,45个循环;62℃延伸10分钟;95℃变性1分钟,40℃复性1分钟,熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号,每升温1℃记录5次。
3、应用配套软件分析结果,基于形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。rs776746位点峰出现在58℃为AA基因型,出现在66℃为GG基因型,两个位置都有峰为AG基因型。如图3所示为多样本的熔解曲线图,分型成功率达到100%。
4、将92例口腔上皮细胞基因组DNA同时进行sanger测序,结果与本发明的检测结果完全一致,说明本发明方法用于检测他克莫司个体化用药基因多态性结果准确度高。
序列表
<110> 上海中优精准医疗科技股份有限公司
<120> 用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n=a或g
<400> 1
cggggtgtct ttcantatct cttccccg 28
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggtgacact atagaataac cacccagctt aacgaatg 38
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaagccctc acgtagcgaa cagcaagagt ctcacacagg a 41
Claims (7)
1.一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针,该探针的序列如SEQ IDNO.:1所示;或者在SEQ ID NO.:1的序列两端加以基团修饰。
2.根据权利要求1所述的探针,其特征在于其中修饰基团为:5′的修饰基团为荧光基团HEX;3′的修饰基团为淬灭基团BHQ1。
3.根据权利要求1所述的探针,其特征在于所述的探针包括环序列和茎序列,其中环序列为第5~23bp,其两侧是两个反向互补的茎序列。
4.一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的引物,其特征在于该引物的序列如SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:3所示。
5.一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒,其特征在于该试剂盒包含权利要求1-3任一项所述的探针和/或权利要求4所述的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于该试剂盒还包含还有Taq酶、dNTP、和/或Mg2+,以及使用说明书。
7.一种用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)采集样本,抽提DNA;
(2)应用权利要求1-3任一项所述的探针和权利要求4所述的引物进行荧光定量PCR反应;
(3)应用PCR仪配套软件分析结果,根据扩增曲线,规定合适基线和阈值,基于形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型;
其中Tm值58℃时为野生型,Tm值66℃时为突变型。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910691195.1A CN112301114A (zh) | 2019-07-29 | 2019-07-29 | 用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910691195.1A CN112301114A (zh) | 2019-07-29 | 2019-07-29 | 用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112301114A true CN112301114A (zh) | 2021-02-02 |
Family
ID=74330073
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910691195.1A Pending CN112301114A (zh) | 2019-07-29 | 2019-07-29 | 用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112301114A (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102277443A (zh) * | 2011-09-16 | 2011-12-14 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 检测他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的试剂盒及扩增方法和检测方法 |
CN102703585A (zh) * | 2012-05-04 | 2012-10-03 | 周宏灏 | 焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法 |
CN106086192A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-11-09 | 上海泽因生物科技有限公司 | 他克莫司个性化用药相关基因的分型检测试剂盒 |
-
2019
- 2019-07-29 CN CN201910691195.1A patent/CN112301114A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102277443A (zh) * | 2011-09-16 | 2011-12-14 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 检测他克莫司和环孢素a个体化用药相关snp位点的试剂盒及扩增方法和检测方法 |
CN102703585A (zh) * | 2012-05-04 | 2012-10-03 | 周宏灏 | 焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法 |
CN106086192A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-11-09 | 上海泽因生物科技有限公司 | 他克莫司个性化用药相关基因的分型检测试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110878343B (zh) | 一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 | |
KR101135829B1 (ko) | 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 | |
CN112852933A (zh) | 一种基于锁核酸修饰的rma法检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及检测方法 | |
CN110564861B (zh) | 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
WO2008077329A1 (fr) | Sonde destinée à détecter la mutation a1555g de surdité génétique mitochondriale héritée de la mère et son utilisation | |
US20090208956A1 (en) | Primer set for amplifying cyp2c9 gene, reagent for amplifying cyp2c9 gene containing the same, and the uses thereof | |
KR101107831B1 (ko) | Sult1a1 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 sult1a1 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 | |
CN114438210B (zh) | 一种基于高通量测序子宫内膜癌分子分型的文库构建方法 | |
CN112301114A (zh) | 用于检测他克莫司个体化用药基因多态性的探针、引物及试剂盒 | |
CN112301120A (zh) | 一种用于检测adrb1基因多态性的探针、引物及试剂盒 | |
CN111909990B (zh) | 单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光pcr检测方法 | |
JP4670039B2 (ja) | アポリポタンパクe遺伝子多型検出方法 | |
CN111705120A (zh) | 一种检测人类mif基因catt重复序列纯合子的试剂盒及步骤 | |
CN112029851A (zh) | 一种氯吡格雷用药基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用 | |
CN111394437A (zh) | 一种人类cyp2c19基因多态性的引物、探针、试剂盒及其应用 | |
CN110257490A (zh) | Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒及其使用方法 | |
CN113005190A (zh) | 用于检测白细胞介素-3基因多态性的探针、引物及试剂盒 | |
CN114317694A (zh) | 一种用于检测ace2基因多态性的探针、引物及试剂盒 | |
CN113005191A (zh) | 用于检测肿瘤坏死因子-α基因多态性的探针、引物及试剂盒 | |
CN112301121A (zh) | 用于检测cyp2c9基因和vkorc1基因多态性的探针、引物、试剂盒 | |
CN112301134A (zh) | 用于检测儿茶酚-氧位-甲基转移酶基因多态性的探针、引物及试剂盒 | |
CN112301113A (zh) | 用于检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的探针、引物及试剂盒 | |
CN112695097B (zh) | 一种区分cyp2d7p和cyp2d8p的cyp2d6*10遗传多态性检测试剂盒 | |
CN107267650A (zh) | 一种aldh2*2基因型检测试剂盒及其检测方法 | |
CN112646865A (zh) | 用于检测ak4基因多态性的探针、引物、试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210202 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |