CN110257490A - Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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陈彬尧
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

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Abstract

本发明公开了一种Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒及其使用方法，包括以下引物及试剂：前扩增引物：CCATACAGGCAACATGACTTAG；后扩增引物：CACAGGGAGTTGACCTTCATAC；Sanger法PCR扩增内引物：GCAGCATTTAGTCCTTGTGA；试剂盒中的Mix、bigdye、ddH2O其它常规试剂。所述试剂盒使用方法包括以下步骤：人基因组DNA提取；普通PCR扩增体系及程序：普通PCR扩增产物纯化：Sanger法PCR扩增体系及程序：Sanger法PCR扩增产物纯化及结果分析。该试剂盒操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确，符合临床大样本检测要求。

Description

Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒及其使用方法。
背景技术
免疫抑制剂治疗是器官移植术后抗排斥反应的重要措施。钙调磷酸酶抑制剂(Calcineurin inhibittors,CNIs)环孢素A(Ciclosporin A,CsA)和他克莫司(Tacrolimus,Tac)是器官移植术后最常用的免疫治疗药物，其应用大大降低了移植术后排斥反应的发生，提高了移植器官的生存率[1]。尽管CNIs是移植药物史上的重大发现，但CNIs的治疗窗窄、不同个体间显著差异的药动力学参数及在血药浓度与药效之间没有明显的线性关系等特点，导致其在临床上应用时，个体之间给药剂量具有显著差异，标准给药剂量很可能不适用于每一名患者[2]。给药剂量不足可导致排斥反应的发生，给药剂量过大容易引起感染和肾毒性、神经毒性、糖尿病、高血脂症、高血压和胃肠道紊乱等药物毒性反应。临床上根据用药后的血药浓度反馈调节他克莫司的给药剂量具有明显的滞后性，不能满足临床对不同患者个体化用药的需求，在一定程度上影响了CNIs的治疗效果。
研究表明，CNIs主要通过肝脏和小肠的细胞色素P450系(主要包括CYP3A5和CYP3A4)代谢[3]。越来越多研究结果显示，药物代谢酶细胞色素P4503A5(CYP3A5)的基因多态性是造成患者血浆中他克莫司浓度个体差异的主要原因。CYP3A5基因第3内含子内22893位存在6986A>G的突变(rs776746，CYP3A5*3)，该SNP可导致CYP3A5mRNA异常剪接，引起终止密码子过早剪切CYP3A5蛋白，从而使其失去酶的活性，因此，CYP3A5*3纯合子个体肝脏和肠道CYP3A5蛋白表达和活性显著下降。CYP3A5*1等位基因频率存在显著种族差异，白种人群中为10％--15％，中国人群中为28％，而黑种人群则高达60％-80％。其活性降低可导致他克莫司的血药浓度升高，不良反应增加。临床药物基因组学实施联盟(ClinicalPharmacogenetics Implementation Consortium,CPIC)指南建议携带CYP3A5*3/*3基因型的移植患者减少他克莫司的用药剂量，以避免发生药物不良反应[4]。
综上，CYP3A5*3是影响CNIs需求剂量差异性的主要因素，目前，一般采用直接测序或定性PCR技术检测CYP3A5*3基因多态性，其检测的灵敏度和特异性均不高，且耗时耗力，不利于预测药物疗效及指导药物的选择性用药。因此开发精准、快速、高效、便捷、经济的检测CYP3A5*3基因多态性的试剂盒，将为CNIs药物临床个体化治疗起到积极的推动作用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒，能准确快速的检测CNIs药物基因CYP3A5*3多态性。
本发明的目的之二在于提供一种Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒的使用方法，该方法便捷高效，敏感性特异性好，为CNIs药物使用剂量提供了技术支持，可推广使用。
本发明实现目的之一采用以下技术方案：
一种Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括以下引物及试剂：
(1)普通PCR扩增引物：
前扩增引物(CYP3A5-S)：CCATACAGGCAACATGACTTAG；
后扩增引物(CYP3A5-A)：CACAGGGAGTTGACCTTCATAC；
(2)Sanger法PCR扩增引物：
Sanger法PCR扩增内引物(CYP3A5-As)：GCAGCATTTAGTCCTTGTGA；
(1)试剂盒中的常规试剂：Mix、bigdye、ddH2O。
本发明实现目的之二采用以下技术方案：
一种Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)人基因组DNA提取；
(2)普通PCR扩增体系及程序：
(2.1)配制20μL普通PCR反应体系，包括以下含量组分：
Mix 14μL；
5μM的CYP3A5-S 1μL；
5μM的CYP3A5-A 1μL；
ddH2O 3μL；
人基因组DNA 1μL；
(2.2)普通PCR扩增程序：
94℃5min；依次在94℃15s，62℃20s，72℃40s，进行34个循环；72℃5min；4℃保温，即得到普通PCR扩增产物；
(3)普通PCR扩增产物纯化：
采用酶解纯化法：每10μL步骤(2)得到的普通PCR扩增产物，加1μL核酸外切酶I和2μL虾小肠碱性磷酸酶；然后于37℃酶反应15min；再于85℃酶失活15min，即得到纯化的普通PCR扩增产物；上述纯化步骤均在PCR仪里完成；
(4)Sanger法PCR扩增体系及程序：
(4.1)配制10μL Sanger法PCR扩增体系，包括以下含量组分：
BigDye 3μL；
CYP3A5-As 1μL；
ddH2O 5μL；
纯化的普通PCR扩增产物 1μL；
(4.2)Sanger法PCR扩增程序：
95℃2min；依次在95℃10s，55℃10s，60℃90s，进行40个循环；4℃保温，即得到Sanger法PCR扩增产物；
(5)Sanger法PCR扩增产物纯化及结果分析：
采用EDTA-乙醇梯度洗脱法：将步骤(4)得到的Sanger法PCR扩增产物中加入2μLEDTA和50μL无水乙醇，混匀后于12000rpm 4℃离心20min，甩尽上清液体，留取沉淀，再加入70μL 75％乙醇，混匀沉淀后于12000rpm 4℃离心10min，甩尽上清液体，然后于水浴锅锅盖烘干10min，最后加入10μL HiDi溶解烘干样品，即得到纯化的Sanger法PCR扩增产物；将所述纯化的Sanger法PCR扩增产物上ABI3130基因分析仪检测其基因型。
本发明收集Pubmed/Gene数据库的人CYP3A5的基因组序列，找出CYP3A5*3的特异位点，设计普通PCR扩增引物：前扩增引物(CYP3A5-S)：CCATACAGGCAACATGACTTAG；后扩增引物(CYP3A5-A)：CACAGGGAGTTGACCTTCATAC和Sanger法PCR扩增引物：测序PCR扩增内引物(CYP3A5-As)：GCAGCATTTAGTCCTTGTGA。上述合成引物粉末后，分别采用ddH2O配制成5μM的引物溶液备用。
Sanger法是经典的DNA序列分析技术，相比序列特异引物引导的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction sequence specific primer，PCR-SSP)和序列特异性寡核苷酸探针杂交聚合酶链反应(PCR using sequence-specific oligonucleotides，PCR-SSO)而言，Sanger法无须电泳、DNA片段也无须荧光标记、防止PCR污染，是目前公认的检测单基因突变位点的最精准方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒，具有精准灵敏、特异性强、快捷、样本需求量少、抗污染等优点，实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测CYP3A5*3基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于CNIs的个体化使用。该试剂盒使用方法操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求，将为CNIs药物临床个体化治疗起到积极的推动作用。
附图说明
图1为本发明CYP3A5*1*1检测峰图；
CYP3A5*3位点为AA，即判读为野生型。
图2为本发明CYP3A5*1*3检测峰图；
CYP3A5*3位点为AG，即判读为野生型。
图3为本发明CYP3A5*3*3检测峰图；
CYP3A5*3位点为GG，即判读为野生型。
具体实施方式
以下通过详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等。
【实施例1】Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒
根据Pubmed/Gene数据库的人的CYP3A5基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_007938.1？from＝5003&to＝36805&report＝genbank)，找出CYP3A5*3的特异位点。设计普通PCR扩增引物：前扩增引物(CYP3A5-S)：CCATACAGGCAACATGACTTAG、后扩增引物(CYP3A5-A)：CACAGGGAGTTGACCTTCATAC、以及Sanger法PCR扩增引物：测序PCR扩增内引物(CYP3A5-As)：GCAGCATTTAGTCCTTGTGA。拟扩增的片段长度为455bp(见序列表)。合成引物粉末后，采用ddH2O配制成5μM的引物溶液备用。
本发明Sanger法检测CNIs药物基因多态性试剂盒包括如下引物及试剂：
(1)普通PCR扩增引物：
前扩增引物(CYP3A5-S)：CCATACAGGCAACATGACTTAG；
后扩增引物(CYP3A5-A)：CACAGGGAGTTGACCTTCATAC。
(2)Sanger法PCR扩增引物：
Sanger法PCR扩增内引物(CYP3A5-As)：GCAGCATTTAGTCCTTGTGA。
(3)试剂盒中其他试剂Mix(预混剂)、bigdye(测序试剂)、ddH2O等为普通PCR和Sanger测序的常规试剂。
【实施例2】Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒的使用方法
具体步骤如下：
(1)人基因组DNA提取：
采用自动化核酸提取仪，将200μL待测样品EDTA抗凝全血和20μL蛋白酶K进行人体全基因组DNA提取，最后调整基因组DNA浓度为10-100ng/μL。
(2)普通PCR扩增体系及程序：
按照以下配方，配制普通PCR反应体系，总体积为20μL。具体如下：
表1
组分 体积
Mix 14μL
CYP3A5-S(5μM) 1μL
CYP3A5-A(5μM) 1μL
dd H<sub>2</sub>O 3μL
基因组DNA 1μL
将表1中配好的体系，置于PCR反应仪中，按照以下扩增程序进行普通PCR扩增，得到普通PCR扩增产物，具体扩增程序如下：
(3)普通PCR扩增产物的纯化：
采用酶解纯化法。每10μL普通PCR扩增产物样品，加入1μL核酸外切酶I(Exo I)和2μL虾小肠碱性磷酸酶(SAP)；进行37℃、15min酶消化；85℃、15min酶失活；上述纯化过程直接在PCR仪里完成。
(4)Sanger法PCR扩增体系及程序：
按照以下配方，配制Sanger法PCR反应体系，总体积为10μL。具体如下：
表2
组分 体积
BigDye 3μL
CYP3A5-As(5μM) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 5μL
纯化产物DNA 1μL
将表2中配好的体系，置于PCR反应仪中，按照以下Sanger法PCR扩增程序进行扩增，得到Sanger法PCR扩增产物，具体扩增程序如下：
(5)Sanger法PCR扩增产物的纯化：
采用EDTA-乙醇梯度洗脱法。在上述步骤(4)得到的Sanger法PCR扩增产物中加入2μL EDTA和50μL无水乙醇，涡旋混匀，12000rpm 4℃离心20min，甩尽上清液体，留取沉淀，并加入70μL 75％乙醇，涡旋混匀，12000rpm 4℃离心10min，甩尽上清液体，然后放置水浴锅锅盖烘干10min，最后加入HiDi缓冲液10μL溶解烘干样品，即得到纯化的Sanger法PCR扩增产物；
(6)将上述步骤(5)得到的纯化的Sanger法PCR扩增产物上ABI3130基因分析仪检测基因型：
(6.1)开机上样：Run 3130Data Collection v3.0软件设置系统自检。先是黄色灯亮，提示连接状态良好。自检合格后，绿色等亮。3130开机成功的标志：运行过程中哪个窗口都不能关闭。将炉温升到60℃：manual control→turn on oven→set oven temperature(60℃)。将纯化的Sanger法PCR扩增产物上测序仪的96孔板待测。
(6.2)创建测序实验板(Plate)：在DC软件树中点击“Plate Manager”；在PlateManager栏左下角点击“New”按钮；在New plate Dialog窗口输入板的信息：Name：板的名称(CYP3A5-LL-20160730)；Application选中“Sequencing Analysis”；Plate Type选中“96-Well”；Owner Name输入仪器归属人；Operator Name输入操作者姓名，完成后点击“OK”按钮。进入Sequencing Analysis Plate Editor，编辑Sample name；Priority中选择100；Result group中选择“SEQ-Results Group”；Instrument Protocol中选择“SEQ-BigDyeV3-36-POP7”；Analysis Protocol中选择“3130POP-BDTV3-KB-Denovo_v5.2”；可使用Ctrl+D执行复制功能。编辑完成，点击OK。
(6.3)程序运行：在DC软件树中点击“Run Schedule”：Plate view点击“FindAll”；双击选择前面编辑好的板(Plate)；点击右侧黄色模拟板；点击软件左上角弹出窗口点弹出窗口点击OK。
(6.4)结果分析：打开Sequence analysis软件，添加运行结束的数据文件。根据Sequence评估各样本信号丰度；根据Electropherogram判断峰形及CYP3A5*3位点。CYP3A5*3位点前后序列分别为GTCTTTCA和TATCTCTTC。如果CYP3A5*3位点是AA即判读为野生型(附图1)，AG判读为突变杂合子(附图2)，GG判读为突变纯合子(附图3)。由此判断出不同基因型患者使用CNIs治疗时的疗效和毒副反应，并预测不同移植患者的CNIs药物的推荐初始剂量(表3)。
表3
综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测CYP3A5*3基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于CNIs的个体化使用。
序列表
<110> 武汉大学
<120> Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒及其使用方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 545
<212> DNA
<213> CYP3A5测序序列(CYP3A5 sequence)
<400> 1
ccatacaggc aacatgactt agtagacaga tgacacagct ctagatgtcc atgggcccca 60
caccaactgc ccttgcagca tttagtcctt gtgagcactt gatgatttac ctgccttcaa 120
tttttcactg acctaatatt ctttttgata atgaagtatt ttaaacatat aaaacattat 180
ggagagtggc ataggagata cccacgtatg taccacccag cttaacgaat gctctactgt 240
catttctaac cataatctct ttaaagagct cttttgtctt tcagtatctc ttccctgttt 300
ggaccacatt acccttcatc atatgaagcc ttgggtggct cctgtgtgag actcttgctg 360
tgtgtcacac cctaatgaac tagaacctaa ggttgctgtg tgtcgtacaa ctaggggtat 420
ggattacata acataatgat caaagtctgg cttcctgggt gtggctccag ctgcagaatc 480
gggctagtga agtttaatca gctccgttgt ccccacacag aacgtatgaa ggtcaactcc 540
ctgtg 545
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatacaggc aacatgactt ag 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacagggagt tgaccttcat ac 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcagcattta gtccttgtga 20

Claims (2)

1.一种Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下引物及试剂：
(1)普通PCR扩增引物：
前扩增引物：CCATACAGGCAACATGACTTAG；
后扩增引物：CACAGGGAGTTGACCTTCATAC；
(2)Sanger法PCR扩增引物：
Sanger法PCR扩增内引物：GCAGCATTTAGTCCTTGTGA；
(3)试剂盒中的常规试剂：Mix、bigdye、ddH2O。
2.一种如权利要求1所述的Sanger法检测CNIs药物基因多态性的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)人基因组DNA提取；
(2)普通PCR扩增体系及程序：
(2.1)配制20μL普通PCR反应体系，包括以下含量组分：
(2.2)普通PCR扩增程序：
94℃5min；依次在94℃15s，62℃20s，72℃40s，进行34个循环；72℃5min；4℃保温，即得到普通PCR扩增产物；
(3)普通PCR扩增产物纯化：
采用酶解纯化法：每10μL步骤(2)得到的普通PCR扩增产物，加1μL核酸外切酶I和2μL虾小肠碱性磷酸酶；然后于37℃酶反应15min；再于85℃酶失活15min，即得到纯化的普通PCR扩增产物；上述纯化步骤均在PCR仪里完成；
(4)Sanger法PCR扩增体系及程序：
(4.1)配制10μL Sanger法PCR扩增体系，包括以下含量组分：
(4.2)Sanger法PCR扩增程序：
95℃2min；依次在95℃10s，55℃10s，60℃90s，进行40个循环；4℃保温，即得到Sanger法PCR扩增产物；
(5)Sanger法PCR扩增产物纯化及结果分析：
采用EDTA-乙醇梯度洗脱法：将步骤(4)得到的Sanger法PCR扩增产物中加入2μL EDTA和50μL无水乙醇，混匀后于12000rpm 4℃离心20min，甩尽上清液体，留取沉淀，再加入70μL75％乙醇，混匀沉淀后于12000rpm 4℃离心10min，甩尽上清液体，然后于水浴锅锅盖烘干10min，最后加入10μL HiDi溶解烘干样品，即得到纯化的Sanger法PCR扩增产物；将所述纯化的Sanger法PCR扩增产物上ABI3130基因分析仪检测其基因型。
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