CN102703585A

CN102703585A - 焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102703585A
Application number: CN201210135368XA
Authority: CN
Inventors: 周宏灏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因的多态性试剂盒及方法。具体是指CYP3A5*3(rs776746)和MDR1(rs1045642)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.3—8所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量CYP3A5*3(rs776746)和MDR1(rs1045642)的检测，从而达到对他克莫司用药实现安全合理有效的个体化给药。

Description

焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

通过基因检测实现免疫抑制剂个体化基因导向治疗，是实现器官移植术后免疫抑制治疗成功的关键因素之一。

他克莫司（Tacrolimus, FK605）为一种新型强效免疫抑制剂，对T细胞具有选择性抑制作用，预防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢菌素。其主要由CYP3A4，CYP3A5等代谢酶代谢，其中CYP3A5呈明显的多态性，其活性会显著影响他克莫司血浆及组织药物浓度，从而影响其疗效和不良反应发生率。CYP3A5*3突变等位基因导致CYP3A5酶活性缺失或下降，中国人群发生率约78%，其中突变型纯合子CYP3A5*3/*3约占全部人群的50%。研究表明，野生型(*1/*1)或杂合型(*1/*3)CYP3A5可迅速代谢他克莫司，造成血药浓度下降，因而他克莫司所需的剂量在CYP3A5*1/*1和*1/*3人群中均显著高于CYP3A5*3/*3人群。研究也发现突变型纯合子CYP3A5*3/*3患者出现肾毒性等不良反应的风险是野生型(*1/*1)或杂合型(*1/*3)CYP3A5杂合子患者的2.7倍。

多药耐药基因MDR1(ABCB1)编码的转运体P-gp糖蛋白是药物跨膜转运泵，可以将药物由细胞内向细胞外泵出。因此当MDR1发生基因突变时，影响P-gp的表达和活性，进而可能改变细胞内和体内的血药浓度，影响药物的疗效和不良反应发生率。研究发现MDR1基因3435位C到T的突变，导致转运体活性下降，他克莫司及其代谢物从肾脏中排除减慢，发生肾毒性等不良反应的风险增加。而MDR1基因3435位的突变对他克莫司血药浓度的影响并不明显。

综上所述，CYP3A5*3和MDR1基因多态性是影响他克莫司需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP3A5*3和MDR1基因多态性的试剂盒将为他克莫司的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

CYP3A5*3 (rs776746)和MDR1 C3435T (rs1045642)基因多态性是影响他克莫司剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床他克莫司个体化用药治疗的用药基因CYP2D6（SEQ ID NO.1）和SULT1A1（SEQ ID NO.2）多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测他克莫司个体化用药相关基因SNP。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

（1）扩增引物：

CYP3A5*3 (rs776746)上游引物：5′-ACG TAT GTA CCA CCC AGC TT -3′（SEQ ID NO.3）；

MDR1 C3435T (rs1045642) 上游引物：5′- GCT GAG AAC ATT GCC TAT GGA -3′（SEQ ID NO.4）；

CYP3A5*3 (rs776746)下游引物：5′-GCC AGA CTT TGA TCA TTA TGT TA-3′（SEQ ID NO.5）；

MDR1 C3435T (rs1045642)下游引物：5′- CAT GCT CCC AGG CTG TTT AT -3′（SEQ ID NO.6）；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

（2）测序引物：

CYP3A5*3 (rs776746)测序引物：5′- AGA GCT CTT TTG TCT TTC A -3′（SEQ ID NO.7）；

MDR1 C3435T (rs1045642) 测序引物：5′- GGT GTC ACA GGA AGA GAT -3′（SEQ ID NO.8）；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用上述试剂盒检测他克莫司用药基因多态性的方法，包括如下步骤：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 10.0μl， dNTP 3.0μl，上游引物 1.0μl，下游引物1.0μl， rTaq1.0μl，水30.0μl，模板4.0μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95^oC 5min预变性；然后依次在95^oC 30S, 52^oC 30S, 67^oC 30S,进行40个循环；再在72^oC 保持5min，最终保持在4^oC，得扩增产物；

（3）焦磷酸测序单链样本纯化；

（4）焦磷酸测序及结果分析。

本发明的试剂盒对CYP3A5*3 (rs776746)目标序列和MDR1 C3435T (rs1045642)目标序列进行分析和检测；其中，CYP3A5*3 (rs776746)目标序列包括：野生型TTGAAAGA（SEQ ID NO.9）和突变型CTGAAAGA（SEQ ID NO.10），扩增出的片段长度为248bp；MDR1 C3435T (rs1045642)目标序列包括：野生型ATCGTG（SEQ ID NO.11）和突变型ATTGTG（SEQ ID NO.12），扩增出的片段长为145bp。

由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对他克莫司个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上他克莫司个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。

附图说明

图1为本发明CYP3A5*3 TT焦磷酸测序结果；

图2为本发明CYP3A5*3 CC焦磷酸测序结果；

图3为本发明MDR1 C3435T CC焦磷酸测序结果；

图4为本发明MDR1 C3435T CT焦磷酸测序结果；

图5为本发明MDR1 C3435T TT焦磷酸测序结果。

具体实施方式

下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。

实施例1：

1. DNA提取

1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：

(1) 检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√； (2)异丙醇（如无，可用无水乙醇替代）和75% 乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。

1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；

1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；

1.4分别移取900uL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；

1.5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；

1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；

1.713,000rpm室温离心20秒；

1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；

1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；

1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；

1.11移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；

1.12打开Eppendorf管，移取100uL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；

1.13 移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；

1.14 移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；

1.15 13,000rpm室温离心1min；

1.16 打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；

1.17 移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；

1.18 13,000rpm室温离心1min；

1.19 打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；

1.20 在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；

1.21 目测沉淀大小，加入50~100ul DNA Rehydration Solution至沉淀；

1.22 过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNA Rehydration Solution溶解DNA。

1.23 在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；

1.24 保存核酸标本至4℃冰箱；

2.聚合酶链反应

2.1在试剂准备区配制50μl PCR扩增体系（模板添加除外），各组分及添加量如下表：

注：上游引物和下游引物各有两种，这里的1.0μl是指每种上游引物各加0.5μl，以及每种下游引物各加0.5μl。

2.2 在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加4.0μl至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；

2.3 在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪：

2.4 设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；

2.5 点击“start”开始仪器运行。

3.焦磷酸测序单链样本纯化

3.1 纯化前试剂和仪器准备：

进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。

3.2单链样本纯化操作：

3.2.1在PSQ 96板中先加40 μlAnnealing Buffer和2~3μl测序引物(10uM)；

3.2.2在振荡器上充分混匀Sepharose Beads；

3.2.3将所需Sepharose Beads量(每样本3μl计算)转移到1.5mL Eppendorf管；

3.2.4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer，使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；

3.2.5将Sepharose Beads混合物加至约40μl PCR产物中，每样本加40μl；

3.2.6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；

3.2.7在Vacuum prep workstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml 70％乙醇、Denaturation Buffer和Washing Buffer；

3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；

3.2.9打开Vacuum Prep Workstation的真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool在纯水中清洗30秒；

3.2.10将Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的Sepharose Beads；

3.2.11拿起PCR板，检查Beads是否都被吸附在了Vacuum Prep Tool上；

3.2.12将Vacuum Prep Tool放入70％乙醇中5秒；

3.2.13将Vacuum Prep Tool移到Denatureation Buffer中5秒；

3.2.14再将Vacuum Prep Tool移到Washing Buffer中清洗10秒；

3.2.15把Tool悬放在Pyro反应板；

3.2.16 Vacuum Prep Tool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放Sepharose Beads；

3.2.17放有纯化样本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游Pyrosequencing反应。

3.3纯化完毕后清洗：

3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗Vacuum Prep Tool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；

3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool；

3.3.3关掉真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool侧放，室温晾干；

3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；

3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。

4. 焦磷酸测序

4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；

4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；

4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。

5. 焦磷酸测序结果分析

在“SNP Runs”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQ mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测CYP3A5*3 和MDR1 C3435T基因多态性，焦磷酸检测结果如图1~5。可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对CYP3A5*3 和MDR1 C3435T基因多态性进行检测和判读。图1~2提示CYP3A5*3分别为野生型纯合子、突变型纯合子；图3~5提示MDR1 C3435T为野生型纯合子、突变型杂合子、突变型纯合子。临床医生可根据CYP3A5*3 和MDR1 C3435T基因多态性，判断出不同基因型患者使用他克莫司治疗时的疗效和毒副反应。

综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测CYP3A5*3 和MDR1 C3435T基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于他克莫司的个体化使用。

SEQUENCE LISTING

<110> 周宏灏

<120> 焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

tttgttcact agaagcaagt gggagaaagc tttgcctctt tgtacttctt catcttctcc 60

cctcaagtcc tcagaatcca cagcgctgac tgtggagtgc tgtggagctg gcatggccca 120

tacaggcaac atgacttagt agacagatga cacagctcta gatgtccatg ggccccacac 180

caactgccct tgcagcattt agtccttgtg agcacttgat gatttacctg ccttcaattt 240

ttcactgacc taatattctt tttgataatg aagtatttta aacatataaa acattatgga 300

gagtggcata ggagataccc acgtatgtac cacccagctt aacgaatgct ctactgtcat 360

ttctaaccat aatctcttta aagagctctt ttgtctttca rtatctcttc cctgtttgga 420

ccacattacc cttcatcata tgaagccttg ggtggctcct gtgtgagact cttgctgtgt 480

gtcacaccct aatgaactag aacctaaggt tgctgtgtgt cgtacaacta ggggtatgga 540

ttacataaca taatgatcaa agtctggctt cctgggtgtg gctccagctg cagaatcggg 600

ctagtgaagt ttaatcagct ccgttgtccc cacacagaac gtatgaaggt caactccctg 660

tgctggccat cacagatccc gacgtgatca gaacagtgct agtgaaagaa tgttattctg 720

tcttcacaaa tcgaagggta agcatccatt ttttgaaatt taaataatga ttgatccact 780

gattaaattt ttattttgaa a 801

<210> 2

<211> 511

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

ctcacagtaa cttggcagtt tcagtgtaag aaataatgat gttaattgtg ctacattcaa 60

agtgtgctgg tcctgaagtt gatctgtgaa ctcttgtttt cagctgcttg atggcaaaga 120

aataaagcga ctgaatgttc agtggctccg agcacacctg ggcatcgtgt cccaggagcc 180

catcctgttt gactgcagca ttgctgagaa cattgcctat ggagacaaca gccgggtggt 240

gtcacaggaa gagathgtga gggcagcaaa ggaggccaac atacatgcct tcatcgagtc 300

actgcctaat gtaagtctct cttcaaataa acagcctggg agcatgtggc agcctctctg 360

gcctatagtt tgatttataa ggggctggtt tcccagaagt gaagagaaat tagcaaccaa 420

atcacaccct tacctgtata caagcatctg gccacacttc ctgtttgggt tagttgttac 480

ctttacctga tcacctgacc ctccttgtga g 511

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

acgtatgtac cacccagctt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

gctgagaaca ttgcctatgg a 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

gccagacttt gatcattatg tta 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

catgctccca ggctgtttat 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

agagctcttt tgtctttca 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

ggtgtcacag gaagagat 18

<210> 9

<211> 8

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

ttgaaaga 8

<210> 10

<211> 8

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

ctgaaaga 8

<210> 11

<211> 6

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

atcgtg 6

<210> 12

<211> 6

<212> DNA

<213> 智人

<400> 12

attgtg 6

Claims

1.一种焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：

（1）扩增引物：

上游引物：5′-ACG TAT GTA CCA CCC AGC TT-3′；

5′- GCT GAG AAC ATT GCC TAT GGA -3′；

下游引物：5′-GCC AGA CTT TGA TCA TTA TGT TA-3′；

5′- CAT GCT CCC AGG CTG TTT AT -3′；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

（2）测序引物：5′- AGA GCT CTT TTG TCT TTC A -3′；

5′- GGT GTC ACA GGA AGA GAT -3′。

2.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测他克莫司个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 10.0μl， dNTP 3.0μl，上游引物 1.0μl，下游引物1.0μl， rTaq1.0μl，水30.0μl，模板4.0μl；循环程序为：95^oC 5min预变性；依次在95^oC 30S，52^oC 30S，67^oC 30S，进行40个循环； 72^oC 保持5min，最终保持在4^oC，得扩增产物；

（3）焦磷酸测序单链样本纯化；

（4）焦磷酸测序及结果分析。