CN102676667A - 焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。具体是指TPMT(rs1142345)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.3—6所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量TPMT(rs1142345)的检测，从而达到对巯嘌呤用药实现安全合理有效的个体化给药。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术
硫嘌呤是6-巯基嘌呤咪唑衍生物，为具有免疫抑制作用的抗代谢剂。可产生烷基化作用抑制核酸的生物合成，防止细胞的增生，并可引起的DNA损伤。通过抑制T淋巴细胞而影响免疫，可抑制迟发过敏反应。临床上主要用于急慢性白血病、绒毛膜上皮癌和器官移植。巯嘌呤甲基转移酶（TPMT）参与巯嘌呤和咪唑硫嘌呤的甲基化作用，与其化疗效果和毒性关系密切。TPMT的活性受到遗传多态性的影响，它可以通过TPMT改变巯嘌呤的代谢率。TPMT的活性在患者间个体差异明显，86.6％的野生型TPMT*1人群TPMT活性较高，而11.1％具有中等活性，有0.3％活性缺失。其中3个（TPMT*2，*3A和*3C[G460A]）占中等和低活性状况的80-95％。TPMT*3A的患者TPMT活性完全丧失，TPMT*3B和TPMT*3C患者的TPMT催化活性分别降低9和1.4倍。区分TPMT*1/*3（中等代谢者）和TPMT*3B/*3C（低代谢者）。研究表明，TPMT中等活性和较低活性的患者只能接受10％～50％的平均巯嘌呤化疗剂量。人群中约0.3％的TPMT活性缺失，11％的人群活性中等，都面临着患骨髓抑制增加的风险。TPMT基因的遗传变异对于急性淋巴细胞性白血病化疗反应的疗效和毒副作用具有重要意义。TPMT活性与上述嘌呤类药物的治疗效果及毒副作用密切相关，是目前FDA批准修改药物说明书增加基因遗传变异警示的有限的几种药物之一，临床医生应结合TPMT基因型慎重使用嘌呤类药物。
综上所述，TPMT (rs1142345)基因多态性是影响硫嘌呤需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测TPMT (rs1142345)基因多态性的试剂盒将为硫嘌呤的临床个体化治疗起到积极的推动作用。
焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
TPMT (rs1142345)基因多态性是影响巯嘌呤剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床巯嘌呤个体化用药治疗的用药基因TPMT (rs1142345)（SEQ ID NO.1）多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测巯嘌呤个体化用药相关基因SNP。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物：
（1）扩增引物：
TPMT (rs1142345)上游引物：5′- TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA-3′（SEQ ID NO.2）；
TPMT (rs1142345)下游引物：5′- TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGC-3′（SEQ ID NO.3）；
其中，下游引物的5′进行生物素标记；
（2）测序引物：
TPMT (rs1142345)测序引物：5′- GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3′（SEQ ID NO.4）；
试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。
一种应用上述试剂盒检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤：
（1）DNA提取；
（2）聚合酶链反应：
配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5.0μl， dNTP 3.0μl，上游引物 0.5μl，下游引物0.5μl， rTaq0.5μl，水39.5μl，模板1.0μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95 oC 5min预变性；然后依次在95oC 30S, 55oC 30S, 72oC 30S，进行35个循环；再在72oC 保持5min，最终保持在4 oC，得扩增产物；
（3）焦磷酸测序单链样本纯化；
（4）焦磷酸测序及结果分析。
本发明的试剂盒对TPMT (rs1142345)目标序列进行分析和检测：野生型AGTTATATCTAC（SEQ ID NO.5）和突变型AGTTATGTCTAC（SEQ ID NO.6），扩增出的片段长度为132bp。
由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对他莫昔芬个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上他莫昔芬个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
附图说明
图1为本发明TPMT (rs1142345) AA焦磷酸测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。
实施例1：
TPMT (rs1142345)上游引物：5′- TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA-3′（SEQ ID NO.2）；
TPMT (rs1142345)下游引物：5′- TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGC-3′（SEQ ID NO.3）；
TPMT (rs1142345)测序引物：5′- GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3′（SEQ ID NO.4）；
1. DNA提取
1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：
(1) 检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√； (2)异丙醇（如无，可用无水乙醇替代）和75% 乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。
1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
1.4分别移取900uL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；
1.5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；
1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；
1.713,000rpm室温离心20秒；
1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；
1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；
1.11移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
1.12打开Eppendorf管，移取100uL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；
1.13 移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；
1.14 移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；
1.15 13,000rpm室温离心1min；
1.16 打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；
1.17 移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
1.18 13,000rpm室温离心1min；
1.19 打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；
1.20 在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；
1.21 目测沉淀大小，加入50~100ul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22 过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNA Rehydration Solution溶解DNA。
1.23 在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24 保存核酸标本至4℃冰箱；
2.聚合酶链反应
2.1在试剂准备区配制50μl PCR扩增体系（模板添加除外），各组分及添加量如下表：
2.3 在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪：
2.4 设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；
2.5 点击“start”开始仪器运行。
3.焦磷酸测序单链样本纯化
3.1 纯化前试剂和仪器准备：
进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。
3.2单链样本纯化操作：
3.2.1在PSQ 96板中先加40 μlAnnealing Buffer和2~3μl测序引物(10uM)；
3.2.2在振荡器上充分混匀Sepharose Beads；
3.2.3将所需Sepharose Beads量(每样本3μl计算)转移到1.5mL Eppendorf管；
3.2.4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer，使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；
3.2.5将Sepharose Beads混合物加至约40μl PCR产物中，每样本加40μl；
3.2.6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；
3.2.7在Vacuum prep workstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml 70％乙醇、Denaturation Buffer和Washing Buffer；
3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；
3.2.9打开Vacuum Prep Workstation的真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool在纯水中清洗30秒；
3.2.10将Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的Sepharose Beads；
3.2.11拿起PCR板，检查Beads是否都被吸附在了Vacuum Prep Tool上；
3.2.12将Vacuum Prep Tool放入70％乙醇中5秒；
3.2.13将Vacuum Prep Tool移到Denatureation Buffer中5秒；
3.2.14再将Vacuum Prep Tool移到Washing Buffer中清洗10秒；
3.2.15把Tool悬放在Pyro反应板；
3.2.16 Vacuum Prep Tool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放Sepharose Beads；
3.2.17放有纯化样本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游Pyrosequencing反应。
3.3纯化完毕后清洗：
3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗Vacuum Prep Tool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；
3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool；
3.3.3关掉真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool侧放，室温晾干；
3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；
3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。
4. 焦磷酸测序
4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；
4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；
4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。
5. 焦磷酸测序结果分析
在“SNP Runs”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQ mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测TPMT (rs1142345)基因多态性，焦磷酸检测结果如图1。可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对TPMT (rs1142345)基因多态性进行检测和判读。图1提示TPMT (rs1142345)为野生型纯合子。临床医生可根据TPMT基因多态性，判断出不同基因型患者使用巯嘌呤治疗时的疗效和毒副反应。
综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测TPMT (rs1142345)基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于巯嘌呤的个体化使用。
SEQUENCE LISTING
<110> 周宏灏
<120> 焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 601
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (127)..(127)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
tttgtatttt tagtagagac agagtttcac catcttggcc aggctggtca tgaactcctg 60
acctcaagtg atccacctgc ctcggcctcc caaagtgttg ggattacagg tgtgagccac 120
cgcaccnagc caattttgag tatttttaaa agaatccctg atgtcattct tcatagtatt 180
ttaacatgtt actctttctt gtttcargta aaatatgcaa tatacrtygt cttgagaagg 240
ttgatgcttt tgaagaacga cakaaaagtt ggggaattga ctgtcttttt gaaaagttat 300
rtctacttac agaaaagtaa atgagacata gataaaataa aatcacactg acatgttttt 360
gaggaattga aaattatgct aaagcctgaa aatgtaatgg atgaattttt aaaattgttt 420
ataaatcata tgatagatct ttactaaaaa tggcttttta gtaaagccat ttactttttc 480
taaaaaagtt ttagaagaaa aagatgtaac taaactttta aagtagctcc tttggagagg 540
agattatgat gtgaaagatt atgcctatgt gtcttgcaga ttgcaagata ttttaccaat 600
c 601
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
tggggaattg actgtctttt tga 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
tccattacat tttcaggctt tagc 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gactgtcttt ttgaaaagtt 20
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
agttatatct ac 12
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
agttatgtct ac 12
Claims (2)
1.焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：
（1）扩增引物：
上游引物：5′-TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA-3′；
下游引物：5′-TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGC-3′；
其中，下游引物的5′进行生物素标记；
（2）测序引物：5′- GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3′。
2.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤：
（1）DNA提取；
（2）聚合酶链反应：
配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5.0μl，dNTP 3.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水39.5μl，模板1.0μl；循环程序为：95 oC 5min预变性；依次在95oC 30S, 55oC 30S, 72oC 30S,进行35个循环； 72oC 保持5min，最终保持在4 oC，得扩增产物；
（3）焦磷酸测序单链样本纯化；
（4）焦磷酸测序及结果分析。
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|---|---|
| CN (1) | CN102676667A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104032020A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-09-10 | 上海中优医药高科技有限公司 | Hrm分析技术检测硫嘌呤个体化用药基因多态性的方法 |
| CN105506097A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-20 | 广州金域检测科技股份有限公司 | 一种检测tpmt基因*2多态性的引物与方法 |
| CN105506098A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-20 | 广州金域检测科技股份有限公司 | 一种检测tpmt基因*3c多态性的引物与方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101333560A (zh) * | 2007-06-29 | 2008-12-31 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 嘌呤类药物敏感基因检测试剂盒 |
| CN101619352A (zh) * | 2009-01-23 | 2010-01-06 | 中南大学 | 一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒 |
| CN101671739A (zh) * | 2009-10-19 | 2010-03-17 | 广州益善生物技术有限公司 | Tpmt基因snp检测的特异性序列、液相芯片及方法 |
| CN101821408A (zh) * | 2007-08-09 | 2010-09-01 | 奥塔戈大学 | 鉴别个体处于硫代嘌呤药物抗性和不耐受性风险的方法 |
-
2012
- 2012-05-04 CN CN2012101353660A patent/CN102676667A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101333560A (zh) * | 2007-06-29 | 2008-12-31 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 嘌呤类药物敏感基因检测试剂盒 |
| CN101821408A (zh) * | 2007-08-09 | 2010-09-01 | 奥塔戈大学 | 鉴别个体处于硫代嘌呤药物抗性和不耐受性风险的方法 |
| CN101619352A (zh) * | 2009-01-23 | 2010-01-06 | 中南大学 | 一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒 |
| CN101671739A (zh) * | 2009-10-19 | 2010-03-17 | 广州益善生物技术有限公司 | Tpmt基因snp检测的特异性序列、液相芯片及方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SOFIE HAGLUND, ET AL.: "Pyrosequencing of TPMT Alleles in a General Swedish Population and in Patients with Inflammatory Bowel Disease", 《 CLINICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104032020A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-09-10 | 上海中优医药高科技有限公司 | Hrm分析技术检测硫嘌呤个体化用药基因多态性的方法 |
| CN105506097A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-20 | 广州金域检测科技股份有限公司 | 一种检测tpmt基因*2多态性的引物与方法 |
| CN105506098A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-04-20 | 广州金域检测科技股份有限公司 | 一种检测tpmt基因*3c多态性的引物与方法 |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120919 |