CN101821408A - 鉴别个体处于硫代嘌呤药物抗性和不耐受性风险的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定个体处于硫代嘌呤药物不耐受性风险的方法和试剂盒，其基于检测与硫代嘌呤药物的抗性或不耐受性相关的TPMT基因启动子突变的存在。

Description

鉴别个体处于硫代嘌呤药物抗性和不耐受性风险的方法
发明领域
本发明涉及鉴定个体处于硫代嘌呤药物不耐受性(intolerance)风险的方法和试剂盒。这些方法和试剂盒基于检测与硫代嘌呤抗性或不耐受性相关的TPMT基因启动子的突变的出现。
发明背景
硫代嘌呤药物(主要为硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤)被用于治疗广泛的疾病。这些当中有急性成淋巴细胞性白血病，与实体器官移植相关的并发症，自身免疫性疾病如风湿性关节炎和炎性肠病(IBD)以及皮肤病情况。
硫代嘌呤药物是惰性的并且在体内通过代谢形成活性代谢物6-甲巯基嘌呤核苷(6-MMPR)以及6-硫代鸟嘌呤核苷(thioguanine)(6-TGN)。6-TGN是有益的，而6-MMPR可能是有毒的。不幸的是，高达40％的个体显示了使用硫代嘌呤药物治疗时的抗性或不耐受性。一部分对硫代嘌呤治疗抗性的个体不能达到6-TGN的治疗水平，并且代替的累积6-MMPR达到肝毒素水平(＞5700pmol/8×108RBC)。
硫代嘌呤S-甲基转移酶(TPMT)是一种细胞质酶，其可以催化硫代嘌呤药物的S-甲基化作用。这种酶是多形态的，在0.6％左右的高加索人血红细胞(RBCs)中表现出了完全缺乏，11％中活性，以及89％有正常TPMT活性(Wang等，2006)。TPMT的缺乏，其会提高来自这些药物的骨髓中毒性风险，已经研究了超过25年，并且，极少的药物遗传学例子中的一个已经从研究转至诊断仪器。US5,856095，示例显示了TPMT基因的基因突变，该突变导致了降低的TPMT活性并且当病人使用标准剂量的硫代嘌呤药物治疗时，其直接与潜在的致命的造血细胞毒性相关，并因此直接联系到了硫代嘌呤药物的不耐受性或抗性。不幸的是，不是所有的硫代嘌呤抗性或不耐受性患者都显示了降低的TPMT活性。大约1-2％的高加索人表现了极高的TPMT活性，其可以致使硫代嘌呤治疗抗性或肝细胞毒性。迄今为止还没有对这种TPMT的过度变形(ultrametaboliser)(UM)表型的满意的分子解释。
提供了鉴定处于硫代嘌呤抗性或不耐受性的个体极高的TPMT活性的工具(means)的一种分析或方法可以对试图证明需要硫代嘌呤治疗的个体是否有这样一种风险的医师是有效的。
因此本发明的一个目的是提供方法和试剂盒，为了鉴定有TPMT UM表型的个体是否处于硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险，或者至少提供给公众一种有用的选择。
发明概述
本发明者已经令人惊奇地发现了硫代嘌呤S-甲基转移酶(TPMT)中存在的未被认识的突变，其与UM表型以及个体对硫代嘌呤治疗的应答相关。更具体地说，TPMT的启动子区域的突变已经被鉴定与UM表型以及与个体在进行硫代嘌呤治疗时的抗性或不耐受性相关。
在这份说明书中指示了关于SEQ ID NO：1的位置，除非上下文中有其它的指示。两个特定的突变此处鉴定位于TPMT的启动子区域。突变影响了下述区域，该区域正常包括一串六个连续重复的GCC基序，致使丢失或增加一个重复，分别为GCC(5)或GCC(7)。可以预期该区域的任何突变，结果为缺失或获得一个或多个GCC重复，将与UM表型以及硫代嘌呤不耐受性或抗性相关。
一方面，本发明提供了一种筛查与UM表型及与处于硫代嘌呤抗性或不耐受性风险相关的一个或多个突变的存在或不存在的方法，所述方法包括确定个体关于TPMT基因启动子的基因型状态的步骤。
突变可能包括一个或多个额外的GCC重复序列，或者缺失一个或多个GCC重复序列。优选的，突变包括添加单个GCC重复获得GCC(7)(SEQ IDNO：4)，或者单个GCC重复的缺失以获得GCC(5)(SEQ ID NO：3)。
基因型状态可能通过从所述个体上获得的DNA，通过直接或间接的方法进行确定。
优选的DNA样品从个体中获得，TPMT启动子的基因型状态通过直接或间接的方法，评价编码TPMT的核苷酸序列的启动子的GCC重复区(SEQID NO：1)的至少一个不同的存在。
更优选的，通过确定TPMT启动子的GCC重复区的突变的存在确定基因型状态。其可能被确定为人基因组序列的一部分，其中特征数据从其自身的基因组序列中确定，通过与已知特征进行比对，或突变可能被特定地检测。突变可能由一个或多个GCC重复序列的缺失或一个或多个GCC重复序列的获得组成。优选的，突变由单个GCC重复的缺失或单个GCC重复的获得组成，其分别选自SEQ ID NO 3或4，使用直接或间接的方法。
在另一个具体实施方案中本发明提供了鉴定个体处于硫代嘌呤抗性或不耐受性风险地方法，所述方法包括：
从所述个体中获取DNA样本，鉴定TPMT启动子的GCC重复区的突变，其中所述突变的存在与UM表型和处于硫代嘌呤抗性和不耐受性的风险相关。
突变可能由一个或多个额外的GCC重复序列组成或者由一个或多个GCC重复序列的缺失组成。
优选的突变由添加单个GCC重复GCC(7)(SEQ ID NO：4)组成，或者单个GCC重复的缺失GCC(5)(SEQ ID NO：3)组成。
在另外的一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其适于用作检测TPMT启动子的GCC重复基序的突变。突变优选选自包括SEQ ID NO3或4的组，并且本发明的核酸分子可能由具有SEQ ID NO1的大约至少15个连续核苷酸或其互补序列组成。
在一个具体实施方式中，核酸分子由探针组成，探针具有结合到包括本发明的至少一个突变的核苷酸序列的序列。
在另一个具体实施方式中，核酸分子由引物组成，引物具有结合到TPMT启动子的本发明的突变的上游或下游的序列。在一个优选的实施方案中引物结合到TPMT启动子GCC连续(sequential)重复基序的上游或者下游，并且与所述GCC重复基序距离多至(up to)一个碱基。
突变可能包括一个或多个GCC重复基序的缺失或获得。优选的，突变包括单个GCC重复基序的缺失或获得，分别得到GCC(5)或GCC(7)。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其具有SEQ ID NO：1的序列，并且包括在GCC重复基序的一个突变。该突变可能包括一个或多个GCC重复基序的缺失或获得。优选的突变选自包括SEQ ID NO 3或4，或者其功能片段，变体或其反义分子。
核酸分子可能可选的包括肽核酸(PNA)。核酸分子可能进一步包括可检测的标签，优选的为荧光标签或放射性同位素标签。可选择的，基因组DNA样品可能是荧光或放射性标记的。
另一方面，本发明涉及纯化的肽，该肽是由本发明的多核苷酸分子编码的，并且涉及抗这些肽的抗体。
另一方面，本发明提供了此处确定的TMPT启动子的GCC突变的用途，用于检测个体具有UM表型以及处于硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险，基于所述个体的个人基因组序列的评估。
突变可能包含一个或多个GCC重复序列的缺失，或者一个或多个GCC重复序列的获得。优选的突变包括单个GCC重复序列的缺失或获得，并且选自包含SEQ ID NO 3或4。
另一方面，本发明提供了用于鉴定个体具有UM表型以及处于硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险的诊断试剂盒，基于TPMT启动子的基因型状态的评估。
在一个优选的具体实施方式中，该试剂盒包括本发明的探针。
可选的，试剂盒包含引物，引物结合到TPMT启动子或其反义链，可与GCC连续重复基序距离多至一个碱基。引物可能是所述基序的上游或下游。
在另一方面，本发明提供了一种诊断试剂盒，用于确定个体具有UM表型并且处于处于硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险，其包括第一和第二引物，引物分别为TPMT启动子的核酸序列或其反义链的上游和下游的互补序列，其在GCC连续重复基序上有突变。
突变可能包括一个或多个GCC重复序列的缺失，或一个或多个GCC重复序列的获得。优选的突变包括单个GCC重复序列的缺失或获得，选自SEQ ID NO 3或4。
现在对发明所涉及的序列和附图进行描述：
序列
SEQ ID NO：1为UCSC基因组浏览器公开的TPMT启动子的基因组序列(http://www.genome.ucsc.edu.2006年3月汇总)；
SEQ ID NO：2为来自TPMT启动子的部分基因组序列，其显示了未突变的GCC连续重复基序(GCC(6))；
SEQ ID NO：3为来自TPMT启动子的部分基因组序列，其显示了GCC连续重复基序上的突变，其中突变包括一个重复的缺失来获得GCC(5)。
SEQ ID NO：4为来自TPMT启动子的部分序列，其显示了GCC连续重复基序上的突变，其中突变包括获得了一个重复来获得GCC(7)。
附图简述
图1表示TPMT活性在人群中的三型分布；
图2表示硫唑嘌呤代谢的示意图；
图3a表示TPMT启动子的基因组；
图3b表示野生型的人类TPMT启动子序列与八个其他的哺乳动物种类的TPMT启动子序列的比对，显示了GCC重复基序的保守程度；
图4表示野生型TPMT启动子序列和各种显示了本发明的突变的启动子序列的电泳图；以及
图5表示野生型和TPMT启动子的变体在报告基因确定中的活性。
发明详述
定义
此处所用的名词“药物”指的是在医疗背景下施用给人们来治疗或预防或控制疾病或情况(或症状(condition))的化学个体(entity)。
名词“治疗”指的是预期对个体在某条件下产生有益变化的一种过程。有益变化可以是，例如，包括其中一个或多个：恢复功能，减轻症状，限制或延缓疾病、紊乱、症状的发展，或预防，限制或延缓个体情况、疾病或紊乱的恶化。
在本发明的背景中，“硫代嘌呤治疗”包括对个体施用硫代嘌呤药物。非限制的硫代嘌呤药物的例子为硫唑嘌呤(
Figure GPA00001087109500051
)以及6-巯基嘌呤(
Figure GPA00001087109500052
)。
在说明书中“硫代嘌呤不耐受性”指的是一种副作用，例如在个体进行硫代嘌呤治疗中的肝脏毒性。
“硫代嘌呤抗性”指的是在个体进行硫代嘌呤治疗时缺少治疗想要的结果。
“个体”指的是人类。
本发明的“突变”指的是基因的变体形式，其关于TPMT基因的启动子序列上的GCC连续重复序列，并且与UM表型相关。
“引物”指的是单链核酸分子，还指的是寡核苷酸，可以特异性杂交(结合)到DNA的互补序列的预计区域。引物是聚合酶链式反应(PCR)中及多种多态性检测方法中的关键试剂。它们提供了PCR中和多种多态性检测中使用的聚合酶的特异性起始位点。
“基因型”或“基因型状态”指的是一系列方法，包括Kwok(2001)综述的那些方法，其确定个体DNA的核酸在多态性或突变位点的性质。
本发明详述和权利要求中用到的术语“包括”指的是“包括至少一部分”，换句话说本发明详述和权利要求中解释说明的语句中包含“包括”，每个语句中该术语后的特征都应当出现，并且其他特征也可出现。相关的名词如“包含”和“被包含”适用类似方式理解。
详述
硫代嘌呤S-甲基转移酶(TPMT；EC 2.1.1.67)是一种细胞溶质酶，可催化硫代嘌呤药物硫唑嘌呤(AZA)和6-巯基嘌呤(6-MP)的S-甲基化作用。这种酶是多形态的，在0.6％左右的高加索人中血红细胞中(RBCs)表现出了完全缺乏(弱甲基剂-PM)，11％中等活性(中等甲基剂-IM)，以及89％正常TPMT活性(广泛甲基剂-EM)(Wang等，2006)。再者1-2％的高加索人落在这种三型分布外，并且显示了超高的TPMT活性(超高甲基剂，UMs)(图1)。因为硫代嘌呤免疫抑制剂有相对狭窄的治疗范围，TPMT基因的突变在鉴定两种关键活性的硫代嘌呤代谢产物，6-甲巯基嘌呤核苷(6-MMPR)和硫代鸟嘌呤硫代鸟嘌呤(6-TGN)的比例起着关键的作用，因此影响了硫代嘌呤治疗的有效性和毒性(参见图2)。PM个体，以及较少程度的IM个体，在施用正常剂量的AZA和6-MP时具有更高的风险的骨髓抑制，其归因于提高的6-TGN浓度。相反的，具有超高TPMT活性的个体更容易经历治疗抗性(归因于亚治疗6-TGN的浓度)以及作为提高的6-MMPR浓度的结果，还更易经历肝毒性。多数TPMT的缺乏的分子学基础现在已经被很好地建立，其中极少数例子之一药物遗传学的现象已经转化为广泛使用的诊断测试来指导处方。相反，显著提高酶活性的原因还不清楚，虽然强的家族性关联暗示这种现象可能有遗传基础。
本发明人已经第一次发现了在表现极高的TPMT活性的病人的TPMT启动子的三核苷酸(GCC)重复区的突变。这些高TPMT活性与硫代嘌呤抗性和不耐受性的风险相关。
据此，一方面，本发明提供了一种筛查个体突变存在与否的方法，该突变与极高水平的TPMT活性(UM表型)相关，并且与硫代嘌呤抗性和不耐受性的风险相关。该方法至少包括确定个体TPMT启动子的基因型状态的步骤。
基因型状态可能通过直接或间接的方法，用从所述个体中获得的DNA进行检测。
TPMT启动子的GCC连续重复区域正常包括6个GCC重复(SEQ IDNO：2)。
TPMT启动子的GCC连续重复区的两个突变已经被鉴定，并且显示了其与UM表型及个体在经历这种治疗时硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险相关。这些突变包括单个GCC重复序列的缺失获得GCC(5)(SEQ ID NO：3)，或得到单个GCC重复序列获得GCC(7)(SEQ ID NO：4)。
但是，可以预计在此区域的任何突变，导致缺失或获得一个或多个GCC重复，将与UM表型以及硫代嘌呤不耐受性或抗性的风险相关。
在一些个体中，一个或多个多态性或突变的存在已经显示导致抗性，同时其他的个体可能表现了药物不耐受性。有一些个体同时表现硫代嘌呤的不耐受性和抗性。通过联系治疗结果同特定的多态性或突变，风险模式(profile)可以被证实来检测具有相同的多态性或突变的个体处于硫代嘌呤不耐性和/或抗性的风险。
因此，在另一个具体实施方式中，本发明提供了一种鉴定个体硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险，所述方法包括：
从所述个体中获得DNA样品，以及鉴定TPMT启动子的GCC重复区的突变，其中所述突变的存在与UM表型和硫代嘌呤抗性或不耐受性相关。
突变可能包括(或由下述组成)一个或多个GCC重复序列的缺失或获得。
优选的突变包括(或由下述组成)单个GCC重复序列的缺失(SEQ IDNO：3)，或单个GCC重复序列的获得(SEQ ID NO：4)。
确定这些突变使得在个体硫代嘌呤治疗过程中的记录得以保持。因此突变分布可以被证实硫代嘌呤不耐受性或抗性的可能性和特殊的突变相关，基于选自相同的或相似的TPMT突变个体的结果。
使用突变分布，随后个体可以被更精确的评估来证实硫代嘌呤治疗是否更可能有效。当发现了成功治疗的低可能性，可使用可选的治疗，包括甲氨蝶呤，英夫利昔单抗(inflixmab)以及其他的生物制剂。可选的(alternatively)，当必要时个体可能直接推入手术室。
分布还可以被用来确定硫代嘌呤治疗中适当的治疗剂量以及频率范围，通过比较具有同样或相似突变个体的各种成功治疗剂量以及频率范围。
其它风险因子可以被结合到执业医师的分析中，来支持成功的硫代嘌呤治疗预后。这些风险因子可以是临床的和遗传学的，可能包括TPMT的突变，如TPMT*2，TPMT*3A和TPMT*3C和其他的(Wang等2006)，鸟嘌呤核苷5’单磷酸合成酶(GMPS；EC6.3.5.2)酶活性或者基因型，肌苷三磷酸焦磷酸酶(ITPA)酶活性和基因型，以及肌苷5’单磷酸脱氢酶(IMPDH；EC1.1.1.205)酶活性或基因型(IMPDHI和IMPDH2的)(Roberts等，2006)。
个体的基因型状态通过比较TPMT启动子序列来确定，特别是所述个体的TPMT启动子的GCC重复序列同SEQ ID NO：1进行比较。个体序列与SEQ ID NO：1的核酸序列上存在至少一个核苷酸的不同(通过直接或间接方法确定)指示了多态性或突变。优选的，至少一个GCC重复基序的不同的出现指示了多态性或突变。其可能包括获得一个或多个GCC重复基序，或缺失一个或多个GCC重复基序。分型(grouping)的多数性或多态性突变少数性使得能够确定治疗成功的不同的可能性。
特别是，考虑到根据本发明的TPMT启动子GCC重复序列的新的突变可能应用于个人基因组测序来确定个体罹患硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险。
个人基因组测序，同时当前在其婴儿时期，将很快成为广泛地可能，并且是以适当的价格。个人的基因组测序是当个人将其自己的基因组测序从而他们的遗传信息可能用于确定疾病的风险模式，他们的身体和生物学特征，以及他们的个人家系。基因组序列同已知的与各种疾病或疾病易感性及生物学特征相关的突变进行比较。现有的新的TPMT启动子突变可以被包含在个人基因组数据库中用于编译疾病风险预测。
TPMT启动子包含可变数串联重复(VNTR)，范围从三个到九个重复(*V3to*V9)，位于主转录起始位点上游43bp处(Alves等，2000)。Spire-Vajron de Ia Moureyre等于1999年构建了报告基因分析，并且发现了*V7等位基因显著降低了萤光素酶活性并且*V8显著提高了萤光素酶活性，相对于3个主要的等位基因来说(*V4，*V5，*V6)。但是，当53个没有亲缘关系的高加索人按照其VNTR基因型分组时，没有观测到VNTR基因型和RBCs中的TPMT活性的平均值的统计学差异(Alives等，2000)。后来的研究无法证明重复数目和体内RBCTPMT活性的明确的关系。最多，其显示了该启动子VNTR仅仅在酶活性水平上有着适度的影响(Fessing等，1998)。因此，迄今为止，还没有发现对TPMT UM状态的分子解释。
本发明首次发现了，在TPMT启动子的另一个重复序列的突变，GCC三核苷酸重复序列，直接与病人的UM表型相关，并且与硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险相关。
一种确定具有UM表型的个体以及硫代嘌呤抗性或不耐受性风险的方法可能包括从所述个体中获得DNA样品。样品随后分析确定TPMT启动子GCC三核苷酸重复序列的突变。优选的，突变包括缺失或获得一个或多个GCC重复基序。更优选的，突变选自TPMT启动子SEQ ID NO：3和4。如果样品指示了所述突变的存在，个体就与硫代嘌呤抗性或不耐受性相关。
已知有许多实验方法并且是本领域技术人员可用的方法，来确定TPMT启动子上额外的突变的存在。这些方法包括，例如，基于PCR的方法，基于变性高压液相色谱法的方法，包括人基因组测序的DNA测序方法，错配DNA的化学或酶法分析，以及错配DNA的电泳法检测。这些方法中的一些特例在下文中详细描述。
这些方法在TPMT上的应用可能提供了可以影响个人之间硫代嘌呤药物不耐受性或抗性之额外突变的可能性的鉴别方法。本领域技术人员将可以认识到许多这样的一般方法可以应用，例如，在Syvanen和Taylor综述中总结过的(2004)。
本发明的引物可能用于确定个体的TPMT启动子上的GCC三核苷酸重复序列的突变的存在有否。特异性突变的存在与否可以通过许多方法来确定，可以为本领域技术人员熟知的任何方法。例如，链终止方法，连接方法，杂交法或者质谱法。
方法的优选实施方式涉及将个体分离的TPMT启动子核酸序列同核酸探针接触，该核酸探针特异性鉴定启动子的GCC三核苷酸重复序列上突变的存在与否。例如，核酸探针可以用于特异性结合，如，杂交到核酸序列上，该核酸序列在选择结合条件下对应于包括至少一个突变的启动子的一部分。
因此，另一方面，本发明直接涉及一种分离的核酸分子，其适用于检测TPMT启动子序列的GCC三核苷酸重复序列的突变，所述核酸分子由具有SEQ ID NO 1的大约至少15个毗连的碱基或其互补序列的核苷酸序列组成。
突变包括缺失或获得一个或多个GCC重复基序。优选的，突变选自缺失单个GCC重复获得GCC(5)(SEQ ID NO：3)或获得单个GCC重复获得GCC(7)(SEQ ID NO：4)。
在一个具体实施方式中，核酸分子由探针组成，该探针具有结合到包括至少本发明的一个突变的核酸序列的序列。
在另一个具体实施方式中，核酸分子由引物组成，该引物具有结合到TPMT启动子的突变的上游或下游的序列。在优选的具体实施方式中的引物于突变的上游或下游结合到TPMT启动子序列，并且距离所述突变可达一个碱基(up to one base from the mutation)。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其具有SEQ ID NO：1的序列的核酸以及包含GCC重复区上的一个或多个突变。优选的，突变包括缺失或获得一个或多个GCC重复基序。更优选的，突变选自具有SEQID NO3或4的序列，或其功能片段，变体或其反义分子。
核酸分子可能可选地包括肽核酸(PNA)。核酸分子可能进一步包括可检测标签，例如荧光标签或放射性同位素标签。可选地，基因组DNA样品可能是荧光或放射性同位素标记的。
基因序列中的突变检测，包括在重复核苷酸序列的突变检测，可以用本领域已知的方法完成。例如，单核苷酸多态性(SNPs)的基因分型的标准技术和/或SSR标记可以应用于检测核苷酸重复基序，包括基于萤光的技术(Chen等，1999)，利用PCR，LCR，巢式PCR以及其他的核酸扩增的方法。SNP基因分型的特异性方法包括，但不限于，TaqMan基因分型分析以及SNPIex平台(Applied Biosystems)，质谱法(如，来自Sequenom的MassARRAY系统)，小序列确定方法，实时PCR，BioPlex系统(BioRad)，CEQ以及SNPstream系统(Beckman)，分子反转探针分析技术(如，AffymettixGeneChip)，BeadArray技术(如，Illumina GoldenGate以及Infinium分析)以及寡核苷酸连接分析法(OLA-Karim等，2000)。通过这些或其他的本领域技术人员可用的方法，TPMT启动子中的一个或多个突变，特别是在启动子的GCC三核苷酸重复序列的突变可以被检测。
因此很多方法都可以用于分析核酸重复序列。检测重复序列的分析分成几种类型，包括，但不限于直接测序法，其包括个人基因组测序，片段多态性分析，杂交分析，基于电脑的数据分析，基于高压液相色谱法的方法，以及突变DNA的电泳检测。施行这些不同的分析的操作步骤和商业试剂盒或服务都是可行的。在一些具体实施方式中，分析通过结合或杂交实行(如从不同的分析中的不同试剂或技术可以结合起来施行一种分析)。下述为本发明有用的但不限定本发明的一些分析示例。
直接测序分析
TPMT启动子的GCC重复序列的突变可能使用直接测序技术进行检测。在这些分析中，DNA样品，例如取自如血液，唾液或口腔棉签样本中的那些，首先用任意合适的方法从病人中分离获得。在一些具体实施方式中，感兴趣的区域被克隆到合适的载体上并且在宿主细胞中(如，细菌)被扩增。在另一些具体实施方式中，TPMT启动子的GCC重复区的DNA使用PCR方法进行扩增。DNA使用任何合适的方法进行测序，包括但不限于使用放射性标记核酸进行手工测序，或自动测序。使用任何合适的方法对测序结果进行展示。序列被检查并确定是否有GCC重复序列突变的存在。
PCR分析
TPMT启动子的GCC重复序列的突变还可能通过使用PCR基础的分析进行检测。PCR分析可能包括使用寡核苷酸引物扩增包含GCC重复序列的片段。TPMT启动子上一个或多个额外的重复的出现会导致产生更长的PCR产物，其可以被凝胶电泳检测，并且与在GCC重复序列没有突变的个体的PCR产物进行比较。TPMT启动子一个或多个更短(fewer)重复缺失的出现会导致产生更短的PCR产物，其可以用同样的方法检测。
片段长度多态性分析
再者，TMPT启动子的GCC重复区域的突变的存在可能使用片段长度多态性分析检测。在片段长度多态性分析检测中，使用酶(如，一种限制性内切酶)产生单一的DNA带型，其基于用酶将DNA在一系列的位点切割。从包含GCC重复序列的突变的样品得到的DNA片段将具有一种不同的带型，与不包括突变的GCC重复序列的样品不同。
RFLP分析
另外，TMPT启动子的GCC重复区域的突变的存在可能使用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)检测。感兴趣的区域首先使用PCR分离。然后PCR产物使用已知的可以对突变的GCC重复序列产生唯一长度片段的限制性酶进行酶切。限制性酶切PCR产物可使用琼脂糖凝胶电泳进行分离，溴化乙啶染色后可直接观测。片段的长度与分子量标准进行比较，并且片段产生自测试和对照样品，来鉴定测试样品包含GCC重复序列的突变。
CFLP分析
可选地，TMPT启动子的GCC重复区的突变可能使用切割酶(CLEAVASE)片段长度多态性分析(CFLP；Third Wave Technologies，Madison，WI；以及U.S专利No.5,888,780)。
杂交分析
还可以考虑用杂交分析的方法检测GCC重复序列突变。在杂交分析中，基于从样品中获得的DNA杂交到互补DNA分子(如，一种寡核苷酸探针)上的能力可以确定突变序列的存在与否。使用一系列杂交技术和检测的一系列杂交分析方法可以应用于此，并且是本领域技术人员熟知的。
质谱法分析
还可能使用MassARRAY系统(Sequenom，San Diego，CA)来检测TMPT启动子的GCC重复序列的突变的存在(参见如US专利No.6,043,031)。
一个最简单的方法为PCR分析。基于此处提供的突变序列的序列，可以构建PCR引物，其与包含突变的TPMT启动子序列的区域互补。引物由包含在突变序列中突变的位置的启动子的任意区域互补的连续的核苷酸序列组成。互补于野生型序列的区域的PCR引物相应于突变的PCR引物还可以在本发明的诊断方法中的充当对照。PCR引物的大小范围可以在任意位置从5个碱基到上百个碱基。但是，优选的引物的大小在10到40个碱基范围内，更优选的是15到32个碱基。随着引物大小的降低，引物对靶区域的特异性也随着降低。因此，虽然小于5个碱基长度的引物可以结合到靶区域上，但其还提高了结合到模板多核苷酸的非靶区域的其他区域的机会，并且其他区域不包含突变的碱基。相反的，更长的引物提供了更好的特异性，但是，制造和处理非常大的片段又变得非常麻烦。虽然如此，当必要的时候，本发明的方法使用长的片段。
为了扩增可能带有突变等位基因的个体患者的基因组DNA区域，靶位点的一侧或两侧引物，如，SEQ ID NO：1的基因组DNA的688到705位(该区域的GCC中)，被制备以及用于PCR反应，使用本领域已知的方法(如Massachusetts Massachusetts General Hospital&Harvard Medical School，Current Protocols In Molecular biology，Chapter 15(Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience 1991))。
根据本发明的方法，一旦获得了扩增的片段，其可以用多种方法分析确定病人是否具有TPMT启动子的突变等位基因。例如，PCR片段可以被测量大小，例如通过在PCR产物中掺入萤光标记的dNTPs后使用毛细血管电泳仪检测。片段的大小可以指示突变存在与否。可选的，扩增的片段可以被测序，并且序列与野生型的TPMT的基因组DNA序列进行比较。如果扩增的片段包括如本发明所述的一个或多个突变，病人更可能具有UM表型并且因此在用标准剂量的硫代嘌呤药物治疗时具有产生造血毒性的风险，所述药物如巯基嘌呤和硫唑嘌呤。可选的，结合使用PCR和RFLP分析可能用于检测个体的TPMT基因型。
在一个优选的具体实施方式中，如上文所述的，荧光标记的dNTPs被掺入到PCR产物中，并使用自动DNA序列/片段分析仪进行毛细管电泳分析显影。在本发明另一个优选的具体实施方式中，使用了两个通常的引物，分别与突变位点的每链(side)互补。通常的引物是那些不包括突变位点，即其序列对于野生型和突变等位基因是通常的。引物在相反的方向延伸因此他们扩增了包含突变位点的相对长的片段。该反应的产物随后通过在电泳仪上测量大小(如毛细血管电泳仪)，或者进行DNA序列分析处理。
基因分型途径包括需要等位基因和引物或序列的特异性杂交的方法；核苷酸与引物等位基因特异性的整合的方法，其结合紧密或临近多态现象或突变(常常指的是“单碱基延伸”，“或微测序”)；以及等位基因特异性连接(结合)到寡核苷酸上(连接链反应或连接挂锁探针)的方法；或通过侵入结构的特异性酶的方法(Invader分析)。
用于基因分型的检测方法可以包括使用基于琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳分离系统，包括专用聚合物的毛细血管电泳法的柱子，不同的荧光或放射性同位素信号，或者检测不同的大小或质量的反应产物。这些方法应用不同的引物，其侧接着，或其临近着，或在其序列中或其大多数(most)3’位置包含着任意的本发明的突变。
本领域技术人员已知的其他的检测突变的方法在Syvanen和Taylor的综述中提到(2004)。一个优选的实施例是使用质谱法确定核酸序列，该序列为TPMT启动子的一部分或互补序列。这样的质谱分析方法是本领域技术人员已知的，上述大多数基因分型分析可以适用于本发明的TPMT突变的质谱法分析检测。
上述的方法的各方面有助于提供试剂盒。
另一方面，本发明提供了一种诊断试剂盒，其可以用于确定个体罹患硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险，基于其TPMT启动子的基因型状态的评估。
试剂盒可包括本发明的一种探针。可选的本发明的一种引物也可应用。所述的引物可以结合到TPMT启动子或其反义链上，可直达到定位于距离本发明突变的一个碱基的核苷酸。
另一方面，本发明提供了一种诊断试剂盒，其用于确定个体罹患硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险，包括第一和第二引物，引物可以互补于所述至少一个突变的TPMT基因的上游和下游核苷酸序列。
优选的突变选自缺失或获得至少一个GCC重复基序。更优选的是，突变选自SEQ ID NO3或4。
另一方面，本发明提供了一种试剂盒，用于检测个体中硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险的改变的可能性，所述试剂盒包括SEQ ID NO：1的核苷酸。
另一方面，试剂盒包括单个引物，其基本上与TPMT启动子序列互补，并且直接结合到本发明的至少一个突变的核苷酸序列上。
在另一方面，本法明提供了一种引物，其适用于检测TPMT启动子序列的GCC三核苷酸重复序列的突变，所述引物由SEQ ID NO：1的大约至少15个毗连的核酸的核苷酸序列组成。优选的突变选自缺失或获得至少一个GCC重复基序。更优选的是突变选自SEQ ID NO：3或4。
试剂盒优选适用以及配置以适用于确定一个或多个特定的突变的存在与否，包括与TPMT启动子序列的一部分相应的核酸序列。
待检测的TPMT启动子上的GCC重复区的单个突变或多个突变与硫代嘌呤治疗中的治疗反应或耐受性的变化性相关，并且用于指示UM表型。
在优选的具体实施方式中，试剂盒包括适于检测TPMT启动子上突变的元件(如，探针和/或引物)，所述突变指示当病人需要该治疗，如病人患有IBD时的UM表型及硫代嘌呤不耐受性或抗性的风险。
还可能希望提供一种试剂盒，其包括适于或用于允许检测指示UM表型及硫代嘌呤不耐受性或抗性相关的风险性的多个突变的元件。这些附加的元件可以，例如，独立包括一种或多种缓冲液，如，扩增缓冲液及杂交缓冲液，其可能是液体的或干燥形式，DNA聚合酶，如，适合进行PCR的聚合酶(如，热稳定DNA聚合酶)，DNA连接酶，如，适宜进行连接链反应的DNA连接酶，专用探针(如挂锁探针)，及脱氧核苷三磷酸(dNTPs)，双脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)或核糖核苷三磷酸。
优选的，试剂盒包括一些寡核苷酸类，其可以特异性杂交到TPMT启动子上。这些寡核苷酸将能够使得用PCR方法从人基因组DNA中特异性扩增TPMT核苷酸。更优选的是，这些寡核苷酸还可以能够充当通过引物，探针，或使多态性等位基因有差别的连接底物，从而特异性鉴别TPMT基因的基因型。可选的，这些寡核苷酸可能适用于新出现的方法，其不依赖于在先的起始DNA的扩增，例如Invader分析和基于连接的检测方法。优选的，寡核苷酸或其他试剂盒元件可以包括检测标记，如，荧光标记，酶表，光散射标记，质量标记，或其他标记。
试剂盒还可能任选地包括使用说明，其可以包括与TPMT UM表型相关的突变以及与硫代嘌呤不耐受性或抗性的风险相关的突变的列表。
优选的试剂盒元件可能包括“对照”DNA样品，构成来自具有每个指示突变的不同等位基因个体的基因组DNA，或包含显示突变的序列的重组质粒或PCR产物。在应用于不同的实验室时，其能赋予分析的质量对照(control)。
本发明还指示了一种诊断分析，来确定人的TPMT基因型。例如，包含DNA的组织如白细胞，口腔内皮(lining)粘膜刮物(scraping)，唾液，上皮细胞，胰腺组织，肝，其他等等，从个体中获得。个体的基因组DNA利用本领域已知的方法从组织中分离，例如苯酚/氯仿抽提。本发明的PCR引物可以被合成。引物优选为10-40个碱基长，更优选的为15-31个碱基长度。添加引物，使用标准的PCR程序，扩增TPMT片段。接着，扩增的序列使用上文描述的各种方法进行分析，其包括长度或质量分析，测序，突变-特异性扩增，或这些方法的综合以及基于这些结果的诊断。
本发明还可以广泛地包括本申请说明书中涉及的或指示过的部分，元件以及特征，个别的或全体的，以及任何或全部的任意两个或多个所述部分，元件或特征的组合，以及此处提到的本发明涉及的本领域技术人员已知的等同物特定的整体，这些已知的等同物并入本文中，就如同其单独示出的一样。
本发明包括上述的以及下述仅作为示例的构建。
实施例1
一个50岁高加索男性(病人A)，具有不确定的肠炎(colitis)，其RBC TPMT的活性，被发现高达25.6单位/ml RBC(指的是图1中的“指示病例”)，使用了放射性化学分析方法(Weinshilboum等，1999)。TPMT表型作为一种临床服务首先在Christchurch(新西兰)于2003年被提供(Sies等，2005)，并且从此超过2000个个体被检测。TPMT活性的标准值域，通过表型分析方法检测的，为9.3到17.6单位/ml RBC(图1)。先前已记录的现有的最高的活性为22.5单位/ml RBC(Sies等，2005)。由于病人A没有接受任何抑制的药物治疗来诱导TPMT活性，因此可以想象得到他的UM状态是由于TPMT启动子内的突变造成的。为了测试这种假说，该病人的TPMT启动子被进行测序，另外其他的9个UM表型的个体(18.4-22.5单位/ml RBC)也进行了测序。
基因组DNA是从5ml病人A的外周血中通过NaCl方法进行提取的(Lahiri等，1991)。扩增TPMT的启动子和5’UTR区获得1225bp片段。PCR反应的总体积为25μl，包括200μM的dNTPs，0.5μM的每个引物，1.5mM的MgCl2，1U的DNA Taq聚合酶(Roche)，1×Q-溶液(Qiagen)以及100ng的gDNA。热循环条件为，95℃@15分钟，随后做35个循环，每个循环包括94℃1分钟，62℃10秒，72℃2分钟；最后72℃延伸4分钟。每个PCR的5微升样品用1％的LE琼脂糖检测。另外的5μl使用
Figure GPA00001087109500161
(USB Corporation，Cleveland，Ohio，USA)按照说明手册进行纯化，使用化学(Applied Biosystems，CA，USA)在ABI3730Genetic Analyzer上进行测序。
图3a显示的是基因组TPMT启动子的序列。正向和反向引物序列标注下划线，以及反向引物上改变碱基以创建添加NcoI识别位点，用粗体显示。垂直箭头分别指示的是HindIII和NcoI的酶切位点。启动子内的转录因子结合位点使用基于web的TFSearch软件确定，＞90.0分数的位点使用粗体和下划线表示。GCC三核苷酸串联重复以及下游可变数量的重复(VNTR)因子被加框(后面的用虚线框)。VNTR因子的每个重复由17-18bp未完成(imperfect)的单元和14bp的核心共有序列组成。大多数通常的VNTR等位基因由4或5个重复组成(VNTR*4&VNTR*5)(Spire-Vayron de Ia Moureyre等1999)。病人A为VNTK*V4等位基因纯合子。TPMT的主转录起始位点(位置+1)使用箭头指示，外显子1用阴影表示。
DNA测序显示病人A为杂合子，在三核苷酸重复区有额外的GCC基序，该重复区正常包括6个重复，位于TPMT转录起始位点的上游324bp处(图3a和4)。这个三核苷酸重复变体还没有在Ensembl上(http://www.ensembl.org/index.html)或在dbSNP(http://www.ncbi.nlm..nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝snp&cmd＝search&term＝)报道过。另外9个具有当地UM表型(范围：18.4-22.5单位/ml RBC)的病人，50个具有正常TPMT活性的病人(范围：12.5-16.5单位/ml RBC)，以及200个高加索人对照的启动子被筛查来确定GCC(7)是否是正常的多态现象或与提高的TPMT活性特异性相关的变体。所有的59个IBD病人都是GCC(6)的纯合子，然而200个对照中的5个是GCC(7)的杂合子变体，显示了GCC(7)可能是与病人的强烈的TPMT活性相关的稀有的突变。另外3个与病人A比较TPMT RBC活性相当的病人(范围：55-65nmol 6-MTG×g-1Hb×h-1正常范围26-50)来自Guy’s和St Thomas医院(伦敦，英国)。这些病人显示了在酶分布中99百分比的TPMT活性。然而，他们中的全部，都没有医疗条件(如，自身免疫溶血贫血)，并且用药(如，促红细胞合成素)可能导致不成熟RBC种群从而引起TPMT活性的升高。DNA测序揭示了这些病人中的一个(病人B；RBC活性65nmol 6-MTG×g-1Hb×h-1)是针对不同变体GCC(5)，在相同GCC重复元件中杂合(图4)。其它的两个英国病人针对野生型GCC(6)等位基因都是纯合子(图4)。本研究中的所有病人针对VNTR*V4或VNTR*V5等位基因都是纯合子或是杂合子。进一步，在任一种UM表型的病人的TPMT中没有发现其他的序列变异，其可能潜在解释提高的TPMT活性。
为了进一步评价已发现的启动子GCC(5)和GCC(7)等位基因和TPMTUM活性的相关性，从曼彻斯特(英国)St Mary’s医院的临床遗传学部门的选择了另外的一些硫代嘌呤治疗中的病人。13个具有肠炎症病或风湿性关节炎的病人的DNA被提供用于分析，它们所有人都具有TPMT UM表型(活性水平＞50nmol/g Hb/h)。在这13个病人中，3个证实了是GCC(7)突变的杂合子，进一步证实TPMT GCC三核苷酸突变在UM表型的病人中的不成比例的表现。
野生型的人TPMT启动子序列与21种其他的哺乳动物种群序列进行比对，来确定三核苷酸重复元件是保守的(图3(b))。比对使用Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)进行。证实了重复元件的一些证据的序列显示了与人TPMT序列同源性的减少。对于每条序列来说，三核苷酸元件粗体表示并加了下划线。零同源的区域用虚线来指示。
人TPMT启动子序列的比对揭示了21种中的9种显示了三核苷酸重复元件的证据(图3b)。在黑猩猩(P.troglodytes)，刺猬(E.europeaus)和欧洲牛(B.taurus)中观测到了(GCC)6等位基因，而在其他的6种中显示了更低的重复数量。检测的哺乳动物中没有一个具有(GCC)5或(GCC)7等位基因。
为了评估三核苷酸重复区域的变异的潜在的功能影响，野生型的和病人A和病人B的变体的TPMT启动子被扩增，并且克隆到少启动子的pGL3-Basic载体上(Promega Corporation，Madison，WI，USA)，使用限制性位点HindIII和NcoI。通过直接DNA测序证实构建体，使用Plasmid Kit(Qiagen)进行纯化。在转染到24孔组织培养板之前24小时接种COS-7细胞(5×104细胞/孔)来保证40-80％的融合。每孔包含500μl达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，添加了10％的胎牛血清和100ng/ml的青霉素&链霉素。前和后转染细胞在37℃，5％CO2中孵育。转染使用
Figure GPA00001087109500182
Transfection Reagent(Qiagen)按照操作手册进行。为了控制在实验重复中的转染效率的变化性，启动子构建体与Renilla载体，pRL-TK(Promega)共转染。在转染后48小时，将COS-7细胞溶于被动性溶解缓冲液中(Promega)，随后使用
Figure GPA00001087109500183
报告确定系统(Promega)确定萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶活性。少启动子的pGL3-basic载体在每个转染实验中用作阴性对照(对照荧光素酶活性的平均值为：0.13±0.07)。表达的不同使用方差分析和Tukey的多重比较测试进行评估，并且考虑当p＜0.05时的统计学显著性。为了标准化转染效率，构建体的启动子活性按照萤火虫荧光素酶活性比Renilla荧光素酶活性的比例进行表达。构建体通过3个分别的转染检测三个重复。构建体在转染中的标准化的萤火虫荧光素酶活性的平均值对于GCC(7)为13.2±0.10，对于GCC(5)为13.2±0.12，对于野生型的GCC(6)为8.0±0.26。在变体和野生型构建体的的基础转录的不同是相当显著的(Tukey’s多重比较检测，p＝＜0.001。进一步说，观测到的GCC(5)和GCC(7)之间的表达差异性也是显著的(图5)。
三核苷酸重复变异可能提高TPMT的表达的分子学机制还不清楚。对转录因子结合位点使用基于web的程序TFSearch(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)和MatInspector(http://www.genomatix.de/)搜索发现两个三核苷酸重复多态线性(GCC(5)和GCC(7))不能创建或取消转录因子结合位点(图3a)。不受理论约束之外，虽然三核苷酸重复变异看起来并没有改变已知的转录因子结合位点，但是可能在临近转录因子结合位点的间距的变化，可能导致增强转录。这种现象并非没有先例。蛋白C基因转录的研究证实了在CAT报告基因分析中，在启动子的-21位上插入了设计的3bp之后与野生型的启动子相比提高了转录活性2.5倍(Spek等，1999)。类似的，Saxena等2006年报道了在MCL-1(骨髓细胞白血病-1)基因主转录起始位点上游的190bp处插入了新的6-18bp多态性片段。在四种细胞系中的荧光素酶报告分析显示了这些插入导致了MCL-1的活性提高了1.8-2.5倍。关于这些变体，无论是设计的3bp插入片段或是MCL-1多态性片段都没有创建或取消转录因子结合位点。Spek等于1999年推测观测到的人工插入提高转录可能是由于在临近的转录因子间释放了空间位阻，由此允许转录因子在结合位点更高的占据(occupancy)以及更高的基因表达。
迄今为止，关于减少TPMT酶活性的22个等位基因突变体(TPMT*2至TPMT*23)已经进行了鉴定(Wang等，2006，Lindquist等2007，Schaeffeler等2006)。然而，没有发现UM活性的任何分子解释。
本发明已经鉴定和表征了在三核苷酸重复区域的两个新颖的突变，其导致了TPMT启动子的体外基础表达的上升。这些数据进一步显示出启动子三核苷酸重复区域的重复单元与野生型6个重复单元的数目偏差，可能解释在常规表型中鉴定出的极端的TPMT UM表型的比例。对于本领域的现有技术，没有人先前记载过这个重复元件的变异。相反在这个三核苷酸重复区的下游＞200bp的位点的TPMT VNTR受到了相当的关注(Spire-Veyron de la Moureyre等，1999；Krynetski等，1997；Alves等2001；Yan等2000)(Spire-Vayron de la Moureyre et al，1999；Alves et al，2000)，并且尽管广泛的体外研究(Spire-Veyron de la Moureyre et al，1999；Alves et al 2001；Yan et al 2000)，显示了这些等位基因仅仅对TPMT表达有“调节”作用。而TPMT启动子VNTR与硫代嘌呤遗传药理学的关联性还不清楚，本发明发现的突变显示了在体外对于表达有着明确的影响。
因为这些病人处于硫代嘌呤不耐受性或抗性的风险中，并且相关的显著的副作用如肝毒性，对于这些病人的鉴定将是非常有好处的。
上述的实施例并不是仅仅用来限定本发明的保护范围。本领域技术人员可以知晓，许多变异都没有脱离本发明权利要求所要求的范围。
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序列表
 
<110>奥塔戈大学(UNIVERSITY OF OTAGO)
 
<120>鉴别个体处于硫代嘌呤药物抗性和不耐受性风险的方法
 
<130>564428CJE
 
<160>4
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>1155
<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)
 
<400>1
acaacacctg caaggctgtg cgggctcctg gccgcaccct atcggccggg aagaacaagc   60
gagggagttc ctactccagg accgtggggt tctcccgcgg ctctgacagt ccccaggagg  120
gagccccaaa ctcccggtgc cagctgcagc cgcctcgctt tccgagaagc tttcggaagc  180
ttttcgaagt cggagaagca actgccccgg ggctcacctt tgcgctgaag aggtgccggg  240
agtctcgggg aaaaggcacc gctgtacaga aaggaaacat tgtagggggg ttagccgacc  300
ggcaacatcg cgacgaaccc ggcgacccca cgccccaaca ccctagcccg ggaattcccc  360
cttcttcaga cagataccca ccccgcaccc tcttttaatc cggggcagga ggtatccgtc  420
cctggggcac ccgcccacct cccaccacgg cgaggggcgc tgcacagggg gaaagggagg  480
gcttgcaccc caaccaagct gctttgtgca acgctgtcac ccgaaatccg ccacggcccc  540
cacgcacgcc cccggagtgg ggagcctccc acctctgagc gccagcgagg cggtgcgcgc  600
cgccctggac tgcgggcgcc tctccggagc cgcgcgccgc gcgcacagga cggctgcagc  660
cgcgccgcga gccccagcct cttctcggcc gccgccgccg ccgccgcttc cgcccctgtc  720
acggcgtgac ccggggtggg aggagccgac aggactaggg atgggtaggg tccccgcctt  780
cgctttagcc gcagcgctcg ctccgccctg cccatttccg ccgctgcgca aaccccggcg  840
cttggggaag tgggtggagt ctgtgcaacg aggtacgggg cgggagtgga gacggggcgc  900
cgggagaggg ggcgggaact gaggcggggc gcgggaaaga ggcggggcgc gggaaagagg  960
cggggcgcgg gcggaggcgg ggcgcgggcg gaggcggggc gcgggcggag gcggggcgcg 1020
gagaagtggc ggaggtggaa gcggaggcgt acccgcccct ggggacgtca ttggtggcgg    1080
aggcaatggc cggcaaccag ctgtaagcga ggcacggaag acatatgctt gtgagacaaa    1140
ggtgtctctg aaact                                                     1155
 
<210>2
<211>50
<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)
 
<400>2
gccccagcct cttctcggcc gccgccgccg ccgccgcttc cgcccctgtc                 50
 
<210>3
<211>47
<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)
 
<400>3
gccccagcct cttctcggcc gccgccgccg ccgcttccgc ccctgtc                    47
 
<210>4
<211>53
<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)
 
<400>4
gccccagcct cttctcggcc gccgccgccg ccgccgccgc ttccgcccct gtc             53

Claims (31)

1.一种筛选个体用来确定与UM表型和与硫代嘌呤抗性或不耐受性风险相关的一个或多个突变存在或不存在的方法，所述方法包括确定个体有关TPMT基因启动子的基因型状态的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过直接或间接的方法确定有关从所述个体获得的DNA的基因型状态。
3.如权利要求2所述的方法，其中DNA样品从个体中获得，并且TPMT启动子的基因型状态通过使用直接的或者间接的方法对编码TPMT的核酸序列(SEQ ID NO：1)的启动子中的GCC重复区域上存在的至少一个不同来进行评估。
4.如权利要求3所述的方法，其中基因型状态是通过TPMT启动子的GCC重复区存在突变来确定的。
5.如权利要求4所述的方法，其中突变由一个或多个GCC重复序列的缺失或由一个或多个GCC重复序列的增加组成。
6.如权利要求4所述的方法，其中突变由单个GCC重复的缺失或单个GCC重复的增加组成，其中单个GCC重复分别选自SEQ ID NO：3或4。
7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其中所述个体的基因型状态通过个人基因组测序确定。
8.一种鉴定个体处于硫代嘌呤抗性或不耐受性风险的方法，所述方法包括：从所述个体获得DNA样品，和鉴定TPMT启动子的GCC重复区中的突变，其中所述突变的存在与UM表型以及硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险相关。
9.如权利要求8所述的方法，其中突变由一个或多个额外的GCC重复序列组成或由一个或多个GCC重复序列的缺失组成。
10.如权利要求9所述的方法，其中突变由单个GCC重复GCC(7)(SEQID NO：4)的添加组成，或者由单个的GCC重复GCC(5)(SEQ ID NO：3)的缺失组成。
11.如权利要求8-10中任一所述的方法，其中该方法包括个人基因组测序。
12.如权利要求3，5和6中任一定义的在TMPT启动子中包含GCC突变之序列的用途，用于鉴定有UM表型和处于硫代嘌呤的抗性或不耐受性的风险的个体，其基于所述个体的个人基因组序列。
13.如权利要求12所述的用途，其中突变由一个或多个额外的GCC重复序列组成或者一个或多个GCC重复序列的缺失组成。
14.如权利要求12所述的用途，其中突变由单个GCC重复GCC(7)(SEQ ID NO：4)的添加组成，或者由单个的GCC重复GCC(5)的缺失组成。
15.一种适用于检测TPMT启动子上GCC重复基序中的突变的分离的核酸分子。
16.如权利要求15所述的分离的核酸，其中突变选自由SEQ ID NO 3或4组成的组，和核酸分子由具有SEQ ID NO 1的大约至少15个毗连的碱基的核苷酸序列或者其互补序列组成。
17.如权利要求15或16所述的核酸分子，由具有结合到含有本发明的至少一个突变的核苷酸序列的序列之探针组成。
18.如权利要求15或16所述的核酸分子，由具有在如权利要求5所述的突变的上游或下游结合到TPMT启动子的序列之引物组成。
19.如权利要求18所述的核酸，其中所述引物在GCC连续重复基序的上游或下游结合到TPMT启动子序列，并且与所述GCC重复基序距离多至一个碱基。
20.如权利要求18所述的核酸分子，其中所述突变包括缺失或增加一个或多个GCC重复基序。
21.如权利要求20所述的核酸分子，其中所述突变包括缺失或增加单个GCC重复基序，分别得到GCC(5)或GCC(7)。
22.一种分离的核酸分子，其具有如SEQ ID NO：1的序列并在GCC重复基序中包含突变。
23.如权利要求22所述的核酸分子，其中所述突变包括缺失或增加一个或多个GCC重复基序。
24.如权利要求23所述的核酸分子，其中所述突变选自包括SEQ ID NO3或4的组，或其功能片段，变体或其反义分子。
25.一种诊断试剂盒，其用于基于TPMT启动子的基因型状态的评估鉴定有UM表型以及处于硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险之个体。
26.如权利要求25所述的试剂盒，包括如权利要求17所述的探针。
27.如权利要求25所述的试剂盒，包括结合到TPMT启动子或其反义链的引物，直至与所述GCC连续重复基序相距一个碱基定位的核苷酸。
28.如权利要求27所述的试剂盒，其中引物是所述基序的上游或下游。
29.一种诊断试剂盒，其用来鉴定具有UM表型，并且处于硫代嘌呤抗性或不耐受性的风险的个体，其包括第一和第二引物，所述引物与分别在所述GCC连续重复基序中的突变的上游或下游的TPMT启动子核苷酸序列或其反义链互补。
30.一种如权利要求29所述的诊断试剂盒，其中所述突变包括一个或多个GCC重复序列的缺失，或是一个或多个GCC重复序列的增加。
31.一种如权利要求30所述的试剂盒，其中所述突变包括缺失或增加单个GCC重复序列，且选自分别包含SEQ ID NO 3或4的组。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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