CN102876784B - 焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法。具体是指B-rfa基因rs113488022(V600E)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量对B-raf基因突变进行检测，从而达到对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体(如西妥昔单抗等)、黑色素瘤抑制剂Zelboraf等用药实现安全合理有效的个体化给药。

Description

焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

B-raf是一种癌基因，它编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学反应，如细胞生长、分化和凋亡等。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、卵巢癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf基因突变，约66%恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中B-raf基因存在体细胞错义突变。大约80-90%的B-raf基因突变发生在exon15的1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。

在结直肠癌中，B-raf突变率约为15%，其中约有90%以上的突变形式为T1799A（V600E），这与K-ras突变互相排斥。最新研究认为，K-ras突变可能导致30%-40%的结直肠癌患者对EGFR靶向治疗无效，而B-raf突变可能导致10%-15%的K-raf野生型患者发生耐药。

新上市的用于治疗晚期转移性或不能切除的黑色素瘤的药物Zelboraf，只能用于B-rafV600E突变患者

因此，对B-raf基因V600E多态性进行分型检测可预测患者对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体的反应性以及Zelboraf疗效，为临床医生给结直肠癌及黑色素瘤制定药物治疗方案提供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测B-raf基因多态性的试剂盒将为抗表皮生长因子受体的单克隆抗体及Zelboraf的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

B-raf基因多态性是影响Zelboraf能否使用的最主要因素。本发明提供一种临床检测使用Zelboraf及抗表皮生长因子受体的单克隆抗体生物标志物的用药基因B-raf多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测Zelboraf及抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药相关基因多态性。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

（1）扩增引物：

B-raf上游引物：5′-CTTTCTAGTAACTCAGCAGCAT-3′（SEQ ID NO.2）；

B-raf下游引物：5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT-3′（SEQ IDNO.3）；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

（2）测序引物：

B-raf测序引物：5′-CCACTCCATCGAGATT-3′（SEQ ID NO.4）；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用上述试剂盒检测B-raf基因多态性的方法，包括如下步骤：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5μl，dNTP 3.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水39.5μl，模板1.0μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30S，50°C 30S，72°C 30S，进行38个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4°C，得扩增产物，扩增产物片段为163bp；

（3）焦磷酸测序单链样本纯化；

（4）焦磷酸测序及结果分析。

本发明的试剂盒对B-raf rs113488022目标序列进行分析和检测，该目标序列包括：野生型GTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGT（SEQ  IDNO.5）和突变型GTGATTTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGT  （SEQ  IDNO.6）；扩增出的片段长为163bp。

由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上抗表皮生长因子受体的单克隆抗体个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。

附图说明

图为本发明B-raf焦磷酸测序结果图，结果显示B-raf为野生型。

具体实施方式

下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。

实施例1：

B-raf上游引物：5′-CTTTCTAGTAACTCAGCAGCAT-3′（SEQ ID NO.2）；

B-raf下游引物：5′-AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT-3′（SEQ IDNO.3）；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

B-raf测序引物：5′-CCACTCCATCGAGATT-3′（SEQ ID NO.4）；

1.DNA提取

1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：

(1)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇（如无，可用无水乙醇替代）和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。

1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；

1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；

1.4分别移取900uL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；

1.5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；

1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；

1.713,000rpm室温离心20秒；

1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；

1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；

1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；

1.11移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；

1.12打开Eppendorf管，移取100uL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；

1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；

1.14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；

1.1513,000rpm室温离心1min；

1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；

1.17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；

1.1813,000rpm室温离心1min；

1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；

1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；

1.21目测沉淀大小，加入50~100ul DNA Rehydration Solution至沉淀；

1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNA Rehydration Solution溶解DNA。

1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；

1.24保存核酸标本至4℃冰箱；

2.聚合酶链反应

2.1在试剂准备区配制50μl PCR扩增体系（模板添加除外），各组分及添加量如下：

10×PCR buffer	5.0μl
		dNTP	3.0μl
上游引物	0.5μl
		下游引物	0.5μl
rTaq	0.5μl
		水	39.5μl

2.2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加1.0μl至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；

2.3在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪：

步骤号	温度	处理时间	循环数
				1	95°C	5min
2	95°C	30s
				3	50°C	30s
4	72°C	30s	Goto step2，for 38cycle
				5	72°C	5min
6	4°C	holding

2.4设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；

2.5点击“start”开始仪器运行。

3.焦磷酸测序单链样本纯化

3.1纯化前试剂和仪器准备：

进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。

3.2单链样本纯化操作：

3.2.1在PSQ 96板中先加40μlAnnealing Buffer和2~3μl测序引物(10uM)；

3.2.2在振荡器上充分混匀Sepharose Beads；

3.2.3将所需Sepharose Beads量(每样本3μl计算)转移到1.5mL Eppendorf管；

3.2.4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer，使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；

3.2.5将Sepharose Beads混合物加至约40μl PCR产物中，每样本加40μl；

3.2.6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；

3.2.7在Vacuum prep workstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml 70％乙醇、Denaturation Buffer和Washing Buffer；

3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；

3.2.9打开Vacuum Prep Workstation的真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool在纯水中清洗30秒；

3.2.10将Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的Sepharose Beads；

3.2.11拿起PCR板，检查Beads是否都被吸附在了Vacuum Prep Tool上；

3.2.12将Vacuum Prep Tool放入70％乙醇中5秒；

3.2.13将Vacuum Prep Tool移到Denatureation Buffer中5秒；

3.2.14再将Vacuum Prep Tool移到Washing Buffer中清洗10秒；

3.2.15把Tool悬放在Pyro反应板；

3.2.16Vacuum Prep Tool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放Sepharose Beads；

3.2.17放有纯化样本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游Pyrosequencing反应。

3.3纯化完毕后清洗：

3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗Vacuum Prep Tool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；

3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool；

3.3.3关掉真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool侧放，室温晾干；

3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；

3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。

4.焦磷酸测序

4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；

4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；

4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。

5.焦磷酸测序结果分析

在“SNP Runs”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQ mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测焦磷酸检测结果如图。可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对B-raf基因多态性进行检测和判读。临床医生可根据B-raf基因多态性，判断出不同基因型患者使用抗表皮生长因子受体的单克隆抗体治疗时的疗效反应以及是否合适使用黑色素瘤抑制剂Zelboraf。

综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测B-raf基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于抗表皮生长因子受体的单克隆抗体以及黑色素瘤抑制剂Zelboraf的个体化使用。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  周宏灏

<120>  焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  501

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  1

tatataggct aaatagaact aatcattgtt ttagacatac ttattgactc taagaggaaa     60

gatgaagtac tatgttttaa agaatattat attacagaat tatagaaatt agatctctta    120

cctaaactct tcataatgct tgctctgata ggaaaatgag atctactgtt ttcctttact    180

tactacacct cagatatatt tcttcatgaa gacctcacag taaaaatagg tgattttggt    240

ctagctacag hgaaatctcg atggagtggg tcccatcagt ttgaacagtt gtctggatcc    300

attttgtgga tggtaagaat tgaggctatt tttccactga ttaaattttt ggccctgaga    360

tgctgctgag ttactagaaa gtcattgaag gtctcaacta tagtattttc atagttccca    420

gtattcacaa aaatcagtgt tcttattttt tatgtaaata gattttttaa cttttttctt    480

tacccttaaa acgaatattt t                                              501

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  2

ctttctagta actcagcagc at                                              22

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  3

agtaaaaata ggtgattttg gtct                                            24

 

<210>  4

<211>  16

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  4

ccactccatc gagatt                                                     16

 

<210>  5

<211>  42

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  5

gtgattttgg tctagctaca gagaaatctc gatggagtgg gt                        42

 

<210>  6

<211>  42

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  6

gtgattttgg tctagctaca gtgaaatctc gatggagtgg gt                        42

 

 

Claims (2)

1.一种焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：

(1)扩增引物：

上游引物：5′-CTT TCT AGT AAC TCA GCA GCA T-3′；

下游引物：5′-AGT AAA AAT AGG TGA TTT TGG TCT-3′；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：5′-CCACTCCATCGAGATT-3′。

2.如权利要求1所述的引物在制备检测B-raf基因多态性试剂中的应用。