CN102575295A - 可用于检测braf突变的方法、引物、探针和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于检测样品中的突变体BRAF序列的存在，特别地用于检测BRAF V600E、V600D、V600K、和V600M突变的存在的方法、引物和探针。

Description

可用于检测BRAF突变的方法、引物、探针和试剂盒
相关申请
本申请要求61/233,054(2009年8月11日提交)；61/237,078(2009年8月26日提交)和61/301,790(2010年2月5日提交)的优先权。
发明背景
本发明涉及用于检测样品中的突变体BRAF序列的存在，特别地用于检测BRAF V600E、V600D、V600K、V600M和V600A突变的存在的方法、引物和探针。
发明背景
在正常细胞经历新生物转化(neoplastic transformation)并变为恶性细胞时出现癌症。转化的(恶性)细胞逃脱规定细胞表型并限制细胞增殖的正常生理控制。如此，个体身体中的转化细胞增殖，形成肿瘤。在发现肿瘤时，临床目标是选择性破坏恶性细胞，同时减轻对经历治疗的个体中的正常细胞引起的任何损害。
B-raf(或BRAF)编码一种属于丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶的蛋白质。BRAF是Ras/Raf/MEK/MAP信号传导途径的一部分，并且在调节MAPKinse/ERK信号传导途径中发挥作用。此基因的突变已经与多种癌症，诸如结肠直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、恶性黑素瘤和腺癌联系起来。已经在结肠癌中报告了BRAF的癌基因突变(几乎均为V600E突变)(Davies H等Nature 2002；417：949-54；Rajagopalan H等，Nature 2002；418：934.)。已经在所有微卫星不稳定性癌的超过一半中及在小得多的稳定性结肠肿瘤亚类中观察到V600E突变(Wang L等，Cancer Res 2003；63：5209-12)。V600E(先前为V599E)突变位于B-raf基因(登录号NM_04333.4)的外显子15上于第1860位(编码序列的第1799位)。在编码序列的第1799位，胸苷变为腺苷，这导致从野生型/非突变体B-rag基因中的缬氨酸(V)变化为突变基因中的谷氨酰胺(E)。另外，也存在罕见的(＜1％)V600K(1798-1799 GT＞AA)突变。此外，V600D突变在4.6％的病例中存在，V600A突变在小于1％的病例中存在，而V600M突变在小于1％的病例中存在。另外，存在着V600R和K601E BRAF突变。
V600E BRAF突变存在于许多组织/肿瘤类型中，包括：神经系统、甲状腺、皮肤、胃肠道、大肠、胆道、卵巢、眼、前列腺、中枢神经系统、肝、小肠、乳房、胰、软组织、上呼吸消化道、肾上腺、自主神经节、造血和淋巴组织、肺、食管、脑垂体、和胃。可以在本发明的测定法中利用自这些组织类型之任一的样品提取的DNA或RNA。
在稳定性和不稳定性癌症两者中，大于90％的具有BRAF突变的肿瘤具有广泛的CpG岛甲基化或称为CpG岛的甲基化物表型(CpG island methylatorphenotype，CIMP)。已经报告了与散发性结肠癌中的微卫星不稳定性(MSI)有关的存活改善(Samowitz WS等，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001；10：917-23；Hailing KC等，J Natl Cancer Inst 1999；91：1295-303)，并且因为散发性不稳定性肿瘤通常显示CIMP(Toyota M等，Proc Natl Acad Sci U S A1999；96：8681-6；Toyota M等，Proc Natl Acad Sci U S A 2000；97：710-5)和BRAF突变(Kambara T等，Gut 2004；53：1137-44；Nagasaka T等，J Clin Oncol2004；22：4584-94)两者，会预期这些特征也会显示与不稳定性肿瘤中的存活改善的关系。Samowitz已经研究了微卫星稳定性肿瘤中的CIMP与存活间的关系，而且已经评估了微卫星稳定性结肠癌中的BRAF突变与存活间的关系。参见Samowitz，Wade S.等，Cancer Research 65，6063-6069，2005年7月15日。Samowitz已经评估了基于大群体的患有结肠癌的个体的样品以测定其与存活和其它临床病理学变量的关系。在5％的微卫星稳定性肿瘤和51.8％的微卫星不稳定性肿瘤中看到V600E BRAF突变。在微卫星稳定性肿瘤中，此突变与结肠直肠癌的较差存活、CIMP较高的、晚期美国癌症联合委员会(AmericanJoint Committee on Cancer，AJCC)阶段、和家族史相关。在5年存活的单变量分析中(16.7％对60.0％)；在针对年龄、阶段、和肿瘤部位调节的分析中；在对AJCC阶段2至4的阶段特异性、年龄经调整的分析中(HRR分别为4.88、3.60、和2.04)；及在对AJCC阶段2至4的Kaplan-Meier存活评估中观察到较差的存活。微卫星不稳定性肿瘤与卓越的5年存活有关，无论V600E突变存在或缺乏(分别为76.2％和75.0％)。Samowitz已经推断，微卫星稳定性结肠癌中的BRAF V600E突变与阶段2至4结肠癌中显著较差的存活有关，但是对微卫星不稳定性肿瘤的卓越预后没有影响。
此外，证明了来自具有MMR基因MLH1和MSH2中的种系突变的遗传性非息肉病性结肠直肠癌综合征(HNPCC)家族的肿瘤中缺乏BRAF突变。这些数据提示了BRAF的癌基因激活仅牵涉散发性结肠直肠肿瘤发生。结肠直肠癌中的阳性BRAF-V600E突变的检出提示了疾病的散发性起源和MLH1、MSH2以及还有MSH6的种系改变的缺乏。这些发现在HNPCC诊断学的遗传测试中具有潜在的影响，并且提示了BRAF作为HNPCC的排除标准(exclusioncriteria)或作为散发性癌症的分子标志物的潜在用途。参见Domingo等，Oncogene(2005)24，3995-3998。
使用MEK的小分子抑制剂和整合的遗传和药理学分析，Solit的小组已经发现了，BRAF的突变与在与“野生型”细胞或包含RAS突变的细胞相比时对MEK抑制的增强的且为选择性的敏感性有关。不管组织谱系，在BRAF突变体细胞中观察到此MEK依赖性，并且它与细胞周期蛋白D1蛋白表达的下调和G1阻滞的诱导两者相关联。药理学MEK抑制完全消除BRAF突变体异种移植物中的肿瘤生长，而RAS突变体肿瘤仅受到部分抑制。这些数据提示了对BRAF突变体肿瘤中的MEK活性的强烈依赖性，而且为此遗传限定的肿瘤亚型提供了合理的治疗策略。参见Solit，David B.等，Nature 439，358-362(2006年1月19日)。
另外，基于遗传研究的结果、细胞生物学、分子病理学和小鼠建模，已经出现人黑素细胞转化的模型。研究已经鉴定出黑素瘤组织中牵涉各种因素，包括碱性成纤维细胞生长因子生成、ERK激活、和常见的BRAF突变。BRAF在RAS下游起作用，并且研究已经表明了RAS和BRAF中的同时突变在黑素瘤中是极端罕见的，提示了BRAF突变替代突变体RAS的至少一些癌基因功能。
对更好地满足有风险形成转移的患者的肿瘤标志物的开发处于活跃的研究中。虽然基于结果的肿瘤标志物评估和治疗选择作为结肠和乳腺癌管理中的护理标准的一部分已有多年，但是对于黑素瘤不存在此类标志物。许多研究已经显示为有希望，但是均尚未通过开发的初步阶段成为临床上有用的测定法。
尽管在黑素瘤生物学研究中有最近的进展，但是可用于诊断和/或监测黑素瘤患者的分子工具的开发仍是相对较新的。在为了对患者监测疾病复发，或选择有形成转移的高风险的患者而设计的方案中获得的进展很少。肿瘤阶段(即来自黑素瘤的存活的最好预示)基于常规的临床病理学变量，诸如原发性肿瘤的厚度和溃疡及区域性淋巴结中或远端部位中转移性疾病的存在。然而，两名具有在显微镜下表现为相同的中间厚度的原发性肿瘤的患者可以具有明显不同的存活。用于此类评估的改善的预后手段的缺乏使主治医生难以确定最好的治疗策略。
已经在多至80％的黑素瘤组织(显著高于此疾病中的任何其它分子改变的频率)中发现了BRAF癌基因的突变。还已经在来自其它类型的癌症的肿瘤组织中检出BRAF突变。实验研究已经表明了，几种BRAF突变，特别是T1799A(先前称作T1796A)热点突变(其占黑素瘤中的BRAF突变的90％)可以转化培养中的成纤维细胞。最近，显示了阻断黑素瘤细胞培养物中的突变体BRAF表达的实验抑制细胞生长并促进细胞死亡，提示了BRAF抑制剂可以显著支持黑素瘤治疗。
发明概述
本发明公开了检测样品中的BRAF V600E、V600D、V600K、V600M和V600A突变的方法。本发明公开了包含用于扩增和检测样品中存在的V600E，V600D、V600K、V600M、或V600A突变体BRAF序列的引物和探针序列的组合物。在扩增特定的BRAF突变中使用如本文中所公开的特定的引物组合。本领域技术人员应当领会，也可以设计对1798-1799 GT＞AA双重突变特异性的引物。
附图简述
图1显示了扩增和检测BRAF突变中所使用的引物和探针。
发明详述
本发明提供了可用于检测BRAF突变的方法、引物、探针和试剂盒。可以使用本发明的方法、引物、探针和试剂盒来检测许多不同细胞类型中的BRAF V600E、V600D、V600K、V600M、和V600A突变，并且如此可以用于诊断许多不同癌症，诸如但不限于黑素瘤、直肠结肠癌、肺癌和甲状腺癌。本发明的方法可以用作癌症患者结果的预示。促成患有任何疾病且特别是癌症(由于其进行性和侵入性性质)的患者的结果改善的关键因素之一是早期且精确的诊断。本发明的方法解决对于用于检测突变体BRAF序列(其存在是转移性疾病的阳性指示剂)的快速的、非侵入性的、且精确的筛选测定法的迫切需要。因此，它鉴定出那些需要用更具攻击性的治疗方案治疗的患者。此外，因为可以对DNA或RNA使用本发明，所以样品制备是容易的，由此降低测定法变化性，其可以源自牵涉样品制备的实验室技术人员的专门知识水平的差异。
作为一个非限制性的例子，可以使用本发明的方法来监测晚期转移性黑素瘤(III/IV期)患者。这些患者有最高的疾病进展风险，并且疾病活动性升高的早期检测会导致较早的治疗和结果的改善。本发明的方法也可以针对测试较早阶段疾病(I/II期)患者，这些患者有他们的疾病会转移性扩散的风险。此外，用别的诊断测试和治疗的早期干预会导致改善的患者存活。
本发明提供了一种用于检测样品中的BRAF突变的存在的方法，所述方法包括：(a)自所述样品分离核酸，其中所述样品包含核酸序列；(b)对所述样品的所述核酸序列实施扩增反应，其中所述扩增反应包含能够与BRAF突变体序列在BRAF序列中的第一位特异性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，和能够在BRAF序列中的第二位特异性退火的第二引物，其中所述第二引物是SEQ IDNO：10，其中所述第一和第二引物与双链BRAF序列的不同链退火，其中当所述样品的序列包含在所述BRAF序列的所述第一位包含突变体序列的BRAF序列时，所述扩增反应能够生成BRAF突变体特异性扩增产物；并(c)显现通过所述扩增反应生成的扩增产物，其中BRAF突变体特异性扩增产物的检出是所述样品中的BRAF突变存在的阳性指示剂。
本发明还提供了一种用于检测样品中的转移性黑素瘤的存在的方法，所述方法包括：(a)自所述样品分离核酸，其中所述样品包含核酸序列；(b)对所述样品的所述核酸序列实施扩增反应，其中所述扩增反应包含能够与BRAF突变体序列在BRAF序列中的第一位特异性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，和能够在BRAF序列中的第二位特异性退火的第二引物，其中所述第二引物是SEQ ID NO：10，其中所述第一和第二引物与双链BRAF序列的不同链退火，其中当所述样品的序列包含在所述BRAF序列的所述第一位包含突变体序列的BRAF序列时，所述扩增反应能够生成BRAF突变体特异性扩增产物；并(c)显现通过所述扩增反应生成的扩增产物，其中BRAF突变体特异性扩增产物的检出是所述样品中的转移性黑素瘤的阳性指示剂。
本发明的实施方案包含BRAF V600E、V600D、V600K、V600M、和V600A突变体特异性引物。例示性的BRAF V600E突变体特异性引物对包括SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。例示性BRAFV600D突变体特异性引物对包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10。例示性BRAF V600K突变体特异性引物对包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10。例示性BRAF V600M突变体特异性引物对包括SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10。例示性BRAF V600A特异性引物包括SEQID NO：3和SEQ ID NO：10。这些引物设计为避免任何已知的BRAF多态性。如本文中所描述的，此类寡核苷酸可以是可检测地标记的(detectablylabeled)。
BRAF V600突变体特异性引物(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10)或合适的BRAF突变体特异性引物对可以是包含生物学相容的盐溶液和/或其它缓冲液或组分的组合物的组分。
本发明的实施方案包括寡核苷酸探针序列SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，其中使用寡核苷酸作为探针以供检测BRAF突变体序列。此探针设计为避免任何已知的BRAF多态性。任选地，寡核苷酸是可检测地标记的。
本发明还提供了包含SEQ ID NO：1-12中至少一项的试剂盒。
可以利用本发明的实施方案来检测V600E、V600D、V600K、V600M、和V600A BRAF突变。
样品
所述方法包括自受试者(例如，哺乳动物)获得组织或体液样品，其中所述样品含有核酸。可以使用的组织或体液的非限制性例子包括血液、血浆、淋巴、肿瘤活组织检查、和身体组织。在一个实施方案中，组织样品包括经石蜡包埋的组织样本。在一些实施方案中，所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实施方案中，核酸是核糖核酸(RNA)。
可以将本方法应用于来自患者的任何类型的组织。此类组织的来源包括但不限于神经系统、甲状腺、皮肤、胃肠道、大肠、胆道、卵巢、眼、前列腺、中枢神经系统、肝、小肠、乳房、胰、软组织、上呼吸消化道、肾上腺、自主神经节、造血和淋巴组织、肺、食管、脑垂体、和胃。为了检查肿瘤组织的抗性，优选的是检查肿瘤组织。在一个优选的实施方案中，也检查来自自其获得肿瘤的患者的正常组织的一部分。
可以在一大批肿瘤类型里应用本发明的方法。这容许制备个体“肿瘤表达概况”，由此在个体患者样品中测定BRAF V600E、V600D、V600K、V600M、或V600A突变体序列的表达水平，并预测对各种化疗剂的响应。在某些实施方案中，将本发明的方法应用于结肠癌或黑素瘤肿瘤。
分离核酸
本发明的实施方案利用本领域技术人员已知的DNA分离方法。一般地，目的是将细胞的细胞核中存在的DNA与其它细胞组分分开。DNA的分离通常以裂解或分解组织或细胞开始。此过程对于破坏蛋白质结构是至关重要的，并且容许自细胞核释放核酸。在盐溶液中实施裂解，所述盐溶液含有使蛋白质变性的去污剂或蛋白酶(降解蛋白质的酶)，诸如蛋白酶K，或在一些情况中含有这两者。它导致细胞的分解，并溶解膜。DNA分离方法包括但不限于酚：氯仿提取、高盐沉淀、碱变性、离子交换柱层析、树脂结合、和顺磁性珠结合。
本发明的实施方案利用本领域技术人员已知的RNA分离方法。可以通过多种方法，包括但不限于Trizol和硫氰酸胍-酚-氯仿提取来将RNA分离并准备好以供杂交。RNA分离的原理基于细胞/组织裂解，接着进行提取、沉淀和清洗。本领域技术人员应当理解，RNA分离的选择会取决于样品类型。通过提及而收录US 12/144,388，其涉及一种自经石蜡包埋的组织(一种用于癌基因标志物测试的常见来源)分离RNA的方法。
扩增
本发明的实施方案利用热和等温扩增方法，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、连接酶链式反应(LCR)、螺旋酶依赖性扩增(HDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)及扩增受阻突变系统(ARMS)。在一个优选的实施方案中，在ARMS中使用所述引物和探针。
检测
本发明的实施方案利用检测方法，包括但不限于标记扩增步骤期间使用的引物，使得用可检测标志物标记扩增产物，并将扩增产物与用可检测标志物标记的寡核苷酸探针杂交。可检测标志物包括但不限于化学发光标签、荧光标签、和放射性标签。
可以使用与依照本领域技术人员会已知的方法使用的标记物类型对应的方法来直接测量经标记的扩增产物。可以依照本领域技术人员已知的方法将经标记的探针与扩增产物杂交。
在实施本发明的方法中，在患者肿瘤样品中测定BRAF V600E突变体表达水平以预测治疗方案的功效。在实施本发明的方法中，在患者肿瘤样品中测定BRAF V600E突变体表达水平以预测治疗方案的功效。在实施本发明的方法中，在患者肿瘤样品中测定BRAF V600D突变体表达水平以预测治疗方案的功效。在实施本发明的方法中，在患者肿瘤样品中测定BRAF V600K突变体表达水平以预测治疗方案的功效。在实施本发明的方法中，在患者肿瘤样品中测定BRAF V600M突变体表达水平以预测治疗方案的功效。在实施本发明的方法中，在患者肿瘤样品中测定BRAF V600A突变体表达水平以预测治疗方案的功效。
在实施本发明的此实施方案的方法中，优选地，自患者分离肿瘤细胞。自患者手术切出或通过常规的活组织检查获得实体或淋巴肿瘤或其部分。通过本领域中典型的任何方法，例如Sambrook，Fischer and Maniatis，MolecularCloning，a laboratory manual(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，(1989)从细胞提取自冷冻或新鲜的样品分离的RNA。优选地，注意避免提取过程期间的RNA降解。
表1
Figure BDA0000152055800000081
Figure BDA0000152055800000092
  Braf_V600D_2GC-F3   AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATAT   仅600D
  Braf_V600M_2GT-F2   AAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACTAT   仅600M
  Braf_1799A_2GC-F   AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACAG   V600E
常见的反向引物(与所有上述正向引物一起使用)
  2Braf_C600-R   GATCCAGACAACTGTTCAAACTGA
常见的探针(与所有引物组合一起使用)
  Braf_C600-Mc2   6FAM-TCCATCGAGATTTC
  Braf_C600-Mc3   6FAM-ACCCACTCCATCGAGA
X碱基＝次要突变
XX碱基＝感兴趣的突变
实施例
实施例1：测试本发明的引物
制备合成的V600E构建体以测试本发明的引物和探针特异性扩增含有BRAF V600E突变的核酸的能力。使用针对BRAF V600E突变的两组引物/探针来进行验证。将V600E合成构建体在gDNA(0.67ng/uL，5ng/PCR)的背景中连续稀释(1∶2)17次。突变浓度范围为10fM至0.15aM。对对照(外显子13)和V600E突变一式二份测定每个稀释样品6x(总共12次)。
实施例2：V600K BRAF突变的检测
可以利用为V600E突变设计的相同引物对来检测罕见的V600K BRAF突变。V600K突变是1798-1799 GT＞AA双重突变。SEQ ID NO：2构成高度特异性引物，其仅会在存在单一1799 T＞A突变的情况中生成扩增产物。如此，在实施利用引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10的扩增反应和利用引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：10对相同样品的另一反应时，第一反应会提供扩增产物(阳性)，而第二反应不会提供产物(阴性)。阳性和阴性结果的此种组合指示V600K突变的存在。
实施例3：BRAF T1799A/GT1798-1799AA/TG1799-1800AT突变排他性(exclusivity)测试
A)测试材料
1.生成DNA合成片段，其含有BRAF V600D、E、和K突变
a.BRAF V600D：
AGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGATAAATCTCGA
TGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTT
b.BRAF V600E
c.BRAF V600K：
ACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAAAGAAATCTC
GATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCAT
TTT
2.针对BRAF突变V600D、E和K突变的序列特异性引物/探针(表1中所列的序列)
a.1799A_1GT(对1799T至A碱基对变化(V600E、V600D和V600K特异性)
b.V600D_2GA(对V600D特异性)
c.V600K_2AT(对V600K特异性)
B.规程
1.将三种合成片段之每种在0.667ng/ul基因组DNA(Promega Corp.-人基因组DNA，100ug)中稀释至200aM的浓度
2.用所有三种引物组(对每种突变特异性)PCR扩增每种突变的合成的特异性片段
3.分析排他性
C.对排他性的分析
下列两个引物/探针组已经设计为扩增特定的突变。用每种合成片段测试这些引物以测试排他性
a.1799A_1GT(扩增V600E、V600D和V600K)。已经在测定法开发部分(7)中描述了此引物/探针组以扩增碱基1799处的T至A变化。
b.V600D_2GA(对V600D特异性)。已经在测定法开发部分(7)中描述了此引物/探针组以扩增碱基1799-1800处的TG变化成AT。
c.V600K_2AT(对V600K特异性)。已经在测定法开发部分(7)中描述了此引物/探针组以扩增碱基1798-1799处的CT变化成AA。
在排他性测试中使用所有引物和探针。
结果：下表描述了用特异性引物探针组成功扩增的片段。加号(+)表示扩增特异性片段。
表2：限定每种突变体类型的引物组合如下：
 1799A_1GT   V600K_2AT   V600D_2GA   突变体
 +   -   -   V600E
 +   -   +   V600D
 +   +   -   V600K
 -   -   -   野生型
 -   -   -   无效的
结果：
我们收集了关于每个合成物和引物/探针组合的Ct数据
Figure BDA0000152055800000111
通过扣除使用设计为对各个模板特异性和非特异性的引物/探针组来对每个模板的PCR扩增的Ct测定排他性
Figure BDA0000152055800000112
Figure BDA0000152055800000121
如下测定delta Ct：
例子：
V600D_2GA对V600D合成片段的排他性＝0
使用V600D片段作为模板，用V600D_2GA引物/探针实施扩增
dCt＝30.39-30.39＝0(排他的)
使用V600D片段作为模板，用1799A_1GT引物/探针实施扩增
dCT＝30.34-30.39＝-0.05(排他的)
使用V600D片段作为模板，用V600K_2AT引物/探针实施扩增
dCT＝39.06-30.39＝8.67(非特异性)
接受标准
dCT(使用对片段特异性的引物的Ct-使用对片段非特异性的引物的Ct)小于等于4
第7部分(测定法开发-参见下表)中描述的预置的接受标准，即引物/探针1799_1GT会检出1799处的T至A碱基对变化，并且因此会检出所有突变。
结果：
V600K_2AT对于V600K突变是排他的
V600D_2GA对于V600D突变是排他的
1799A_1GT对于所有三种突变(V600E，V600E和V600K)中含有的1799 T至A变化是排他的。
表3：限定每种突变体类型的引物组合
  BrafEx13   1799A_1GT   1799A_2AT   V600K_2AT   V600D_2GA   突变体
  +   +   +   -   -   V600E
  +   +   -   -   +   V600D
  +   +   -   +   -   V600K
  +   -   -   -   -   野生型
  ＞30Ct   -   -   -   -   无效的

Claims (16)

1.一种用于检测样品中的BRAF突变的存在的方法，所述方法包括：(a)自所述样品分离核酸，其中所述样品包含DNA序列；(b)对所述样品的所述DNA序列实施扩增反应，其中所述扩增反应包含能够与BRAF突变体序列在BRAF DNA序列中的第一位特异性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，和能够在BRAFDNA序列中的第二位特异性退火的第二引物，其中所述第一和第二引物与双链BRAF DNA序列的不同链退火，其中当所述样品的DNA序列包含在所述BRAF DNA序列的所述第一位包含突变体序列的BRAF DNA序列时，所述扩增反应能够生成BRAF突变体特异性扩增产物；并(c)显现通过所述扩增反应生成的扩增产物，其中BRAF突变体特异性扩增产物的检出是所述样品中的BRAF突变的阳性指示剂。
2.一种用于检测样品中的BRAF突变的存在的方法，所述方法包括：(a)自所述样品分离核酸，其中所述样品包含RNA序列；(b)对所述样品的所述RNA序列实施扩增反应，其中所述扩增反应包含能够与BRAF突变体序列在BRAF RNA序列中的第一位特异性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，和能够在BRAFRNA序列中的第二位特异性退火的第二引物，其中所述第一和第二引物与双链BRAF RNA序列的不同链退火，其中当所述样品的RNA序列包含在所述BRAF RNA序列的所述第一位包含突变体序列的BRAF RNA序列时，所述扩增反应能够生成BRAF突变体特异性扩增产物；并(c)显现通过所述扩增反应生成的扩增产物，其中BRAF突变体特异性扩增产物的检出是所述样品中的BRAF突变的阳性指示剂。
3.权利要求1的方法，其中所述BRAF突变的存在是所述样品中的转移性黑素瘤的阳性指示剂。
4.权利要求2的方法，其中所述BRAF突变的存在是所述样品中的转移性黑素瘤的阳性指示剂。
5.权利要求1或2的方法，其中所述BRAF突变选自下组：BRAF V600E、BRAF V600D、BRAF V600K、BRAF V600M和BRAF V600A突变。
6.权利要求1或2的方法，其中所述样品选自下组：血液、组织或细胞。
7.权利要求1或2的方法，其中所述组织样品是经甲醛固定的经石蜡包埋的组织。
8.权利要求1或2的方法，其中能够在BRAF核酸序列中的第二位特异性退火的所述第二引物是SEQ ID NO：10。
9.一种确定用于治疗患者中的肿瘤的化学治疗方案的方法，包括：(a)获得所述肿瘤的组织样品，并固定所述样品，以获得固定的肿瘤样品；(b)自所述固定的肿瘤样品分离mRNA；(c)使用能够扩增所述BRAF基因的区域的寡核苷酸引物对来将所述mRNA进行扩增，以获得BRAF扩增样品；(d)测定所述扩增样品中的BRAF mRNA量；(e)比较来自步骤(d)的BRAF mRNA量与内部对照基因的mRNA量；并(e)基于所述扩增样品中的BRAF mRNA量和BRAF基因表达的阈值水平，确定化学治疗方案。
10.权利要求9的方法，其中所述寡核苷酸引物由寡核苷酸引物对SEQID NO：1和SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：10，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10或与其至少80％相同的寡核苷酸引物对组成。
11.一种用于检测BRAF基因表达的试剂盒，其包含寡核苷酸对SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10或与其至少80％相同的寡核苷酸引物对。
12.一种对BRAF V600E、V600D、V600K、V600M和V600A突变特异性的核酸探针，其中所述探针包含SEQ ID NO：11。
13.一种对BRAF V600E、V600D、V600K、V600M和V600A突变特异性的核酸探针，其中所述探针包含SEQ ID NO：12。
14.一种检测突变体BRAF核酸序列的存在的方法，包括添加探针，其中所述探针包含寡核苷酸序列SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。
15.一种检测样品中的BRAF V600K突变的存在的方法，所述方法包括：(a)自所述样品分离核酸，其中所述样品包含DNA序列；(b)对所述样品的所述DNA序列实施第一扩增反应，其中所述扩增反应包含能够与BRAF突变体序列在BRAF DNA序列中的第一位特异性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO：1，和能够在BRAF DNA序列中的第二位特异性退火的第二引物，其中所述第一和第二引物与双链BRAF DNA序列的不同链退火，其中当所述样品的DNA序列包含在所述BRAF DNA序列的所述第一位包含突变体序列的BRAF DNA序列时，所述扩增反应能够生成BRAF突变体特异性扩增产物；(c)对所述样品的所述DNA序列实施第二扩增反应，其中所述扩增反应包含第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO：2，和能够在BRAF DNA序列中的第二位特异性退火的第二引物，其中由于所述第一引物的简并性，所述扩增反应不能生成BRAF突变体特异性扩增产物；并(d)显现通过所述第一扩增反应生成的扩增产物，其中一个样品中的BRAF突变体特异性扩增产物的检出和来自所述第二反应的扩增产物的缺乏是所述样品中的BRAFV600K突变的阳性指示剂。
16.一种检测样品中的BRAF V600K突变的存在的方法，所述方法包括：(a)自所述样品分离核酸，其中所述样品包含RNA序列；(b)对所述样品的所述RNA序列实施第一扩增反应，其中所述扩增反应包含能够与BRAF突变体序列在BRAF RNA序列中的第一位特异性退火的第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO：1，和能够在BRAF RNA序列中的第二位特异性退火的第二引物，其中所述第一和第二引物与双链BRAF RNA序列的不同链退火，其中当所述样品的RNA序列包含在所述BRAF RNA序列的所述第一位包含突变体序列的BRAF RNA序列时，所述扩增反应能够生成BRAF突变体特异性扩增产物；(c)对所述样品的所述RNA序列实施第二扩增反应，其中所述扩增反应包含第一引物，其中所述第一引物是SEQ ID NO：2，和能够在BRAF RNA序列中的第二位特异性退火的第二引物，其中由于所述第一引物的简并性，所述扩增反应不能生成BRAF突变体特异性扩增产物；并(d)显现通过所述第一扩增反应生成的扩增产物，其中一个样品中的BRAF突变体特异性扩增产物的检出和来自所述第二反应的扩增产物的缺乏是所述样品中的BRAFV600K突变的阳性指示剂。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102816851A (zh) * 2012-08-29 2012-12-12 苏州旷远生物分子技术有限公司 用于检测braf基因v600e突变的引物、探针、试剂盒及方法
CN102876784A (zh) * 2012-09-13 2013-01-16 周宏灏 焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法
CN104017887A (zh) * 2014-06-18 2014-09-03 广州好芝生物科技有限公司 人类braf基因突变检测引物对和探针及其试剂盒
CN105102983A (zh) * 2012-12-27 2015-11-25 奎斯特诊断投资股份有限公司 Ddr2突变作为黑素瘤或基底细胞癌的可靶向的特征
CN105400900A (zh) * 2015-12-29 2016-03-16 杭州迪安生物技术有限公司 焦磷酸测序技术检测braf基因v600e微量突变试剂盒及其应用
CN105861691A (zh) * 2016-05-06 2016-08-17 北京晋祺生物科技有限公司 一种braf基因突变检测的引物组合物、试剂盒及方法
CN109161594A (zh) * 2018-08-17 2019-01-08 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测braf基因突变的方法及其试剂盒

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6153758B2 (ja) * 2012-04-20 2017-06-28 アークレイ株式会社 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
US10077474B2 (en) * 2012-05-29 2018-09-18 Abbott Molecular, Inc. Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits
EP2711432A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-26 Genomica S.A.U. Method for detection of BRAF and PI3K mutations
CN103103269B (zh) * 2013-01-18 2015-07-15 陕西佰美基因股份有限公司 一种基于探针熔解技术准确检测braf基因突变的方法
CN105431550A (zh) * 2013-03-15 2016-03-23 雅培分子公司 多重等位基因检测
KR101378920B1 (ko) * 2013-04-18 2014-03-27 주식회사 현일바이오 Ｂｒａｆ 돌연변이의 선택적 검출 방법 및 이를 이용한 키트
BR112016003058A2 (pt) * 2013-08-14 2017-11-21 Qiagen Mansfield Inc composições e métodos para análise multiplex de ácidos nucleicos nras e braf
JP2017521662A (ja) * 2014-07-11 2017-08-03 エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッドＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． セリン／トレオニンタンパク質キナーゼＢ−ｒａｆ（ＢＲＡＦ）のためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ
JP6941688B2 (ja) * 2017-06-29 2021-09-29 コリア アドヴァンスド インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー 神経節膠腫が誘導された動物モデルならびに神経節膠腫およびこれに関連する疾患の診断用組成物
WO2019066621A1 (ko) * 2017-09-29 2019-04-04 주식회사 젠큐릭스 Ras/braf 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트
WO2022119423A1 (ko) * 2020-12-04 2022-06-09 주식회사 제노픽스 폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101487051A (zh) * 2009-02-24 2009-07-22 广州益善生物技术有限公司 Braf基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004337120A (ja) * 2003-05-19 2004-12-02 Chang Gung Univ 膀胱癌再発検査方法
US7745125B2 (en) * 2004-06-28 2010-06-29 Roche Molecular Systems, Inc. 2′-terminator related pyrophosphorolysis activated polymerization

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101487051A (zh) * 2009-02-24 2009-07-22 广州益善生物技术有限公司 Braf基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JARRY.A.等: "Real-time allele-specific amplification for sensitive detection of the BRAFmutation V600E", 《MATERIALS AND METHOD》, vol. 18, no. 5, 31 October 2004 (2004-10-31), pages 349 - 352, XP004523911, DOI: doi:10.1016/j.mcp.2004.05.004 *
YANCOVITZ等: "Detection of mutant BRAF alleles in the plasma of patients with metastatic melanoma", 《JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS》, vol. 9, no. 2, 30 April 2007 (2007-04-30), XP008151906, DOI: doi:10.2353/jmoldx.2007.060135178 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102816851A (zh) * 2012-08-29 2012-12-12 苏州旷远生物分子技术有限公司 用于检测braf基因v600e突变的引物、探针、试剂盒及方法
CN102876784A (zh) * 2012-09-13 2013-01-16 周宏灏 焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法
CN102876784B (zh) * 2012-09-13 2014-11-19 周宏灏 焦磷酸测序法检测B-raf基因多态性的试剂盒及方法
CN105102983A (zh) * 2012-12-27 2015-11-25 奎斯特诊断投资股份有限公司 Ddr2突变作为黑素瘤或基底细胞癌的可靶向的特征
CN105102983B (zh) * 2012-12-27 2017-08-08 奎斯特诊断投资股份有限公司 Ddr2突变作为黑素瘤或基底细胞癌的可靶向的特征
CN107236816A (zh) * 2012-12-27 2017-10-10 奎斯特诊断投资股份有限公司 Ddr2突变作为黑素瘤或基底细胞癌的可靶向的特征
CN104017887A (zh) * 2014-06-18 2014-09-03 广州好芝生物科技有限公司 人类braf基因突变检测引物对和探针及其试剂盒
CN105400900A (zh) * 2015-12-29 2016-03-16 杭州迪安生物技术有限公司 焦磷酸测序技术检测braf基因v600e微量突变试剂盒及其应用
CN105861691A (zh) * 2016-05-06 2016-08-17 北京晋祺生物科技有限公司 一种braf基因突变检测的引物组合物、试剂盒及方法
CN109161594A (zh) * 2018-08-17 2019-01-08 中山大学达安基因股份有限公司 一种检测braf基因突变的方法及其试剂盒

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