CN102816851A

CN102816851A - 用于检测braf基因v600e突变的引物、探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102816851A
Application number: CN2012103103138A
Authority: CN
Inventors: 王进; 赵小龙; 何晓辉; 刘乔; 陈允斌
Original assignee: SUZHOU KUANGYUAN MOLECULAR BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU KUANGYUAN MOLECULAR BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-08-29
Filing date: 2012-08-29
Publication date: 2012-12-12

Abstract

本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的BRAF基因突变检测的引物、探针、试剂盒及方法，用于检测BRAF基因V600E突变。本发明快速、成本低，具有临床检测推广价值。

Description

用于检测BRAF基因V600E突变的引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于检测BRAF基因V600E突变的引物、探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

BRAF基因是一种癌基因，与ARAF和RAF1(CRAF)基因同属于RAF家族，其编码的BRAF蛋白是一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信号通路中的重要转导因子，参与细胞内多种生物学事件的调控，如细胞生长、分化和凋亡等。

BRAF基因位于7q34，长约190kb，转录mRNA长2.5kb，编码783氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000~95000。BRAF蛋白由783个氨基酸组成，功能上从N 端到C端为RAS结合区、富半胱氨酸区(Cys)、甘氨酸环(Gloop)和激活区。在绝大多数组织和细胞类型中，BRAF是MEK/ERK最为关键的激活因子。它主要有CR1、CR2和CR33个保守区。其中CR1区含RBD区(RAS蛋白结合区)和富含半胱氨酸区(Cys)；CR3区为激酶结构域，含甘氨酸环(G loop)，为ATP结合位点和激活区，该区T598和S601两个位点的磷酸化对BRAF蛋白的激活至关重要，这两个位点氨基酸的置换将导致激酶持续性激活。

研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的BRAF突变。BRAF突变主要有两种类型：(1). 11%位于Exon11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等的点突变；(2). 89％的突变发生在Exon15上的激活区，其中约92％位于第1799位点T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(即V600E)。V600E突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。BRAF蛋白激活后导致MEK/ERK的激活，通过转录物或非转录物的方式影响肿瘤进展。因此，及时检测BRAF突变情况，对早期筛查肿瘤病人以及对肿瘤个体化治疗、预后将具有重要的指导意义。

多年来，国内外对BRAF基因突变进行检测大多采用DNA直接测序法。由于测序法的灵敏度只能检测低至20%含量的突变，由于肿瘤组织取材及肿瘤细胞突变发生率的不同，导致测序法往往不能检出BRAF突变，造成假阴性的结果。另外，测序过程周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选，难以实现大规模推广。

发明内容

本发明针对现有技术检测BRAF基因突变时灵敏度低、周期长、数据分析过程繁琐等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的BRAF基因突变检测的引物、探针、试剂盒及方法，用于检测BRAF基因V600E突变，本发明快速、成本低，具有临床检测推广价值。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物与探针, 其特征在于所述检测引物及探针根据BRAF基因V600E突变位点设计，序列如下所示：

检测正向引物：5’- AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3’；（ SEQ ID No.1）

检测反向引物：5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3’；（ SEQ ID No.2）

检测荧光探针：5’荧光基团- TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3’淬灭基团（ SEQ ID No.3）。

本发明还提供了一种用于检测BRAF基因V600E突变的内控引物及内控荧光探针, 其特征在于所述内控引物及探针根据GAPDH基因保守序列设计，序列如下所示：

内控正向引物：5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；（ SEQ ID No.4）

内控反向引物：5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；（ SEQ ID No.5）

内控荧光探针：5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团（ SEQ ID No.6）。

上述检测BRAF基因V600E突变的探针及内控荧光探针5’端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM，3’端连有的淬灭基团为Dabcyl；内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为ROX，3’端连有的淬灭基团为BHQ-2。

本发明还提供了一种用于检测BRAF基因V600E突变的荧光PCR试剂盒，包括本发明上述检测BRAF基因V600E突变的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说，包含检测BRAF基因V600E突变的突变特异性PCR反应液，PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还包含上述检测引物与探针。上述突变特异性检测的PCR反应液包含的检测引物与探针的序列如下：

检测正向引物：5’- AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3’；

检测反向引物：5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3’；

检测荧光探针：5’荧光基团- TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3’淬灭基团。

上述试剂盒的突变特异性PCR反应液优选方案中，除了包括检测BRAF基因V600E突变的检测引物和相应的荧光探针外，还包括一对内控引物及相应荧光探针，内控引物与内控探针的序列如下：

内控正向引物：5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；

内控反向引物：5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；

内控荧光探针：5’荧光基团-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’淬灭基团。

上述试剂盒中检测BRAF基因V600E突变的探针以及内控荧光探针 5’端的荧光基团可以为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM，3’端连有的淬灭基团为Dabcyl；内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为ROX，3’端连有的淬灭基团为BHQ-2。

上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；

PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：

第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为95℃，时间为20秒；

退火：起始温度为56℃，时间为30 秒；

延伸：温度为65℃，时间为45秒；

第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为95℃，时间为20秒；

退火：温度为56℃，时间为30 秒；（设置荧光信号采集）

延伸：温度为65℃，时间为45秒。

本发明还提供了一种利用上述引物和荧光探针或者含有上述引物和探针的荧光PCR试剂盒进行检测BRAF基因V600E突变的方法，步骤包括

（1）引物和探针的设计：根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的BRAF基因的参考序列（NG_007873.2）以及dbSNP 数据库公开的BRAF基因V600E突变（dbSNP:rs113488022）信息, 采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测BRAF基因V600E位点突变的引物与探针, 具体如下：

检测正向引物：5’- AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3’；

检测反向引物：5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3’；

为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类基因GAPDH的一段保守序列（其GeneBank参考序列编号为：NG_007073.2），采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针，具体序列如下所示：

内控正向引物：5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；

内控反向引物：5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；

（2）待测样本处理和模板提取

2a. 从待检测者体内采集组织样本；

2b. 从组织样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取DNA；

2c. 测定DNA浓度和纯度，要求浓度10~100ng/μl；OD_260nm/OD_280nm=1.6~2.0。

（3）荧光PCR扩增：

将待检测模板DNA与一定量的Taq DNA聚合酶加入上述BRAF基因V600E突变特异性检测的PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：

预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；

PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：

第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为95℃，时间为20秒；

退火：起始温度为56℃，时间为30 秒；

延伸：温度为65℃，时间为45秒；

第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为95℃，时间为20秒；

退火：温度为56℃，时间为30 秒；（设置荧光信号采集）

延伸：温度为65℃，时间为45秒。

（4）分析结果

在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察BRAF基因V600E突变特异性PCR反应体系内检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本含有V600E突变。

本发明还提供了一种检测BRAF基因V600E突变的引物、探针、试剂盒及方法在检测BRAF基因V600E突变中的应用。

本发明所述技术方案中的有关内容解释如下：

1、本发明所述技术方案中：所述引物（primer）是指由一定数量的dNTP构成的寡核苷酸序列，通常由DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。在聚合酶链式反应中，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物的3’-OH必须是游离的。DNA聚合酶可由其3’端开始进行延伸，合成新的核酸链。

2、本发明工作原理是：等位基因特异PCR (Allele Specific PCR, AS-PCR)，又称为等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplification, ASA)或者扩增受阻突变系统(Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于Taq DNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，在进行PCR反应时，若引物3’端形成错配，链延伸反应就会因为3’，5’-磷酸二酯键形成的障碍而受阻，导致PCR产物量急剧减少，在一定扩增循环内，不会检测出特异的扩增产物；反之，3’端配对则能够检测出扩增产物。于是，针对已知的突变位点，将其突变碱基设计于检测引物的3’端，扩增反应后，通过凝胶电泳观察产物的有无即可判断该位点是否含有突变。

荧光定量PCR是( Real-time PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针被称“TaqMan探”，为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’→ 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

通过基于荧光探针的实时荧光PCR技术检测突变特异性反应体系的产物，在特定的扩增循环条件下，检测荧光信号形成对数扩增“S”型曲线则表明该样本含有突变。

2、本发明所述技术方案中，所述荧光探针是一种寡聚核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。目前常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX，ROX等。淬灭基团有BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、TAMRA等。

3. 本发明所述技术方案中，所述的内控引物及其相应的探针可以用来监测反应有效性的指标，用以判断是否存在模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果的情况。正常情况下，PCR正常扩增会形成的指数级扩增曲线，形象的描述为“S”型扩增曲线，表明体系正常扩增。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号形成对数扩增“S”型曲线时，为阳性结果，也说明PCR体系扩增正常，无需采用内控引物及其相应的探针进行结果的验证。然而，当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，检测为阴性结果，但也有可能是模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果，这种情况下，可以采用内控引物及其相应的探针进行排除。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，而内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线时，可以验证阴性结果的准确性。而当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，且内控信号也未形成正常对数扩增“S”型曲线时，则说明实验条件或仪器上出现问题影响试验结果。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：

1、本发明技术方案采用特殊设计的引物与探针，其PCR检测特异性非常高，并且采用实时荧光PCR技术，检测结果判读容易。

2、本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，而且在实验过程中不需测序，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。

3、本发明采用实时荧光PCR技术平台，可实现高通量检测。

附图说明

附图1为某肿瘤组织样本BRAF基因V600E突变检测图。

附图2为某正常组织样本BRAF基因V600E突变检测图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通常采用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的荧光定量PCR仪型号为ABI 7500或BioRad CFX96。

实施例1. 引物和探针的设计：

根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的BRAF基因的参考序列（NG_007873.2）以及dbSNP 数据库公开的BRAF基因V600E突变（dbSNP:rs113488022）信息, 采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测BRAF基因V600E位点突变的引物与探针, 具体如下：

检测正向引物：5’- AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3’；

检测反向引物：5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3’；

检测荧光探针：5’FAM- TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3’ Dabcyl。

内控正向引物：5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；

内控反向引物：5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；

内控荧光探针：5’ROX-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’BHQ-2。

实施例2. 引物的制备

将设计好的引物及探针序列发至合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。

实施例3. 检测BRAF基因V600E突变的荧光PCR试剂盒的准备

制备检测BRAF基因V600E突变特异性反应液，该PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还包含了突变检测引物与探针及内控引物与探针。突变检测PCR反应液各组分浓度及包含的引物与探针的序列信息如下：

表1.PCR反应液组分

反应液组分	浓度
		缓冲液	10×
镁离子	15mM
		dNTP（A/T/G/C）	各20mM
上游检测引物	2μM
		下游检测引物	2μM
检测信号探针	2μM
		上游内控引物	1μM
下游内控引物	1μM
		内控信号探针	1μM

反应液内包含的引物与探针的序列信息如下：

检测正向引物：5’- AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3’；

检测反向引物：5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3’；

检测荧光探针：5’FAM- TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT -3’ Dabcyl;

内控正向引物：5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；

内控反向引物：5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；

内控荧光探针：5’ROX-TGTTGCCATCAATGACCCCTTC-3’BHQ-2。

实施例4：检测BRAF基因V600E突变的荧光PCR方法

第一步：准备DNA

（1）、从待检测者体内采集组织样本；

（2）、从组织样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取DNA；

（3）、测定DNA浓度和纯度，要求浓度10~100ng/μl；OD_260nm/OD_280nm=1.6~2.0。

第二步：PCR反应体系配制

在荧光定量PCR专用的管子内按照下表配制PCR反应体系

表2.PCR反应体系组成

ddH₂O	加至25μl
		PCR反应液	2.5μl
DNA聚合酶（2.5U/μl）	0.2μl
		基因组DNA	约80ng
石蜡油	20μl

上述PCR反应液采用实施例3制备的试剂盒，也可以按照实施例3提供的配方表1制备检测BRAF基因V600E突变的PCR反应液。

第三步：上机检测

按照下表设置温度循环及信号采集程序

表3.PCR反应程序

注：“*”处设置Fam和Rox双通道采集荧光信号。

第四步：分析结果

在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，在内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线的前提条件下，观察突变检测PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检样本中含有BRAF基因V600E突变。

附图1为某肿瘤组织样本BRAF基因V600E突变检测图，检测图显示内控荧光信号（ROX通道）形成指数扩增“S”型曲线，显示反应体系工作正常，检测荧光信号（FAM通道）也形成指数扩增“S”型曲线，提示该样本含有BRAF基因V600E突变。

附图2为某正常组织样本BRAF基因V600E突变检测图，检测图显示内控荧光信号（ROX通道）形成指数扩增“S”型曲线，显示反应体系工作正常，而检测荧光信号（FAM通道）没有形成指数扩增“S”型曲线，提示该样本不含有BRAF基因V600E突变。

注意：

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Organization Applicant

----------------------

Street : 江苏省常熟市高新区湖山路99号常熟国家大学科技园求真楼T2-409室

City : 常熟市

State : 江苏省

Country : 中国

PostalCode : 215500

PhoneNumber : 0512-52358499

FaxNumber :

EmailAddress :

<110> OrganizationName : 苏州旷远生物分子技术有限公司

Application Project

-------------------

<120> Title : 用于检测BRAF基因V600E突变的引物、探针、试剂盒及方法

<130> AppFileReference :

<140> CurrentAppNumber :

<141> CurrentFilingDate : 2012-08-01

Sequence

--------

<210> SEQ ID No.1

<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）

<400> PreSequenceString

AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA

<212> Type : DNA

<211> Length : 28

Sequence

--------

<210> SEQ ID No.2

<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）

<400> PreSequenceString

CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC

<212> Type : DNA

<211> Length : 23

Sequence

--------

<210> SEQ ID No.3

<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）

<400> PreSequenceString

TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCT

<212> Type : DNA

<211> Length : 24

Sequence

--------

<210> SEQ ID No.4

<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）

<400> PreSequenceString

CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG

<212> Type : DNA

<211> Length : 22

Sequence

--------

<210> SEQ ID No.5

<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）

<400> PreSequenceString

CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT

<212> Type : DNA

<211> Length : 24

Sequence

--------

<210> SEQ ID No.6

<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）

<400> PreSequenceString

TGTTGCCATCAATGACCCCTTC

<212> Type : DNA

<211> Length : 22

Claims

1. 一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物与探针, 其特征在于所述检测引物及探针根据BRAF基因V600E突变位点设计，序列如下所示：

检测正向引物：5’- AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACACA -3’；

检测反向引物：5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGCATC -3’；

2. 一种用于检测BRAF基因V600E突变的内控引物及内控荧光探针, 其特征在于所述内控引物及探针根据GAPDH基因保守序列设计，序列如下所示：

内控正向引物：5’-CGCCCTCTTAATGGGGAGGTGG-3’；

内控反向引物：5’-CTTTGGGGCTCACCATGTAGCACT-3’；

3.如权利要求1-2所述的引物对及相应荧光探针，其特征在于所述荧光探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX，3’端的淬灭基团为BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、或TAMRA。

4. 一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的检测引物及其相应探针。

5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括权利要求2所述的内控引物对及相应荧光探针。

6.一种BRAF基因V600E突变的检测方法，所述方法包括使用权利要求1所述的引物及探针。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述方法还包括使用权利要求2所述的引物及探针。

8.一种BRAF基因V600E突变的检测方法，所述方法包括使用权利要求4-5所述的试剂盒。

9.权利要求1-2所述的引物及探针在检测BRAF基因V600E突变中的应用。