CN104404159A - 用于检测人hla-b*5801基因的引物、探针、荧光pcr试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于人HLA-B*5801等位基因检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法，根据“等位基因特异PCR”原理，在实时荧光定量PCR技术平台上检测人白细胞抗原HLA-B*5801等位基因。

Description

用于检测人HLA-B*5801基因的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于HLA-B*5801等位基因检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。
背景技术
人类白细胞抗原 （HLA）是一组位于第6号染色体上的基因，是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体，全世界已发现超过2700多种等位基因，虽然其中多少等位基因罕见。HLA基因是人类最复杂的遗传多态性系统，其多态性分布存在明显的族群特征。至今，来自中国大陆、香港、台湾和泰国的汉族人的研究表明，HLA-B*5801等位基因与药物别嘌醇导致的严重皮肤不良反应存在着很强的相关性。而在欧洲及日本人种中，其相关性则比较低。
别嘌醇为次黄嘌呤氧化酶抑制剂,能够减少尿酸合成并降低血中尿酸浓度,是治疗痛风的首选药物。但该药引起的严重药疹临床屡见报道,是最易引起严重药疹的药物之一。有研究结果显示别嘌醇的不良反应主要表现为皮肤、黏膜损害,占不良反应的88.28%,其余部分57.81%为发热,约31.64%为肝脏损,20.31%为肾脏损害, 9.77%则为血液系统损害。而别嘌呤醇引发皮肤变态反应致死率达40%
HLA-B*5801等位基因如何引发别嘌醇导致的皮肤不良反应的药理学机制目前还不清楚，但由于携带高水平HLA-B5801等位基因者发生别嘌醇严重过敏反应的风险显著升高，仍然可以HLA-B*5801作为药物不良反应的标记物。因此，在开始别嘌醇治疗前，高危患者最好能检测该等位基因携带频率，尤其是在汉族人中。HLA-B*5801在汉族人的携带率高达~9%左右，痛风患病率在中国逐年上升，检测HLA-B*5801对减少药物不良反应，提高治疗效果有着重要意义。
HLA等位基因有2700多种，分为A、B、C等基因族。中国汉人中，HLA-B等位基因大概有150种左右，HLA-B*5801的携带率达~9%，并呈区域性差异。等位基因间的差异在于多个编码氨基酸的SNP位点组成。
目前，国内外对HLA-B*5801等位基因进行分析，大多采用PCR-SSCP、测序法（SBT）和荧光PCR法。测序法最为准备，但需要通过专业软件对测序结果进行分析，检测分析周期长。PCR-SSCP法是一种经典的方法，通过几对HLA-B*5801特异性引物扩增DNA并通过电泳结果来分析，污染风险大，周期长，不适合临床应用。现行的荧光PCR法，采用染料对扩增的特异片段产生信号，特异性较弱，而且无法进行PCR反应内控。
发明内容
本发明针对现有技术检测HLA-B*5801等位基因时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于Taqman实时荧光定量PCR技术平台的HLA-B*5801等位基因检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，用于检测人HLA-B*5801等位基因。本方法针对临床检测的要求，引入PCR反应内控，保证检测反应的真实性和准确性。本发明快速、成本低，具有广泛推广价值。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物及其相应探针，根据HLA-B*5801特异的等位基因多态性设计，序列如下所示：
正向引物：
HLA-B*5801 F: 5’-CACGGAACATGAAGGCCTCC -3’ （ SEQ ID No.1）；
反向引物：
HLA-B*5801 R: 5’-CGGAGGAGGCGCCCGTAG-3’ （ SEQ ID No.2）
荧光探针：
TM-HLA-B*5801: 5’荧光基团- CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT -3’淬灭基团（ SEQ ID No.3）。
本发明还提供了 一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的内控引物对及相应荧光探针，序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’-GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3’ （ SEQ ID No.4）；
反向引物：GAPDH R: 5’-TAGCACTCACCATGTAGTTGAG-3’ （ SEQ ID No.5）；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3’淬灭基团（ SEQ ID No.6）。
上述检测人HLA-B*5801等位基因的探针和内控引物对应的荧光探针5’端的荧光基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM，TET，VIC，HEX或ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光PCR定量分析的常规使用的荧光淬灭基团，优选BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse或TAMRA，更优选的方案为检测荧光探针的5’端连有的荧光基团为FAM，3’端连有的淬灭基团为BHQ1；内控荧光探针的5’端连有的荧光基团为ROX，3’端连有的淬灭基团为BHQ-2。
本发明还提供了一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的荧光PCR试剂盒，包括本发明所述检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针和使用说明书。具体的说，包括检测人HLA-B*5801等位基因的PCR反应液，其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还对应的包含上述检测引物与探针。上述各特异性检测的PCR反应液分别包含的引物与探针的序列如下：
（1）HLA-B*5801 PCR反应液
HLA -B*5801 F：5’- CACGGAACATGAAGGCCTCC -3’；
HLA- B*5801 R：:5’- CGGAGGAGGCGCCCGTAG -3’
TM-HLA- B*5801 : 5’荧光基团- CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT -3’淬灭基团
上述试剂盒的PCR反应液优选方案中，除了包括检测人HLA B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针外，还包括一对内控引物及相应荧光探针，内控引物和探针的序列如下：
内控引物：
GAPDH F: 5’- GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG -3’ 
GAPDH R: 5’- TAGCACTCACCATGTAGTTGAG -3’
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’荧光基团- TGATGCATCTATGAACGCTTC -3’淬灭基团。
上述试剂盒使用说明书包含对PCR扩增条件的描述，优选的PCR扩增条件为：预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为20秒；
退火延伸：起始温度为62℃，时间为45 秒；
第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为20秒；
退火延伸：起始温度为62℃，时间为45 秒；（设置荧光信号采集）
本发明还提供了一种利用上述检测引物和荧光探针或者上述含有的检测HLA-B*5801等位基因的荧光PCR试剂盒进行HLA-B*5801等位基因检测的方法，步骤包括：
（1）待测样品处理和模板提取
a. 从待检测者抽取血液样本；
b. 从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；
c. 测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μl；OD260nm/OD280nm=1.6~2.0。
（2）荧光PCR扩增：
将待检测模板DNA与一定量的Taq DNA聚合酶加入含有本发明所述检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后，放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，优选将待检测模板DNA与一定量的Taq DNA聚合酶加入含有内控引物及相应荧光探针的上述试剂盒优选方案的PCR反应液内，在荧光PCR管内混合均匀离心后放入荧光定量PCR仪器按照特定的温度循环及信号采集程序进行PCR反应，用以监测反应有效性。
上述荧光PCR扩增方案优选采用以下温度循环及信号采集程序进行PCR反应：
预变性的条件为：温度为95℃，时间为3分钟；
PCR反应由第一阶段和第二阶段构成：
第一阶段由10次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为20秒；
退火延伸：起始温度为62℃，时间为45 秒；
第二阶段由30次扩增循环构成，其条件为：
变性：温度为95℃，时间为20秒；
退火延伸：起始温度为62℃，时间为45 秒；（设置荧光信号采集）
（3）分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的HLA-B*5801等位基因为阳性。
本发明还提供了一种检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针在检测人HLA-B*5801等位基因的应用。
本发明还提供了一种含有检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针的试剂盒在检测人HLA-B*5801等位基因的应用。
本发明所述技术方案中的有关内容解释如下。
1. 本发明工作原理是：等位基因特异PCR (Allele Specific PCR, ASPCR)，又称为等位基因特异性扩增法(Allele Specific Amplification, ASA)或者扩增受阻突变系统(Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，其基本原理是由于Taq DNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，在进行PCR反应时，若引物3’端形成错配，链延伸反应就会因为3’,5’-磷酸二酯键形成的障碍而受阻，导致PCR产物量急剧减少，在一定扩增循环内，不会检测出特异的扩增产物；反之，3’端配对则能够检测出扩增产物。于是，针对已知的多态性位点，将其多态性碱基设计于检测引物的3’端，扩增反应后，通过凝胶电泳观察产物的有无即可判断多态性位点的碱基类型。
荧光定量PCR是( Real-time PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针被称“TaqMan探针”，为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’→ 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
通过基于荧光探针的实时荧光PCR技术检测“等位基因特异PCR”反应体系的产物，根据形成扩增曲线的荧光信号在特定阈值时循环数（Ct值）的大小可判断相应检测体系内模板相应等位基因的类型。
2. 本发明所述技术方案中的引物和探针的设计：根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的HLA-B基因的参考序列（NG_023187）以及英国IMG/HLA 数据库公开的HLA-B*5801 (HLA00386) 的信息, 采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测HLA-B*5801等为基因的引物与探针。为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列（其GeneBank参考序列编号为：NG_007073.2），采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针。
本发明所述技术方案中，所述引物（primer）是指由一定数量的dNTP构成的寡核苷酸序列，通常由DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。在聚合酶链式反应中，引物可与待扩增目的核酸链上与之互补的区域结合，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物的3’-OH必须是游离的。DNA聚合酶可由其3′端开始进行延伸，合成新的核酸链。
本发明所述技术方案中，所述荧光探针是一种寡聚核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。目前常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX，ROX等。淬灭基团有BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、TAMRA等。
3. 本发明所述技术方案中，所述的内控引物及其相应的探针可以用来监测反应有效性的指标，用以判断是否存在模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果的情况。正常情况下，PCR正常扩增会形成的指数级扩增曲线，形象的描述为“S”型扩增曲线，表明体系正常扩增。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号形成对数扩增“S”型曲线时，为多态性类型的阳性结果，也说明PCR体系扩增正常，无需采用内控引物及其相应的探针进行结果的验证。然而，当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，检测结果为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阴性结果，但也有可能是模板质量、机器故障、试剂稳定性等因素影响试验结果，这种情况下，可以采用内控引物及其相应的探针进行排除。当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，而内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线时，可以验证多态性类型的阴性结果的准确性。而当特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号未形成对数扩增“S”型曲线，且内控信号也未形成正常对数扩增“S”型曲线时，则说明实验条件或仪器上出现问题影响试验结果，而非多态性类型的阴性结果。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1.本发明技术方案中的检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物和相应的荧光探针以及内控引物及相应探针，其PCR检测特异性非常高，并且采用实时荧光PCR技术，检测结果判读容易，更加适合临床检测。本发明技术方案采用Taqman探针，检测信号比荧光染料根据特异。
2、本发明技术方案中的检测引物与探针价格低廉，而且在实验过程中不需测序，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。
3、本发明技术方案中的检测引物与探针，采用实时荧光PCR技术平台，可实现高通量检测。
附图说明
附图1为某HLA-B*5801等位基因携带者样本试剂盒检测图。
附图2为某样本HLA-B*5801等位基因携带者样本测序图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，通常采用常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。本发明所使用的荧光定量PCR仪型号为ABI 7500或BioRad CFX96。
实施例1. 引物和探针的设计：
根据美国国立生物技术信息中心NCBI的核酸序列数据库GeneBank公开的HLA-B基因的参考序列（NG_023187）以及英国IMG/HLA 数据库公开的HLA-B*5801 (HLA00386) 的信息, 采用ABI公司的Primer Express 3.0软件分别设计检测HLA-B*5801等为基因的引物与探针。引物与探针, 具体如下：
正向引物：
HLA-B*5801 F: 5’-CACGGAACATGAAGGCCTCC -3’
反向引物：
HLA-B*5801 R: 5’-CGGAGGAGGCGCCCGTAG-3’
荧光探针：
TM-HLA-B*5801: 5’Fam- CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT -3’BHQ1
为了监测反应体系的有效性，在检测体系内加入内控引物与探针，本发明选取人类保守基因GAPDH的一段序列（其参考序列编号为：NG_007073.2），采用ABI公司的Primer Express 3.0软件设计检测引物及探针，具体序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’- GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG -3’；
反向引物：GAPDH R: 5’- TAGCACTCACCATGTAGTTGAG -3’；
内控荧光探针：
TM-GAPDH: 5’ Rox- TGATGCATCTATGAACGCTTC -3’BHQ2。
实施例2. 引物的制备
将设计好的引物及探针序列交由合成公司合成，一般采用仪器自动化学合成，需提供合成检验合格报告。
实施例3：荧光PCR检测人HLA-B*5801等位基因的试剂盒的准备
制备检测人HLA-B*5801等位基因反应液, 其中PCR反应液包含了PCR反应必须的缓冲液、镁离子、dNTP等物质外，还包含了检测引物与探针和内控引物与探针。上述各特异性检测的PCR反应液组分浓度及包含的引物与探针的序列信息如下：
表1. PCR反应液组分
反应液组分 浓度
缓冲液 10×
镁离子 15mM
dNTP（A/T/G/C） 各20mM
上游检测引物 2μM
下游检测引物 2μM
检测信号探针 2μM
上游内控引物 1μM
下游内控引物 1μM
内控信号探针 1μM
HLA-B*5801等位基因
HLA-B*5801 F: 5’-CACGGAACATGAAGGCCTCC -3’
HLA-B*5801 R: 5’-CGGAGGAGGCGCCCGTAG-3’
TM-HLA-B*5801: 5’Fam- CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT -3’BHQ1
GAPDH F: 5’- GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG -3’；
GAPDH R: 5’- TAGCACTCACCATGTAGTTGAG -3’；
TM-GAPDH: 5’ Rox- TGATGCATCTATGAACGCTTC -3’BHQ2。
 
实施例4：荧光PCR检测人HLA-B*5801等位基因的方法
第一步：准备DNA
（1）.从待检测者抽取血液样本；
（2）.从血液样本中获取DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；
（3）.测定DNA浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μl；OD260nm/OD280nm=1.7~2.0。
第二步：PCR反应体系配制
在荧光定量PCR专用的管子内按照下表配制PCR反应体系
表2.PCR反应体系组成
ddH2O 加至25μl
PCR反应液 2.5μl
DNA聚合酶（5.0U/μl） 0.5μl
基因组DNA 约80ng
石蜡油 20μl
上述PCR反应液采用实施例3制备的试剂盒中的HLA-B*5801等位基因反应液，也可以按照实施例3表1提供的配制方法制备含有检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物与探针并含有内控引物和探针的PCR反应液;
第三步：上机检测
按照下表设置温度循环及信号采集程序
表3. PCR反应程序
注：“*”处设置Fam和Rox双通道采集荧光信号。
第四步：分析结果
在上述PCR反应体系与温度循环程序条件下，在内控信号形成正常对数扩增“S”型曲线的前提条件下，观察特异性PCR反应体系内目的检测荧光信号是否形成对数扩增“S”型曲线，如果形成对数扩增“S”型曲线则该待检DNA样本为该特异性反应体系所代表的多态性类型的阳性。例如：某待检样本在反应体系检测荧光信号（FAM通道）形成对数扩增“S”型曲线，则提示该样本为HLA-B*5801等位基因阳性。
附图1为某样本HLA-B*5801等位基因试剂盒检测图，检测图HLA-B*5801等位基因反应体系内的内控荧光信号均合格，则判断该样本为HLA-B*5801等位基因阳性。
附图2为附图1样本HLA-B*5801等位基因测序图，测序结果显示该样本HLA-B*5801等位基因阳性。试剂盒检测结果与测序结果一致。
注意：
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
Organization Applicant
----------------------
      Street : 高新技术开发区金都路8号
      City : 常熟市
      State : 江苏省
      Country : 中国
      PostalCode : 215500
      PhoneNumber : 0512-52358499
      FaxNumber :
      EmailAddress :
<110> OrganizationName : 苏州旷远生物分子技术有限公司
 
Application Project
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<120> Title : 用于检测人HLA-B*5801基因的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法
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<210> SEQ ID No.3
<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）
<400> PreSequenceString
      CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT
<212> Type : DNA
<211> Length : 22
 
 
Sequence
--------
<210> SEQ ID No.4
<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）
<400> PreSequenceString
      GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG
<212> Type : DNA
<211> Length : 25
 
 
Sequence
--------
<210> SEQ ID No.5
<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）
<400> PreSequenceString
      TAGCACTCACCATGTAGTTGAG
<212> Type : DNA
<211> Length : 20
 
 
Sequence
--------
<210> SEQ ID No.6
<213> OrganismName : 人类（Homo sapiens）
<400> PreSequenceString
      TGATGCATCTATGAACGCTTC
<212> Type : DNA
<211> Length : 20 

Claims (8)

1.一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的检测引物及其相应探针，其特征在于所述检测引物及探针根据HLA-B*5801等位基因特异位点设计，序列如下所示：
正向引物：
HLA-B*5801 F: 5’-CACGGAACATGAAGGCCTCC -3’
反向引物：
HLA-B*5801 R: 5’-CGGAGGAGGCGCCCGTAG-3’
荧光探针：
TM-HLA-B*5801: 5’荧光基团- CCCAGGCGCGTTTACCCGGTTT -3’淬灭基团。
2.一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的内控引物对及相应荧光探针，其特征在于所述内控引物对及相应荧光探针的序列如下所示：
内控引物对：
正向引物：GAPDH F: 5’-GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTG-3’ 
反向引物：GAPDH R: 5’-TAGCACTCACCATGTAGTTGAG-3’内控荧光探针：
荧光探针: TM-GAPDH: 5’荧光基团-TGATGCATCTATGAACGCTTC-3’淬灭基团。
3.如权利要求1-2所述的引物对及相应荧光探针，其特征在于所述荧光探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX，3’端的淬灭基团为BHQ -1、BHQ -2、Dabcyl、Eclipse、或TAMRA。
4.一种用于检测人HLA-B*5801等位基因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求1所述的检测引物及其相应探针和/或括权利要求2所述的检测引物及其相应探针。
5.如权利要求4所述的检测人HLA-B*5801等位基因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括如权利要求2所述内控引物对及相应荧光探针。
6.一种人HLA-B*5801等位基因的检测方法，所述方法包括使用权利要求1和/或权利要求2所述的引物及探针。
7.一种人HLA-B*5801等位基因的检测方法，所述方法包括使用权利要求4-5所述的试剂盒。
8.权利要求1-2所述的引物及探针在检测人HLA-B*5801等位基因中的应用。
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