JP7111773B2 - 核酸配列変種を検出するための方法 - Google Patents
核酸配列変種を検出するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7111773B2 JP7111773B2 JP2020119137A JP2020119137A JP7111773B2 JP 7111773 B2 JP7111773 B2 JP 7111773B2 JP 2020119137 A JP2020119137 A JP 2020119137A JP 2020119137 A JP2020119137 A JP 2020119137A JP 7111773 B2 JP7111773 B2 JP 7111773B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- selector
- nucleic acid
- amplification
- target region
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims description 136
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 135
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 144
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 143
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 125
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 125
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 56
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 43
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 34
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims description 20
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 9
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 9
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims 2
- 102000004150 Flap endonucleases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000652 Flap endonucleases Proteins 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 102
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 85
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 62
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 44
- 102200048955 rs121434569 Human genes 0.000 description 44
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 39
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 37
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 29
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 29
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 29
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 26
- 238000001327 Förster resonance energy transfer Methods 0.000 description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 24
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 22
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 18
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 17
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M Alexa Fluor 546 Chemical compound [H+].[Na+].CC1CC(C)(C)NC(C(=C2OC3=C(C4=NC(C)(C)CC(C)C4=CC3=3)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=C1C=C2C=3C(C(=C(Cl)C=1Cl)C(O)=O)=C(Cl)C=1SCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZAINTDRBUHCDPZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 12
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 12
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 12
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 12
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 9
- COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 4-carboxy-3-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(C([O-])=O)=CC=C1C(O)=O COCMHKNAGZHBDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 8
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 102200006538 rs121913530 Human genes 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical group CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 5-carboxytetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C([O-])=O YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 6
- VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N bissulfosuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VYLDEYYOISNGST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- DEQPBRIACBATHE-FXQIFTODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-2-iminopentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCC(=N)C(=O)O)SC[C@@H]21 DEQPBRIACBATHE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- -1 spacer phosphoramidites Chemical class 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- FXYPGCIGRDZWNR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[[3-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-3-oxopropyl]disulfanyl]propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FXYPGCIGRDZWNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OWSWOWLMQKUWTE-UHFFFAOYSA-N 1-[5-(2,5-dioxo-3-sulfopyrrolidin-1-yl)oxy-5-oxopentanoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O OWSWOWLMQKUWTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONTCUDVUGYVDSS-UHFFFAOYSA-N 4-(3-amino-6-iminoxanthen-9-yl)benzene-1,3-dicarboxylic acid Chemical compound C=12C=CC(=N)C=C2OC2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O ONTCUDVUGYVDSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPVHBBXCESDRKW-UHFFFAOYSA-N 5(6)-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21.C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BPVHBBXCESDRKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZEKAXIFHLIITGV-UHFFFAOYSA-N 7-methoxycoumarin-4-acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 ZEKAXIFHLIITGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 4
- ZYUWUKIAUDIXCQ-UHFFFAOYSA-N N-(2,4-dinitrophenyl)aminohexanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O ZYUWUKIAUDIXCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) pentanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 4
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 3
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical group NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- AYDAHOIUHVUJHQ-UHFFFAOYSA-N 1-(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=CC=2)OC(=O)C1=CC=2N1C(=O)C=CC1=O AYDAHOIUHVUJHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOTJUWBJENROFB-UHFFFAOYSA-N 1-[3-[[3-(2,5-dioxo-3-sulfopyrrolidin-1-yl)oxy-3-oxopropyl]disulfanyl]propanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCSSCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VOTJUWBJENROFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SYEKJCKNTHYWOJ-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2-sulfobutanedioic acid;ethane-1,2-diol Chemical compound OCCO.OC(=O)CC(S(O)(=O)=O)(C(O)=O)N1C(=O)CCC1=O.OC(=O)CC(S(O)(=O)=O)(C(O)=O)N1C(=O)CCC1=O SYEKJCKNTHYWOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJSMFQNTEUNRPY-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-5-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(N=C=S)C=C1C([O-])=O IJSMFQNTEUNRPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QQHITEBEBQNARV-UHFFFAOYSA-N 3-[[2-carboxy-2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2-sulfoethyl]disulfanyl]-2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2-sulfopropanoic acid Chemical compound O=C1CCC(=O)N1C(S(O)(=O)=O)(C(=O)O)CSSCC(S(O)(=O)=O)(C(O)=O)N1C(=O)CCC1=O QQHITEBEBQNARV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTVWTPGLLAELLI-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzenesulfonyl chloride Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 VTVWTPGLLAELLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QLHLYJHNOCILIT-UHFFFAOYSA-N 4-o-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 1-o-[2-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoyl]oxyethyl] butanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCC(=O)OCCOC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QLHLYJHNOCILIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethylamino)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GGMFTOCYWNYUSU-UHFFFAOYSA-N 5-(5-aminopentylcarbamoyl)-2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(=O)NCCCCCN)C=C1C([O-])=O GGMFTOCYWNYUSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMERMCRYYFRELX-UHFFFAOYSA-N 5-{[2-(iodoacetamido)ethyl]amino}naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1NCCNC(=O)CI ZMERMCRYYFRELX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HWQQCFPHXPNXHC-UHFFFAOYSA-N 6-[(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=CC=2)OC(=O)C1=CC=2NC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 HWQQCFPHXPNXHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyrhodamine 6G Chemical compound [Cl-].C=12C=C(C)C(NCC)=CC2=[O+]C=2C=C(NCC)C(C)=CC=2C=1C1=CC(C(O)=O)=CC=C1C(=O)OCC VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHCPTFFIERCDSB-UHFFFAOYSA-N 7-(diethylamino)-2-oxochromene-3-carboxylic acid Chemical compound C1=C(C(O)=O)C(=O)OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C21 WHCPTFFIERCDSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical compound NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- BDJDTKYGKHEMFF-UHFFFAOYSA-M QSY7 succinimidyl ester Chemical compound [Cl-].C=1C=C2C(C=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)N3CCC(CC3)C(=O)ON3C(CCC3=O)=O)=C3C=C\C(=[N+](\C)C=4C=CC=CC=4)C=C3OC2=CC=1N(C)C1=CC=CC=C1 BDJDTKYGKHEMFF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PAOKYIAFAJVBKU-UHFFFAOYSA-N QSY9 succinimidyl ester Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].C=1C=C2C(C=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)N3CCC(CC3)C(=O)ON3C(CCC3=O)=O)=C3C=C\C(=[N+](\C)C=4C=CC(=CC=4)S([O-])(=O)=O)C=C3OC2=CC=1N(C)C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 PAOKYIAFAJVBKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N Tranexamic acid Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZZAGLMPBQOKGGT-UHFFFAOYSA-N [4-[4-(4-prop-2-enoyloxybutoxy)benzoyl]oxyphenyl] 4-(4-prop-2-enoyloxybutoxy)benzoate Chemical compound C1=CC(OCCCCOC(=O)C=C)=CC=C1C(=O)OC(C=C1)=CC=C1OC(=O)C1=CC=C(OCCCCOC(=O)C=C)C=C1 ZZAGLMPBQOKGGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 150000008366 benzophenones Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2,3-dihydroxybutanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)C(O)C(O)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- MLEBFEHOJICQQS-UHFFFAOYSA-N monodansylcadaverine Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)NCCCCCN MLEBFEHOJICQQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- DAKRRPZULHQSKP-UHFFFAOYSA-N 1-oxospiro[2-benzofuran-3,16'-3-oxa-9,23-diazaheptacyclo[17.7.1.15,9.02,17.04,15.023,27.013,28]octacosa-1(27),2(17),4(15),5(28),13,18-hexaene]-5-carboxylic acid Chemical compound C1CCN2CCCC(C=C3C4(OC(=O)C5=CC=C(C=C54)C(=O)O)C4=C5)=C2C1=C3OC4=C1CCCN2CCCC5=C12 DAKRRPZULHQSKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 3-phenyldioxetane Chemical compound C1OOC1C1=CC=CC=C1 UMTZYGZMIJRCFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDGNQWAJTIGWLE-UHFFFAOYSA-N 5-[(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2NC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MDGNQWAJTIGWLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N Dioxetane Chemical class C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000772173 Homo sapiens Tubby-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101000677914 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 40S ribosomal protein S5 Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100029293 Tubby-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N [3-(3'-methoxyspiro[adamantane-2,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC(C3)CC2C4)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- IBOVDNBDQHYNJI-UHFFFAOYSA-N dabcyl SE dye Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=C1 IBOVDNBDQHYNJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007848 endpoint PCR Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- UATCLPJEZJKNHE-UHFFFAOYSA-N n-(3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)-2-iodoacetamide Chemical compound O1C(=O)C2=CC(NC(=O)CI)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 UATCLPJEZJKNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- OVTCUIZCVUGJHS-VQHVLOKHSA-N trans-dipyrrin Chemical compound C=1C=CNC=1/C=C1\C=CC=N1 OVTCUIZCVUGJHS-VQHVLOKHSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/185—Modifications characterised by incorporating bases where the precise position of the bases in the nucleic acid string is important
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/186—Modifications characterised by incorporating a non-extendable or blocking moiety
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/197—Modifications characterised by incorporating a spacer/coupling moiety
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/102—Multiple non-interacting labels
- C12Q2565/1025—Multiple non-interacting labels labels being on the same oligonucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
発明の分野
本発明は、標的核酸配列における核酸変種を検出するための方法、および高忠実度配列増幅のための方法に関する。
本発明は、標的核酸配列における核酸変種を検出するための方法、および高忠実度配列増幅のための方法に関する。
背景
核酸変種の検出は種々の状況に関して重要であり、疾患の検出および予後診断に関して極めて重要である。現在、核酸変種を検出するための広範囲にわたるアッセイ形式が存在する。このようなアッセイ法には、加ピロリン酸分解活性化重合(PAP)、LNAブロッカーを用いるアッセイ法、およびcast-PCRアッセイ法が含まれる。
核酸変種の検出は種々の状況に関して重要であり、疾患の検出および予後診断に関して極めて重要である。現在、核酸変種を検出するための広範囲にわたるアッセイ形式が存在する。このようなアッセイ法には、加ピロリン酸分解活性化重合(PAP)、LNAブロッカーを用いるアッセイ法、およびcast-PCRアッセイ法が含まれる。
加ピロリン酸分解活性化重合(PAP)を用いて、変異荷重を測定すること、または微小残存病変を検出することができる。PAPでは、加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオチド(P*)を利用することによって、加ピロリン酸分解とDNAポリメラーゼによる重合を連続して結合する。活性化されたP*は、DNA重合によって伸長され得る。有意な非特異的増幅は、極めて稀な事象である、ミスマッチ加ピロリン酸分解とDNAポリメラーゼによる誤取り込みの組み合わせを必要とするため、このアッセイ法の特異性は、加ピロリン酸分解および重合の両方によって生じる。(例えば以下を参照されたい：Liu and Sommer, 「Pyrophosphorolysis-activated polymerization (PAP): application to allele-specific amplification,」 Biotechniques, 29(5):1072-6, 1078, 1080 (2000)(非特許文献1)；全体として参照により本明細書に組み入れられる。)
野生型核酸がより多量に存在する核酸の集団において核酸変種を検出および/または定量する方法と共に、LNAブロッカーを使用することもできる。このような方法は、少数または変異体の配列ではなく野生型に標的化され、野生型DNAの検出を阻止するように機能する短い高親和性オリゴヌクレオチドを利用する。LNAブロッカープローブをより長い検出プローブまたはPCRプライマーと併用して、少数または変異体の配列を増幅および/または同定することができる。(例えば以下を参照されたい：米国特許出願第20100009355号(特許文献1)；全体として参照により本明細書に組み入れられる。)
cast-PCRもまた、異なる対立遺伝子間の配列変化を解析するためのアッセイ法として用いることができる。この方法は、核酸変種を区別するために競合的対立遺伝子特異的TaqMan PCR(「cast-PCR」)を用いる。cast-PCRは、標的核酸配列に対する2つの増幅反応の実施を採用する。第1反応は、第1対立遺伝子特異的プライマー、および第1対立遺伝子変種と相補的な第1対立遺伝子特異的ブロッカーの存在下での増幅、ならびにその後の増幅産物の検出を含む。第2反応は、第2対立遺伝子特異的プライマー、および第2対立遺伝子変種と相補的な第2対立遺伝子特異的ブロッカーの存在下での増幅、ならびにその後の増幅産物の検出を含む。(例えば以下を参照されたい：米国特許出願第20100221717号(特許文献2)；全体として参照により本明細書に組み入れられる。)
上記の方法はいずれも、様々な課題および限界を有する。稀な変種を検出するためのこれらのアプローチの背後にある一般的な問題は、酵素忠実度不良である。複製および関連する増幅中に導入されたエラーは、真の稀な変種および変異から容易に識別することができず、したがってこれらのアプローチの性能を損なう。加えて、増幅不応性変異系(ARMS、Nucleic Acids Res. 17:2503-16 (1989)(非特許文献2))などの対立遺伝子特異的プライミングの場合、増幅中の誤プライミングが変種部位を「上書き」し、不良な結果をもたらし得る。ほとんどの場合、上記方法の特異性は0.1～5％の対立遺伝子蔓延度に限定される。使用されるポリメラーゼが、稀な対立遺伝子の検出感度を約3～5％に限定するのに十分なエラーを導入するため、このことは次世代配列決定アプローチの場合でさえ当てはまる。これらのアッセイ法のすべてに関する重要な難しさは、それらの根本がDNAポリメラーゼを用いる増幅法であり、ポリメラーゼが非忠実のせいでエラーを導入し、これがポリメラーゼに応じて1～3％の範囲またはそれ以上の固有のバックグラウンドを生じることである。デジタルPCRのような、いくつかの方法ははるかにより高レベルの特異性をもたらし得るが、これらの方法は複雑で高価であり、確証的または診断的なアッセイ法と容易に調和しない。加えて、デジタルPCRはまた、高レベルの多重化に役立たない。
当技術分野において、稀な核酸配列変種をより効率的に検出し得るさらなるアッセイ方法の必要性が存在する。さらに、ポリメラーゼ関連増幅系に付随する取り込みエラーを減少させる方法が必要とされる。さらなるアッセイ法を開発する必要があり、本発明の方法はそのようなさらなるアッセイ方法を提供する。
Biotechniques, 29(5):1072-6, 1078, 1080 (2000)
Nucleic Acids Res. 17:2503-16 (1989)
本発明は、標的領域における核酸変種の有無を検出するための方法を提供する。これらの方法は、セレクターブロッカーの存在下でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて標的領域を増幅する段階を含む。セレクターブロッカーは、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含む。本方法は、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含み、この場合、標的領域の増幅によって標的領域における核酸変種の存在が示される。核酸変種は、欠失、変異、または挿入を含み得る。
本発明の方法はまた、＞1:1000の感度を提供し得る(すなわち、1000コピーの野生型標的領域の存在下において、標的領域における1コピーの核酸変種が検出され得る)。いくつかの態様において、感度は、＞1:1500、＞1:2000、＞1:2500、＞1:3000、＞1:3500もしくは＞1:4000、＞1:5000、＞1:10,000、＞1:20:000、＞1:50:000、＞1:100,000、＞1:120,000、＞1:150,000、＞1:200,000、＞1:250,000、＞1:500,000、＞1:750,000、＞1:1,000,000、またはそれ以上の感度である。
本方法はまた、セレクターブロッカーと共にレポータープローブを用いる段階をさらに含み得る。レポータープローブは、増幅が存在する場合に第1シグナルを提供し、増幅が存在しない場合に第2シグナルを提供する。
本方法はまた、フォワードプライマーと、リバースプライマーと、セレクターブロッカーと、核酸変種を受けやすい標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドとを含む反応混合物を提供する。セレクターブロッカーは、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含む。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドの領域を増幅するのに有用である。反応混合物はレポータープローブをさらに含んでよく、レポーターは、増幅が存在する場合に第1シグナルを提供し、増幅が存在しない場合に第2シグナルを提供する。
本発明はまた高忠実度増幅を行うための方法を提供し、このような方法は、いくつかの態様において、核酸標的領域の増幅におけるヌクレアーゼ耐性プライマーと高忠実度ポリメラーゼの併用を含む。
本発明はまたキットを提供する。本発明によって企図されるキットは、フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーを含み得る。セレクターブロッカーは、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含む。フォワードプライマーは、標的領域の上流の領域と相補的な配列を含む。キットは、リバースプライマーおよびレポータープローブをさらに含み得る。ヌクレアーゼ耐性プライマー、ならびに3'エキソヌクレアーゼ活性を含む高忠実度ポリメラーゼおよび修復酵素を含むキットもまた企図される。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
以下の段階を含む、標的領域における核酸変種の有無を検出するための方法：
セレクターブロッカーの存在下でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて標的領域を増幅する段階であって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が生じる位置を除いて標的領域と相補的な配列を含む、段階、
標的領域の増幅を検出する段階であって、標的領域の増幅が標的領域における核酸変種の存在を示す、段階。
［２］
核酸変種が欠失、変異、または挿入を含む、［1］記載の方法。
［３］
セレクターブロッカーが伸長可能でない、［1］記載の方法。
［４］
セレクターブロッカーがスイッチ-ブロッカーとして設定される、［1］記載の方法。
［５］
セレクターブロッカーとフォワードプライマーがプライマー-スイッチとして相互に連結または結合される、［1］記載の方法。
［６］
セレクターブロッカーが3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護される、［1］記載の方法。
［７］
標的配列に対するセレクターブロッカーの親和性が増加した、［1］記載の方法。
［８］
セレクターブロッカーがPNAもLNAも含まない、［1］記載の方法。
［９］
セレクターブロッカーが検出可能な実体を含む、［1］記載の方法。
［１０］
標的領域とハイブリダイズした場合のフォワードプライマーの3'末端が、標的領域において核酸変種から約30ヌクレオチド未満離れて位置する、［1］記載の方法。
［１１］
標的領域とハイブリダイズするフォワードプライマーの3'末端が、標的領域とハイブリダイズするセレクターブロッカーの5'末端と重複する、［1］記載の方法。
［１２］
セレクターブロッカーの5'末端が前記核酸変種を含まない、［11］記載の方法。
［１３］
セレクターブロッカーと共にレポータープローブをさらに含む方法であって、該レポーターが、増幅が存在する場合に第1シグナルを提供し、増幅が存在しない場合に第2シグナルを提供する、［1］記載の方法。
［１４］
セレクターブロッカーと共にレポータープローブをさらに含む方法であって、該レポータープローブが蛍光標識およびクエンチャーを含む、［1］記載の方法。
［１５］
セレクターブロッカーと共にレポータープローブをさらに含む方法であって、該レポータープローブがその5'末端に、またはその5'末端から7ヌクレオチドまでに第1実体を含み、該セレクターブロッカーがその3'末端に第2実体を含み、かつ該セレクターブロッカーおよび該レポータープローブが標的領域とハイブリダイズした場合に、該第1実体と該第2実体との間でエネルギー移動が起こる、［1］記載の方法。
［１６］
増幅産物の融解曲線を得ることまたは増幅産物の配列決定により、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含む、［1］記載の方法。
［１７］
増幅産物の量を、標的領域における核酸変種の有無と関連した所定のレベルと比較することにより、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含む、［1］記載の方法。
［１８］
フォワードプライマーと、リバースプライマーと、セレクターブロッカーと、核酸変種を受けやすい標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドとを含む反応混合物であって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ該フォワードプライマーおよび該リバースプライマーが、標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドの領域を増幅するのに有用である、反応混合物。
［１９］
レポータープローブをさらに含む反応混合物であって、該レポーターが、増幅が存在する場合に第1シグナルを提供し、増幅が存在しない場合に第2シグナルを提供する、［18］記載の反応混合物。
［２０］
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いた鋳型ヌクレオチドの増幅によって生成される単位複製配列をさらに含む、［18］記載の反応混合物。
［２１］
フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーを含むキットであって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ該フォワードプライマーが標的領域の上流の領域と相補的な配列を含む、キット。
［２２］
リバースプライマーおよびレポータープローブをさらに含む、［21］記載のキット。
［２３］
セレクターブロッカーがスイッチ-ブロッカーである、［21］記載のキット。
［２４］
フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーがプライマー-スイッチとして含まれる、［21］記載のキット。
［２５］
増幅がデジタルPCRによる、［1］記載の方法。
［２６］
以下の段階を含む、標的領域における核酸変種の有無を検出するための方法：
セレクターブロッカーの存在下でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて標的領域を増幅する段階であって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在する状態の標的領域と相補的な配列を含む、段階、
標的領域の増幅を検出する段階であって、標的領域の増幅が標的領域における核酸変種の非存在を示す、段階。
［２７］
フォワードプライマーと、リバースプライマーと、セレクターブロッカーと、核酸変種を受けやすい標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドとを含む反応混合物であって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在する状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ該フォワードプライマーおよび該リバースプライマーが、標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドの領域を増幅するのに有用である、反応混合物。
［２８］
フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーを含むキットであって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在する状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ該フォワードプライマーが標的領域の上流の領域と相補的な配列を含む、キット。
［２９］
ヌクレアーゼ耐性プライマー、高忠実度酵素、ブロッカー、FRETプローブ、およびFlipプローブより選択される1つまたは複数の試薬の、増幅反応中の使用を含む、核酸の標的領域の高忠実度増幅のための方法。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
以下の段階を含む、標的領域における核酸変種の有無を検出するための方法：
セレクターブロッカーの存在下でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて標的領域を増幅する段階であって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が生じる位置を除いて標的領域と相補的な配列を含む、段階、
標的領域の増幅を検出する段階であって、標的領域の増幅が標的領域における核酸変種の存在を示す、段階。
［２］
核酸変種が欠失、変異、または挿入を含む、［1］記載の方法。
［３］
セレクターブロッカーが伸長可能でない、［1］記載の方法。
［４］
セレクターブロッカーがスイッチ-ブロッカーとして設定される、［1］記載の方法。
［５］
セレクターブロッカーとフォワードプライマーがプライマー-スイッチとして相互に連結または結合される、［1］記載の方法。
［６］
セレクターブロッカーが3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護される、［1］記載の方法。
［７］
標的配列に対するセレクターブロッカーの親和性が増加した、［1］記載の方法。
［８］
セレクターブロッカーがPNAもLNAも含まない、［1］記載の方法。
［９］
セレクターブロッカーが検出可能な実体を含む、［1］記載の方法。
［１０］
標的領域とハイブリダイズした場合のフォワードプライマーの3'末端が、標的領域において核酸変種から約30ヌクレオチド未満離れて位置する、［1］記載の方法。
［１１］
標的領域とハイブリダイズするフォワードプライマーの3'末端が、標的領域とハイブリダイズするセレクターブロッカーの5'末端と重複する、［1］記載の方法。
［１２］
セレクターブロッカーの5'末端が前記核酸変種を含まない、［11］記載の方法。
［１３］
セレクターブロッカーと共にレポータープローブをさらに含む方法であって、該レポーターが、増幅が存在する場合に第1シグナルを提供し、増幅が存在しない場合に第2シグナルを提供する、［1］記載の方法。
［１４］
セレクターブロッカーと共にレポータープローブをさらに含む方法であって、該レポータープローブが蛍光標識およびクエンチャーを含む、［1］記載の方法。
［１５］
セレクターブロッカーと共にレポータープローブをさらに含む方法であって、該レポータープローブがその5'末端に、またはその5'末端から7ヌクレオチドまでに第1実体を含み、該セレクターブロッカーがその3'末端に第2実体を含み、かつ該セレクターブロッカーおよび該レポータープローブが標的領域とハイブリダイズした場合に、該第1実体と該第2実体との間でエネルギー移動が起こる、［1］記載の方法。
［１６］
増幅産物の融解曲線を得ることまたは増幅産物の配列決定により、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含む、［1］記載の方法。
［１７］
増幅産物の量を、標的領域における核酸変種の有無と関連した所定のレベルと比較することにより、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含む、［1］記載の方法。
［１８］
フォワードプライマーと、リバースプライマーと、セレクターブロッカーと、核酸変種を受けやすい標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドとを含む反応混合物であって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ該フォワードプライマーおよび該リバースプライマーが、標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドの領域を増幅するのに有用である、反応混合物。
［１９］
レポータープローブをさらに含む反応混合物であって、該レポーターが、増幅が存在する場合に第1シグナルを提供し、増幅が存在しない場合に第2シグナルを提供する、［18］記載の反応混合物。
［２０］
フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いた鋳型ヌクレオチドの増幅によって生成される単位複製配列をさらに含む、［18］記載の反応混合物。
［２１］
フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーを含むキットであって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ該フォワードプライマーが標的領域の上流の領域と相補的な配列を含む、キット。
［２２］
リバースプライマーおよびレポータープローブをさらに含む、［21］記載のキット。
［２３］
セレクターブロッカーがスイッチ-ブロッカーである、［21］記載のキット。
［２４］
フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーがプライマー-スイッチとして含まれる、［21］記載のキット。
［２５］
増幅がデジタルPCRによる、［1］記載の方法。
［２６］
以下の段階を含む、標的領域における核酸変種の有無を検出するための方法：
セレクターブロッカーの存在下でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて標的領域を増幅する段階であって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在する状態の標的領域と相補的な配列を含む、段階、
標的領域の増幅を検出する段階であって、標的領域の増幅が標的領域における核酸変種の非存在を示す、段階。
［２７］
フォワードプライマーと、リバースプライマーと、セレクターブロッカーと、核酸変種を受けやすい標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドとを含む反応混合物であって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在する状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ該フォワードプライマーおよび該リバースプライマーが、標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドの領域を増幅するのに有用である、反応混合物。
［２８］
フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーを含むキットであって、該セレクターブロッカーが、核酸変種が存在する状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ該フォワードプライマーが標的領域の上流の領域と相補的な配列を含む、キット。
［２９］
ヌクレアーゼ耐性プライマー、高忠実度酵素、ブロッカー、FRETプローブ、およびFlipプローブより選択される1つまたは複数の試薬の、増幅反応中の使用を含む、核酸の標的領域の高忠実度増幅のための方法。
発明の詳細な説明
本発明の方法は、ブロッカープローブを用いて、非常に高い感度で、場合によっては＞1:1000の感度で、核酸変種を検出することができるという発見に一部基づいている。場合によっては、感度は＞1:2000である。したがって、本発明は、標的領域における核酸変種の有無を検出するための方法を提供する。本方法は、セレクターブロッカーの存在下でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて標的領域を増幅する段階を含む。いくつかの態様において、セレクターブロッカーは、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含む。本方法は、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含み、この場合、標的領域の増幅によって標的領域における核酸変種の存在が示される。
本発明の方法は、ブロッカープローブを用いて、非常に高い感度で、場合によっては＞1:1000の感度で、核酸変種を検出することができるという発見に一部基づいている。場合によっては、感度は＞1:2000である。したがって、本発明は、標的領域における核酸変種の有無を検出するための方法を提供する。本方法は、セレクターブロッカーの存在下でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて標的領域を増幅する段階を含む。いくつかの態様において、セレクターブロッカーは、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含む。本方法は、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含み、この場合、標的領域の増幅によって標的領域における核酸変種の存在が示される。
いくつかの態様において、本発明の方法の感度は＞1:1000である(すなわち、1000コピーの標的領域の中から1コピーの標的が検出され得る)。いくつかの態様において、感度は、＞1:1500、＞1:2000、＞1:2500、＞1:3000、＞1:3500もしくは＞1:4000、＞1:5000、＞1:10,000、＞1:20:000、＞1:50:000、＞1:100,000、＞1:120,000、＞1:150,000、＞1:200,000、＞1:250,000、＞1:500,000、＞1:750,000、＞1:1,000,000、またはそれ以上の感度である。いくつかの態様では、少なくとも約1000、約1500、約2000、約2500、約3000、約3500、約4000、約5,000、約10,000、約20:000、約50:000、約100,000、約120,000、約150,000、約200,000、約250,000、約500,000、約750,000、約1,000,000コピー、またはそれ以上の野生型核酸の存在下において、1コピーの標的核酸、例えば核酸変種などが検出され得る。
本発明の方法によると、「増幅の存在」ならびに同様の用語および語句は、増幅、およびより多くの、増強された、または増加した増幅を含み得る。本発明の方法によると、「増幅の非存在」ならびに同様の用語および語句は、増幅なし、およびより少ない、低下した、または減少した増幅を含み得る。
いくつかの態様において、本方法は、セレクターブロッカーの存在下でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて標的領域を増幅する段階を含む。これらの態様において、セレクターブロッカーは、核酸変種が存在する状態の標的領域と相補的な配列を含む。本方法は、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含み、この場合、標的領域の増幅によって、標的領域における核酸変種の非存在が示される。さらなる他の態様では、ヌクレアーゼ耐性プライマーが、3'エキソヌクレアーゼ修復活性を有する高忠実度ポリメラーゼおよび修復酵素と併用される。
核酸配列を増幅するための一般的方法は、当技術分野において十分に記載されており、周知である。任意のそのような方法を、本発明の方法と共に使用することができる。いくつかの態様において、増幅は、例えばVogelstein and Kinzler(「Digital PCR,」 PNAS, 96:9236-9241 (1999)；全体として参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているようなデジタルPCR法を用いる。このような方法は、標的領域を増幅する前に、標的領域を含む試料を希釈する段階を含む。希釈は、従来のプレート、マルチウェルプレート、ナノウェル中への希釈、およびマイクロパッドまたは微小滴上への希釈を含み得る。(例えば、Beer NR, et al., 「On-chip, real-time, single-copy polymerase chain reaction in picoliter droplets,」 Anal. Chem. 79(22):8471-8475 (2007)；Vogelstein and Kinzler, 「Digital PCR,」 PNAS, 96:9236-9241 (1999)；およびPohl and Shih, 「Principle and applications of digital PCR,」 Expert Review of Molecular Diagnostics, 4(1):41-47 (2004)を参照されたい；これらはすべて、全体として参照により本明細書に組み入れられる。) いくつかの態様において、増幅はデジタルPCRによる。
場合によっては、標的領域を増幅するために本発明の方法と共に使用される酵素には、高忠実度DNAポリメラーゼ、例えば3'-5'エキソヌクレアーゼプルーフリーディング能を有するDNAポリメラーゼが含まれるが、これに限定されない。本方法と共に用いられ得る酵素の例には、AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent、およびKapa HiFi DNAポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の方法によって検出され得る核酸変種は、標的領域における欠失、標的領域における変異、および/または標的領域における挿入を含む。欠失は、標的領域からのヌクレオチド塩基の除去を含む。検出され得る欠失には、標的領域からの1、2、3、4、または5ヌクレオチド塩基の欠失が含まれる。変異には、置換(トランスバージョンおよびトランジションなど)、脱塩基部位、架橋部位、および化学的に変化したまたは修飾された塩基が含まれ得るが、これらに限定されない。検出され得る変異には、標的領域内の1、2、3、4、5個、またはそれ以上のヌクレオチド塩基の変異が含まれる。挿入は、標的領域中へのヌクレオチドの付加を含む。検出され得る挿入には、標的領域中への1、2、3、4、または5ヌクレオチド塩基の挿入が含まれ得る。いくつかの態様では、本発明の方法によって、欠失、変異、および/または挿入が検出される。
本発明の方法はまた、セレクターブロッカーの使用を含み得る。一般的に、セレクターブロッカーは、核酸変種を受けやすい標的領域と相補的な配列を含む。本発明によると、セレクターブロッカー内の相補的配列は、任意の核酸変種が存在しない状態の標的領域と完全に相補的であってよく、または核酸変種を有する場所を除いて標的領域と相補的(すなわち、部分的に相補的)であってよい。いくつかの態様において、セレクターブロッカーは、標的領域と相補的であるが、標的領域における少なくとも1つの核酸変種と相補的でない配列を含む。いくつかの他の態様において、セレクターブロッカーは、標的領域と相補的であるが、標的領域における少なくとも2つまたはそれ以上の核酸変種と相補的でない配列を含む。さらなる他の態様において、セレクターブロッカーは、標的領域と相補的であるが、標的領域における核酸変種の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または98％と相補的でない配列を含む。さらなる他の態様において、セレクターブロッカーは、標的領域と相補的であるが、ある種の核酸変種と、そのようなミスマッチが、少なくとも1つまたは複数の核酸変種の存在と非存在との間の増幅の検出可能な違いを提供するのに十分な程度まで相補的でない配列を含む。
本方法はまた、セレクター-ブロッカーが、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相互作用する場合と、核酸変種が存在する状態の標的領域と相互作用する場合とのTmの違いを決定することを提供する。いくつかの態様において、セレクター-ブロッカーが、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相互作用する場合と、核酸変種が存在する状態の標的領域と相互作用する場合とのTmの違いは、最大化される。いくつかの態様において、Tmの違いは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20セ氏温度、またはそれ以上である。いくつかの態様において、Tmの違いは、10～15セ氏温度、11～14セ氏温度、または12～13セ氏温度である。いくつかの態様において、Tmの違いは2～3セ氏温度であってよい。いくつかの態様では、核酸変種が存在しない状態の標的領域と、核酸変種が存在する状態の標的領域とのTmの識別が高いほど、該核酸の存在しない状態の標的領域と該核酸の存在する状態の標的領域との増幅の違いがより有意である。
相補性を融解温度(Tm)と関連して説明することもでき、この場合、相補性とは、例えば他の配列に対してより相補的であるが、完全に相補的でない配列(すなわち、完全におよび部分的に相補的な配列)を含め、相補性のより高い配列とより低い配列の勾配を指す。相補性がより高い配列は一般的に、相補性がより低い配列よりも高いTmを示す(すなわち、98％の相補性を示す配列は、40％の相補性を示す配列よりも高いTmを有する)。本発明の方法においては一般的に、より高い配列相補性を示す配列は、標的領域と相互作用した場合により高いTmを示す。
配列が特にG/CリッチまたはA/Tリッチである場合などのいくつかの態様では、Tmと相補性が逆になる場合があり、例えば、より高い相補性を有するがA/Tリッチである配列は、より低い相補性を有するがG/Cリッチである配列よりも低いTmを有し得る。Tmと配列の相互作用に関するそのような情報は当技術分野で周知であり、当業者は本発明の方法を適切に容易に適応させることができるため、本発明の方法はなお適用可能である。
本発明によると、セレクターブロッカーはまた、「スイッチ配列」と称される核酸配列を含むように設定することもできる。本発明の方法に記載されるようなスイッチ配列を含むセレクターブロッカーは、「スイッチ-ブロッカー」とも称される。
スイッチ-ブロッカーのスイッチ配列は、スイッチ-ブロッカーの5'領域に位置し、5個またはそれ以上のヌクレオチド、例えば5、6、7、8、9、10、15、20、もしくは25個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む短い核酸配列である。スイッチ配列は、標的領域に高親和性で結合する。いくつかの態様において、スイッチ配列は、1つまたは複数の核酸変種を含む標的領域の部分に結合する。いくつかの態様において、スイッチ配列と標的配列との間の1、2、3、4、5、6、7個、またはそれ以上の核酸変化(例えば、ミスマッチ、欠失、挿入、または変異を含む)は、少なくとも1つまたは複数の核酸変種の存在と非存在との間の増幅の検出可能な違いを引き起こすのに十分である。いくつかの態様において、スイッチ配列と標的配列との配列の違いは、スイッチ配列が標的配列に結合するのを妨害するかまたは防ぐのに十分である。いくつかの態様において、スイッチ配列は、核酸変種が生じる1つまたは複数の位置を含む標的領域と(完全にまたは部分的に)相補的である。いくつかの他の態様において、スイッチ配列は、核酸変種が生じる少なくとも1つの位置を除いて標的領域と(完全にまたは部分的に)相補的である。
いくつかの態様において、スイッチ-ブロッカーは、「長いハイブリダイズ領域」と称される、標的領域と相補的なより長い核酸配列に連結されたスイッチ配列を含む。長いハイブリダイズ領域は、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ヌクレオチド長、またはそれ以上であってよい。いくつかの態様において、長いハイブリダイズ領域は、標的領域と隣接しているかまたはその近傍の相補的領域に結合することによって、核酸配列の標的領域にスイッチ-ブロッカーを標的化する。スイッチ配列は、本明細書に記載される連結もしくは結合方法を用いて、架橋ヌクレオチド配列を介して、または当技術分野で公知の任意の他の連結もしくは結合方法によって、長いハイブリダイズ領域に連結するまたは結合させることができる。
例えばスイッチ配列と長いハイブリダイズ領域などの核酸は、種々の方法によって共に連結するかまたは結合させることができる。核酸配列の連結または結合は、様々な連結部分および結合方法によって達成することができ、種々のそのようなものが当技術分野で周知であり、そのうちのいずれかを本発明の方法と共に用いることができる。連結または結合は、個々の核酸エレメントを合成し、従来の結合方法(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2001-2011；およびBioconjugate Techniques, 2nd Ed., Hermanson G., T., Academic Press, Inc., 2008.)を用いてそれらを結合させることによって達成することができる。このような方法には、ゼロ長架橋剤、ホモ二官能性架橋剤、ヘテロ二官能性架橋剤(例えばNHS/マレイミドヘテロ二官能性リンカーなど)、三官能性架橋剤、および光反応性架橋剤が含まれ得る。ホモ二官能性架橋剤には、例えば、アミン-アミン架橋剤、スルフヒドリル-スルフヒドリル架橋剤、およびチオール-チオール架橋剤が含まれ得る。ヘテロ二官能性架橋剤には、例えば、アミン-スルフヒドリル架橋剤、カルボキシル-アミン架橋剤、スルフヒドリル-炭水化物架橋剤、スルフヒドリル-ヒドロキシル架橋剤、アミン-チオール架橋剤、およびアミン-カルボン酸架橋剤が含まれ得る。いくつかの態様において、フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーは、それらが望ましい架橋試薬と共に用いるのに適した基を含むように合成される。いくつかの態様において、フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーは、3'ホスホラミダイト、5'ホスホラミダイト、ならびにスペーサーホスホラミダイト12および18(Glen Research)を含むがこれらに限定されないホスホラミダイトリンカーの組み合わせを用いて合成される。
リンカーおよび架橋剤の例には、C18二酸に基づく架橋剤(ジアクリル酸およびジメタクリル酸架橋剤など)；Zエレメント；スベリン酸ビス[スルホスクシンイミジル](BSSSまたはBS3)；スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)；グルタル酸ビス[スルホスクシンイミジル](BS2G)；ジチオビス[プロピオン酸スクシンイミジル](DTSPまたはDSP)；(3,3'-ジチオビス[プロピオン酸スルホスクシンイミジル])(DTSSP)；グルタル酸ジスクシンイミジル(DSG)；エチレングリコールビス(コハク酸スルホスクシンイミジル)；エチレングリコールビス(コハク酸スクシンイミジル)；酒石酸ジスクシンイミジル；ならびにNHS/マレイミドヘテロ二官能性リンカー、アリールアジド、ベンゾフェノン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
架橋ヌクレオチド配列は、標的核酸中の隣接ヌクレオチド配列と並ぶが、ワトソン・クリック水素結合相互作用を介して標的の相補的塩基に結合しないヌクレオチド配列を含む。このような塩基には、デオキシイノシンおよび5-ニトロインドール-2'-デオキシリボシドが含まれるが、これらに限定されない。
本発明はまた、スイッチ-ブロッカーへの検出可能な標識の導入を提供する。いくつかの態様において、スイッチ-ブロッカーはレポータープローブとして機能し得る。
本発明によると、セレクターブロッカーは伸長可能であっても、または伸長可能でなくてもよい。セレクターブロッカーは、場合により、3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護するために、当技術分野で公知の種々の方法によって修飾され得る。セレクターブロッカーはまた、3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護するために、1つまたは複数の修飾を含んでよく、このような修飾には、2'-O-メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホルアミダート骨格修飾、メチルホスホン酸骨格修飾、3'末端リン酸修飾、および3'アルキル置換が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、セレクターブロッカーは、1つまたは複数の修飾が存在するために、3'および/または5'エキソヌクレアーゼ活性に耐性である。
本発明の方法はまた、標的配列に対する親和性が増加したセレクターブロッカーを用いることを提供する。このようなセレクターブロッカーには、長さが伸長されたセレクターブロッカー、およびセレクターブロッカーに対する化学的修飾が含まれ得る。このような修飾には、2'フルオロ(2'-デオキシ-2'-フルオロ-ヌクレオシド)修飾、LNA(ロックド核酸)、PNA(ペプチド核酸)、ZNA(Zip核酸)、モルフォリノ、メチルホスホン酸、ホスホルアミダート、ポリカチオン複合物、および2'ピレン修飾が含まれ得る。いくつかの態様において、セレクターブロッカーは、2'フルオロ修飾(別称、2'-デオキシ-2'-フルオロ-ヌクレオシド)、LNA(ロックド核酸)、PNA(ペプチド核酸)、ZNA(Zip核酸)、モルフォリノ、メチルホスホン酸、ホスホルアミダート、および/またはポリカチオン複合物を含む1つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様において、セレクターブロッカーはPNAもLNAも含まない。
セレクターブロッカーはまた、検出可能な実体を含み得る。このような検出可能な実体には、例えば蛍光標識および化学発光標識が含まれ得るが、これらに限定されない。このような検出可能な実体には、FRET対のメンバーもまた含まれ得る。いくつかの態様において、セレクターブロッカーは検出可能な実体を含む。
蛍光標識には、AMCA、DEAC(7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸)；7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3；7-ヒドロキシクマリン-3；MCA(7-メトキシクマリン-4-酢酸)；7-メトキシクマリン-3；AMF(4'-(アミノメチル)フルオレセイン)；5-DTAF(5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン)；6-DTAF(6-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン)；6-FAM(6-カルボキシフルオレセイン)、5(6)-FAMカダベリン；5-FAMカダベリン；5(6)-FAMエチレンジアミン；5-FAMエチレンジアミン；5-FITC(FITC異性体I；フルオレセイン-5-イソチオシアネート)；5-FITCカダベリン；フルオレセイン-5-マレイミド；5-IAF(5-ヨードアセトアミドフルオレセイン)；6-JOE(6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン)；5-CR110(5-カルボキシローダミン110)；6-CR110(6-カルボキシローダミン110)；5-CR6G(5-カルボキシローダミン6G)；6-CR6G(6-カルボキシローダミン6G)；5(6)-カルボキシローダミン6Gカダベリン；5(6)-カルボキシローダミン6Gエチレンジアミン；5-ROX(5-カルボキシ-X-ローダミン)；6-ROX(6-カルボキシ-X-ローダミン)；5-TAMRA(5-カルボキシテトラメチルローダミン)；6-TAMRA(6-カルボキシテトラメチルローダミン)；5-TAMRAカダベリン；6-TAMRAカダベリン；5-TAMRAエチレンジアミン；6-TAMRAエチレンジアミン；5-TMR C6マレイミド；6-TMR C6マレイミド；TR C2マレイミド；TRカダベリン；5-TRITC；G異性体(テトラメチルローダミン-5-イソチオシアネート)；6-TRITC；R異性体(テトラメチルローダミン-6-イソチオシアネート)；ダンシルカダベリン(5-ジメチルアミノナフタレン-1-(N-(5-アミノペンチル))スルホンアミド)；EDANS C2マレイミド；フルオレサミン；NBD；およびピロメテン、ならびにそれらの誘導体が含まれ得るが、これらに限定されない。
化学発光標識には、サザンブロットおよびウェスタンブロットプロトコールと共に用いられる標識が含まれ得るが、これらに限定されない(例えば以下を参照されたい：Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd ed.) (2001)；全体として参照により本明細書に組み入れられる)。例には、-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3''-ホスホリルオキシ)フェニル-1,2-ジオキセタン(AMPPD)；アクリジニウムエステル、およびアダマンチル安定化1,2-ジオキセタン、ならびにそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によると、フォワードプライマーは、1つまたは複数の核酸変種に対する様々な適切な位置と(完全にまたは部分的に)相補的であるように設計することができる。いくつかの態様において、フォワードプライマーの3'領域は、1つまたは複数の核酸変種の位置に関して種々の位置で標的領域と(完全にまたは部分的に)相補的である。例えば、場合により標的領域とハイブリダイズした場合のフォワードプライマーの3'領域は、標的領域において1つまたは複数の核酸変種から0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60ヌクレオチド、またはそれ以上離れて位置し得る。いくつかの態様において、標的領域とハイブリダイズした場合のフォワードプライマーの3'領域は、標的領域において1つまたは複数の核酸変種から約30ヌクレオチド未満離れて位置する。
場合によっては、フォワードプライマーとセレクターブロッカーは、部分的または完全な標的領域とのハイブリダイゼーションについて競合することができ、これが感度の増加をもたらし得る。例えば、フォワードプライマーとセレクターブロッカーは、0、5、10、15ヌクレオチド、またはそれ以上重複し得る。いくつかの態様において、標的領域とハイブリダイズするフォワードプライマーの3'領域は、標的領域とハイブリダイズするセレクターブロッカーの5'領域と重複する。いくつかの態様において、プライマーとセレクターブロッカーがセレクターブロッカーの5'領域において重複する場合、重複領域は核酸変種を含まない。フォワードプライマーおよび/またはセレクターブロッカーは、場合により、3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護するために、当技術分野で公知の種々の方法によって修飾され得る。フォワードプライマーおよび/またはセレクターブロッカーは1つまたは複数の修飾を含んでよく、このような修飾には、2'-O-メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホルアミダート骨格修飾、メチルホスホン酸骨格修飾、3'末端リン酸修飾、および3'アルキル置換が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、フォワードプライマーおよび/またはセレクターブロッカーは、3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護される。
いくつかの態様において、セレクターブロッカーとフォワードプライマーは相互に連結または結合され、この組み合わせは「プライマー-スイッチ」とも称される。例えばフォワードプライマーとセレクターブロッカーなどの核酸は、種々の方法によって共に連結するかまたは結合させることができる。核酸配列の連結または結合は、様々な連結部分および結合方法によって達成することができ、種々のそのようなものが当技術分野で周知であり、そのうちのいずれかを本発明の方法と共に用いることができる。連結または結合は、個々の核酸エレメントを合成し、従来の結合方法(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2001-2011；およびBioconjugate Techniques, 2nd Ed., Hermanson G., T., Academic Press, Inc., 2008.)を用いてそれらを結合させることによって達成することができる。このような方法には、ゼロ長架橋剤、ホモ二官能性架橋剤、ヘテロ二官能性架橋剤(例えばNHS/マレイミドヘテロ二官能性リンカーなど)、三官能性架橋剤、および光反応性架橋剤が含まれ得る。ホモ二官能性架橋剤には、例えば、アミン-アミン架橋剤、スルフヒドリル-スルフヒドリル架橋剤、およびチオール-チオール架橋剤が含まれ得る。ヘテロ二官能性架橋剤には、例えば、アミン-スルフヒドリル架橋剤、カルボキシル-アミン架橋剤、スルフヒドリル-炭水化物架橋剤、スルフヒドリル-ヒドロキシル架橋剤、アミン-チオール架橋剤、およびアミン-カルボン酸架橋剤が含まれ得る。いくつかの態様において、フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーは、それらが望ましい架橋試薬と共に用いるのに適した基を含むように合成される。いくつかの態様において、フォワードプライマーおよびセレクターブロッカーは、3'ホスホラミダイト、5'ホスホラミダイト、ならびにスペーサーホスホラミダイト12および18(Glen Research)を含むがこれらに限定されないホスホラミダイトリンカーの組み合わせを用いて合成される。
リンカーおよび架橋剤の例には、C18二酸に基づく架橋剤(ジアクリル酸およびジメタクリル酸架橋剤など)；Zエレメント；スベリン酸ビス[スルホスクシンイミジル](BSSSまたはBS3)；スベリン酸ジスクシンイミジル(DSS)；グルタル酸ビス[スルホスクシンイミジル](BS2G)；ジチオビス[プロピオン酸スクシンイミジル](DTSPまたはDSP)；(3,3'-ジチオビス[プロピオン酸スルホスクシンイミジル])(DTSSP)；グルタル酸ジスクシンイミジル(DSG)；エチレングリコールビス(コハク酸スルホスクシンイミジル)；エチレングリコールビス(コハク酸スクシンイミジル)；酒石酸ジスクシンイミジル；ならびにNHS/マレイミドヘテロ二官能性リンカー、アリールアジド、およびベンゾフェノン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によると、例えば「プライマー-スイッチ」の状況において、フォワードプライマーとセレクターブロッカーが、公知であるか後に発見される任意の適切な手段によって連結される場合、フォワードプライマーとセレクターブロッカーはいずれも、核酸変種が生じる位置においてそれらが異なることを除いて、同じ標的領域と相補的な配列を有し得る。いくつかの態様では、プライマースイッチのフォワードプライマーは、核酸変種が生じる少なくとも1つの位置を除いて、標的領域と相補的な配列を有し、プライマースイッチのセレクターブロッカーは、核酸変種が生じる1つまたは複数の位置を含む同じ標的領域と相補的な配列を有する。いくつかの他の態様では、プライマースイッチのフォワードプライマーは、核酸変種が生じる1つまたは複数の位置を含む標的領域と相補的な配列を有し、プライマースイッチのセレクターブロッカーは、核酸変種が生じる少なくとも1つの位置を除いて、同じ標的領域と相補的な配列を有する。いくつかの態様において、セレクターブロッカーはフォワードプライマーよりも高いTmを有する。いくつかの態様において、セレクターブロッカーはフォワードプライマーよりも低いTmを有する。
本発明の方法はまた、レポータープローブと併せて、またはレポータープローブとしてのスイッチブロッカーと併せて、セレクターブロッカーを用いることを提供する。いくつかの態様において、レポータープローブはセレクターブロッカーと共に用いられる。
レポータープローブは伸長可能であっても、または非伸長可能でなくてもよい。レポータープローブは、場合により、3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護するために、当技術分野で公知の種々の方法によって修飾され得る。レポータープローブは1つまたは複数の修飾を含んでよく、このような修飾には、2'-O-メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホルアミダート骨格修飾、メチルホスホン酸骨格修飾、3'末端リン酸修飾、および3'アルキル置換が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、レポータープローブは3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護される。
レポータープローブおよびスイッチ-ブロッカーはまた、蛍光標識およびクエンチャーを含み得る。蛍光標識には、本明細書に記載されるものが含まれ得るが、これらに限定されない。クエンチャーには、DABCYL C2アミン；DABCYL C2マレイミド；DABCYL酸(4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸)；DABCYL酸(4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸)；DABCYL酸(4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸)；DABCYLスクシンイミジルエステル(4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸、スクシンイミジルエステル)；DABCYLスクシンイミジルエステル(4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸、スクシンイミジルエステル)；DABSYLクロリド(4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4-スルホニルクロリド)；DNPアミン；DNPマレイミド；DNP-X酸(6-(2,4-ジニトロフェニル)アミノヘキサン酸)；DNP-X酸、SE(6-(2,4-ジニトロフェニル)アミノヘキサン酸、スイシンイミジルエステル)；およびそれらの誘導体が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、レポータープローブがセレクターブロッカーと共に用いられる場合、レポータープローブは蛍光標識のみを含む。いくつかの態様において、レポータープローブがセレクターブロッカーと共に用いられる場合、レポータープローブは蛍光標識およびクエンチャーを含む。いくつかの態様において、レポーターは、増幅が存在する場合に第1シグナルを提供し、増幅が存在しない場合に第2シグナルを提供する。第1シグナルおよび第2シグナルは、例えば標的領域にハイブリダイズするレポータープローブおよび標的領域にハイブリダイズしないレポータープローブに起因して起こり得る。
レポータープローブの5'末端およびセレクターブロッカーの3'末端は、エネルギー移動が起こることを可能にする実体を含み得る。5'末端は、5'末端において、または5'末端から1、2、3、4、5、6、もしくは7ヌクレオチド、もしくはそれ以上離れて、エネルギー移動を可能にする実体を含み得る。いくつかの態様において、エネルギー移動を可能にする実体は、5'末端から5ヌクレオチド離れて位置する。いくつかの態様において、レポーターがセレクターブロッカーと併せて用いられる場合、レポータープローブはその5'末端において第1実体を含み、セレクターブロッカーはその3'末端において第2実体を含み、その結果、セレクターブロッカーおよびレポータープローブが標的領域とハイブリダイズした場合に、第1実体と第2実体との間でエネルギー移動が起こり得る。3'末端は、3'末端において、または3'末端から1、2、3、4、5、6、もしくは7ヌクレオチド、もしくはそれ以上離れて、エネルギー移動を可能にする実体を含み得る。
場合により、エネルギー移動を可能にする第1実体および第2実体は、FRET対の一部である。FRET(蛍光共鳴エネルギー移動またはフェルスター共鳴エネルギー移動)とは、励起状態の2つの実体間の距離依存的な相互作用であり、光子を放出することなく、励起エネルギーがドナー実体からアクセプター実体に移動する。FRET対には、6-FAM(ドナー)とLC Red 640またはAlexa Fluor 546(アクセプター)；フルオレセイン(ドナー)とテトラメチルローダミン(アクセプター)；IAEDANS(ドナー)とフルオレセイン(アクセプター)；EDANS(ドナー)とDabcyl(アクセプター)；フルオレセイン(ドナー)とフルオレセイン(アクセプター)；BODIPY FL(ドナー)とBODIPY FL(アクセプター)；ならびにフルオレセイン(ドナー)とQSY 7およびQSY 9色素(アクセプター)が含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明の方法はまた、当技術分野で周知の任意の検出方法を用いて、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含み得る。例えば、検出は、増幅産物の融解曲線を得ることによるか、質量分析によるか、または増幅産物の配列決定によるものであってよい。増幅産物は、増幅産物中の核酸変種の種類および数に応じて、異なる融解曲線を示す。融解曲線を決定するための方法は十分に記載されており、当業者に周知であり、融解曲線を決定するための任意のそのような方法を本発明の方法と共に使用することができる。質量分析を用いるための方法および核酸を配列決定するための方法もまた、すべて当技術分野で周知である。(例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd ed.) (2001)、およびPlum, Optical Methods, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2001-2011を参照されたい；これらはすべて、全体として参照により本明細書に組み入れられる)。(例えば以下を参照されたい：Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2001-2011, specifically Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of DNA Polymerase Reaction Products；全体として参照により本明細書に組み入れられる。) 核酸配列決定のための方法もまた日常的であり、当業者によって周知であり、配列決定のための任意の方法を本発明の方法と共に使用することができる。(例えば以下を参照されたい：Current Protocols in Molecular Biology, 1995-2010；全体として参照により本明細書に組み入れられる。) いくつかの態様では、融解曲線および配列決定反応を用いて核酸変種を特徴づけることができる。
本発明の方法は、増幅産物の量を、標的領域における核酸変種の有無と関連した所定のレベルと比較することにより、標的領域の増幅を検出する段階をさらに含む。増幅を検出するか、または増幅産物の量を決定するための方法は当技術分野で周知であり、任意のそのような方法を使用することができる。(例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) (2001)、およびGallagher, Current Protocols Essential Laboratory Techniques, 2008を参照されたい；これらはすべて、全体として参照により本明細書に組み入れられる。)
標的領域における核酸変種の有無と関連した所定のレベルは、十分に多数の試料において標的領域中の核酸変種と関連した基準レベルを決定し、そのレベルを所定のレベルとして用いることにより、決定することができる。さらに、基準レベル情報および基準レベルを決定するための方法は、公的に利用可能なデータベースおよび他の情報源から入手することができる。所定のレベルは、標的領域中に核酸変種を含まない核酸を増幅するための所与の試料中に存在する増幅の所定のレベルであってよい。所定のレベルはまた、標的領域中に核酸変種を含む核酸を増幅するための所与の試料中に存在する増幅の所定のレベルであってよい。(例えば以下を参照されたい：Bunk, D.M., 「Reference Materials and Reference Measurement Procedures: An Overview from a National Metrology Institute,」 Clin. Biochem. Rev., 28(4):131-137 (2007)；全体として参照により本明細書に組み入れられる)。所定のレベルとの比較は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができ、上記の所定のレベルのいずれかをそのような比較において用いることができる(例えば以下を参照されたい：Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) (2001)；全体として参照により本明細書に組み入れられる)。
増幅産物はまた、例えばアクチンまたはGAPDHなどの核酸マーカーを用いるなど、当技術分野で公知の任意の方法を用いて定量することもできる。定量はまた、増幅反応に公知の量で添加され得る標準化対照に基づいてもよい。このような方法は周知であり、記載されている。(例えば以下を参照されたい：Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) (2001)；全体として参照により本明細書に組み入れられる。)
本発明はまた反応混合物を含む。反応混合物は、少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性プライマーと、3'エキソヌクレアーゼ修復活性を有する高忠実度酵素または酵素の組み合わせとを含み得る。反応混合物はまた、フォワードプライマー、リバースプライマー、セレクターブロッカー、プライマー-スイッチ、またはスイッチ-ブロッカー、および核酸変種を受けやすい標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、反応混合物中のセレクターブロッカー、プライマー-スイッチブロッカー、またはスイッチ-ブロッカーは、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含み得る。いくつかの態様において、反応混合物中のセレクターブロッカー、プライマー-スイッチブロッカー、またはスイッチ-ブロッカーは、核酸変種が存在する状態の標的領域と相補的な配列を含み得る。反応混合物中のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、標的領域を含む鋳型ポリヌクレオチドの領域を増幅するのに有用である。いくつかの態様において、反応混合物は、増幅が存在する場合に第1シグナルを提供し、増幅が存在しない場合に第2シグナルを提供するレポータープローブまたはスイッチ-ブロッカーをさらに含む。いくつかの態様において、反応混合物は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーによる鋳型ヌクレオチドの増幅によって生成される単位複製配列を含む。
本発明はまたキットを提供する。本発明によって企図されるキットは、ヌクレアーゼ耐性プライマー、および3'エキソヌクレアーゼ修復活性を有する高忠実度酵素または酵素の組み合わせを含み得る。本発明によって企図されるキットはまた、フォワードプライマー、プライマー-スイッチ、セレクターブロッカー、またはスイッチ-ブロッカーを含み得る。いくつかの態様において、プライマー-スイッチ、セレクターブロッカー、およびスイッチ-ブロッカーは、核酸変種が存在しない状態の標的領域とより高い配列相補性を有し、フォワードプライマーは、標的領域の上流の領域と相補的な配列を含む。いくつかの態様において、プライマー-スイッチ、セレクターブロッカー、およびスイッチ-ブロッカーは、核酸変種が存在する状態の標的領域とより高い配列相補性を有し、フォワードプライマーは、標的領域の上流の領域と相補的な配列を含む。いくつかの態様において、キットはリバースプライマーおよびレポータープローブをさらに含む。
本発明はまた、核酸標的領域の高忠実度増幅のための方法を提供する。このような方法は、核酸増幅反応中の、ヌクレアーゼ耐性プライマー、高忠実度酵素、ブロッカー、FRETプローブ、およびFlipプローブを含む試薬の使用を含む。これらは単独で、または任意の組み合わせで用いることができ、当技術分野で公知の任意の核酸増幅法と共に用いることができる。本発明のこの局面は、例えばPCR、エマルジョンPCR、および次世代配列決定プラットフォームと関連した固相増幅を含むがこれらに限定されない、ポリメラーゼに基づく多くの増幅系への適用を有する。
いくつかの態様では、増幅反応において、ヌクレアーゼ耐性プライマー、高忠実度酵素、ブロッカー、FRETプローブ、およびFlipプローブが用いられる。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ耐性プライマー、高忠実度酵素、ブロッカー、およびFRETプローブが用いられる。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ耐性プライマー、高忠実度酵素、およびブロッカーが用いられる。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ耐性プライマーおよび高忠実度酵素が用いられる。いくつかの態様では、ヌクレアーゼ耐性プライマーおよびブロッカーが用いられる。
いくつかの態様では、ヌクレアーゼ耐性プライマー、高忠実度酵素、ブロッカー、およびFRETプローブのうちの1つまたは複数が、セレクターブロッカー、プライマー-スイッチ、スイッチ-ブロッカー、および/または本明細書に記載される他の方法のいずれかと共に用いられる。
ヌクレアーゼ耐性プライマーには、エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐために修飾されたプライマーが含まれる。いくつかの態様において、プライマーは、3'または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護するために修飾されており、このような修飾には、2'-O-メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホルアミダート骨格修飾、メチルホスホン酸骨格修飾、3'末端リン酸修飾、および3'アルキル置換が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、増幅反応において使用されるプライマーおよび/またはプローブは、1つまたは複数の修飾によって、3'および/または5'エキソヌクレアーゼ活性から保護される。
高忠実度酵素により、標的配列の高忠実度(高度に正確な)増幅が可能になる。いくつかの態様において、使用される酵素には、高忠実度DNAポリメラーゼ、例えば3'-5'エキソヌクレアーゼプルーフリーディング能を有するDNAポリメラーゼが含まれる。本方法と共に用いられ得る酵素の例には、AmpliTaq、Phusion HS II、Deep Vent、およびKapa HiFi DNAポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
ブロッカーは、複製を防ぐかまたは阻害することができ、かつ増幅反応におけるプライマーおよび/またはプローブ中に取り込まれる任意の修飾ヌクレオチド、またはヌクレオチドに結合する薬剤、または修飾ヌクレオチドに結合する薬剤を含み得る。ブロッカーは、いずれも複製を阻害するかまたは防ぐ、2'フルオロ(2'-デオキシ-2'-フルオロ-ヌクレオシド)修飾、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド、または3'-修飾を有するヌクレオチドを含み得る。
ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドには、2'-O-メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ホスホロジチオエートヌクレオチド、ホスホルアミダートヌクレオチド、およびメチルホスホン酸ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
3'-修飾を有するヌクレオチドには、3'末端リン酸修飾ヌクレオチド、3'アルキル置換ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
オリゴヌクレオチドの2'フルオロ(2'-デオキシ-2'-フルオロ-ヌクレオシド)修飾は、フルオロ基として、AMCA、DEAC(7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸)；7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3；7-ヒドロキシクマリン-3；MCA(7-メトキシクマリン-4-酢酸)；7-メトキシクマリン-3；AMF(4'-(アミノメチル)フルオレセイン)；5-DTAF(5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン)；6-DTAF(6-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン)；6-FAM(6-カルボキシフルオレセイン)、5(6)-FAMカダベリン；5-FAMカダベリン；5(6)-FAMエチレンジアミン；5-FAMエチレンジアミン；5-FITC(FITC異性体I；フルオレセイン-5-イソチオシアネート)；5-FITCカダベリン；フルオレセイン-5-マレイミド；5-IAF(5-ヨードアセトアミドフルオレセイン)；6-JOE(6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン)；5-CR110(5-カルボキシローダミン110)；6-CR110(6-カルボキシローダミン110)；5-CR6G(5-カルボキシローダミン6G)；6-CR6G(6-カルボキシローダミン6G)；5(6)-カルボキシローダミン6Gカダベリン；5(6)-カルボキシローダミン6Gエチレンジアミン；5-ROX(5-カルボキシ-X-ローダミン)；6-ROX(6-カルボキシ-X-ローダミン)；5-TAMRA(5-カルボキシテトラメチルローダミン)；6-TAMRA(6-カルボキシテトラメチルローダミン)；5-TAMRAカダベリン；6-TAMRAカダベリン；5-TAMRAエチレンジアミン；6-TAMRAエチレンジアミン；5-TMR C6マレイミド；6-TMR C6マレイミド；TR C2マレイミド；TRカダベリン；5-TRITC；G異性体(テトラメチルローダミン-5-イソチオシアネート)；6-TRITC；R異性体(テトラメチルローダミン-6-イソチオシアネート)；ダンシルカダベリン(5-ジメチルアミノナフタレン-1-(N-(5-アミノペンチル))スルホンアミド)；EDANS C2マレイミド；フルオレサミン；NBD；およびピロメテン、ならびにそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない、種々の蛍光標識を使用し得る。
上記のFRET(蛍光共鳴エネルギー移動またはフェルスター共鳴エネルギー移動)はまた、核酸増幅においても使用され得る。FRET対には、6-FAM(ドナー)とLC Red 640またはAlexa Fluor 546(アクセプター)；フルオレセイン(ドナー)とテトラメチルローダミン(アクセプター)；IAEDANS(ドナー)とフルオレセイン(アクセプター)；EDANS(ドナー)とDabcyl(アクセプター)；フルオレセイン(ドナー)とフルオレセイン(アクセプター)；BODIPY FL(ドナー)とBODIPY FL(アクセプター)；ならびにフルオレセイン(ドナー)とQSY 7およびQSY 9色素(アクセプター)が含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明のFlipプローブは、4つのセグメントおよび2つまたはそれ以上の標識を有する自己クエンチングプローブである。約1～7塩基の第1標的領域ハイブリダイズセグメント、第1標識、約4～10塩基の第2標的領域ハイブリダイズセグメント、約4～9塩基の第3標的領域ハイブリダイズセグメント、約4～10塩基の第4セグメント、および第2標識。(例えば図21を参照されたい。) いくつかの態様において、第2セグメントと第4セグメントは相互に相補的であり、標的領域の非存在下において、第2セグメントと第4セグメントはハイブリダイズして、第1標識と第2標識を相互にごく近接して位置づける。いくつかの態様において、第1標識はフルオロフォアであり、第2標識はクエンチャーである。いくつかの態様において、第1標識はクエンチャーであり、第2標識はフルオロフォアである。いくつかの態様において、フルオロフォアは第1標識であり、クエンチャーは第2標識である。いくつかの態様において、フルオロフォアはFlipプローブの5'末端の近傍にあり、セレクタープローブの3'末端上の標識とごく近接しており、プローブが標的領域に結合していない場合にFRET相互作用を可能にする。いくつかの態様において、Flipプローブの第1セグメントは、最適なFRET相互作用のために2つの標識間に距離を「空ける」ために用いられる。
いくつかの態様において、Flipプローブは、セレクターブロッカー、プライマー-スイッチ、スイッチ-ブロッカー、および/または本明細書に記載される他の方法のいずれかと共に用いられる。これらの態様において、Flipプローブは、標的の非存在下において高レベルのクエンチングを生じるように設計され、標的領域の存在下では、Flipプローブは標的配列に結合し、有意な蛍光を生じるように設計される。いくつかの態様では、標的領域に結合すると、Flipプローブ上に位置する蛍光吸収体が、FRETを介して、セレクターブロッカー上に位置する放射体にエネルギー移動できるようになる。
本明細書に記載される方法を実施するための機器使用は、容易に利用可能である。このような機器には、リアルタイムおよびエンドポイントPCRアッセイ、エマルジョンPCR、固相PCR、融解曲線解析、ならびに配列決定解析のための機器含まれ得る。このような機器には、Life Technologies 7500 Fast Dxリアルタイム機器(高分解能融解曲線解析もできる)および3500xlキャピラリーゲル機器が含まれる。本発明の方法において有用であることが当技術分野で公知である他の機器もまた、本発明の方法を実施するに当たり、当業者によって使用が企図される。
実施例1. EGFR T790M変異検出のためのSelectorアッセイの設計
Selectorアッセイの1つの様式は、非対称PCR(10～20倍過剰のリバースプライマーを用いる)、およびフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)による逆鎖のエンドポイント融解曲線解析検出を用いる。FRET対は、それぞれ6-FAMおよびLC Red 640またはAlexa Fluor 546フルオロフォアに連結されたセレクターおよびレポーターオリゴヌクレオチドである。ここで用いられるセレクターオリゴヌクレオチドは、15-mer(そのTmを上昇させるために2'-フルオロヌクレオシド置換を有する)である。セレクターは野生型配列と相補的であり、野生型増幅のブロッカーとして働く。加えて、フォワードプライマーとセレクターの間には6ヌクレオチドの重複が存在する。セレクター濃度は、フォワードプライマーが野生型鋳型に結合するのを打ち負かすために、典型的には4倍高いレベルで用いられた。野生型特異的ヌクレオチドが中央に位置し、かつその親和性が増加しているため、セレクターは変異体と野生型鋳型との間の有意なTmの違いを示す。セレクターAの場合には、この違いは約13℃である(図2もまた参照されたい)。レポーターは、セレクターが解離し始める温度で標的に結合しているように、セレクターよりも約10℃高いTmを有するように設計された。融解温度のこの違いのために、融解曲線解析によって変異体と野生型鋳型を区別することが可能になる。
Selectorアッセイの1つの様式は、非対称PCR(10～20倍過剰のリバースプライマーを用いる)、およびフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)による逆鎖のエンドポイント融解曲線解析検出を用いる。FRET対は、それぞれ6-FAMおよびLC Red 640またはAlexa Fluor 546フルオロフォアに連結されたセレクターおよびレポーターオリゴヌクレオチドである。ここで用いられるセレクターオリゴヌクレオチドは、15-mer(そのTmを上昇させるために2'-フルオロヌクレオシド置換を有する)である。セレクターは野生型配列と相補的であり、野生型増幅のブロッカーとして働く。加えて、フォワードプライマーとセレクターの間には6ヌクレオチドの重複が存在する。セレクター濃度は、フォワードプライマーが野生型鋳型に結合するのを打ち負かすために、典型的には4倍高いレベルで用いられた。野生型特異的ヌクレオチドが中央に位置し、かつその親和性が増加しているため、セレクターは変異体と野生型鋳型との間の有意なTmの違いを示す。セレクターAの場合には、この違いは約13℃である(図2もまた参照されたい)。レポーターは、セレクターが解離し始める温度で標的に結合しているように、セレクターよりも約10℃高いTmを有するように設計された。融解温度のこの違いのために、融解曲線解析によって変異体と野生型鋳型を区別することが可能になる。
実施例2. Kapa HiFi反応条件下でセレクターおよびレポーターオリゴヌクレオチドプローブを用いる野生型および変異体合成標的の検出
0.4μMの合成の変異体または野生型標的のいずれかと共に、1×HiFi緩衝液、0.4μMセレクターA(6-FAM標識)、0.4μMレポーターA(LC Red 640標識)を含む10μl反応容積を混合した。混合物を95℃まで5分間加熱し、その後98℃で30秒および57℃で30秒の2サイクルを行った。次に解離曲線解析を行った(95℃で1分、45℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。カスタム設定LC Red 640チャネルにおいて、LC Red 640 FRETシグナルを検出した。
0.4μMの合成の変異体または野生型標的のいずれかと共に、1×HiFi緩衝液、0.4μMセレクターA(6-FAM標識)、0.4μMレポーターA(LC Red 640標識)を含む10μl反応容積を混合した。混合物を95℃まで5分間加熱し、その後98℃で30秒および57℃で30秒の2サイクルを行った。次に解離曲線解析を行った(95℃で1分、45℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。カスタム設定LC Red 640チャネルにおいて、LC Red 640 FRETシグナルを検出した。
実施例3. AmpliTaq(登録商標) DNAポリメラーゼ、Stoffel断片(Life Technologies)によるPCRを用いたSelectorアッセイ
1×Stoffel緩衝液(10 mM KCl、10 mM Tris-HCl、pH 8.3)、4 mM MgCl2、0.3 mM Cleanamp dNTP(TriLink Biotechnologies)、0.1μMフォワードプライマー、1μMリバースプライマー、0.4μMセレクターA(6-FAM標識)、0.4μMレポーターB(Alexa Fluor 546標識)、2 U Stoffel断片、および表示量のゲノムDNAを含む10μl反応容積中で反応を行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷した。ABI 7900HT機器において、以下のサイクル条件：94℃で3分、94℃で30秒および60℃で30秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(94℃で1分、45℃で30秒、次に1％勾配で94℃にする)。TAMRAチャネルにおいて、Alexa Fluor 546 FRETシグナルを検出した。PCR反応はABI 7900HT機器で実行した。実行終了時の解離曲線解析から、変異体産物と野生型産物との間に約7℃の違いがあることが示される。
1×Stoffel緩衝液(10 mM KCl、10 mM Tris-HCl、pH 8.3)、4 mM MgCl2、0.3 mM Cleanamp dNTP(TriLink Biotechnologies)、0.1μMフォワードプライマー、1μMリバースプライマー、0.4μMセレクターA(6-FAM標識)、0.4μMレポーターB(Alexa Fluor 546標識)、2 U Stoffel断片、および表示量のゲノムDNAを含む10μl反応容積中で反応を行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷した。ABI 7900HT機器において、以下のサイクル条件：94℃で3分、94℃で30秒および60℃で30秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(94℃で1分、45℃で30秒、次に1％勾配で94℃にする)。TAMRAチャネルにおいて、Alexa Fluor 546 FRETシグナルを検出した。PCR反応はABI 7900HT機器で実行した。実行終了時の解離曲線解析から、変異体産物と野生型産物との間に約7℃の違いがあることが示される。
実施例4. 高忠実度Kapa HS DNAポリメラーゼを用いた、複雑なバックグラウンドにおける変異体T790M検出のSelectorアッセイ
1×HiFi緩衝液(2mM MgCl2および他の成分を含む)、0.3 mM dNTP、0.1μMフォワードプライマー、2μMリバースプライマー、0.4μMセレクターA(6-FAM標識)、0.4μMレポーターA(LC Red 640標識)、0.4 U KAPA HiFiホットスタートDNAポリメラーゼ(Kapa Biosystems)、および表示量のゲノムDNAを含む10μl反応容積中で、KAPA HiFiホットスタートDNAポリメラーゼによるPCRを行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷した。ABI 7900HT機器において、以下のサイクル条件：95℃で5分、98℃で30秒および57℃で30秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(95℃で1分、45℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。カスタム設定LC Red 640チャネルにおいて、LC Red 640 FRETシグナルを検出した。6.6 ngの野生型DNAのバックグラウンドにおいて、14 pgおよび28 pgの変異体DNAが検出された。より多量の変異体DNA(28 pg)は、10件の反応のうち9件で変異体ピークを示す結果を示し、1件の反応は野生型の融解温度においてより低いピークを示した。6.6 ngの野生型を伴う14 pgの変異体に関しては、10件の反応のうちの6件が変異体ピークを示し、残りの反応は、野生型により近い融解温度を有するより低いピークを示した。
1×HiFi緩衝液(2mM MgCl2および他の成分を含む)、0.3 mM dNTP、0.1μMフォワードプライマー、2μMリバースプライマー、0.4μMセレクターA(6-FAM標識)、0.4μMレポーターA(LC Red 640標識)、0.4 U KAPA HiFiホットスタートDNAポリメラーゼ(Kapa Biosystems)、および表示量のゲノムDNAを含む10μl反応容積中で、KAPA HiFiホットスタートDNAポリメラーゼによるPCRを行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷した。ABI 7900HT機器において、以下のサイクル条件：95℃で5分、98℃で30秒および57℃で30秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(95℃で1分、45℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。カスタム設定LC Red 640チャネルにおいて、LC Red 640 FRETシグナルを検出した。6.6 ngの野生型DNAのバックグラウンドにおいて、14 pgおよび28 pgの変異体DNAが検出された。より多量の変異体DNA(28 pg)は、10件の反応のうち9件で変異体ピークを示す結果を示し、1件の反応は野生型の融解温度においてより低いピークを示した。6.6 ngの野生型を伴う14 pgの変異体に関しては、10件の反応のうちの6件が変異体ピークを示し、残りの反応は、野生型により近い融解温度を有するより低いピークを示した。
実施例5. T790M変異に関するSelector Plusアッセイ
このアッセイ法は(Selectorアッセイの場合と同様に)野生型増幅のブロッカーを用いるが、Selector Plusアッセイでは、ブロッカーは3'末端においてLC Red 640またはAlexa Fluor 546フルオロフォアのいずれかを含む(これはやはり融解曲線解析のためのFRET対として機能する、以下を参照されたい)。加えて、レポーターは、アニーリング/伸長段階中に蓄積するPCR産物のリアルタイム検出を可能にする二重標識プローブである。レポーターは、5'末端においてまたは5'末端の近くで6-FAM標識により標識され、3'末端においてDabcylクエンチャーにより標識される。レポーターの設計は、アニーリング/伸長条件(56～60℃)下で、標的の非存在においてレポーターのステム構造がループを生じ、これが6-FAMをDabcylクエンチャーにごく接近させて、非常に低いバックグラウンドをもたらすというものである。単位複製配列の存在下では、レポーターはステムループ構造を開いて結合する。増加する6-FAM蛍光の量は、存在する単位複製配列の量と相関する。リアルタイム検出を用いて、大過剰の野生型分子を含む試料中のT790M変異体分子の存在を同定する。これは、Cq値を、公知の量のT790M変異体および野生型のCq値と相関させることによって行う。リアルタイムCq値がミスマッチの存在を示す場合、それらをミスマッチの存在について検証する。これは、イミノビオチンを用いて2本の鎖のうちの一方を選択的に捕捉し、融解曲線解析および配列決定を実施することによって行う(図8を参照されたい)。
このアッセイ法は(Selectorアッセイの場合と同様に)野生型増幅のブロッカーを用いるが、Selector Plusアッセイでは、ブロッカーは3'末端においてLC Red 640またはAlexa Fluor 546フルオロフォアのいずれかを含む(これはやはり融解曲線解析のためのFRET対として機能する、以下を参照されたい)。加えて、レポーターは、アニーリング/伸長段階中に蓄積するPCR産物のリアルタイム検出を可能にする二重標識プローブである。レポーターは、5'末端においてまたは5'末端の近くで6-FAM標識により標識され、3'末端においてDabcylクエンチャーにより標識される。レポーターの設計は、アニーリング/伸長条件(56～60℃)下で、標的の非存在においてレポーターのステム構造がループを生じ、これが6-FAMをDabcylクエンチャーにごく接近させて、非常に低いバックグラウンドをもたらすというものである。単位複製配列の存在下では、レポーターはステムループ構造を開いて結合する。増加する6-FAM蛍光の量は、存在する単位複製配列の量と相関する。リアルタイム検出を用いて、大過剰の野生型分子を含む試料中のT790M変異体分子の存在を同定する。これは、Cq値を、公知の量のT790M変異体および野生型のCq値と相関させることによって行う。リアルタイムCq値がミスマッチの存在を示す場合、それらをミスマッチの存在について検証する。これは、イミノビオチンを用いて2本の鎖のうちの一方を選択的に捕捉し、融解曲線解析および配列決定を実施することによって行う(図8を参照されたい)。
イミノビオチンは、アビジンに対してpH依存的結合定数を有する。イミノビオチンは、pH 10では結合しており、pH 4ではアビジン樹脂から溶出され得る。
磁性アビジンビーズ(Spherotech, Inc.)を用いて、イミノビオチン含有鎖を捕捉する。熱、低塩、および変性剤の組み合わせによって、非イミノビオチン化鎖をイミノビオチン化鎖から分離する。単離されたイミノビオチン化鎖を、pH 4において磁性アビジンビーズから溶出する。次に、単離されたイミノビオチン化鎖、セレクターおよびレポーター(FRET対として働く)を混合し、(実施例4に記載される通りに)解離曲線を実行することにより、融解曲線解析を行う。検出は、LC Red 640チャネルまたはAlexa Fluor 546チャネルにおいて行う。配列決定反応は、製造業者の説明書に従って、BigDye(登録商標)ターミネーターv 1.1サイクル配列決定キットと共にイミノビオチン化鎖および/または非イミノビオチン化鎖を用いることによって行う。配列決定反応物を、解析のためにABI3730 DNA分析装置に供試する。
（表１）Selectorアッセイに用いられるオリゴヌクレオチド
[*はホスホロチオエート結合を示す；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す]
（表２）Selector Plusアッセイのためのオリゴヌクレオチド
[*はホスホロチオエート結合を示す；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す]
実施例6. Selectorアッセイを用いた、複雑な野生型ゲノムバックグラウンドにおける稀な変異体の検出
漸増量のH1975ゲノムDNA(それぞれ7、70、700、および7000コピーのT790Mに相当する0.05 ng、0.5 ng、5 ng、または50 ng)を、50 ng ABR16965ゲノムDNA(約14000コピーの野生型対照)の存在下または非存在下でSelectorアッセイにおいて使用した(すべての反応がセレクターを伴う)。図9を参照されたい。増幅データをプロットし、グラフに示した(左パネル)。50 pg H1975と50 ng ABR16965の混合物のSelectorアッセイ反応物の融解曲線解析および配列決定データを示す(変異体コピーと野生型コピーの1：2000混合物)。T790M変異に特異的なヌクレオチド(A)を配列ピークの上に矢印で示し、セレクターの結合する領域を四角で示す。
漸増量のH1975ゲノムDNA(それぞれ7、70、700、および7000コピーのT790Mに相当する0.05 ng、0.5 ng、5 ng、または50 ng)を、50 ng ABR16965ゲノムDNA(約14000コピーの野生型対照)の存在下または非存在下でSelectorアッセイにおいて使用した(すべての反応がセレクターを伴う)。図9を参照されたい。増幅データをプロットし、グラフに示した(左パネル)。50 pg H1975と50 ng ABR16965の混合物のSelectorアッセイ反応物の融解曲線解析および配列決定データを示す(変異体コピーと野生型コピーの1：2000混合物)。T790M変異に特異的なヌクレオチド(A)を配列ピークの上に矢印で示し、セレクターの結合する領域を四角で示す。
結果：
漸増量のH1975ゲノムDNA(7コピーから約7000コピーまで)を、セレクターおよび約14000コピーのABR16965ゲノムDNA(野生型対照)の存在下で、Selectorアッセイにおいて使用した。増幅データグラフから見られ得るように、野生型対照DNAの存在は、T790M変異体の増幅に最小限に影響を及ぼす(H1975のグラフをH1975＋ABR16965のグラフと比較)。試験した濃度にわたってSelector(商標)アッセイが直線回帰を示すことが明白であり、試験した範囲にわたってこのアッセイ法が定量的であることが示される。また、変異体の融解曲線ピークを示す融解曲線解析、および配列決定の結果から、50 pg H1975(7コピーのT790M)を50 ngのABR16965(14000コピーのEGFR)と混合した場合に、T790M変異が検出され得ることが示される。T790M変異体はまた、野生型DNAと混合した場合に、より多量のH1975を用いても検出され得る(データは表示せず)。したがって、ここでのデータから、変異体DNAを1:2000もの比率で野生型DNAと混合した場合に、Selector(商標)アッセイがこれを検出できたことが示される。
漸増量のH1975ゲノムDNA(7コピーから約7000コピーまで)を、セレクターおよび約14000コピーのABR16965ゲノムDNA(野生型対照)の存在下で、Selectorアッセイにおいて使用した。増幅データグラフから見られ得るように、野生型対照DNAの存在は、T790M変異体の増幅に最小限に影響を及ぼす(H1975のグラフをH1975＋ABR16965のグラフと比較)。試験した濃度にわたってSelector(商標)アッセイが直線回帰を示すことが明白であり、試験した範囲にわたってこのアッセイ法が定量的であることが示される。また、変異体の融解曲線ピークを示す融解曲線解析、および配列決定の結果から、50 pg H1975(7コピーのT790M)を50 ngのABR16965(14000コピーのEGFR)と混合した場合に、T790M変異が検出され得ることが示される。T790M変異体はまた、野生型DNAと混合した場合に、より多量のH1975を用いても検出され得る(データは表示せず)。したがって、ここでのデータから、変異体DNAを1:2000もの比率で野生型DNAと混合した場合に、Selector(商標)アッセイがこれを検出できたことが示される。
方法：
Selectorアッセイ反応は、以下の成分：0.2μMフォワードプライマー(
；*はホスホロチオエートを示す)、2μMリバースプライマー(
；*はホスホロチオエートを示す)、0.3μMセレクター6(
；*はホスホロチオエートを示す；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す)、0.6μMレポーター4(
；*はホスホロチオエートを示す；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す)、3 mM MgCl2、0.4 mM dNTP、0.4 U Kapa HiFiホットスタートDNAポリメラーゼ(Kapa Biosystems、Cat. No. KK2101)、1×HiFi緩衝液、0.2μl ROX参照色素(LifeTechnologies、Cat. No.12223-012)を含む10μl容積中で行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷し、ABI 7900HT機器において以下のサイクル条件：95℃で5分、次の98℃で20秒、61℃で30秒、52℃で1分、69℃で15秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(95℃で1分、40℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。52℃のサイクル段階中に6-FAMおよびLCRed640蛍光をモニターすることによって、増幅産物の検出を行った。融解曲線解析については、40℃から95℃への移行中に、LCRed640シグナルをモニターした。
Selectorアッセイ反応は、以下の成分：0.2μMフォワードプライマー(
サンガー配列決定については、PCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製し、配列決定プライマーT790M seq6
と共に、製造業者の説明書に従ってBigDye(登録商標)ターミネーターv1.1サイクル配列決定キット(LifeTechnologies、Cat. No. 4337449)を用いて、配列決定反応を行った。Centri-Sep(商標)カラム(LifeTechnologies、Cat. No. 401762)を用いて配列決定反応物を精製し、3730 DNA分析装置で解析した。
実施例7. Selectorアッセイを用いた野生型増幅の阻害の実証
肺癌血液試料のWGA材料由来の野生型鋳型を用いて、Selectorアッセイを行った。図10を参照されたい。セレクターの存在下または非存在下における野生型鋳型の増幅を示す。セレクターの存在下または非存在下においてH1975ゲノムDNA標準物質(0.05 ng、0.5 ng、5 ng、および50 ng)を用いてSelectorアッセイを行うことによって得られた検量線中に、検出されたコピーをプロットする(セレクターを含む反応における検量線のみを示す)。
肺癌血液試料のWGA材料由来の野生型鋳型を用いて、Selectorアッセイを行った。図10を参照されたい。セレクターの存在下または非存在下における野生型鋳型の増幅を示す。セレクターの存在下または非存在下においてH1975ゲノムDNA標準物質(0.05 ng、0.5 ng、5 ng、および50 ng)を用いてSelectorアッセイを行うことによって得られた検量線中に、検出されたコピーをプロットする(セレクターを含む反応における検量線のみを示す)。
結果：
T790Mについて陰性であることが判明した肺癌血液試料由来のWGA材料を用いて、野生型鋳型を作製した。これを行うために、WGA材料を15サイクルかけて前もって増幅して、T790M変異領域を含む228 bp PCR断片を作製し、これを次にSelectorアッセイにおいてネステッドPCRに用いた。図10中の増幅曲線から見られ得るように、Selectorアッセイ反応にセレクターを添加すると、野生型鋳型の増幅は阻止され、55サイクルまで検出不可能である。野生型コピーの数は、H1975ゲノム標準物質と同じプレート上で実行した検量線により決定し、約10800と算出された。
T790Mについて陰性であることが判明した肺癌血液試料由来のWGA材料を用いて、野生型鋳型を作製した。これを行うために、WGA材料を15サイクルかけて前もって増幅して、T790M変異領域を含む228 bp PCR断片を作製し、これを次にSelectorアッセイにおいてネステッドPCRに用いた。図10中の増幅曲線から見られ得るように、Selectorアッセイ反応にセレクターを添加すると、野生型鋳型の増幅は阻止され、55サイクルまで検出不可能である。野生型コピーの数は、H1975ゲノム標準物質と同じプレート上で実行した検量線により決定し、約10800と算出された。
方法：
本実験で用いられるWGA材料は、図13および14について記載されるようにCEE(商標)マイクロチャネルを用いて調製された肺癌血液試料に由来する。セレクターおよびレポーターを用いず、サイクルを15サイクル行い、かつ融解曲線解析を省略したことを除いて、図1について記載されるようなSelectorアッセイ反応条件下で、フォワードプライマーFP19(
；*はホスホロチオエートを示す)およびリバースプライマーRP14(
；*はホスホロチオエートを示す)を用いて、WGA材料を前もって増幅した。得られた材料を10 mM Tris-HCl、pH 8.0、0.1 mM EDTAで50倍希釈し、図9について記載されるように、セレクターの存在下または非存在下でSelectorアッセイ反応において使用した。
本実験で用いられるWGA材料は、図13および14について記載されるようにCEE(商標)マイクロチャネルを用いて調製された肺癌血液試料に由来する。セレクターおよびレポーターを用いず、サイクルを15サイクル行い、かつ融解曲線解析を省略したことを除いて、図1について記載されるようなSelectorアッセイ反応条件下で、フォワードプライマーFP19(
実施例8. 肺癌患者の血漿から単離された核酸を用いたSelectorアッセイ
肺癌患者血漿試料から調製された核酸を、T790M Selectorアッセイにおいて使用した。Selectorアッセイ反応を、セレクターの存在下または非存在下で行った。後者の条件は、野生型配列の増幅を可能にし、反応条件および血漿調製物中の核酸の存在の対照として役立つ。変異体および野生型の融解曲線ピークの位置を表示して、SelectorアッセイPCR産物の融解曲線解析を示す。－セレクターPCR反応物の融解曲線解析については、増幅後にセレクターおよびレポーターを添加した。Selectorアッセイ反応産物を配列決定して、変異体T790M配列(CAT)または野生型配列(CGT)の存在を確認した。配列の下に四角で示したセレクターは、セレクター結合の位置を示す。
肺癌患者血漿試料から調製された核酸を、T790M Selectorアッセイにおいて使用した。Selectorアッセイ反応を、セレクターの存在下または非存在下で行った。後者の条件は、野生型配列の増幅を可能にし、反応条件および血漿調製物中の核酸の存在の対照として役立つ。変異体および野生型の融解曲線ピークの位置を表示して、SelectorアッセイPCR産物の融解曲線解析を示す。－セレクターPCR反応物の融解曲線解析については、増幅後にセレクターおよびレポーターを添加した。Selectorアッセイ反応産物を配列決定して、変異体T790M配列(CAT)または野生型配列(CGT)の存在を確認した。配列の下に四角で示したセレクターは、セレクター結合の位置を示す。
結果：
セレクターの非存在下および存在下でSelectorアッセイを用いて、肺癌患者の血漿から核酸を調製した。セレクターの存在下におけるリアルタイムPCRの結果は、検出される変異体増幅を示す(6-FAMおよびLCRed640チャネルにおける＋セレクター反応を参照されたい)。増幅産物の融解曲線解析によって、変異体配列の増幅がさらに確認された。＋セレクター反応物の融解曲線ピークは、－セレクター反応物において観察される野生型融解曲線ピークよりも約13℃低いTmを示した。変異の存在を確認するために、＋セレクターのPCR産物を配列決定し、T790Mに特有の変異が同定された。－セレクターPCR産物の配列決定は、野生型配列の同定をもたらす。検量線に基づき(図11B)、血漿3 ml中に見出されるT790Mコピーの数は577であり、見出されるEGFRコピーの数は46348であった。
セレクターの非存在下および存在下でSelectorアッセイを用いて、肺癌患者の血漿から核酸を調製した。セレクターの存在下におけるリアルタイムPCRの結果は、検出される変異体増幅を示す(6-FAMおよびLCRed640チャネルにおける＋セレクター反応を参照されたい)。増幅産物の融解曲線解析によって、変異体配列の増幅がさらに確認された。＋セレクター反応物の融解曲線ピークは、－セレクター反応物において観察される野生型融解曲線ピークよりも約13℃低いTmを示した。変異の存在を確認するために、＋セレクターのPCR産物を配列決定し、T790Mに特有の変異が同定された。－セレクターPCR産物の配列決定は、野生型配列の同定をもたらす。検量線に基づき(図11B)、血漿3 ml中に見出されるT790Mコピーの数は577であり、見出されるEGFRコピーの数は46348であった。
方法：
肺癌患者(18299)由来の血液(約8 ml)をCEE-Sure(商標)チューブ(Biocept, Inc.；抗凝集試薬を含む)中に採取し、血液採取の48時間以内に、血漿部分由来の核酸を調製した。これを行うために、全血を3000×g、RTで5分間遠心し、得られた血漿画分を16000×g、4℃で10分間再度遠心した。約3 mlの血漿上清を、以下の修正を加えて、製造業者の説明書に従ってQIAamp循環核酸キット(Qiagen、Cat. No. 55114)を用いる核酸の調製に使用した：プロテイナーゼK消化を60℃で60分間行い、キャリアーRNAの添加を省略し、提供される溶出緩衝液を20μl用いて溶出を行った。
肺癌患者(18299)由来の血液(約8 ml)をCEE-Sure(商標)チューブ(Biocept, Inc.；抗凝集試薬を含む)中に採取し、血液採取の48時間以内に、血漿部分由来の核酸を調製した。これを行うために、全血を3000×g、RTで5分間遠心し、得られた血漿画分を16000×g、4℃で10分間再度遠心した。約3 mlの血漿上清を、以下の修正を加えて、製造業者の説明書に従ってQIAamp循環核酸キット(Qiagen、Cat. No. 55114)を用いる核酸の調製に使用した：プロテイナーゼK消化を60℃で60分間行い、キャリアーRNAの添加を省略し、提供される溶出緩衝液を20μl用いて溶出を行った。
血漿由来の核酸調製物(全量約17μl)のうちの1μlを、以前に記載されたように10μlのT790M SelectorアッセイPCR反応において直接使用した。
セレクターの非存在下で実行したSelectorアッセイ反応からのPCR産物の融解曲線プロファイルを決定するには(上記の－セレクターを参照されたい)、増幅後にセレクターおよびレポーターを添加し、以前に記載されたのと同じ条件下で解離曲線解析を実行した。
図11Aに示される血漿核酸反応の増幅データを、検量線グラフ上にプロットした。検量線は、セレクターの存在下または非存在下で、漸増量のH1975ゲノムDNAを用いてSelector(商標)アッセイを行うことによって得られた。反応は、血漿核酸と同じプレート上で実行した。
実施例9. 肺癌患者の血漿に由来するmRNAのSelectorアッセイ
肺癌患者(18280)の核酸試料から調製されたcDNAを、以前に記載されたように(実施例8を参照されたい)、セレクターの存在下または非存在下で実行するSelectorアッセイにおいて使用した。cDNAを用いる反応を2つ組で実行した。反応の一方は、セレクターの存在下での増幅を示した。50 pg H1975(セレクターの存在下における約7コピーのT790M)の増幅を、同じグラフ上に示す。増幅産物の融解曲線プロファイルは変異体に対応し、配列決定により、増幅されたPCR産物中にT790M変異が存在することが確認された。
肺癌患者(18280)の核酸試料から調製されたcDNAを、以前に記載されたように(実施例8を参照されたい)、セレクターの存在下または非存在下で実行するSelectorアッセイにおいて使用した。cDNAを用いる反応を2つ組で実行した。反応の一方は、セレクターの存在下での増幅を示した。50 pg H1975(セレクターの存在下における約7コピーのT790M)の増幅を、同じグラフ上に示す。増幅産物の融解曲線プロファイルは変異体に対応し、配列決定により、増幅されたPCR産物中にT790M変異が存在することが確認された。
方法：
臨床肺癌試料のDNAse I処理した核酸から、Superscript III第1鎖合成系(LifeTechnologies Cat. No. 18080-051)を用いてcDNAを調製した。キットによって提供されるオリゴ(dT)を使用し、製造業者の説明書に従って合成を行った。
臨床肺癌試料のDNAse I処理した核酸から、Superscript III第1鎖合成系(LifeTechnologies Cat. No. 18080-051)を用いてcDNAを調製した。キットによって提供されるオリゴ(dT)を使用し、製造業者の説明書に従って合成を行った。
結果：
本発明者らは、肺癌血漿試料由来のcDNA調製物中にT790M変異体の存在を検出した。血漿3 ml中に、T790Mの約8つのRNAコピーが検出された。
本発明者らは、肺癌血漿試料由来のcDNA調製物中にT790M変異体の存在を検出した。血漿3 ml中に、T790Mの約8つのRNAコピーが検出された。
実施例10. Biocept CEE(商標)マイクロチャネルから回収した細胞のSelectorアッセイ
全血中のH1975を用いた添加および回収実験の増幅データを示す。図13Aを参照されたい。漸増量のH1975ゲノムDNA対照を用いる反応から得られた検量線グラフ中に、データをプロットした(上パネル)。セレクターの存在下での反応は、添加したH1975細胞(漸増数の添加A、添加B、および添加C)の定量を可能にするのに対して、セレクターの非存在下での反応は、マイクロチャネル溶出液中に見出されるバックグラウンド細胞(WBC)の定量を可能にする。
全血中のH1975を用いた添加および回収実験の増幅データを示す。図13Aを参照されたい。漸増量のH1975ゲノムDNA対照を用いる反応から得られた検量線グラフ中に、データをプロットした(上パネル)。セレクターの存在下での反応は、添加したH1975細胞(漸増数の添加A、添加B、および添加C)の定量を可能にするのに対して、セレクターの非存在下での反応は、マイクロチャネル溶出液中に見出されるバックグラウンド細胞(WBC)の定量を可能にする。
図13Aからの増幅産物を、融解曲線解析によって解析した。図13Bを参照されたい。－セレクターPCR反応物の融解曲線解析については、増幅後にセレクターおよびレポーターを添加した。変異体および野生型の融解曲線ピークの位置を表示する。試料をサンガー配列決定反応において用いて、変異体または野生型配列の存在を確認した。セレクター結合の位置を配列の下に示す。
方法：
漸増数のH1975細胞を、CEE-Sure(商標)チューブ中の全血に添加した。バフィーコートを調製し、EpCAMを含む癌細胞の表面上のマーカーを特異的に認識するビオチン化抗体のカクテルと共にインキュベートした。次にバフィーコートを、ストレプトアビジンコーティングしたマイクロチャネル(CEE(商標)マイクロチャネル、Biocept, Inc.)に通した。サイトケラチン染色により、捕捉されたH1975細胞を可視化し、数え上げ、その後チャネルから溶出した。プロテアーゼによる消化および酵素の不活化の後、1μlを(実施例9に記載される通りに)Selectorアッセイにおいて使用した。
漸増数のH1975細胞を、CEE-Sure(商標)チューブ中の全血に添加した。バフィーコートを調製し、EpCAMを含む癌細胞の表面上のマーカーを特異的に認識するビオチン化抗体のカクテルと共にインキュベートした。次にバフィーコートを、ストレプトアビジンコーティングしたマイクロチャネル(CEE(商標)マイクロチャネル、Biocept, Inc.)に通した。サイトケラチン染色により、捕捉されたH1975細胞を可視化し、数え上げ、その後チャネルから溶出した。プロテアーゼによる消化および酵素の不活化の後、1μlを(実施例9に記載される通りに)Selectorアッセイにおいて使用した。
結果：
添加したH1975細胞を、BioceptのCEE(商標)マイクロチャネルを用いて全血から回収した。添加A、添加B、および添加Cは、(溶出前後のマイクロチャネルのCK+染色により判断して)それぞれ0個、3個、および16個細胞/μlマイクロチャネル溶出液を含んでいた。溶出およびプロテアーゼ消化後、ゲノムDNA材料を、セレクターの存在下または非存在下でSelectorアッセイにおいて使用した。検量線に基づき、添加A、添加B、および添加C中で検出されたH1975細胞の数は、それぞれ0個、3個、および36個/μlマイクロチャネル溶出液であった。したがって、Selector(商標)アッセイの結果は、マイクロチャネルの結果と厳密に一致する。
添加したH1975細胞を、BioceptのCEE(商標)マイクロチャネルを用いて全血から回収した。添加A、添加B、および添加Cは、(溶出前後のマイクロチャネルのCK+染色により判断して)それぞれ0個、3個、および16個細胞/μlマイクロチャネル溶出液を含んでいた。溶出およびプロテアーゼ消化後、ゲノムDNA材料を、セレクターの存在下または非存在下でSelectorアッセイにおいて使用した。検量線に基づき、添加A、添加B、および添加C中で検出されたH1975細胞の数は、それぞれ0個、3個、および36個/μlマイクロチャネル溶出液であった。したがって、Selector(商標)アッセイの結果は、マイクロチャネルの結果と厳密に一致する。
実施例11. Biocept CEE(商標)マイクロチャネルから回収し、WGAを用いて増幅した細胞のSelectorアッセイ
実施例9において解析したのと同じ添加および回収反応物を全ゲノム増幅し、セレクターの存在下でSelectorアッセイ反応において使用した。それぞれ0個、3個、および16個細胞/マイクロチャネル溶出液を含んだ添加A、添加B、および添加CからのWGA反応物の増幅データおよび融解曲線解析を図14Aに示す。セレクター反応は2つ組で実行し、両方の反応の結果を示す。
実施例9において解析したのと同じ添加および回収反応物を全ゲノム増幅し、セレクターの存在下でSelectorアッセイ反応において使用した。それぞれ0個、3個、および16個細胞/マイクロチャネル溶出液を含んだ添加A、添加B、および添加CからのWGA反応物の増幅データおよび融解曲線解析を図14Aに示す。セレクター反応は2つ組で実行し、両方の反応の結果を示す。
増幅を示した、WGA材料を用いて行ったSelectorアッセイ反応物(添加Bおよび添加C)を配列決定して、変異の存在を検証した。T790M特異的変異(CAT)の位置を示す。図14Bを参照されたい。セレクター結合の領域を、配列の下に四角で表示する。
結果：
上記の添加および回収実験からのゲノムDNA材料を全ゲノム増幅(WGA)し、T790M変異の存在についてSelectorアッセイにおいて試験した。WGA反応に、それぞれH1975細胞6個またはH1975細胞32個を含む添加Bおよび添加C試料を鋳型として用いた場合に、増幅が検出された(方法を参照されたい)。予測通り、添加A(H1975細胞0個)試料は増幅を示さなかった。融解曲線解析および配列決定の結果から、添加Bおよび添加C試料において、WGA材料中にT790M変異が存在することが確認された。したがって、Selectorアッセイは、マイクロチャネル溶出細胞由来のWGA材料とも首尾よく用いられ、6個ほどの細胞同等物がWGA増幅され、Selectorアッセイを用いて検出された。
上記の添加および回収実験からのゲノムDNA材料を全ゲノム増幅(WGA)し、T790M変異の存在についてSelectorアッセイにおいて試験した。WGA反応に、それぞれH1975細胞6個またはH1975細胞32個を含む添加Bおよび添加C試料を鋳型として用いた場合に、増幅が検出された(方法を参照されたい)。予測通り、添加A(H1975細胞0個)試料は増幅を示さなかった。融解曲線解析および配列決定の結果から、添加Bおよび添加C試料において、WGA材料中にT790M変異が存在することが確認された。したがって、Selectorアッセイは、マイクロチャネル溶出細胞由来のWGA材料とも首尾よく用いられ、6個ほどの細胞同等物がWGA増幅され、Selectorアッセイを用いて検出された。
方法：
製造業者の説明書に従ってRepli-gミニキット(Qiagen)を用いて、チャネルから溶出されたH1975材料の全ゲノム増幅を行った。マイクロチャネルから溶出されたH1975材料のうちの2μlを、WGA反応に用いた(添加A：0個細胞/μl、添加B：3個細胞/μl、添加C：16個細胞/μl)。増幅されたDNAを10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM EDTAで40 ng/μlに希釈してから、Selectorアッセイに添加した。Selector(商標)アッセイは、1 mM EGTAを反応に添加したことを除いて、実施例9について記載された通りに行った。
製造業者の説明書に従ってRepli-gミニキット(Qiagen)を用いて、チャネルから溶出されたH1975材料の全ゲノム増幅を行った。マイクロチャネルから溶出されたH1975材料のうちの2μlを、WGA反応に用いた(添加A：0個細胞/μl、添加B：3個細胞/μl、添加C：16個細胞/μl)。増幅されたDNAを10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM EDTAで40 ng/μlに希釈してから、Selectorアッセイに添加した。Selector(商標)アッセイは、1 mM EGTAを反応に添加したことを除いて、実施例9について記載された通りに行った。
実施例12. 重複するフォワードプライマーを用いたSelectorアッセイ
セレクターの存在下または非存在下で野生型鋳型を使用して、セレクターと重複するフォワードプライマーを用いたSelectorアッセイを行った。図15Aを参照されたい。セレクターおよび野生型鋳型の存在下における50 pg H1975の増幅もまた試験した。Selectorアッセイ反応のリアルタイムPCRおよび融解曲線解析を示す。－セレクターPCR反応物の融解曲線解析については、増幅後にセレクターおよびレポーターを添加した。
セレクターの存在下または非存在下で野生型鋳型を使用して、セレクターと重複するフォワードプライマーを用いたSelectorアッセイを行った。図15Aを参照されたい。セレクターおよび野生型鋳型の存在下における50 pg H1975の増幅もまた試験した。Selectorアッセイ反応のリアルタイムPCRおよび融解曲線解析を示す。－セレクターPCR反応物の融解曲線解析については、増幅後にセレクターおよびレポーターを添加した。
結果：
Selectorアッセイにおいて、セレクターと重複するフォワードプライマーを用いた。異なる量の野生型鋳型を試験して、セレクターによって増幅が効率的に阻止されるが、同じ反応液中に存在する50 pg H1975変異体ゲノムDNAの効率的な増幅をなお可能にする野生型鋳型の量を決定した。用いた条件下において、約800コピーの野生型鋳型(セレクターの非存在下で実行した検量線に基づく算出；データは表示せず)が、増幅について阻止されるが、同じ混合物中に存在する約7つの変異体コピー(50 pg H1975)の増幅を可能にすると判断された(図15Aを参照されたい)。セレクターの非存在下における野生型鋳型(図15B、パネルAを参照されたい)、およびセレクターの存在下における野生型鋳型と50 pg H1975変異体の混合物(図15B、パネルBを参照されたい)のSelector(商標)アッセイ反応物を配列決定して、増幅された鋳型の同一性を確認した。
Selectorアッセイにおいて、セレクターと重複するフォワードプライマーを用いた。異なる量の野生型鋳型を試験して、セレクターによって増幅が効率的に阻止されるが、同じ反応液中に存在する50 pg H1975変異体ゲノムDNAの効率的な増幅をなお可能にする野生型鋳型の量を決定した。用いた条件下において、約800コピーの野生型鋳型(セレクターの非存在下で実行した検量線に基づく算出；データは表示せず)が、増幅について阻止されるが、同じ混合物中に存在する約7つの変異体コピー(50 pg H1975)の増幅を可能にすると判断された(図15Aを参照されたい)。セレクターの非存在下における野生型鋳型(図15B、パネルAを参照されたい)、およびセレクターの存在下における野生型鋳型と50 pg H1975変異体の混合物(図15B、パネルBを参照されたい)のSelector(商標)アッセイ反応物を配列決定して、増幅された鋳型の同一性を確認した。
方法：
Selectorアッセイ反応および配列決定は、フォワードプライマーFP14ovl(
；*はホスホロチオエートを示す)をSelectorアッセイに用いたことを除いて、まさに実施例9について記載された通りに行った。野生型鋳型は実施例10に記載されるように作製し、10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM EDTA中の1000倍希釈物のSelectorアッセイデータを示す。
Selectorアッセイ反応および配列決定は、フォワードプライマーFP14ovl(
実施例13. 増幅中に配列エラーを導入し、性能を低下させる忠実度の低い酵素
本実施例では、以前の実施例において用いられた高忠実度/修復酵素Kapa HiFiホットスタートDNAポリメラーゼの代わりに、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを使用した。酵素の変更以外は、変性を95℃までわずかに下げ、かつ増幅緩衝液中で3 mM Mg++を用いることを除いて、反応条件は実施例6における条件と同等であった。いずれの変更も、AmpliTaq酵素の要件に合わせるためになされた。図16中、矢印は、AmpliTaq Goldの低忠実度と関連して配列中に導入されたG＞Aエラーを示す。T790M変異においてAに変化するGヌクレオチド(WTとして表示)もまた示してある。セレクター結合の領域を、配列の下に四角で表示する。Kapa HiFi酵素を用いてこれと同じアッセイが行われる場合には、有意な増幅は起こらず、任意の有意な取り込みエラーが導入されるという証拠もない(実施例7を参照されたい)。
本実施例では、以前の実施例において用いられた高忠実度/修復酵素Kapa HiFiホットスタートDNAポリメラーゼの代わりに、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを使用した。酵素の変更以外は、変性を95℃までわずかに下げ、かつ増幅緩衝液中で3 mM Mg++を用いることを除いて、反応条件は実施例6における条件と同等であった。いずれの変更も、AmpliTaq酵素の要件に合わせるためになされた。図16中、矢印は、AmpliTaq Goldの低忠実度と関連して配列中に導入されたG＞Aエラーを示す。T790M変異においてAに変化するGヌクレオチド(WTとして表示)もまた示してある。セレクター結合の領域を、配列の下に四角で表示する。Kapa HiFi酵素を用いてこれと同じアッセイが行われる場合には、有意な増幅は起こらず、任意の有意な取り込みエラーが導入されるという証拠もない(実施例7を参照されたい)。
本実施例は、鍵となる2つの要因を説明する。第一に、Selectorアッセイは、3'エキソヌクレアーゼ修復活性を有する、Kapa HiFi酵素のような高忠実度酵素を用いて行った場合に、より優れた性能をもたらした。Selectorアッセイは稀な事象を検出する目的で使用されるため、酵素によって導入されるいかなるエラーもアッセイの性能を損ない得る。したがって、高忠実度酵素を、ヌクレアーゼから保護されたプライマー、ブロッカー、およびプローブと組み合わせて使用することができる。第二に、本実施例において、セレクターの使用、および変異の増幅を可能にしながら、野生型シグナルを抑制するその能力は、任意のポリメラーゼ駆動性増幅反応の高感度モデルを提供する。したがって、本実施例は、ヌクレアーゼ耐性プライマーと高忠実度酵素の組み合わせ、または3'エキソヌクレアーゼ修復活性を有する酵素の組み合わせが、任意のポリメラーゼ依存的増幅反応の性能を高め、その反応の配列忠実度をより高い程度に維持するという直接的証拠を提供する。これらの方法は、エマルジョンPCRおよび固相PCRを含む任意のPCR反応、ならびに次世代配列決定およびプラットフォームへの適用において使用することができる。
Selectorアッセイは、野生型配列のフォワードプライマーによる増幅を高度に抑制する。同時に、リバースプライマーは線形増幅をなお駆動する。組み合わされたこの非常に低レベルの増幅期中に、セレクターのフットプリント内で取り込みエラーが起こった場合、セレクターによる阻止は減少し、指数関数的増殖が起こる。これに加えて、AmpliTaq Goldを用いた場合、1つまたは複数の誤取り込みエラーが日常的に観察される。したがって、本発明の方法と共に高忠実度ポリメラーゼを使用することで、このようなエラーを減少させるかまたは防ぐことができる。
結果：
AmpliTaq Gold(登録商標) DNAポリメラーゼおよび約680コピーの野生型鋳型(実施例7に記載される通りに調製)を用いて、セレクターの存在下でSelectorアッセイを行った。同量の野生型鋳型を、セレクターの存在下で、Kapa HiFiホットスタートDNAポリメラーゼと共にSelectorアッセイにおいて用いた場合には、いかなる検出可能な増幅産物も生じなかった(55サイクルの増幅後)。しかしながら、セレクターの存在下で、同様のサイクル条件下で(および5 mM、7 mM、または10 mM MgCl2と共に)、AmpliTaq DNAポリメラーゼを用いると、いずれの場合にも増幅産物が認められ、融解曲線ピークは変異体産物の存在を示した(図16以外のデータは表示せず)。個々のウェルからの変異体産物の配列決定により、セレクター結合の領域中に異なる変異が存在することが明らかになる(図16)。ここで示される例はG＞A変異である。頻繁に観察される別の変異は、T790MヌクレオチドG＞A変化である。このことから、セレクターの存在が、酵素によって導入された変異の選択的増幅を引き起こし得ることが示される。この場合もやはり、本発明の方法と共に高忠実度ポリメラーゼを使用することで、このようなエラーを減少させるかまたは防ぐことができる。
AmpliTaq Gold(登録商標) DNAポリメラーゼおよび約680コピーの野生型鋳型(実施例7に記載される通りに調製)を用いて、セレクターの存在下でSelectorアッセイを行った。同量の野生型鋳型を、セレクターの存在下で、Kapa HiFiホットスタートDNAポリメラーゼと共にSelectorアッセイにおいて用いた場合には、いかなる検出可能な増幅産物も生じなかった(55サイクルの増幅後)。しかしながら、セレクターの存在下で、同様のサイクル条件下で(および5 mM、7 mM、または10 mM MgCl2と共に)、AmpliTaq DNAポリメラーゼを用いると、いずれの場合にも増幅産物が認められ、融解曲線ピークは変異体産物の存在を示した(図16以外のデータは表示せず)。個々のウェルからの変異体産物の配列決定により、セレクター結合の領域中に異なる変異が存在することが明らかになる(図16)。ここで示される例はG＞A変異である。頻繁に観察される別の変異は、T790MヌクレオチドG＞A変化である。このことから、セレクターの存在が、酵素によって導入された変異の選択的増幅を引き起こし得ることが示される。この場合もやはり、本発明の方法と共に高忠実度ポリメラーゼを使用することで、このようなエラーを減少させるかまたは防ぐことができる。
方法：
AmpliTaq Gold(登録商標) DNAポリメラーゼを用いるSelectorアッセイ反応は、以下の成分：0.2μMフォワードプライマー(実施例6に記載されるものと同じ)、2μMリバースプライマー(実施例1に記載されるものと同じ)、0.3μMセレクター6(実施例6に記載されるものと同じ)、0.6μMレポーター4(実施例6に記載されるものと同じ)、5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、3 U AmpliTaq Gold(登録商標)(LifeTechnologies、Cat. No. 4311814)、1×PCR gold緩衝液(15 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM KCl)、0.2μl ROX参照色素(LifeTechnologies、Cat. No.12223-012)を含む10μl容積中で行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷し、ABI 7900HT機器において以下のサイクル条件：95℃で5分、次の95℃で20秒、61℃で30秒、52℃で1分、69℃で15秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(95℃で1分、40℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。52℃のサイクル段階中に6-FAMおよびLC-Red 640蛍光をモニターすることによって、増幅産物の検出を行った。融解曲線解析については、40℃から95℃への移行中に、LC-Red 640シグナルをモニターした。サンガー配列決定は、まさに実施例6に記載される通りに行った。
AmpliTaq Gold(登録商標) DNAポリメラーゼを用いるSelectorアッセイ反応は、以下の成分：0.2μMフォワードプライマー(実施例6に記載されるものと同じ)、2μMリバースプライマー(実施例1に記載されるものと同じ)、0.3μMセレクター6(実施例6に記載されるものと同じ)、0.6μMレポーター4(実施例6に記載されるものと同じ)、5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、3 U AmpliTaq Gold(登録商標)(LifeTechnologies、Cat. No. 4311814)、1×PCR gold緩衝液(15 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM KCl)、0.2μl ROX参照色素(LifeTechnologies、Cat. No.12223-012)を含む10μl容積中で行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷し、ABI 7900HT機器において以下のサイクル条件：95℃で5分、次の95℃で20秒、61℃で30秒、52℃で1分、69℃で15秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(95℃で1分、40℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。52℃のサイクル段階中に6-FAMおよびLC-Red 640蛍光をモニターすることによって、増幅産物の検出を行った。融解曲線解析については、40℃から95℃への移行中に、LC-Red 640シグナルをモニターした。サンガー配列決定は、まさに実施例6に記載される通りに行った。
実施例14. 単純なFRETレポーター系を用いるSelectorアッセイ
Selectorアッセイ増幅および融解曲線解析を行い、FAM標識ブロッカー(ブロッカー8)およびLC-Red 640標識アンカー(アンカー5)の存在下で行った反応について示す。示されるこの実験では、実施例6に記載されるリバースプライマーと組み合わせて、ブロッカーと重複するフォワードプライマーを使用した(詳細については方法を参照されたい)。50 pg H1975ゲノムDNA(約7コピーのT790M変異体を含む)または約1100コピーの野生型EGFR DNA鋳型(実施例7に記載される通りに調製)のいずれかを用いて、Selectorアッセイを行った。増幅産物を、リアルタイムPCRグラフ中に矢印で示す。(NTC：鋳型なし対照)。
Selectorアッセイ増幅および融解曲線解析を行い、FAM標識ブロッカー(ブロッカー8)およびLC-Red 640標識アンカー(アンカー5)の存在下で行った反応について示す。示されるこの実験では、実施例6に記載されるリバースプライマーと組み合わせて、ブロッカーと重複するフォワードプライマーを使用した(詳細については方法を参照されたい)。50 pg H1975ゲノムDNA(約7コピーのT790M変異体を含む)または約1100コピーの野生型EGFR DNA鋳型(実施例7に記載される通りに調製)のいずれかを用いて、Selectorアッセイを行った。増幅産物を、リアルタイムPCRグラフ中に矢印で示す。(NTC：鋳型なし対照)。
結果：
FAM標識ブロッカー(ブロッカー8)、LC-Red 640標識アンカー(アンカー5)、ブロッカーと重複するフォワードプライマー、および以前の実施例で用いられたリバースプライマーを用いて、Selectorアッセイを行った。50 pg H1975ゲノムDNAにおける変異体増幅は検出されたが(約7コピーのT790M変異体)、約1100コピーの野生型EGFR DNA鋳型は効率的に阻止され、いかなる増幅も示さなかった。7コピーのH1975をおよそ1100コピーの野生型EGFRと混合したところ、やはり変異体増幅が示された。
FAM標識ブロッカー(ブロッカー8)、LC-Red 640標識アンカー(アンカー5)、ブロッカーと重複するフォワードプライマー、および以前の実施例で用いられたリバースプライマーを用いて、Selectorアッセイを行った。50 pg H1975ゲノムDNAにおける変異体増幅は検出されたが(約7コピーのT790M変異体)、約1100コピーの野生型EGFR DNA鋳型は効率的に阻止され、いかなる増幅も示さなかった。7コピーのH1975をおよそ1100コピーの野生型EGFRと混合したところ、やはり変異体増幅が示された。
方法：
Selectorアッセイ反応は、以下の成分：0.5μMフォワードプライマー(
；*はホスホロチオエートを示す；ブロッカーと重複）、2μMリバースプライマー(
；*はホスホロチオエートを示す)、0.4μMブロッカー8(
；*はホスホロチオエートを示す；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す)、0.4μMアンカー5(
；*はホスホロチオエートを示す；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す
：C3は3炭素スペーサーである)、3 mM MgCl2、0.4 mM dNTP、0.4 U Kapa HiFiホットスタートDNAポリメラーゼ(Kapa Biosystems、Cat. No. KK2101)、1×HiFi緩衝液、0.2μl ROX参照色素(LifeTechnologies、Cat. No.12223-012)を含む10μl容積中で行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷し、ABI 7900HT機器において以下のサイクル条件：95℃で5分、次の98℃で20秒、61℃で30秒、52℃で1分、69℃で15秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(95℃で1分、40℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。52℃のサイクル段階中にLC-Red 640蛍光をモニターすることによって、増幅産物の検出を行った。融解曲線解析については、40℃から95℃への移行中に、LC-Red 640シグナルをモニターした。
Selectorアッセイ反応は、以下の成分：0.5μMフォワードプライマー(
：C3は3炭素スペーサーである)、3 mM MgCl2、0.4 mM dNTP、0.4 U Kapa HiFiホットスタートDNAポリメラーゼ(Kapa Biosystems、Cat. No. KK2101)、1×HiFi緩衝液、0.2μl ROX参照色素(LifeTechnologies、Cat. No.12223-012)を含む10μl容積中で行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷し、ABI 7900HT機器において以下のサイクル条件：95℃で5分、次の98℃で20秒、61℃で30秒、52℃で1分、69℃で15秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(95℃で1分、40℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。52℃のサイクル段階中にLC-Red 640蛍光をモニターすることによって、増幅産物の検出を行った。融解曲線解析については、40℃から95℃への移行中に、LC-Red 640シグナルをモニターした。
実施例15. Selectorアッセイを用いたKRAS G12C変異の検出
野生型ゲノムDNA(対照血液17004；約1400コピーのKRAS)を含む混合物中でH2122ゲノムDNA(G12C変異についてホモ接合性)を用いる増幅、融解曲線解析、および配列決定結果を、KRASセレクターの存在下または非存在下で行った。増幅産物を、リアルタイムPCRグラフ中に矢印で示す(図18を参照されたい)。KRAS G12C変異に特異的なヌクレオチドを、配列決定結果中に矢印で示す(野生型：C、G12C：A)。セレクター結合の領域を、配列の下に四角で表示する。
野生型ゲノムDNA(対照血液17004；約1400コピーのKRAS)を含む混合物中でH2122ゲノムDNA(G12C変異についてホモ接合性)を用いる増幅、融解曲線解析、および配列決定結果を、KRASセレクターの存在下または非存在下で行った。増幅産物を、リアルタイムPCRグラフ中に矢印で示す(図18を参照されたい)。KRAS G12C変異に特異的なヌクレオチドを、配列決定結果中に矢印で示す(野生型：C、G12C：A)。セレクター結合の領域を、配列の下に四角で表示する。
結果：
セレクターの存在下で、50 pg H2122ゲノムDNA(G12C変異についてホモ接合性；約14コピー)と50 ng野生型ゲノムDNA(対照血液17004；約1400コピーのKRAS)の混合物を用いて、KRAS G12C変異に関するSelectorアッセイ反応を行った。本発明者らは変異体増幅を検出することができ、増幅産物の融解曲線解析から、変異体に特有のピークが示された(Tm約52℃)。このことは配列決定によって確認され、配列決定は、G12C変異に特異的なC＞Aヌクレオチド変化を示した(図18、上パネル)。対照的に、セレクターの非存在下における同量の野生型ゲノムDNAは、変異体と比較した場合に64℃へと約12℃移行する融解曲線ピークを示した。配列決定により、増幅産物中にKRAS野生型に特異的なCヌクレオチドの存在が確認された(図18、下パネル)。
セレクターの存在下で、50 pg H2122ゲノムDNA(G12C変異についてホモ接合性；約14コピー)と50 ng野生型ゲノムDNA(対照血液17004；約1400コピーのKRAS)の混合物を用いて、KRAS G12C変異に関するSelectorアッセイ反応を行った。本発明者らは変異体増幅を検出することができ、増幅産物の融解曲線解析から、変異体に特有のピークが示された(Tm約52℃)。このことは配列決定によって確認され、配列決定は、G12C変異に特異的なC＞Aヌクレオチド変化を示した(図18、上パネル)。対照的に、セレクターの非存在下における同量の野生型ゲノムDNAは、変異体と比較した場合に64℃へと約12℃移行する融解曲線ピークを示した。配列決定により、増幅産物中にKRAS野生型に特異的なCヌクレオチドの存在が確認された(図18、下パネル)。
方法：
Selectorアッセイ反応は、以下の成分：0.3μMフォワードプライマー(
；*はホスホロチオエートを示す)、2μMリバースプライマー(
；*はホスホロチオエートを示す)、0.3μMセレクター1(
；*はホスホロチオエートを示す；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す)、0.5μMレポーター2(
；*はホスホロチオエートを示す；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す)、3 mM MgCl2、0.4 mM dNTP、0.4 U Kapa HiFiホットスタートDNAポリメラーゼ(Kapa Biosystems、Cat. No. KK2101)、1×HiFi緩衝液、0.2μl ROX参照色素(LifeTechnologies、Cat. No.12223-012)を含む10μl容積中で行った。PCR反応液を384-ウェルプレート上に負荷し、ABI 7900HT機器において以下のサイクル条件：95℃で5分、次の98℃で20秒、61℃で30秒、52℃で1分、69℃で15秒の55サイクルでPCRサイクルを行い、その後解離曲線解析を行った(95℃で1分、40℃で30秒、次に1％勾配で95℃にする)。52℃のサイクル段階中に6-FAMおよびLC-Red 640蛍光をモニターすることによって、増幅産物の検出を行った。融解曲線解析については、40℃から95℃への移行中に、LC-Red 640シグナルをモニターした。サンガー配列決定については、PCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製し、配列決定プライマー
と共に、製造業者の説明書に従ってBigDye(登録商標)ターミネーターv1.1サイクル配列決定キット(LifeTechnologies、Cat. No. 4337449)を用いて、配列決定反応を行った。Centri-Sep(商標)カラム(LifeTechnologies、Cat. No. 401762)を用いて配列決定反応物を精製し、3730 DNA分析装置で解析した。
Selectorアッセイ反応は、以下の成分：0.3μMフォワードプライマー(
細胞株由来のゲノムDNA(H1975、H2122)は、製造業者によって提供される培養細胞に関するプロトコールに従って、QIAmp DNA血液ミニキット(Qiagen Cat. No. 51104)を用いて調製した。対照血液試料由来のゲノムDNA(ABR16965、17004)は、PAXgene血液DNAキット(PreAnalytix Cat. No. 761133)および血液を用いて調製し、血液はPAXgene血液DNAチューブ(PreAnalytix Cat. No. 761125)中に回収した。
実施例16. Deep Vent (exo-) DNAポリメラーゼを用いるPCRにおけるプライマースイッチオリゴヌクレオチド構築物の使用による点変異の識別
結果：
単一の点変異だけ異なる鋳型配列間のPCR識別に及ぼすプライマー-スイッチオリゴヌクレオチド構築物の効果を評価した。T790M変異の検出用のプライマー-スイッチ構築物を試験した。これは、合成の野生型および変異体標的配列を用いて行った。プライマー-スイッチ構成(図19を参照されたい)をこれらの研究に使用し、挿入SYTO(登録商標) 9色素を使用するリアルタイムPCR解析を用いて、個々の一致標的およびミスマッチ標的と共に試験した(方法の項を参照されたい)。結果から、変異体T790M対立遺伝子の、野生型と比較して約4ΔCqの優先的増幅が示され、各リアルタイムCqはそれぞれ23および27であった。
結果：
単一の点変異だけ異なる鋳型配列間のPCR識別に及ぼすプライマー-スイッチオリゴヌクレオチド構築物の効果を評価した。T790M変異の検出用のプライマー-スイッチ構築物を試験した。これは、合成の野生型および変異体標的配列を用いて行った。プライマー-スイッチ構成(図19を参照されたい)をこれらの研究に使用し、挿入SYTO(登録商標) 9色素を使用するリアルタイムPCR解析を用いて、個々の一致標的およびミスマッチ標的と共に試験した(方法の項を参照されたい)。結果から、変異体T790M対立遺伝子の、野生型と比較して約4ΔCqの優先的増幅が示され、各リアルタイムCqはそれぞれ23および27であった。
方法：
これらの研究のために、2種類の一本鎖鋳型配列を調製した。「野生型」と命名された第1配列
、および「T790M」と命名された第2配列
を調製した。各PCR混合物は、フォワードプライマーとしてのスイッチ-ブロッカープライマー(
；小文字は2'-フルオロリボヌクレオシドを示す；C3は3炭素スペーサーである；S18はスペーサー18(ヘキサエチレングリコール)を示す、および(5')は
の逆合成を示す)、ならびに非修飾リバースプライマー
を使用した。各プライマーは、0.2 mM dNTP、1×Thermopol緩衝液(New England Biolabs；20 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、0.1％ Triton X-100、25℃でpH 8.8)、1単位のDeep Vent (exo+)またはDeep Vent (exo-) DNAポリメラーゼ(いずれもNew England Biolabsによる)；2μM SYTO(登録商標) 9(挿入色素；Life Technologies)；1.5μM ROX(参照色素；Agilent)、および105コピーの野生型またはT790M鋳型を含む25μL PCR設定において0.2μM濃度で使用した。反応液を200μL光学チューブ中で3つ組で調製し、反応はAgilent MX3005Pリアルタイムサーマルサイクラーで実行した。反応液を以下のサーマルサイクルプロトコール：95℃で10分；[95℃で40秒、58℃で30秒、72℃で1分]の40サイクル；および72℃で7分に供した。
これらの研究のために、2種類の一本鎖鋳型配列を調製した。「野生型」と命名された第1配列
実施例17. PCRにおけるプライマー-スイッチオリゴヌクレオチド構築物の使用による点変異の識別‐Phusion(登録商標)ホットスタートII高忠実度DNAポリメラーゼとDeep Vent (exo-) DNAポリメラーゼの比較
結果：
本研究は、実施例16において使用したものと同じプライマー-スイッチ構成および標的を使用した場合の、Phusion(登録商標)ホットスタートII高忠実度DNAポリメラーゼとDeep Vent (exo-) DNAポリメラーゼを比較した。PCRサイクル条件は、実施例16において用いた条件とわずかに異なったが(方法を参照されたい)、反応条件以外は同等であった。結果から、Deep Vent (exo-) DNAポリメラーゼを用いた場合、野生型よりも変異体の増幅を支持するΔCq＝約3が得られ(24.5対27.5)、その一方で、PhusionホットスタートIIポリメラーゼは、野生型よりも変異体の増幅をΔCq＝約6だけ支持した(22対28)。この結果から、プライマー-スイッチ構築物が、3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼおよび3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼと共に効率的に働くことが示される。この結果から、3'エキソヌクレアーゼ修復活性を有する酵素が好ましいこともまた示される。
結果：
本研究は、実施例16において使用したものと同じプライマー-スイッチ構成および標的を使用した場合の、Phusion(登録商標)ホットスタートII高忠実度DNAポリメラーゼとDeep Vent (exo-) DNAポリメラーゼを比較した。PCRサイクル条件は、実施例16において用いた条件とわずかに異なったが(方法を参照されたい)、反応条件以外は同等であった。結果から、Deep Vent (exo-) DNAポリメラーゼを用いた場合、野生型よりも変異体の増幅を支持するΔCq＝約3が得られ(24.5対27.5)、その一方で、PhusionホットスタートIIポリメラーゼは、野生型よりも変異体の増幅をΔCq＝約6だけ支持した(22対28)。この結果から、プライマー-スイッチ構築物が、3'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼおよび3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼと共に効率的に働くことが示される。この結果から、3'エキソヌクレアーゼ修復活性を有する酵素が好ましいこともまた示される。
方法：
方法およびプライマー-スイッチ構成は、以下の点を除いて実施例16と同様であった。Phusion(登録商標)ホットスタートII高忠実度DNAポリメラーゼ反応は1×Phusion(登録商標) HF緩衝液(New England Biolabs)中で行い、1単位のPhusion(登録商標)ホットスタートII高忠実度DNAを用いた(New England Biolabs)。加えて、サイクル条件は： 95℃で3分；[95℃で40秒、58℃で30秒、72℃で1分]の40サイクル；および72℃で7分であった。
方法およびプライマー-スイッチ構成は、以下の点を除いて実施例16と同様であった。Phusion(登録商標)ホットスタートII高忠実度DNAポリメラーゼ反応は1×Phusion(登録商標) HF緩衝液(New England Biolabs)中で行い、1単位のPhusion(登録商標)ホットスタートII高忠実度DNAを用いた(New England Biolabs)。加えて、サイクル条件は： 95℃で3分；[95℃で40秒、58℃で30秒、72℃で1分]の40サイクル；および72℃で7分であった。
実施例18. T790M選択的増幅のためのスイッチ-ブロッカーの設計
設計：
オリゴヌクレオチドを設計および合成して、スイッチ-ブロッカーアプローチのうちの1つを用いて、野生型と比較したT790M対立遺伝子の選択的増幅を研究した(図20を参照されたい)。一連のアニーリング温度および伸長温度にわたるこの系の試験を可能にするために、複数のフォワードプライマーを調製した。加えて、5'末端BHQ1(Black Holeクエンチャー1)クエンチャーから17ヌクレオチド離れてFAM蛍光標識を配置することにより、「自己報告性」となるようにスイッチ-ブロッカーを合成した。この配置は、ハイブリダイゼーション時にFAMフルオロフォアとBHQ1クエンチャーとの間に最適な差次的分離を生じるように選択された。ハイブリダイズした場合、17ヌクレオチドの分離はおよそ1.5回の塩基回転に等しく、これは2つの標識を二重鎖の反対側に配置し、2つの標識の互いからの有意な距離を達成するのに役立つ。ハイブリダイズすると、FAM標識と関連した蛍光の顕著な増加が起こる。フォワードプライマー1：
。フォワードプライマー2：
。フォワードプライマー3：
。スイッチブロッカー：
。リバースプライマー：
[*はホスホロチオエートを示す、B：5-ニトロインドール、C3：3炭素スペーサー]
設計：
オリゴヌクレオチドを設計および合成して、スイッチ-ブロッカーアプローチのうちの1つを用いて、野生型と比較したT790M対立遺伝子の選択的増幅を研究した(図20を参照されたい)。一連のアニーリング温度および伸長温度にわたるこの系の試験を可能にするために、複数のフォワードプライマーを調製した。加えて、5'末端BHQ1(Black Holeクエンチャー1)クエンチャーから17ヌクレオチド離れてFAM蛍光標識を配置することにより、「自己報告性」となるようにスイッチ-ブロッカーを合成した。この配置は、ハイブリダイゼーション時にFAMフルオロフォアとBHQ1クエンチャーとの間に最適な差次的分離を生じるように選択された。ハイブリダイズした場合、17ヌクレオチドの分離はおよそ1.5回の塩基回転に等しく、これは2つの標識を二重鎖の反対側に配置し、2つの標識の互いからの有意な距離を達成するのに役立つ。ハイブリダイズすると、FAM標識と関連した蛍光の顕著な増加が起こる。フォワードプライマー1：
実施例6および7などの先の実施例において記載された条件を用いるこれらの構築物の評価、ならびに一連のアニーリング温度および伸長温度にわたる試験により、このスイッチ-ブロッカーT790M構築物の最適なアッセイ条件の確立が可能になるはずである。
本明細書に記載される実施例および態様が例示目的のためのみであること、ならびにそれらの観点からの様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用される出版物、特許、および特許出願はすべて、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (17)
- 標的領域における核酸変種の有無を検出するための、第２の結合配列に連結または結合した第１の結合配列を含む組成物であって、該第１の結合配列がフォワードプライマーであり、該第２の結合配列が該第１の結合配列の３’末端で連結または結合しておらず、該第１の結合配列および第２の結合配列が、核酸の標的領域中の配列とそれぞれ相補的であり、該第２の結合配列が、核酸変種が存在しない状態の標的領域と相補的な配列を含み、かつ、（ｉ）該第２の結合配列が、前記フォワードプライマーが相補的である配列と重複する配列に相補的であるか、または、（ｉｉ）該第２の結合配列が、前記フォワードプライマーが相補的である配列の５’の配列に相補的である、組成物。
- 前記第２の結合配列が伸長可能でない、請求項１記載の組成物。
- 前記第１の結合配列および第２の結合配列が、連結しているか、または核酸、架橋剤、Ｓ１８スペーサー、またはそれらの組み合わせを介して結合している、請求項１または２記載の組成物。
- 前記第２の結合配列が、前記フォワードプライマーが相補的である配列と重複する配列に相補的である、請求項１～３のいずれか一項記載の組成物。
- 前記第２の結合配列が、検出可能な実体をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項記載の組成物。
- 前記検出可能な実体が、第２の結合配列に結合されている、請求項５記載の組成物。
- 前記検出可能な実体が、蛍光標識、化学発光標識、およびFRET対からなる群から選択される、請求項５記載の組成物。
- 前記検出可能な実体が、蛍光標識、およびクエンチャーからなる群から選択される、請求項５記載の組成物。
- 前記検出可能な実体が、プライマーとして第１の結合配列の伸長の間に第２の結合領域の加水分解によりクエンチされない、請求項８記載の組成物。
- 前記第１の結合配列および第２の結合配列が、固体支持体に結合していない、請求項１～９のいずれか一項記載の組成物。
- リバースプライマーをさらに含む、請求項１記載の組成物。
- 標的領域における核酸変種の有無を検出するための方法であって、
請求項１１記載の組成物の存在下で標的領域を増幅する段階であって、該標的領域の増幅が、該標的領域における核酸変種の存在を示し、該増幅の非存在が、該標的領域における核酸変種の非存在を示す、段階
を含む方法。 - 前記核酸変種が、欠失、変異、または挿入を含む、請求項１２記載の方法。
- 前記増幅が、３’エキソヌクレアーゼ修復活性を有する酵素の存在下で行われる、請求項１２記載の方法。
- 前記第２の結合配列が、蛍光／クエンチャー対を含む、請求項１２記載の方法。
- 前記検出可能な実体が、プライマーとして第１の結合配列の伸長の間に第２の結合配列の加水分解によりクエンチされない、請求項１５記載の方法。
- 前記増幅が、５’エキソヌクレアーゼまたはフラップエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素の存在下で行われる、請求項１６記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022116372A JP2022137291A (ja) | 2011-05-04 | 2022-07-21 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161482576P | 2011-05-04 | 2011-05-04 | |
| US61/482,576 | 2011-05-04 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018080526A Division JP6734887B2 (ja) | 2011-05-04 | 2018-04-19 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022116372A Division JP2022137291A (ja) | 2011-05-04 | 2022-07-21 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020202831A JP2020202831A (ja) | 2020-12-24 |
| JP7111773B2 true JP7111773B2 (ja) | 2022-08-02 |
Family
ID=47108269
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014509501A Active JP6404118B2 (ja) | 2011-05-04 | 2012-05-04 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
| JP2018080526A Active JP6734887B2 (ja) | 2011-05-04 | 2018-04-19 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
| JP2020119137A Active JP7111773B2 (ja) | 2011-05-04 | 2020-07-10 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
| JP2022116372A Pending JP2022137291A (ja) | 2011-05-04 | 2022-07-21 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014509501A Active JP6404118B2 (ja) | 2011-05-04 | 2012-05-04 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
| JP2018080526A Active JP6734887B2 (ja) | 2011-05-04 | 2018-04-19 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022116372A Pending JP2022137291A (ja) | 2011-05-04 | 2022-07-21 | 核酸配列変種を検出するための方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US9834817B2 (ja) |
| EP (2) | EP3382039B1 (ja) |
| JP (4) | JP6404118B2 (ja) |
| KR (3) | KR102252447B1 (ja) |
| CN (2) | CN108220406B (ja) |
| AU (3) | AU2012250516B2 (ja) |
| BR (1) | BR112013028296B1 (ja) |
| WO (1) | WO2012151560A2 (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9534255B2 (en) | 2008-12-17 | 2017-01-03 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants |
| JP5805064B2 (ja) | 2009-03-27 | 2015-11-04 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 対立遺伝子変種を検出するための方法、組成物、およびキット |
| BR112013028296B1 (pt) * | 2011-05-04 | 2020-03-24 | Biocept, Inc. | Métodos para detecção de variantes de sequências de ácido nucléico |
| WO2014164874A2 (en) * | 2013-03-13 | 2014-10-09 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for modulation of amplification efficiency |
| CN105209642A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-12-30 | 卡耐基华盛顿学院 | 基因组测序和表观遗传分析的方法 |
| JP2016512696A (ja) | 2013-03-15 | 2016-05-09 | アーノルド, ライル, ジェイ.ARNOLD, Lyle, J. | アセンブラ配列を利用する断片化された標的核酸の増幅方法 |
| US10253377B2 (en) | 2013-04-05 | 2019-04-09 | Wayne State University | Systems and methods to assess microbiomes and treatments thereof |
| US9410172B2 (en) * | 2013-09-16 | 2016-08-09 | General Electric Company | Isothermal amplification using oligocation-conjugated primer sequences |
| ES2841173T3 (es) | 2013-10-03 | 2021-07-07 | Janssen Biotech Inc | Variantes de Protoxina-II y métodos de uso |
| ES2861353T3 (es) * | 2014-05-19 | 2021-10-06 | Univ Rice William M | Amplificación específica de alelo utilizando una composición de oligonucleótidos cebadores no específicos de alelo y bloqueantes específicos de alelo solapantes |
| CA2957396C (en) * | 2014-08-07 | 2021-03-09 | Evrykleia LIANIDOU | Method of determining pik3ca mutational status in a sample |
| EP3277304B1 (en) * | 2015-04-02 | 2021-08-04 | Janssen Biotech, Inc. | Protoxin-ii variants and methods of use |
| EP3283627B1 (en) * | 2015-04-15 | 2021-12-01 | The General Hospital Corporation | Lna-based mutant enrichment next-generation sequencing assays |
| JP2018512878A (ja) * | 2015-04-20 | 2018-05-24 | ネオゲノミクス ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | 次世代シークエンシングの感度を高めるための方法 |
| WO2017070281A1 (en) * | 2015-10-21 | 2017-04-27 | Admera Health LLC | Blocker-based enrichment system and uses thereof |
| US11414686B2 (en) | 2016-05-06 | 2022-08-16 | William Marsh Rice University | Stoichiometric nucleic acid purification using randomer capture probe libraries |
| CN107577921A (zh) * | 2017-08-25 | 2018-01-12 | 云壹生物技术（大连）有限公司 | 一种肿瘤靶向基因测序数据解析方法 |
| CN108048531B (zh) * | 2017-11-16 | 2021-06-18 | 苏州吉玛基因股份有限公司 | 一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量pcr方法 |
| WO2020023493A1 (en) * | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Ripple Biosolutions Llc | Methods and composition for targeted genomic analysis |
| CN109136345A (zh) * | 2018-09-21 | 2019-01-04 | 北京知光基因科技有限公司 | 一种扩增并检测低含量基因突变的pcr方法及其应用 |
| US11921049B2 (en) * | 2018-11-09 | 2024-03-05 | Shaofeng Ding | Pyrophosphorolysis activated fluorescence to measure PAP amplification of nucleic acid |
| CN110004219A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-07-12 | 格尚微(上海)生物科技有限公司 | 一种egfr t790m和c797s顺式突变的检测方法 |
| WO2021151395A1 (zh) * | 2020-01-30 | 2021-08-05 | 上海快灵生物科技有限公司 | 基于双标记寡核苷酸探针熔解曲线的多重检测靶核苷酸序列的方法及其试剂盒 |
| CN111647650B (zh) * | 2020-07-06 | 2023-06-27 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100068711A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-03-18 | Xenomics, Inc. | Methods of PCR-Based Detection of "Ultra Short" Nucleic Acid Sequences |
| JP2014513963A (ja) | 2011-05-04 | 2014-06-19 | バイオセプト インコーポレイティッド | 核酸配列変種を検出するための方法 |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6180338B1 (en) * | 1992-08-04 | 2001-01-30 | Beckman Coulter, Inc. | Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences |
| US5767259A (en) * | 1994-12-27 | 1998-06-16 | Naxcor | Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains |
| ATE295427T1 (de) * | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
| US6399304B1 (en) * | 1996-12-20 | 2002-06-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules |
| US5928869A (en) * | 1997-05-30 | 1999-07-27 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids by fluorescence quenching |
| US20030165888A1 (en) * | 2001-07-18 | 2003-09-04 | Brown Bob D. | Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes |
| CA2384838C (en) * | 1999-09-13 | 2006-07-18 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences |
| US6379888B1 (en) | 1999-09-27 | 2002-04-30 | Becton, Dickinson And Company | Universal probes and methods for detection of nucleic acids |
| GB9928884D0 (en) * | 1999-12-08 | 2000-02-02 | Nmt Group Plc | Closure assembly |
| WO2002061133A2 (en) * | 2000-11-09 | 2002-08-08 | Yale University | Nucleic acid detection using structured probes |
| US6479244B1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-11-12 | Galileo Genomics | Method for genotyping microsatellite DNA markers |
| US7163790B2 (en) * | 2001-11-28 | 2007-01-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction |
| EP1448793B1 (en) * | 2001-12-08 | 2008-09-03 | Seegene, Inc. | Annealing control primer and its uses |
| JP2004081051A (ja) * | 2002-08-23 | 2004-03-18 | Srl Inc | ラミブジン耐性ｂ型肝炎ウイルスの測定方法及びそれに用いられる核酸 |
| CA2524572C (en) * | 2003-05-01 | 2018-07-10 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotides comprising a molecular switch having enhanced sensitivity to the presence of a mismatch |
| JP2006166808A (ja) * | 2004-12-16 | 2006-06-29 | Olympus Corp | 塩基配列解析用プローブ及び塩基配列解析用固相化担体、並びに塩基配列解析方法 |
| US7504218B2 (en) * | 2005-02-09 | 2009-03-17 | Stratagene California | Key probe compositions and methods for polynucleotide detection |
| WO2006095941A1 (en) * | 2005-03-05 | 2006-09-14 | Seegene, Inc. | Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide |
| WO2007106534A2 (en) * | 2006-03-14 | 2007-09-20 | Harbor-Ucla Research And Education Institute | Selective amplification of minority mutations using primer blocking high-affinity oligonucleotides |
| ES2345954T3 (es) * | 2006-05-12 | 2010-10-06 | Cepheid | Deteccion de la union de recombinacion de adn. |
| JP5142244B2 (ja) * | 2006-10-05 | 2013-02-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 新規蛍光標識核酸 |
| GB0703996D0 (en) * | 2007-03-01 | 2007-04-11 | Oxitec Ltd | Nucleic acid detection |
| JP5424903B2 (ja) * | 2007-03-08 | 2014-02-26 | バイオファイアー ダイアグノスティックス，インコーポレイテッド | 融解解析のためのプライマー |
| US8071338B2 (en) * | 2007-08-08 | 2011-12-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Suppression of amplification using an oligonucleotide and a polymerase significantly lacking 5′-3′ nuclease activity |
| CN101280338B (zh) * | 2007-12-13 | 2011-08-17 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种检测核酸多态性的核酸扩增方法 |
| US9534255B2 (en) | 2008-12-17 | 2017-01-03 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants |
| JP5805064B2 (ja) * | 2009-03-27 | 2015-11-04 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 対立遺伝子変種を検出するための方法、組成物、およびキット |
| US8409802B2 (en) * | 2009-08-14 | 2013-04-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Format of probes to detect nucleic acid differences |
| WO2011027966A2 (en) * | 2009-09-03 | 2011-03-10 | Seegene, Inc. | Td probe and its uses |
| DE102010025496A1 (de) * | 2009-10-09 | 2011-04-21 | Universität Duisburg-Essen | Verfahren zur Detektion von Genveränderungen, insbesondere Mutationen |
| EP2646550B1 (en) * | 2010-12-02 | 2015-02-18 | Keygene N.V. | Targeted alteration of dna with oligonucleotides |
-
2012
- 2012-05-04 BR BR112013028296-7A patent/BR112013028296B1/pt active IP Right Grant
- 2012-05-04 AU AU2012250516A patent/AU2012250516B2/en active Active
- 2012-05-04 EP EP18172421.2A patent/EP3382039B1/en active Active
- 2012-05-04 EP EP12779445.1A patent/EP2705162B1/en active Active
- 2012-05-04 JP JP2014509501A patent/JP6404118B2/ja active Active
- 2012-05-04 KR KR1020197022982A patent/KR102252447B1/ko active IP Right Grant
- 2012-05-04 KR KR1020137032060A patent/KR102010601B1/ko active IP Right Grant
- 2012-05-04 CN CN201810150712.XA patent/CN108220406B/zh active Active
- 2012-05-04 WO PCT/US2012/036678 patent/WO2012151560A2/en active Application Filing
- 2012-05-04 KR KR1020217014073A patent/KR20210056458A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-05-04 CN CN201280032293.0A patent/CN103635593B/zh active Active
-
2013
- 2013-03-15 US US13/841,842 patent/US9834817B2/en active Active
-
2017
- 2017-10-30 US US15/796,982 patent/US10745749B2/en active Active
- 2017-11-27 AU AU2017268486A patent/AU2017268486B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-19 JP JP2018080526A patent/JP6734887B2/ja active Active
-
2020
- 2020-02-21 AU AU2020201291A patent/AU2020201291B2/en active Active
- 2020-07-10 JP JP2020119137A patent/JP7111773B2/ja active Active
- 2020-07-13 US US16/927,353 patent/US20200340052A1/en active Pending
-
2021
- 2021-07-15 US US17/376,575 patent/US20220017957A1/en active Pending
-
2022
- 2022-07-21 JP JP2022116372A patent/JP2022137291A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100068711A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-03-18 | Xenomics, Inc. | Methods of PCR-Based Detection of "Ultra Short" Nucleic Acid Sequences |
| JP2014513963A (ja) | 2011-05-04 | 2014-06-19 | バイオセプト インコーポレイティッド | 核酸配列変種を検出するための方法 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7111773B2 (ja) | 核酸配列変種を検出するための方法 | |
| US10975419B2 (en) | Probes for improved melt discrimination and multiplexing in nucleic acid assays | |
| US11965212B2 (en) | Nucleic acid detection combining amplification with fragmentation | |
| US11261481B2 (en) | Probes for improved melt discrimination and multiplexing in nucleic acid assays | |
| JP2007282512A (ja) | セルフアニーリング形成を阻害する方法およびその用途 | |
| EP4097230A1 (en) | Method for quantitating nucleic acid library |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200807 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200807 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201020 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201009 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20210304 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210913 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211126 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220210 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220308 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220523 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220617 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220721 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7111773 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |