KR20210056458A - 핵산 서열 변이체를 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 영역 내의 핵산 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 셀렉터(selector) 차단제의 존재 하에서 표적 영역을 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 증폭하는 단계를 포함한다. 상기 셀렉터 차단제는 상기 핵산 변이체의 부재 하에서 상기 표적 영역에 상보적인 서열을 포함한다. 상기 방법은 상기 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 표적 영역의 증폭은 상기 표적 영역 내의 상기 핵산 변이체의 존재를 표시한다. 상기 핵산 변이체는 결실, 돌연변이 또는 삽입을 포함할 수 있다.

Description

핵산 서열 변이체를 검출하는 방법{METHODS FOR DETECTING NUCLEIC ACID SEQUENCE VARIANTS}
본 발명은 표적 핵산 서열 내의 핵산 변이체를 검출하는 방법, 및 고충실도(high-fidelity) 서열 증폭 방법에 관한 것이다.
핵산 변이체의 검출은 다양한 상황과 관련하여 중요하고, 질환의 검출 및 예후와 관련하여 임상적으로 중요하다. 핵산 변이체를 검출하기 위한 광범위한 어세이 포맷이 현재 존재한다. 이러한 어세이는 피로인산분해(pyrophosphorolysis)-활성화된 중합(PAP), LNA 차단제를 사용하는 어세이 및 캐스트(cast)-PCR 어세이를 포함한다.
피로인산분해-활성화된 중합(PAP)은 돌연변이 적재를 측정하거나 최소 잔류 질환을 검출하는 데에 이용될 수 있다. PAP에서, 피로인산분해 및 DNA 중합효소에 의한 중합은 피로인산분해-활성화가능한 올리고뉴클레오티드(P*)를 사용함으로써 연속적으로 커플링된다. 활성화된 P*는 DNA 중합에 의해 연장될 수 있다. 유의한 비특이적 증폭으로서 피로인산분해 및 중합 둘다로부터의 어세이 결과의 특이성은 매우 드문 사건인, DNA 중합효소에 의한 불일치 피로인산분해와 잘못된 도입의 조합을 필요로 한다. (예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Liu and Sommer, "Pyrophosphorolysis-activated polymerization (PAP): application to allele-specific amplification," Biotechniques, 29(5):1072-6, 1078, 1080 (2000))을 참조한다.)
LNA 차단제는 야생형 핵산이 더 풍부하게 존재하는 핵산 집단에서 핵산 변이체를 검출하고/하거나 정량하는 방법에서 사용될 수도 있다. 이러한 방법은 소수의 서열 또는 돌연변이체 서열보다는 오히려 야생형에 표적화되고 야생형 DNA의 검출을 차단하는 기능을 하는 짧은 고친화성 올리고뉴클레오티드를 사용한다. LNA 차단제 프로브는 소수의 서열 또는 돌연변이체 서열을 증폭하고/하거나 확인하는 데에 있어서 보다 긴 검출 프로브 또는 PCR 프라이머와 함께 사용될 수 있다. (예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제20100009355호를 참조한다.)
캐스트-PCR은 상이한 대립형질들 사이의 서열 변이를 분석하기 위한 어세이로서 이용될 수도 있다. 이 방법은 핵산 변이체들을 구별하기 위해 경쟁 대립형질 특이적 TaqMan PCR("캐스트-PCR")을 이용한다. 캐스트-PCR은 표적 핵산 서열에 대해 2종의 증폭 반응을 수행하는 단계를 이용한다. 제1 반응은 제1 대립형질 특이적 프라이머, 및 제1 대립형질 변이체에 상보적인 제1 대립형질 특이적 차단제의 존재 하에서의 증폭에 이어서 증폭 생성물의 검출을 포함한다. 제2 반응은 제2 대립형질 특이적 프라이머, 및 제2 대립형질 변이체에 상보적인 제2 대립형질 특이적 차단제의 존재 하에서의 증폭에 이어서 증폭 생성물의 검출을 포함한다. (예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제20100221717호를 참조한다).
상기 방법들 모두가 다양한 과제 및 한계를 갖는다. 드문 변이체를 검출하는 데에 있어서 이들 방법들의 공통된 문제점은 낮은 효소 정확성이다. 복제 및 관련 증폭 동안 도입된 오류는 실제 드문 변이체 및 돌연변이로부터 용이하게 구별될 수 없으므로 이들 방법들의 성능을 손상시킨다. 또한, 대립형질 특이적 프라이밍, 예컨대, 증폭 불응성 돌연변이 시스템의 경우(ARMS, Nucleic Acids Res. 17:2503-16 (1989)), 증폭 동안의 잘못된 프라이밍은 변이체 부위를 "겹쳐 쓸 수 있고" 좋지 않은 결과를 초래할 수 있다. 대다수의 경우 상기 방법들의 특이성은 0.1% 내지 5%의 대립형질 발생률로 한정된다. 이것은 차세대 서열분석 방법을 이용한 경우조차도 그러한데, 이는 사용된 중합효소가 드문 대립형질의 검출의 민감도를 약 3% 내지 5%로 한정하기에 충분한 오류를 도입하기 때문이다. 이들 어세이들 모두가 갖는 핵심적인 어려움은 그들의 부정확성으로 인해 중합효소에 따라 1% 내지 3%의 범위 또는 그 이상의 고유 배경을 생성하는 오류를 도입하는 DNA 중합효소를 사용하는 증폭 방법이 상기 어세이들의 핵심이라는 점이다. 몇몇 방법들, 예컨대, 디지털 PCR은 훨씬 더 높은 수준의 특이성을 제공할 수 있으나, 이들 방법들은 복잡하고 비싸며 확인 또는 진단 어세이에 용이하게 접속되지 않는다. 또한, 디지털 PCR은 고수준의 다중화에 적합하지 않다.
드문 핵산 서열 변이체를 보다 효과적으로 검출할 수 있는 추가 어세이 방법이 당분야에서 필요하다. 나아가, 중합효소 관련 증폭 시스템과 관련된 도입 오류를 감소시키는 방법이 필요하다. 추가 어세이가 개발될 필요가 있고, 본 발명의 방법은 이러한 추가 어세이 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 표적 영역 내의 핵산 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 셀렉터(selector) 차단제의 존재 하에서 표적 영역을 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 증폭하는 단계를 포함한다. 셀렉터 차단제는 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역에 상보적인 서열을 포함한다. 상기 방법은 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 표적 영역의 증폭은 표적 영역 내의 핵산 변이체의 존재를 표시한다. 핵산 변이체는 결실, 돌연변이 또는 삽입을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 >1:1000의 민감도를 제공할 수도 있다(즉, 표적 영역 내의 1 카피의 핵산 변이체가 1000 카피의 야생형 표적 영역의 존재 하에서 검출될 수 있다). 몇몇 실시양태들에서, 민감도는 >1:1500, >1:2000, >1:2500, >1:3000, >1:3500 또는 >1:4000, >1:5000, >1:10,000, >1:20,000, >1:50,000, >1:100,000, >1:120,000, >1:150,000, >1:200,000, >1:250,000, >1:500,000, >1:750,000, >1:1,000,000, 또는 그 이상의 민감도이다.
상기 방법은 셀렉터 차단제와 함께 레포터(reporter) 프로브를 사용하는 단계도 추가로 포함할 수 있다. 레포터 프로브는 증폭의 존재 하에서 제1 신호를 제공하고 증폭의 부재 하에서 제2 신호를 제공한다.
본 발명은 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 셀렉터 차단제, 및 핵산 변이체를 갖기 쉬운(susceptible) 표적 영역을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물도 제공한다. 셀렉터 차단제는 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역에 상보적인 서열을 포함한다. 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 표적 영역을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드의 영역을 증폭하는 데에 유용하다. 반응 혼합물은 레포터 프로브를 추가로 포함할 수 있고, 이때 레포터는 증폭의 존재 하에서 제1 신호를 제공하고 증폭의 부재 하에서 제2 신호를 제공한다.
본 발명은 고충실도 증폭을 수행하는 방법도 제공하고, 이러한 방법은 몇몇 실시양태들에서 핵산 표적 영역의 증폭에서 고충실도 중합효소와 함께 핵산분해효소(nuclease) 내성 프라이머를 사용하는 단계를 포함한다.
본 발명은 키트도 제공한다. 본 발명에 의해 고려되는 키트는 정방향 프라이머 및 셀렉터 차단제를 포함할 수 있다. 셀렉터 차단제는 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역에 상보적인 서열을 함유한다. 정방향 프라이머는 표적 영역의 업스트림(upstream)에 위치하는 영역에 상보적인 서열을 포함한다. 상기 키트는 역방향 프라이머 및 레포터 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 핵산분해효소 내성 프라이머, 고충실도 중합효소 및 3' 핵산말단분해효소(exonuclease) 활성을 포함하는 복구 효소를 포함하는 키트도 고려된다.
도 1: 본원에 기재된 셀렉터 어세이 방법의 개략도.
도 2: 본원에 기재된 셀렉터 플러스 어세이 방법의 개략도.
도 3: EGFR T790M 돌연변이 검출을 위한 셀렉터 어세이 디자인.
도 4: 셀렉터 A 및 레포터 A를 사용하였을 때 합성 돌연변이체 또는 야생형 표적에 대한 용융 곡선 프로파일은 돌연변이체 합성 표적의 경우 용융 온도의 유의한 감소(약 13℃)가 있다는 것을 보여준다.
도 5: 앰플리택(AmpliTaq)® DNA 중합효소 스토펠(Stoffel) 단편을 사용한 셀렉터 어세이. NTC(주형 부재 대조군), 100 pg H1975(돌연변이체) 또는 10 ng WBC17088(야생형) DNA가 앰플리택® DNA 중합효소 스토펠 단편을 사용한 셀렉터 어세이에서 사용되었다.
도 6: 카파(Kapa) HS 효소를 사용한 셀렉터 어세이. NTC(주형 부재 대조군); 6.6 ng WBC 17088(야생형); 또는 6.6 ng WBC17088(야생형)과 함께 14 pg 또는 28 pg H1975(돌연변이체) DNA가 카파 HS DNA 중합효소를 사용한 셀렉터 어세이에서 사용되었다.
도 7: EGFR T790M 돌연변이 검출을 위한 셀렉터 플러스 어세이. 셀렉터 플러스 어세이는 과량의 야생형 배경에서 돌연변이체 주형의 존재를 확인하도록 디자인된 3개의 단계로 구성된다: 1) PCR 생성물을 축적하는 실시간 검출; 2) 용융 곡선 분석; 및 3) 서열분석.
도 8: 용융 곡선 분석 및 서열분석을 위한 증폭된 이미노바이오틴 표지된 가닥의 단리.
도 9: 셀렉터™ 어세이는 정량적이고 과량의 야생형 주형의 존재는 T790M 돌연변이체 증폭에 최소한으로 영향을 미친다.
도 10: 셀렉터에 의한 야생형 증폭의 억제.
도 11: 도 11a) 임상 폐암 혈장 샘플로부터의 핵산에서 EGFR T790M 확인. 도 11b) 증폭 데이터의 표준 곡선.
도 12: 임상 폐암 혈장 샘플로부터 제조된 cDNA를 사용한 셀렉터 어세이.
도 13: 도 13a) 전혈에서 H1975 세포의 스파이크(spike) 및 회수 후 바이오셉트(Biocept)의 CEE™ 마이크로채널을 밀어내는 물질을 사용한 셀렉터 어세이. 도 13b) 스파이크 및 회수 셀렉터 어세이 반응의 용융 곡선 분석 및 생거(Sanger) 서열분석.
도 14: 도 14a) 전혈에서 H1975의 스파이크 및 회수 실험으로부터 전체 게놈 증폭된(WGA) 물질을 사용한 셀렉터 어세이. 도 14b) WGA 물질을 사용한 셀렉터™ 어세이 반응의 서열분석.
도 15: 도 15a) 셀렉터와 중첩되는 정방향 프라이머(FP14ovl)를 사용한 셀렉터 어세이. 도 14b) 셀렉터의 부재 하에서 야생형 주형을 사용하거나(패널 A) 야생형 주형과 50 pg H1975의 혼합물을 사용한(패널 B) 셀렉터 어세이 반응을 서열분석하여 생성물의 본질을 확인하였다. T790M 특이적 돌연변이(CAT)의 위치가 표시되어 있다. 셀렉터 결합의 영역은 서열 아래에 상자로 표시되어 있다.
도 16: 셀렉터의 존재 하에서 야생형 주형을 사용하여 앰플리택 골드 DNA 중합효소로 수행한 T790M 셀렉터™ 어세이 반응의 생거 서열분석.
도 17. FAM-표지된 차단제 및 LC-레드(Red) 640-표지된 고착제(anchor)를 사용한 셀렉터™ 어세이.
도 18: KRAS G12C 돌연변이에 대한 셀렉터 어세이.
도 19: 2개의 S18 스페이서를 사용하는 스위치-차단제 구축물. 이 디자인은 T790M 관련 돌연변이를 우선적으로 증폭하기 위한, 실시예 15 및 16에 기재된 디자인이다.
도 20: 변이체 대립형질 구별을 증가시키기 위해 5-니트로인돌 "가교"를 사용하는 스위치-차단제. 이 디자인은 T790M과 관련된 변이체 대립형질에 대한 우선적인 증폭을 보여준다. 또한, 상기 디자인은 쌍을 이룬 소광제(quencher)와 형광 표지(혼성화 시 증가하는 형광)를 사용하는 자체 보고 배열을 보여준다.
도 21: 예시적 플립(Flip) 프로브 디자인의 개략도.
본 발명의 방법은 부분적으로 차단제 프로브가 매우 높은 민감도, 몇몇 경우 >1:1000의 민감도, 몇몇 경우 >1:2000의 민감도로 핵산 변이체를 검출하는 데에 사용될 수 있다는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 표적 영역 내의 핵산 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 셀렉터 차단제의 존재 하에서 표적 영역을 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 증폭하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역에 상보적인 서열을 포함한다. 상기 방법은 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 표적 영역의 증폭은 표적 영역 내의 핵산 변이체의 존재를 표시한다.
몇몇 실시양태들에서, 본 발명의 방법의 민감도는 >1:1000이다(즉, 1000 카피의 표적 영역 중에서 1 카피의 표적이 검출될 수 있다). 몇몇 실시양태들에서, 민감도는 >1:1500, >1:2000, >1:2500, >1:3000, >1:3500 또는 >1:4000, >1:5000, >1:10,000, >1:20,000, >1:50,000, >1:100,000, >1:120,000, >1:150,000, >1:200,000, >1:250,000, >1:500,000, >1:750,000, >1:1,000,000, 또는 그 이상의 민감도이다. 몇몇 실시양태들에서, 1 카피의 표적 핵산, 예컨대, 핵산 변이체는 적어도 약 1000, 약 1500, 약 2000, 약 2500, 약 3000, 약 3500, 약 4000, 약 5,000, 약 10,000, 약 20:000, 약 50:000, 약 100,000, 약 120,000, 약 150,000, 약 200,000, 약 250,000, 약 500,000, 약 750,000, 약 1,000,000, 또는 그 이상의 카피의 야생형 핵산의 존재 하에서 검출될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, "증폭의 존재" 및 유사한 용어 및 어구는 증폭뿐만 아니라 보다 많은, 향상된 또는 증가된 증폭도 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, "증폭의 부재" 및 유사한 용어 및 어구는 증폭의 부재뿐만 아니라 보다 적은, 저하된 또는 감소된 증폭도 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태들에서, 상기 방법은 셀렉터 차단제의 존재 하에서 표적 영역을 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 증폭하는 단계를 포함한다. 이들 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 핵산 변이체의 존재 하에서 표적 영역에 상보적인 서열을 포함한다. 상기 방법은 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 표적 영역의 증폭은 표적 영역 내의 핵산 변이체의 부재를 표시한다. 다른 실시양태들에서, 핵산분해효소 내성 프라이머가 고충실도 중합효소, 및 3' 핵산말단분해효소 복구 활성을 보유하는 복구 효소와 함께 사용된다.
핵산 서열을 증폭하는 일반적인 방법은 잘 기재되어 있고 당분야에서 잘 공지되어 있다. 임의의 이러한 방법은 본 발명의 방법과 함께 이용될 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 증폭은 디지털 PCR 방법, 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Vogelstein and Kinzler, "Digital PCR," PNAS, 96:9236-9241 (1999))에 기재된 디지털 PCR 방법을 이용한다. 이러한 방법은 표적 영역의 증폭 전에 표적 영역을 함유하는 샘플을 희석하는 단계를 포함한다. 희석은 통상적인 플레이트, 다중웰 플레이트 또는 나노웰 내로의 희석뿐만 아니라 마이크로패드 상으로의 희석 또는 마이크로소적으로서의 희석도 포함할 수 있다. (예를 들면, 문헌(Beer NR, et al., "On-chip, real-time, single-copy polymerase chain reaction in picoliter droplets," Anal. Chem. 79(22):8471-8475 (2007)); 문헌(Vogelstein and Kinzler, "Digital PCR," PNAS, 96:9236-9241 (1999)); 및 문헌(Pohl and Shih, "Principle and applications of digital PCR," Expert Review of Molecular Diagnostics, 4(1):41-47 (2004))(이들 모두 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)을 참조한다). 몇몇 실시양태들에서, 증폭은 디지털 PCR에 의한 증폭이다.
몇몇 경우, 표적 영역의 증폭을 위해 본 발명의 방법에서 사용되는 효소는 고충실도 DNA 중합효소, 예를 들면, 3'-5' 핵산말단분해효소 교정(proof-reading) 성능을 갖는 DNA 중합효소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 방법에서 사용될 수 있는 효소의 예에는 앰플리택, 푸젼(Phusion) HS II, 딥 벤트(Deep Vent) 및 카파 HiFi DNA 중합효소가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 핵산 변이체는 표적 영역 내의 결실, 표적 영역 내의 돌연변이 및/또는 표적 영역 내의 삽입을 포함한다. 결실은 표적 영역으로부터의 뉴클레오티드 염기의 제거를 포함한다. 검출될 수 있는 결실은 표적 영역으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 뉴클레오티드 염기의 결실을 포함한다. 돌연변이는 치환(예컨대, 전환 및 전이), 무염기(abasic) 부위, 가교된 부위 및 화학적으로 변경된 또는 변형된 염기를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 검출될 수 있는 돌연변이는 표적 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 뉴클레오티드 염기의 돌연변이를 포함한다. 삽입은 표적 영역 내로의 뉴클레오티드의 추가를 포함한다. 검출될 수 있는 삽입은 표적 영역 내로의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 뉴클레오티드 염기의 삽입을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 결실, 돌연변이 및/또는 삽입은 본 발명의 방법에 의해 검출된다.
본 발명의 방법은 셀렉터 차단제의 사용도 포함할 수 있다. 일반적으로, 셀렉터 차단제는 핵산 변이체를 갖기 쉬운 표적 영역에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명에 따르면, 셀렉터 차단제 내의 상보적인 서열은 임의의 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역에 전체적으로 상보적일 수 있거나, 표적 영역이 핵산 변이체를 갖는 경우를 제외하고 상기 표적 영역에 상보적(즉, 부분적으로 상보적)일 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 표적 영역에 상보적이지만, 표적 영역 내의 하나 이상의 핵산 변이체에는 상보적이지 않는 서열을 포함한다. 몇몇 다른 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 표적 영역에 상보적이지만, 표적 영역 내의 2개 이상의 핵산 변이체에는 상보적이지 않는 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 셀렉터 차단제는 표적 영역에 상보적이지만, 표적 영역 내의 핵산 변이체의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상에는 상보적이지 않는 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 셀렉터 차단제는 표적 영역에 상보적이지만, 이러한 불일치가 하나 이상의 핵산 변이체의 존재와 부재 사이의 검출가능한 증폭 차이를 제공하기에 충분한 정도까지 일부 핵산 변이체들에는 상보적이지 않는 서열을 포함한다.
상기 방법은 셀렉터-차단제가 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역과 상호작용하는 경우와 셀렉터-차단제가 핵산 변이체의 존재 하에서 표적 영역과 상호작용하는 경우 사이의 Tm 차이의 측정도 제공한다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터-차단제가 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역과 상호작용하는 경우와 셀렉터-차단제가 핵산 변이체의 존재 하에서 표적 영역과 상호작용하는 경우 사이의 Tm 차이는 최대화된다. 몇몇 실시양태들에서, 상기 Tm 차이는 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃ 또는 20℃ 이상이다. 몇몇 실시양태들에서, 상기 Tm 차이는 10℃ 내지 15℃, 11℃ 내지 14℃ 또는 12℃ 내지 13℃이다. 몇몇 실시양태들에서, 상기 Tm 차이는 2℃ 내지 3℃일 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 핵산 변이체의 부재 하에서의 표적 영역과 핵산 변이체의 존재 하에서의 표적 영역 사이의 Tm 차이가 높을수록, 핵산의 부재 하에서의 표적 영역의 증폭과 핵산의 존재 하에서의 표적 영역의 증폭 사이의 차이가 더욱 현저하다.
상보성은 용융 온도(Tm)와 관련하여 기재될 수도 있고, 이때 상보성은 예를 들면, 다른 서열에 비해 상대적으로 더 상보적이지만 서열이 전체적으로 상보적이지 않은 서열을 포함하는, 보다 더 상보적인 서열 및 보다 덜 상보적인 서열(즉, 전체적으로 상보적인 서열 및 부분적으로 상보적인 서열)의 구배를 의미한다. 보다 더 상보적인 서열은 일반적으로 보다 덜 상보적인 서열보다 더 높은 Tm을 나타낸다(즉, 98%의 상보성을 나타내는 서열은 40%의 상보성을 나타내는 서열보다 더 높은 Tm을 가질 것이다). 본 발명의 방법에서, 일반적으로 보다 높은 서열 상보성을 나타내는 서열은 표적 영역과 상호작용할 때 보다 높은 Tm을 나타낼 것이다.
몇몇 실시양태들에서, 예컨대, 서열이 특히 G/C 또는 A/T 풍부 서열인 경우, Tm 및 상보성은 역전될 수 있다(예를 들면, 보다 높은 상보성을 갖지만 A/T가 풍부한 서열은 보다 낮은 상보성을 갖지만 G/C가 풍부한 서열보다 더 낮은 Tm을 가질 수 있다). 본 발명의 방법은 Tm과 서열 사이의 상호작용에 관한 이러한 정보가 당분야에서 잘 공지되어 있고 당업자가 본 방법을 적절히 용이하게 채택할 수 있기 때문에 여전히 적용가능할 것이다.
본 발명에 따르면, 셀렉터 차단제는 "스위치 서열"로서 지칭된 핵산 서열을 포함하도록 구성될 수도 있다. 본 발명의 방법에서 기재된 바와 같이 스위치 서열을 포함하는 셀렉터 차단제는 "스위치-차단제"로서도 지칭된다.
스위치-차단제의 스위치 서열은 스위치-차단제의 5' 영역에 위치하고 5개 이상의 뉴클레오티드, 예를 들면, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개 또는 25개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 짧은 핵산 서열이다. 스위치 서열은 표적 영역에 고친화성으로 결합한다. 몇몇 실시양태들에서, 스위치 서열은 하나 이상의 핵산 변이체를 함유하는 표적 영역의 부분에 결합한다. 몇몇 실시양태들에서, 스위치 서열과 표적 서열 사이의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 이상의 핵산 변경(예를 들면, 불일치, 결실, 삽입 또는 돌연변이)은 하나 이상의 핵산 변이체의 존재와 부재 사이의 검출가능한 증폭 차이를 야기하기에 충분하다. 몇몇 실시양태들에서, 스위치 서열과 표적 서열 사이의 서열 차이(들)는 스위치 서열과 표적 서열의 결합을 파괴하거나 방해하기에 충분하다. 몇몇 실시양태들에서, 스위치 서열은 핵산 변이체가 발생하는 하나 이상의 위치를 포함하는 표적 영역에 (전체적으로 또는 부분적으로) 상보적이다. 몇몇 다른 실시양태들에서, 스위치 서열은 핵산 변이체가 발생하는 하나 이상의 위치를 제외하고 표적 영역에 (전체적으로 또는 부분적으로) 상보적이다.
몇몇 실시양태들에서, 스위치-차단제는 "긴 혼성화 영역"으로서 지칭되는, 표적 영역에 상보적인 보다 긴 핵산 서열에 연결된 스위치 서열을 포함한다. 긴 혼성화 영역은 길이에 있어서 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 긴 혼성화 영역은 표적 영역에 인접한 또는 가까운 상보성 영역에 결합함으로써 스위치-차단제를 핵산 서열의 표적 영역에 표적화한다. 스위치 서열은 본원에 기재된 연결 또는 접합 방법의 이용을 통해, 가교형성 뉴클레오티드 서열을 통해 또는 당분야에서 공지된 임의의 다른 연결 또는 접합 방법을 통해 긴 혼성화 영역에 연결될 수 있거나 접합될 수 있다.
핵산들, 예를 들면, 스위치 서열 및 긴 혼성화 영역은 다양한 방법들에 의해 서로 연결될 수 있거나 접합될 수 있다. 핵산 서열들의 연결 또는 접합은 다양한 연결 모이어티들(moieties) 및 접합 방법들(이들의 다양한 예가 당분야에서 잘 공지되어 있고 이들 중 임의의 연결 모이어티 및 접합 방법이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있음)을 통해 달성될 수 있다. 연결 또는 접합은 개별 핵산 요소들의 합성 및 통상적인 접합 방법을 이용한 이들의 접합에 의해 달성될 수 있다(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2001-2011; and Bioconjugate Techniques, 2nd Ed., Hermanson G., T., Academic Press, Inc., 2008). 이러한 방법은 제로-길이 가교제, 동종이작용성 가교제, 이종이작용성 가교제(예를 들면, NHS/말레이미드 이종이작용성 링커), 삼작용성 가교제 및 광반응성 가교제를 포함할 수 있다. 동종이작용성 가교제는 예를 들면, 아민-대-아민 가교제, 설프하이드릴-대-설프하이드릴 가교제 및 티올-대-티올 가교제를 포함할 수 있다. 이종이작용성 가교제는 예를 들면, 아민-대-설프하이드릴 가교제, 카복실-대-아민 가교제, 설프하이드릴-대-탄수화물 가교제, 설프하이드릴-대-하이드록실 가교제, 아민-대-티올 가교제 및 아민-대-카복실산 가교제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 정방향 프라이머 및 셀렉터 차단제는 이들이 원하는 가교제와 함께 사용되기에 적합한 기를 함유하도록 합성된다. 몇몇 실시양태들에서, 정방향 프라이머 및 셀렉터 차단제는 스페이서 포스포르아미다이트 12 및 18(글렌 리서치(Glen Research))을 포함하나 이들로 한정되지 않는 3' 포스포르아미다이트, 5' 포스포르아미다이트 및 포스포르아미다이트 링커의 조합물의 사용을 통해 합성된다.
링커(linker) 및 가교제의 예에는 C18 이산(diacid)-기제 가교제(예컨대, 다이아크릴레이트 및 다이메타크릴레이트 가교제); Z 요소; 비스[설포석신이미딜] 수베레이트(BSSS 또는 BS3); 다이석신이미딜 수베레이트(DSS); 비스[설포석신이미딜] 글루타레이트(BS2G); 다이티오비스[석신이미딜 프로피오네이트](DTSP 또는 DSP); (3,3'-다이티오비스[설포석신이미딜프로피오네이트])(DTSSP); 다이석신이미딜 글루타레이트(DSG); 에틸렌 글리콜비스(설포석신이미딜석시네이트); 에틸렌 글리콜비스(석신이미딜석시네이트); 다이석신이미딜 타르트레이트; 및 NHS/말레이미드 이종이작용성 링커, 아릴 아지드, 벤조페논 유도체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
가교형성(bridging) 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 내의 인접 뉴클레오티드 서열과 정렬되지만 와슨-크릭(Watson-Crick) 수소결합 상호작용을 통해 표적의 상보적인 염기에 결합하지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 염기는 데옥시이노신 및 5-니트로인돌-2'-데옥시리보사이드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명은 스위치-차단제 내로의 검출가능한 표지의 도입도 제공한다. 몇몇 실시양태들에서, 스위치-차단제는 레포터 프로브로서 작용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 셀렉터 차단제는 연장될 수 있거나 연장될 수 없다. 몇몇 경우 셀렉터 차단제는 3' 또는 5' 핵산말단분해효소 활성으로부터 보호되도록 당분야에서 공지된 다양한 방법들에 의해 변경될 수 있다. 셀렉터 차단제는 3' 또는 5' 핵산말단분해효소 활성으로부터 보호되도록 하나 이상의 변경을 포함할 수도 있고, 이러한 변경은 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 변경, 포스포로티오에이트 골격 변경, 포스포로다이티오에이트 골격 변경, 포스포르아미데이트 골격 변경, 메틸포스포네이트 골격 변경, 3' 말단 포스페이트 변경 및 3' 알킬 치환을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 하나 이상의 변경의 존재로 인해 3' 및/또는 5' 핵산말단분해효소 활성에 대한 내성을 나타낸다.
본 발명의 방법은 표적 서열에 대한 증가된 친화성을 갖는 셀렉터 차단제의 사용도 제공한다. 이러한 셀렉터 차단제는 증가된 길이뿐만 아니라 셀렉터 차단제에 대한 화학적 변경도 갖는 셀렉터 차단제를 포함할 수 있다. 이러한 변경은 2' 플루오로(2'-데옥시-2'-플루오로-뉴클레오사이드) 변경, LNA(잠긴(locked) 핵산), PNA(펩티드 핵산), ZNA(지프(Zip) 핵산), 모르폴리노, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 다가양이온성 접합체 및 2' 피렌 변경을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 2' 플루오로 변경(2'-데옥시-2'-플루오로-뉴클레오사이드로도 공지되어 있음), LNA(잠긴 핵산), PNA(펩티드 핵산), ZNA(지프 핵산), 모르폴리노, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및/또는 다가양이온성 접합체를 포함하는 하나 이상의 변경을 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 PNA 또는 LNA를 함유하지 않는다.
셀렉터 차단제는 검출가능한 물질(entity)도 함유할 수 있다. 이러한 검출가능한 물질은 예를 들면, 형광 표지 및 발광 표지를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 검출가능한 물질은 FRET 쌍의 구성원도 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 검출가능한 물질을 함유한다.
형광 표지는 AMCA, DEAC(7-다이에틸아미노쿠마린-3-카복실산); 7-하이드록시-4-메틸쿠마린-3; 7-하이드록시쿠마린-3; MCA(7-메톡시쿠마린-4-아세트산); 7-메톡시쿠마린-3; AMF(4'-(아미노메틸)플루오레세인); 5-DTAF(5-(4,6-다이클로로트라이아지닐)아미노플루오레세인); 6-DTAF(6-(4,6-다이클로로트라이아지닐)아미노플루오레세인); 6-FAM(6-카복시플루오레세인), 5(6)-FAM 카다베린; 5-FAM 카다베린; 5(6)-FAM 에틸렌다이아민; 5-FAM 에틸렌다이아민; 5-FITC(FITC 이성질체 I; 플루오레세인-5-이소티오시아네이트); 5-FITC 카다베린; 플루오레세인-5-말레이미드; 5-IAF(5-요오도아세트아미도플루오레세인); 6-JOE(6-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시플루오레세인); 5-CR110(5-카복시로다민 110); 6-CR110(6-카복시로다민 110); 5-CR6G(5-카복시로다민 6G); 6-CR6G(6-카복시로다민 6G); 5(6)-카록시로다민 6G 카다베린; 5(6)-카록시로다민 6G 에틸렌다이아민; 5-ROX(5-카복시-X-로다민); 6-ROX(6-카복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카복시테트라메틸로다민); 6-TAMRA(6-카복시테트라메틸로다민); 5-TAMRA 카다베린; 6-TAMRA 카다베린; 5-TAMRA 에틸렌다이아민; 6-TAMRA 에틸렌다이아민; 5-TMR C6 말레이미드; 6-TMR C6 말레이미드; TR C2 말레이미드; TR 카다베린; 5-TRITC; G 이성질체(테트라메틸로다민-5-이소티오시아네이트); 6-TRITC; R 이성질체(테트라메틸로다민-6-이소티오시아네이트); 단실(Dansyl) 카다베린(5-다이메틸아미노나프탈렌-1-(N-(5-아미노펜틸))설폰아미드); EDANS C2 말레이미드; 플루오레스카민; NBD; 및 피로메텐 및 이의 유도체를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
화학발광 표지는 서던 블롯 및 웨스턴 블롯 프로토콜에서 사용되는 표지를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd ed.) (2001)) 참조). 예에는 -(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3"-포스포릴옥시)페닐-1,2-다이옥세탄(AMPPD); 아크리디늄 에스테르 및 아다만틸-안정화된 1,2-다이옥세탄, 및 이들의 유도체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 따르면, 정방향 프라이머는 하나 이상의 핵산 변이체를 기준으로 다양한 적합한 위치에 (전체적으로 또는 부분적으로) 상보적이도록 디자인될 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 정방향 프라이머의 3' 영역은 하나 이상의 핵산 변이체의 위치를 기준으로 다양한 위치에서 표적 영역에 (전체적으로 또는 부분적으로) 상보적일 수 있다. 예를 들면, 정방향 프라이머의 3' 영역은 몇몇 경우 표적 영역에 혼성화될 때 표적 영역 내의 하나 이상의 핵산 변이체로부터 0개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개 또는 60개 이상의 뉴클레오티드만큼 떨어져 위치할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 정방향 프라이머의 3' 영역은 표적 영역에 혼성화될 때 표적 영역 내의 하나 이상의 핵산 변이체로부터 약 30개 미만의 뉴클레오티드만큼 떨어져 위치한다.
몇몇 경우, 정방향 프라이머와 셀렉터 차단제는 부분 또는 전체 표적 영역에의 혼성화에 대해 경쟁할 수 있고, 이것은 민감도를 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 정방향 프라이머와 셀렉터 차단제는 0개, 5개, 10개 또는 15개 이상의 뉴클레오티드만큼 중첩될 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 표적 영역에 혼성화하는 정방향 프라이머의 3' 영역은 표적 영역에 혼성화하는 셀렉터 차단제의 5' 영역과 중첩된다. 몇몇 실시양태들에서, 상기 프라이머와 셀렉터 차단제가 셀렉터 차단제의 5' 영역에서 중첩될 때, 중첩 영역은 핵산 변이체(들)를 함유하지 않는다. 정방향 프라이머 및/또는 셀렉터 차단제는 몇몇 경우 3' 또는 5' 핵산말단분해효소 활성으로부터 보호되도록 당분야에서 공지된 다양한 방법들에 의해 변경될 수 있다. 정방향 프라이머 및/또는 셀렉터 차단제는 하나 이상의 변경을 포함할 수 있고, 이러한 변경은 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 변경, 포스포로티오에이트 골격 변경, 포스포로다이티오에이트 골격 변경, 포스포르아미데이트 골격 변경, 메틸포스포네이트 골격 변경, 3' 말단 포스페이트 변경 및 3' 알킬 치환을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태들에서, 정방향 프라이머 및/또는 셀렉터 차단제는 3' 또는 5' 핵산말단분해효소 활성으로부터 보호된다.
몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제 및 정방향 프라이머는 서로 연결되거나 접합되고, 이 조합은 "프라이머-스위치"로서도 지칭된다. 핵산들, 예를 들면, 정방향 프라이머와 셀렉터 차단제는 다양한 방법들에 의해 서로 연결될 수 있거나 접합될 수 있다. 핵산 서열들의 연결 또는 접합은 다양한 연결 모이어티들 및 접합 방법들(이들의 다양한 예가 당분야에서 잘 공지되어 있고 이들 중 임의의 연결 모이어티 및 접합 방법이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있음)을 통해 달성될 수 있다. 연결 또는 접합은 개별 핵산 요소들의 합성 및 통상적인 접합 방법을 이용한 이들의 접합에 의해 달성될 수 있다(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2001-2011; and Bioconjugate Techniques, 2nd Ed., Hermanson G., T., Academic Press, Inc., 2008). 이러한 방법은 제로-길이 가교제, 동종이작용성 가교제, 이종이작용성 가교제(예를 들면, NHS/말레이미드 이종이작용성 링커), 삼작용성 가교제 및 광반응성 가교제를 포함할 수 있다. 동종이작용성 가교제는 예를 들면, 아민-대-아민 가교제, 설프하이드릴-대-설프하이드릴 가교제 및 티올-대-티올 가교제를 포함할 수 있다. 이종이작용성 가교제는 예를 들면, 아민-대-설프하이드릴 가교제, 카복실-대-아민 가교제, 설프하이드릴-대-탄수화물 가교제, 설프하이드릴-대-하이드록실 가교제, 아민-대-티올 가교제 및 아민-대-카복실산 가교제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 정방향 프라이머 및 셀렉터 차단제는 이들이 원하는 가교제와 함께 사용되기에 적합한 기를 함유하도록 합성된다. 몇몇 실시양태들에서, 정방향 프라이머 및 셀렉터 차단제는 스페이서 포스포르아미다이트 12 및 18(글렌 리서치)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 3' 포스포르아미다이트, 5' 포스포르아미다이트 및 포스포르아미다이트 링커의 조합물의 사용을 통해 합성된다.
링커 및 가교제의 예에는 C18 이산(diacid)-기제 가교제(예컨대, 다이아크릴레이트 및 다이메타크릴레이트 가교제); Z 요소; 비스[설포석신이미딜] 수베레이트(BSSS 또는 BS3); 다이석신이미딜 수베레이트(DSS); 비스[설포석신이미딜] 글루타레이트(BS2G); 다이티오비스[석신이미딜 프로피오네이트](DTSP 또는 DSP); (3,3'-다이티오비스[설포석신이미딜프로피오네이트])(DTSSP); 다이석신이미딜 글루타레이트(DSG); 에틸렌 글리콜비스(설포석신이미딜석시네이트); 에틸렌 글리콜비스(석신이미딜석시네이트); 다이석신이미딜 타르트레이트; 및 NHS/말레이미드 이종이작용성 링커, 아릴 아지드 및 벤조페논 유도체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명에 따르면, 정방향 프라이머와 셀렉터 차단제가 예를 들면, "프라이머-스위치"와 관련하여 공지되어 있거나 향후 발견될 임의의 적합한 수단에 의해 연결될 때, 정방향 프라이머 및 셀렉터 차단제 둘다는 이들이 핵산 변이체(들)가 발생하는 위치(들)에서 상이하다는 점을 제외하고 동일한 표적 영역에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 프라이머 스위치의 정방향 프라이머는 핵산 변이체가 발생하는 하나 이상의 위치를 제외한 표적 영역에 상보적인 서열을 갖는 반면, 프라이머 스위치의 셀렉터 차단제는 핵산 변이체(들)가 발생하는 하나 이상의 위치(들)를 포함하는 동일한 표적 영역에 상보적인 서열을 갖는다. 몇몇 다른 실시양태들에서, 프라이머 스위치의 정방향 프라이머는 핵산 변이체(들)가 발생하는 하나 이상의 위치(들)를 포함하는 표적 영역에 상보적인 서열을 갖는 반면, 프라이머 스위치의 셀렉터 차단제는 핵산 변이체가 발생하는 하나 이상의 위치를 제외한 동일한 표적 영역에 상보적인 서열을 갖는다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 정방향 프라이머보다 더 높은 Tm을 갖는다. 몇몇 실시양태들에서, 셀렉터 차단제는 정방향 프라이머보다 더 낮은 Tm을 갖는다.
본 발명의 방법은 레포터 프로브와 함께 또는 레포터 프로브로서의 스위치 차단제와 함께 셀렉터 차단제를 사용하는 것도 제공한다. 몇몇 실시양태들에서, 레포터 프로브는 셀렉터 차단제와 함께 사용된다.
레포터 프로브는 연장될 수 있거나 연장될 수 없다. 레포터 프로브는 몇몇 경우 3' 또는 5' 핵산말단분해효소 활성으로부터 보호되도록 당분야에서 공지된 다양한 방법들에 의해 변경될 수 있다. 레포터 프로브는 하나 이상의 변경을 포함할 수 있고, 이러한 변경은 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 변경, 포스포로티오에이트 골격 변경, 포스포로다이티오에이트 골격 변경, 포스포르아미데이트 골격 변경, 메틸포스포네이트 골격 변경, 3' 말단 포스페이트 변경 및 3' 알킬 치환을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태들에서, 레포터 프로브는 3' 또는 5' 핵산말단분해효소 활성으로부터 보호된다.
레포터 프로브 및 스위치-차단제는 형광 표지 및 소광제도 함유할 수 있다. 형광 표지는 본원에 기재된 형광 표지들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 소광제는 댑실(DABCYL) C2 아민; 댑실 C2 말레이미드; 댑실 산(4-((4-(다이메틸아미노)페닐)아조)벤조산); 댑실 산(4-((4-(다이메틸아미노)페닐)아조)벤조산); 댑실 산(4-((4-(다이메틸아미노)페닐)아조)벤조산); 댑실 석신이미딜 에스테르(4-((4-(다이메틸아미노)페닐)아조)벤조산, 석신이미딜 에스테르); 댑실 석신이미딜 에스테르(4-((4-(다이메틸아미노)페닐)아조)벤조산, 석신이미딜 에스테르); 댑실 클로라이드(4-다이메틸아미노아조벤젠-4-설포닐 클로라이드); DNP 아민; DNP 말레이미드; DNP-X 산(6-(2,4-다이니트로페닐)아미노헥산산); DNP-X 산, SE (6-(2,4-다이니트로페닐)아미노헥산산, 석신이미딜 에스테르) 및 이들의 유도체를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태들에서, 레포터 프로브가 셀렉터 차단제와 함께 사용될 때, 레포터 프로브는 형광 표지만을 함유한다. 몇몇 실시양태들에서, 레포터 프로브가 셀렉터 차단제와 함께 사용될 때, 레포터 프로브는 형광 표지 및 소광제를 함유한다. 몇몇 실시양태들에서, 레포터는 증폭의 존재 하에서 제1 신호를 제공하고 증폭의 부재 하에서 제2 신호를 제공한다. 제1 신호 및 제2 신호는 예를 들면, 표적 영역에 혼성화하는 레포터 프로브 및 표적 영역에 혼성화하지 않는 레포터 프로브로 인해 발생할 수 있다.
레포터 프로브의 5' 말단 및 셀렉터 차단제의 3' 말단은 에너지 전달이 일어나게 하는 물질을 포함할 수 있다. 5' 말단은 5' 말단에서 또는 5' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 이상의 뉴클레오티드만큼 떨어진 위치에서 에너지 전달을 허용하는 물질을 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 에너지 전달을 허용하는 물질은 5' 말단으로부터 5개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 위치한다. 몇몇 실시양태들에서, 레포터가 셀렉터 차단제와 함께 사용되는 경우, 셀렉터 차단제 및 레포터 프로브가 표적 영역에 혼성화할 때 에너지 전달이 제1 물질과 제2 물질 사이에 일어날 수 있도록 레포터 프로브는 그의 5' 말단에서 제1 물질을 함유하고 셀렉터 차단제는 그의 3' 말단에서 제2 물질을 함유한다. 3' 말단은 3' 말단에서 또는 3' 말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 이상의 뉴클레오티드만큼 떨어진 위치에서 에너지 전달을 허용하는 물질을 함유할 수 있다.
몇몇 경우, 에너지 전달을 허용하는 제1 물질 및 제2 물질은 PRET 쌍의 일부이다. FRET(형광 공명 에너지 전달 또는 포스터(Forster) 공명 에너지 전달)는 2개의 물질들의 여기된 상태들 사이의 거리 의존적 상호작용이고, 이때 여기 에너지는 광자의 방사 없이 공여자 물질로부터 수용자 물질로 전달된다. FRET 쌍은 6-FAM (공여자) 및 LC 레드 640 또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 546(수용자); 플루오레세인(공여자) 및 테트라메틸로다민(수용자); IAEDANS(공여자) 및 플루오레세인(수용자); EDANS(공여자) 및 댑실(수용자); 플루오레세인(공여자) 및 플루오레세인(수용자); BODIPY FL(공여자) 및 BODIPY FL(수용자); 및 플루오레세인(공여자) 및 QSY 7 및 QSY 9 염료(수용자)를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 방법은 당분야에서 잘 공지된 임의의 검출 방법을 이용하여 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계도 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 검출은 증폭된 생성물에 대한 용융 곡선을 수득함으로써, 질량 분광측정에 의해, 또는 증폭된 생성물의 서열분석에 의해 달성될 수 있다. 증폭 생성물은 증폭 생성물 내의 핵산 변이체의 유형 및 수에 따라 상이한 용융 곡선을 나타낼 것이다. 용융 곡선을 결정하는 방법은 잘 기재되어 있고 당업자에게 잘 공지되어 있고, 용융 곡선을 결정하는 임의의 이러한 방법이 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 질량 분광측정의 이용 방법뿐만 아니라 핵산을 서열분석하는 방법도 당분야에서 잘 공지되어 있다. (예를 들면, 모두 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd ed.) (2001)) 및 문헌(Plum, Optical Methods, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2001-2011))을 참조한다.) (예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2001-2011, specifically Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of DNA Polymerase Reaction Products)을 참조한다.) 핵산 서열분석 방법도 관용적인 방법이고 당업자에게 잘 공지되어 있고, 임의의 서열분석 방법이 본 발명의 방법과 함께 이용될 수 있다. (예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, 1995-2010)을 참조한다.) 몇몇 실시양태들에서, 용융 곡선 및 서열분석 반응은 핵산 변이체를 특징규명하는 데에 이용될 수 있다.
본 발명의 방법은 증폭된 생성물의 양을 표적 영역 내의 핵산 변이체의 존재 또는 부재와 관련된 미리 측정된 수준과 비교함으로써 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 증폭을 검출하거나 증폭된 생성물의 양을 측정하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 임의의 이러한 방법이 이용될 수 있다. (모두 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) (2001)) 및 문헌(Gallagher, Current Protocols Essential Laboratory Techniques, 2008))을 참조한다.)
표적 영역 내의 핵산 변이체의 존재 또는 부재와 관련된 미리 측정된 수준은 충분히 큰 수의 샘플들에서 표적 영역 내의 핵산 변이체와 관련된 표준 수준을 측정하고 상기 수준을 미리 측정된 수준으로서 사용함으로써 측정될 수 있다. 또한, 표준 수준 정보 및 표준 수준을 측정하는 방법은 공개적으로 입수가능한 데이터베이스뿐만 아니라 다른 공급원으로부터 수득될 수 있다. 미리 측정된 수준은 표적 영역 내의 핵산 변이체를 함유하지 않는 핵산의 증폭을 위한 주어진 샘플에 존재할 미리 측정된 증폭 수준일 수 있다. 미리 측정된 수준은 표적 영역 내의 핵산 변이체를 함유하는 핵산의 증폭을 위한 주어진 샘플에 존재할 미리 측정된 증폭 수준일 수도 있다. (예를 들면, 전체적으로 참고로 도입되는 문헌(Bunk, D.M., "Reference Materials and Reference Measurement Procedures: An Overview from a National Metrology Institute," Clin. Biochem. Rev., 28(4):131-137 (2007))을 참조한다.) 미리 측정된 수준과의 비교는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있고, 상기 미리 측정된 수준 중 임의의 미리 측정된 수준이 이러한 비교에서 사용될 수 있다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) (2001) 참조).
증폭 생성물은 당분야에서 공지된 임의의 방법을 이용함으로써, 예를 들면, 핵산 마커, 예컨대, 액틴 또는 GAPDH를 사용함으로써 정량될 수도 있다. 정량은 공지된 양으로 증폭 반응에 첨가될 수 있는 표준화 대조군에 기초할 수도 있다. 이러한 방법은 잘 공지되어 있고 기재되어 있다. (예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌(Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) (2001))을 참조한다.)
본 발명은 반응 혼합물도 포함한다. 반응 혼합물은 하나 이상의 핵산분해효소 내성 프라이머, 및 3' 핵산말단분해효소 복구 활성을 갖는 고충실도 효소 또는 효소들의 조합물을 포함할 수 있다. 반응 혼합물은 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 셀렉터 차단제, 프라이머-스위치 또는 스위치-차단제, 및 핵산 변이체를 갖기 쉬운 표적 영역을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 몇몇 실시양태들에서, 반응 혼합물 중의 셀렉터 차단제, 프라이머-스위치 차단제 또는 스위치-차단제는 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역에 상보적인 서열을 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 반응 혼합물 중의 셀렉터 차단제, 프라이머-스위치 차단제 또는 스위치-차단제는 핵산 변이체의 존재 하에서 표적 영역에 상보적인 서열을 함유할 수 있다. 반응 혼합물 중의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 표적 영역을 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드의 영역을 증폭하는 데에 유용하다. 몇몇 실시양태들에서, 반응 혼합물은 증폭의 존재 하에서 제1 신호를 제공하고 증폭의 부재 하에서 제2 신호를 제공하는 레포터 프로브 또는 스위치-차단제를 추가로 함유한다. 몇몇 실시양태들에서, 반응 혼합물은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머에 의한 주형 뉴클레오티드의 증폭에 의해 생성된 앰플리콘(amplicon)을 함유한다.
본 발명은 키트도 제공한다. 본 발명에 의해 고려되는 키트는 핵산분해효소 내성 프라이머, 및 3' 핵산말단분해효소 복구 활성을 갖는 고충실도 효소 또는 효소들의 조합물을 함유할 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 키트는 정방향 프라이머, 프라이머-스위치, 셀렉터 차단제 또는 스위치-차단제도 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태들에서, 프라이머-스위치, 셀렉터 차단제 및 스위치-차단제는 핵산 변이체의 부재 하에서 표적 영역에 상보적인 보다 큰 서열을 갖고, 정방향 프라이머는 표적 영역의 업스트림에 위치하는 영역에 상보적인 서열을 함유한다. 몇몇 실시양태들에서, 프라이머-스위치, 셀렉터 차단제 및 스위치-차단제는 핵산 변이체의 존재 하에서 표적 영역에 상보적인 보다 큰 서열을 갖고, 정방향 프라이머는 표적 영역의 업스트림에 존재하는 영역에 상보적인 서열을 함유한다. 몇몇 실시양태들에서, 상기 키트는 역방향 프라이머 및 레포터 프로브를 추가로 함유한다.
본 발명은 핵산 표적 영역의 고충실도 증폭 방법도 제공한다. 이러한 방법은 핵산 증폭 반응 동안 핵산분해효소 내성 프라이머, 고충실도 효소, 차단제, FRET 프로브 및 플립 프로브를 포함하는 시약들(reagents)을 사용하는 단계를 포함한다. 이들은 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있고 당분야에서 공지된 임의의 핵산 증폭 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 이 양태는 예를 들면, PCR, 에멀젼(emulsion) PCR, 및 차세대 서열분석 플랫폼과 관련된 고체상 증폭을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 중합효소-기초 증폭 시스템에 적용된다.
몇몇 실시양태들에서, 핵산분해효소 내성 프라이머, 고충실도 효소, 차단제, FRET 프로브 및 플립 프로브가 증폭 반응에서 사용된다. 몇몇 실시양태들에서, 핵산분해효소 내성 프라이머, 고충실도 효소, 차단제 및 FRET 프로브가 사용된다. 몇몇 실시양태들에서, 핵산분해효소 내성 프라이머, 고충실도 효소 및 차단제가 사용된다. 몇몇 실시양태들에서, 핵산분해효소 내성 프라이머 및 고충실도 효소가 사용된다. 몇몇 실시양태들에서, 핵산분해효소 내성 프라이머 및 차단제가 사용된다.
몇몇 실시양태들에서, 핵산분해효소 내성 프라이머, 고충실도 효소, 차단제 및 FRET 프로브 중 하나 이상이 셀렉터 차단제, 프라이머-스위치, 스위치-차단제 및/또는 본원에 기재된 다른 방법들 중 임의의 방법과 함께 사용된다.
핵산분해효소 내성 프라이머는 핵산말단분해효소에 의한 분해를 방해하도록 변경된 프라이머를 포함한다. 몇몇 실시양태들에서, 상기 프라이머는 3' 또는 5' 핵산말단분해효소 활성으로부터 보호되도록 변경되고, 이러한 변경은 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 변경, 포스포로티오에이트 골격 변경, 포스포로다이티오에이트 골격 변경, 포스포르아미데이트 골격 변경, 메틸포스포네이트 골격 변경, 3' 말단 포스페이트 변경 및 3' 알킬 치환을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태들에서, 증폭 반응에서 사용되는 프라이머(들) 및/또는 프로브(들)는 하나 이상의 변경에 의해 3' 및/또는 5' 핵산말단분해효소 활성으로부터 보호된다.
고충실도 효소는 표적 서열의 고충실도(매우 정확한) 증폭을 허용한다. 몇몇 실시양태들에서, 사용된 효소는 고충실도 DNA 중합효소, 예를 들면, 3'-5' 핵산말단분해효소 교정 성능을 갖는 DNA 중합효소를 포함할 것이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 효소는 앰플리택, 푸젼 HS II, 딥 벤트 및 카파 HiFi DNA 중합효소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
차단제는 복제를 방해할 수 있거나 억제할 수 있고 증폭 반응에서 프라이머(들) 및/또는 프로브(들) 내로 도입되는 변경된 뉴클레오티드에 결합하는 뉴클레오티드 또는 물질에 결합하는 임의의 변경된 뉴클레오티드 또는 물질을 포함할 수 있다. 차단제는 2' 플루오로(2'-데옥시-2'-플루오로-뉴클레오사이드) 변경, 핵산분해효소 내성 뉴클레오티드 또는 3'-변경을 갖는 뉴클레오티드(이들 모두 복제를 억제하거나 방해함)를 포함할 수 있다.
핵산분해효소 내성 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드, 포스포로다이티오에이트 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트 뉴클레오티드 및 메틸포스포네이트 뉴클레오티드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
3'-변경을 갖는 뉴클레오티드는 3' 말단 포스페이트 변경된 뉴클레오티드, 3' 알킬 치환된 뉴클레오티드 및 다이데옥시 뉴클레오티드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
올리고뉴클레오티드의 2' 플루오로(2'-데옥시-2'-플루오로-뉴클레오사이드) 변경은 하기 형광 표지들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 형광 표지를 플루오로 기로서 사용할 수 있다: AMCA, DEAC(7-다이에틸아미노쿠마린-3-카복실산); 7-하이드록시-4-메틸쿠마린-3; 7-하이드록시쿠마린-3; MCA(7-메톡시쿠마린-4-아세트산); 7-메톡시쿠마린-3; AMF(4'-(아미노메틸)플루오레세인); 5-DTAF(5-(4,6-다이클로로트라이아지닐)아미노플루오레세인); 6-DTAF(6-(4,6-다이클로로트라이아지닐)아미노플루오레세인); 6-FAM(6-카복시플루오레세인), 5(6)-FAM 카다베린; 5-FAM 카다베린; 5(6)-FAM 에틸렌다이아민; 5-FAM 에틸렌다이아민; 5-FITC(FITC 이성질체 I; 플루오레세인-5-이소티오시아네이트); 5-FITC 카다베린; 플루오레세인-5-말레이미드; 5-IAF(5-요오도아세트아미도플루오레세인); 6-JOE(6-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시플루오레세인); 5-CR110(5-카복시로다민 110); 6-CR110(6-카복시로다민 110); 5-CR6G(5-카복시로다민 6G); 6-CR6G(6-카복시로다민 6G); 5(6)-카록시로다민 6G 카다베린; 5(6)-카록시로다민 6G 에틸렌다이아민; 5-ROX(5-카복시-X-로다민); 6-ROX(6-카복시-X-로다민); 5-TAMRA(5-카복시테트라메틸로다민); 6-TAMRA(6-카복시테트라메틸로다민); 5-TAMRA 카다베린; 6-TAMRA 카다베린; 5-TAMRA 에틸렌다이아민; 6-TAMRA 에틸렌다이아민; 5-TMR C6 말레이미드; 6-TMR C6 말레이미드; TR C2 말레이미드; TR 카다베린; 5-TRITC; G 이성질체(테트라메틸로다민-5-이소티오시아네이트); 6-TRITC; R 이성질체(테트라메틸로다민-6-이소티오시아네이트); 댄실 카다베린 (5-다이메틸아미노나프탈렌-1-(N-(5-아미노펜틸))설폰아미드); EDANS C2 말레이미드; 플루오레스카민; NBD; 및 피로메텐 및 이의 유도체.
상기 논의된 바와 같이 FRET(형광 공명 에너지 전달 또는 포스터 공명 에너지 전달)도 핵산 증폭에서 이용될 수 있다. FRET 쌍은 6-FAM(공여자) 및 LC 레드 640 또는 알렉사 플루오르 546(수용자); 플루오레세인(공여자) 및 테트라메틸로다민(수용자); IAEDANS(공여자) 및 플루오레세인(수용자); EDANS(공여자) 및 댑실(수용자); 플루오레세인(공여자) 및 플루오레세인(수용자); BODIPY FL(공여자) 및 BODIPY FL(수용자); 및 플루오레세인(공여자) 및 QSY 7 및 QSY 9 염료(수용자)를 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 플립 프로브는 하기 4개의 절편 및 2개 이상의 표지를 갖는 자체 소광 프로브이다: 약 1개 내지 7개의 염기로 구성된 제1 표적 영역 혼성화 절편, 제1 표지, 약 4개 내지 10개의 염기로 구성된 제2 표적 영역 혼성화 절편, 약 4개 내지 9개의 염기로 구성된 제3 표적 영역 혼성화 절편, 약 4개 내지 10개의 염기로 구성된 제4 절편 및 제2 표지. (예를 들면, 도 21을 참조한다.) 몇몇 실시양태들에서, 제2 절편 및 제4 절편은 표적 영역의 부재 하에서 제2 절편과 제4 절편이 혼성화하여 제1 표지 및 제2 표지를 서로 아주 근접하여 위치시키도록 서로 상보적이다. 몇몇 실시양태들에서, 제1 표지는 형광단이고, 제2 표지는 소광제이다. 몇몇 실시양태들에서, 제1 표지는 소광제이고, 제2 표지는 형광단이다. 몇몇 실시양태들에서, 형광단은 제1 표지이고, 소광제는 제2 표지이다. 몇몇 실시양태들에서, 형광단은 플립 프로브의 5' 말단 근처에 존재하고 셀렉터 프로브의 3' 말단 상의 표지에 아주 근접하여 존재하여 상기 프로브가 표적 영역에 결합되지 않을 때 FRET 상호작용을 가능하게 한다. 몇몇 실시양태들에서, 플립 프로브의 제1 절편은 최적 FRET 상호작용을 위해 2개의 표지들 사이에 거리를 "두는" 데에 사용된다.
몇몇 실시양태들에서, 플립 프로브는 셀렉터 차단제, 프라이머-스위치, 스위치-차단제, 및/또는 본원에 기재된 다른 방법들 중 임의의 방법과 함께 사용된다. 이들 실시양태들에서, 플립 프로브는 표적의 부재 하에서 높은 수준의 소광을 생성하도록 디자인되는 반면, 표적 영역의 존재 하에서 플립 프로브는 표적 서열에 결합하고 유의한 형광을 생성하도록 디자인된다. 몇몇 실시양태들에서, 표적 영역에의 결합은 플립 프로브 상에 위치한 형광 흡수제가 FRET를 통해 에너지를 셀렉터 차단제 상에 위치한 방사체에 전달하게 한다.
본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 기계는 용이하게 입수될 수 있다. 이러한 기계는 실시간 및 종점 PCR 어세이, 에멀젼 PCR, 고체상 PCR, 용융 곡선 분석 및 서열분석을 위한 기계를 포함할 수 있다. 이러한 기계는 라이프 테크놀로지스 7500 패스트(Life Technologies 7500 Fast) Dx 실시간 기계(고해상 용융 곡선 분석도 수행할 수 있음) 및 3500xl 모세관 겔 기계를 포함한다. 본 발명의 방법에서 유용할, 당분야에서 공지된 다른 기계도 본 발명의 방법의 실시에서 당업자에 의한 사용을 위해 고려된다.
실시예
실시예 1. EGFR T790M 돌연변이 검출을 위한 셀렉터 어세이의 디자인
셀렉터 어세이의 한 모드는 (10배 내지 20배 과량의 역방향 프라이머를 사용하는) 비대칭 PCR 및 포스터 공명 에너지 전달(FRET)에 의한 역방향 가닥의 종점 용융 곡선 분석 검출을 이용한다. FRET 쌍은 각각 6-FAM 및 LC 레드 640 또는 알렉사 플루오르 546 형광단에 연결된 셀렉터 및 레포터 올리고뉴클레오티드이다. 여기서 사용된 셀렉터 올리고뉴클레오티드는 (그의 Tm을 증가시키기 위한 2'-플루오로 리보뉴클레오사이드 치환을 갖는) 15-머이다. 셀렉터는 야생형 서열에 상보적이고 야생형 증폭을 위한 차단제로서 작용한다. 또한, 정방향 프라이머와 셀렉터 사이에 6개의 뉴클레오티드 중첩이 있다. 셀렉터 농도는 전형적으로 야생형 주형과의 결합에서 정방향 프라이머를 이기도록 4배 더 높은 수준으로 사용되었다. 야생형 특이적 뉴클레오티드의 중앙 위치 및 그의 증가된 친화성으로 인해 셀렉터는 돌연변이체와 야생형 주형 사이의 유의한 Tm 차이를 보인다. 셀렉터 A의 경우, 이 차이는 약 13℃이다(도 2 또한 참조). 레포터는 셀렉터가 해리되기 시작하는 온도에서 표적에 결합되도록 셀렉터보다 약 10℃ 더 높은 Tm을 갖도록 디자인되었다. 용융 온도에서의 이 차이는 용융 곡선 분석을 통해 돌연변이체와 야생형 주형을 구별할 수 있게 한다.
실시예 2. 카파 HiFi 반응 조건 하에서 셀렉터 및 레포터 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 야생형 및 돌연변이체 합성 표적의 검출
1x HiFi 완충제, 0.4 μM 셀렉터 A(6-FAM으로 표지됨) 및 0.4 μM 레포터 A(LC 레드 640으로 표지됨)를 함유하는 10 ㎕ 부피의 반응물을 0.4 μM 합성 돌연변이체 또는 야생형 표적과 조합하였다. 혼합물을 95℃에서 5분 동안 가열한 후, 30초 동안 98℃ 및 30초 동안 57℃의 2회 주기를 수행하였다. 그 다음, 해리 곡선 분석을 수행하였다(1분 동안 95℃, 30초 동안 45℃, 그 다음 95℃까지 1% 상승). LC 레드 640 FRET 신호를 주문 셋업 LC 레드 640 채널에서 검출하였다.
실시예 3. 앰플리택 ® DNA 중합효소 스토펠 단편(라이프 테크놀로지스)을 사용한 PC을 이용한 셀렉터 어세이
1x 스토펠 완충제(10 mM KCl, 10 mM 트라이스-HCl, pH 8.3), 4 mM MgCl2, 0.3 mM 클린앰프(Cleanamp) dNTP(트라이링크 바이오테크놀로지스(TriLink Biotechnologies)), 0.1 μM 정방향 프라이머, 1 μM 역방향 프라이머, 0.4 μM 셀렉터 A(6-FAM으로 표지됨), 0.4 μM 레포터 B(알렉사 플루오르 546으로 표지됨), 2 U 스토펠 단편 및 표시된 양의 게놈 DNA를 함유하는 10 ㎕ 부피의 반응물에서 반응을 수행하였다. PCR 반응물을 384-웰 플레이트 상에 적재하였다. 하기 순환 조건을 이용하여 ABI 7900HT 기계에서 PCR 순환을 수행하였다: 3분 동안 94℃; 30초 동안 94℃ 및 30초 동안 60℃의 55회 주기 후; 해리 곡선 분석(1분 동안 94℃, 30초 동안 45℃, 그 다음 94℃까지 1% 상승). 알렉사 플루오르 546 FRET 신호를 TAMRA 채널에서 검출하였다. PCR 반응을 ABI 7900HT 기계 상에서 수행하였다. 상기 수행의 말기에서의 해리 곡선 분석은 돌연변이체와 야생형 생성물 사이의 약 7℃ 차이가 있다는 것을 보여준다.
실시예 4. 고충실도 카파 HS DNA 중합효소를 사용하여 복합 배경에서 돌연변이체 T790M을 검출하는 셀렉터 어세이
(2 mM MgCl2 및 다른 성분들을 함유하는) 1x HiFi 완충제, 0.3 mM dNTP, 0.1 μM 정방향 프라이머, 2 μM 역방향 프라이머, 0.4 μM 셀렉터 A(6-FAM으로 표지됨), 0.4 μM 레포터 A(LC 레드 640으로 표지됨), 0.4 U 카파 HiFi 핫 스타트(Hot start) DNA 중합효소 및 표시된 양의 게놈 DNA를 함유하는 10 ㎕ 부피의 반응물에서 카파 HiFi 핫 스타트 DNA 중합효소(카파 바이오시스템스(Kapa Biosystems))를 사용한 PCR을 수행하였다. PCR 반응물을 384-웰 플레이트 상에 적재하였다. 하기 순환 조건을 이용하여 ABI 7900HT 기계에서 PCR 순환을 수행하였다: 5분 동안 95℃; 30초 동안 98℃ 및 30초 동안 57℃의 55회 주기 후; 해리 곡선 분석(1분 동안 95℃, 30초 동안 45℃, 그 다음 95℃까지 1% 상승). LC 레드 640 FRET 신호를 주문 셋업 LC 레드 640 채널에서 검출하였다. 14 pg 및 28 pg의 돌연변이체 DNA를 6.6 ng의 야생형 DNA의 배경에서 검출하였다. 보다 많은 양의 돌연변이체 DNA(28 pg)는 10개의 반응 중 돌연변이체 피크를 보이는 9개의 반응 및 야생형의 용융 온도에서 보다 낮은 피크를 보이는 1개의 반응을 갖는 결과를 제공하였다. 6.6 ng의 야생형을 갖는 14 pg의 돌연변이체의 경우, 10개의 반응 중 6개의 반응이 돌연변이체 피크를 보였고, 나머지 반응은 야생형에 더 가까운 용융 온도를 갖는 보다 낮은 피크를 보였다.
실시예 5. T790M 돌연변이를 위한 셀렉터 플러스 어세이
본 어세이는 (셀렉터 어세이에서와 마찬가지로) 야생형 증폭에 대한 차단제를 사용하지만, 셀렉터 플러스 어세이의 경우 상기 차단제는 3' 말단에서 LC 레드 640 또는 알렉사 플루오르 546 형광단(이것은 용융 곡선 분석을 위한 FRET 쌍으로서 다시 작용함, 하기 참조)을 함유한다, 또한, 레포터는 어닐링/연장 단계 동안 PCR 생성물 축적의 실시간 검출을 가능하게 하는 이중 표지된 프로브이다. 레포터를 5' 말단에서 또는 5' 말단 근처에서 6-FAM 표지로 표지하고 3' 말단에서 댑실 소광제로 표지한다. 레포터의 디자인은 어닐링/연장 조건(56℃ 내지 60℃) 하에서 레포터의 줄기 구조가 6-FAM을 댑실 소광제에 아주 근접하여 존재하게 하여 표적의 부재 하에서 매우 낮은 배경을 생성하는 루프를 생성하도록 한다. 앰플리콘의 존재 하에서 레포터는 개방된 줄기-루프 구조에 결합한다. 증가하는 6-FAM 형광의 양은 존재하는 앰플리콘의 양과 상호관련되어 있다. 과량의 야생형 분자를 함유하는 샘플에서 T790M 돌연변이체 분자의 존재를 확인하기 위해 실시간 검출을 이용한다. 이것은 Cq 값을 공지된 양의 T790M 돌연변이체 및 야생형에 대한 Cq 값과 상호관련시킴으로써 수행된다. 실시간 Cq 값들이 불일치의 존재를 표시하는 경우, 이들을 불일치의 존재에 대해 검증한다. 이것은 이미노바이오틴을 사용하여 2개의 가닥들 중 하나를 선택적으로 포획하고 용융 곡선 분석 및 서열분석을 실시함으로써 수행된다(도 8 참조).
이미노바이오틴은 아비딘에 대한 pH 의존적 결합 상수를 갖는다. 이것은 pH 10에서 결합되고 pH 4에서 아비딘 수지로부터 용출될 수 있다.
자성 아비딘 비드(스페로텍 인코포레이티드(Spherotech, Inc.))를 사용하여 이미노바이오틴 함유 가닥을 포획한다. 비-이미노바이오티닐화된 가닥을 열, 낮은 염 및 변성제의 조합으로 이미노바이오티닐화된 가닥으로부터 분리한다. 단리된 이미노바이오티닐화된 가닥을 pH 4에서 자성 아비딘 비드로부터 용출한다. 그 다음, 단리된 이미노바이오티닐화된 가닥, 셀렉터 및 레포터(FRET 쌍으로서 작용함)를 조합하고 (실시예 4에 기재된 바와 같이) 해리 곡선을 작도함으로써 용융 곡선 분석을 수행한다. 검출을 LC 레드 640 또는 알렉사 플루오르 546 채널에서 수행한다. 제조자의 설명서에 따라 빅다이(BigDye)® 터미네이터 v1.1 순환 서열결정(Cycle Sequencing) 키트와 함께 이미노바이오티닐화된 가닥 및/또는 비-이미노바이오티닐화된 가닥을 사용하여 서열분석 반응을 수행한다. 서열분석 반응을 분석용 ABI3730 DNA 분석기 상에서 수행한다.
Figure pat00001
Figure pat00002
실시예 6. 셀렉터 어세이를 이용한 복합 야생형 게놈 배경에서의 드문 돌연변이체의 검출
증가하는 양의 H1975 게놈 DNA(각각 7, 70, 700 및 7000 카피의 T790M에 상응하는 0.05 ng, 0.5 ng, 5 ng 또는 50 ng)를 50 ng ABR16965 게놈 DNA(약 14000 카피의 야생형 대조군)의 존재 또는 부재 하에서 셀렉터 어세이(셀렉터를 갖는 모든 반응)에서 사용하였다. 도 9를 참조한다. 증폭 데이터가 작도되었고 그래프로 표시되어 있다(좌측 패널). 50 pg H1975와 50 ng ABR16965의 혼합물의 셀렉터 어세이 반응의 용융 곡선 분석 및 서열분석 데이터가 표시되어 있다(돌연변이체 대 야생형 카피의 1:2000 혼합물). T790M 돌연변이(A)에 대해 특이적인 뉴클레오티드는 서열 피크 위에 화살표로 표시되어 있고, 셀렉터에 의해 결합된 영역은 상자로 표시되어 있다.
결과:
증가하는 양의 H1975 게놈 DNA(7 내지 약 7000 카피)를 셀렉터 및 약 14000 카피의 ABR16965 게놈 DNA(야생형 대조군)의 존재 하에서 셀렉터 어세이에서 사용하였다. 증폭 데이터 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이, 야생형 대조군 DNA의 존재는 T790M 돌연변이체의 증폭에 최소한으로 영향을 미친다(H1975와 H1975+ABR16965 그래프를 비교한다). 셀렉터™ 어세이가 시험된 농도에 걸쳐 선형 회귀를 보이는 것은 분명한데, 이것은 상기 어세이가 시험된 범위에 걸쳐 정량적이라는 것을 암시한다. 또한, 돌연변이체 용융 곡선 피크를 보이는 용융 곡선 분석 및 서열분석 결과는 50 pg의 H1975(7 카피의 T790M)가 50 ng의 ABR16965(14000 카피의 EGFR)와 혼합될 때 T790M 돌연변이가 검출될 수 있다는 것을 암시한다. T790M 돌연변이체는 야생형 DNA와 혼합될 때 보다 많은 양의 H1975로 검출될 수도 있다(데이터는 표시되어 있지 않음). 따라서, 상기 데이터는 셀렉터™ 어세이가 1:2000만큼 많은 비로 야생형 DNA와 혼합되었을 때 돌연변이체 DNA를 검출할 수 있다는 것을 보여준다.
방법:
하기 성분들을 함유하는 10 ㎕ 부피로 셀렉터 어세이 반응을 수행하였다: 0.2 μM 정방향 프라이머(5'-C*A*CCGTGCAR*C*T*C-3'; R=A/G; *는 포스포로티오에이트를 표시함), 2 μM 역방향 프라이머(5'-T*G*TGTTCCCGGACAT*A*G*T-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시함), 0.3 μM 셀렉터 6(5'-2'OMe(a*u)*cacgcagcu*c*a*(LC 레드 640)-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시하고; 소문자는 2'-플루오로 리보뉴클레오사이드를 표시함), 0.6 μM 레포터 4(5'-u*g*ccc(C7-NH)(6-FAM)TTCGGCTGCcuccu GGAGCCG*A*A*(댑실)-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시하고; 소문자는 2'-플루오로 리보뉴클레오사이드를 표시함), 3 mM MgCl2, 0.4 mM dNTP, 0.4 U 카파 HiFi 핫 스타트 DNA 중합효소(카파 바이오시스템스, 카달로그 번호 KK2101), 1 x HiFi 완충제, 0.2 ㎕ ROX 기준 염료(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 12223-012). PCR 반응물을 384-웰 플레이트 상에 적재하고, 하기 순환 조건을 이용하여 ABI 7900HT 기계에서 PCR 순환을 수행하였다: 5분 동안 95℃; 20초 동안 98℃, 30초 동안 61℃, 1분 동안 52℃ 및 15초 동안 69℃의 55회 주기 후; 해리 곡선 분석(1분 동안 95℃, 30초 동안 45℃, 그 다음 95℃까지 1% 상승). 52℃ 주기 단계 동안 6-FAM 및 LC 레드 640 형광을 모니터링함으로써 증폭 생성물의 검출을 수행하였다. 용융 곡선 분석을 위해, 40℃에서 95℃로의 전이 동안 LC 레드 640 신호를 모니터링하였다.
생거 서열분석을 위해, PCR 생성물을 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트(퀴아젠)로 정제하고, 서열분석 프라이머 T790M seq6(CATAGCAGCTGTTTTCCCAGTCATCGACGTTGTAGTCCAGGAGGCAGCCGAA)과 함께 빅다이® 터미네이터 v1.1 순환 서열결정 키트(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 4337449)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 서열분석 반응을 수행하였다. 센트리-셉(Centri-Sep)™ 컬럼(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 401762)을 사용하여 서열분석 반응물을 정제하고 3730 DNA 분석기 상에서 분석하였다.
실시예 7. 셀렉터 어세이를 이용한 야생형 증폭의 억제의 입증
폐암 혈액 샘플의 WGA 물질로부터의 야생형 주형을 사용하여 셀렉터 어세이를 수행하였다. 도 10을 참조한다. 셀렉터의 존재 또는 부재 하에서 야생형 주형의 증폭이 표시되어 있다. 검출된 카피는 셀렉터(0.05 ng, 0.5 ng, 5 ng 및 50 ng)의 존재 또는 부재 하에서 H1975 게놈 DNA 표준물을 사용하여 셀렉터 어세이를 수행함으로써 수득된 표준 곡선으로 작도되어 있다(셀렉터를 사용한 반응에서 표준 곡선만이 표시되어 있다).
결과:
T790M에 대한 음성을 나타내는 것으로 확인된 폐암 혈액 샘플로부터의 WGA 물질을 사용하여 야생형 주형을 발생시켰다. 이를 수행하기 위해, 상기 WGA 물질을 15 주기 동안 미리 증폭함으로써 T790M 돌연변이 영역을 함유하는 228 bp PCR 단편을 발생시킨 후, 이 단편을 셀렉터 어세이에서 네스티드(nested) PCR에 사용하였다. 도 10에서 증폭 곡선으로부터 알 수 있는 바와 같이, 셀렉터 어세이 반응에의 셀렉터의 첨가는 야생형 주형의 증폭을 차단하여 야생형 주형이 최대 55 주기 동안 검출될 수 없다. H1975 게놈 표준물을 사용하여 동일한 플레이트 상에서 수행한 표준 곡선으로 야생형 카피의 수를 측정하고 약 10800으로서 계산하였다.
방법:
*본 실험에서 사용된 WGA 물질은 도 13 및 14에 대해 기재된 CEE™ 마이크로채널을 사용하여 준비한 폐암 혈액 샘플로부터의 WGA 물질이다. 셀렉터 및 레포터를 사용하지 않았고 15 주기 동안 순환을 수행하였고 용융 곡선 분석을 생략하였다는 점을 제외하고 도 1에 대해 기재된 셀렉터 어세이 반응 조건 하에서 상기 WGA 물질을 정방향 프라이머 FP19(A*C*CGTGCARCTCA*T*C*A; R=A/G; *는 포스포로티오에이트를 표시함) 및 역방향 프라이머 RP14(G*C*ACGCACACACAT*A*T*C; *는 포스포로티오에이트를 표시함)로 미리 증폭하였다. 수득된 물질을 10 mM 트라이스-HCl(pH 8.0) 및 0.1 mM EDTA로 50배 희석하고 도 9에 대해 기재된 바와 같이 셀렉터의 존재 또는 부재 하에서 셀렉터 어세이 반응에서 사용하였다.
실시예 8. 폐암 환자의 혈장으로부터 단리된 핵산을 사용한 셀렉터 어세이
폐암 환자 혈장 샘플로부터 준비된 핵산을 T790M 셀렉터 어세이에서 사용하였다. 셀렉터 어세이 반응을 셀렉터의 존재 또는 부재 하에서 수행하였다. 후자 조건은 야생형 서열의 증폭을 허용하고 반응 조건 및 혈장 제제 중의 핵산의 존재에 대한 대조군으로서 사용된다. 돌연변이체 및 야생형 용융 곡선 피크의 위치가 표시되어 있는 셀렉터 어세이 PCR 생성물의 용융 곡선 분석이 제시되어 있다. -셀렉터 PCR 반응의 용융 곡선 분석을 위해, 셀렉터 및 레포터를 증폭 후 첨가하였다. 셀렉터 어세이 반응 생성물을 서열분석하여 돌연변이체 T790M(CAT) 또는 야생형 서열(CGT)의 존재를 확인하였다. 서열 아래에 상자로 표지된 셀렉터는 셀렉터 결합의 위치를 표시한다.
결과:
셀렉터의 부재 및 존재 하에서 셀렉터 어세이를 이용하여 폐암 환자의 혈장으로부터 핵산을 준비하였다. 셀렉터의 존재 하에서의 실시간 PCR 결과는 검출된 돌연변이체 증폭을 표시한다(6-FAM 및 LC 레드 640 채널에서의 +셀렉터 반응 참조). 돌연변이체 서열의 증폭을 증폭 생성물의 용융 곡선 분석으로 더 확인하였다. +셀렉터 반응의 용융 곡선 피크는 -셀렉터 반응에서 관찰된 야생형 용융 곡선 피크보다 약 13℃ 더 낮은 Tm을 보여주었다. 돌연변이의 존재를 확인하기 위해, +셀렉터의 PCR 생성물을 서열분석하였고 T790M에 대해 특징적인 돌연변이를 확인하였다. -셀렉터 PCR 생성물의 서열분석은 야생형 서열을 확인시켜 주었다. 표준 곡선(도 11b)에 기초하였을 때, 3 ㎖ 혈장에서 발견된 T790M 카피의 수는 577이었고, 발견된 EGFR 카피의 수는 46348이었다.
방법:
폐암 환자(18299)로부터의 혈액(약 8 ㎖)을 CEE-Sure™ 튜브(바이오셉트 인코포레이티드; 항응집제를 함유함) 내로 뽑아내고, 채혈 후 48시간 이내에 혈장 부분으로부터 핵산을 준비하였다. 이를 수행하기 위해, 전혈을 3000 x g 및 실온에서 5분 동안 원심분리하고, 수득된 혈장 분획을 16000 x g 및 4℃에서 10분 동안 다시 원심분리하였다. 하기 변경을 갖는 제조자의 설명서에 따라 퀴아앰프(QIAamp) 순환 핵산 키트(퀴아젠, 카달로그 번호 55114)를 사용하는 핵산 준비를 위해 약 3 ㎖의 혈장 상청액을 사용하였다: 단백질분해효소(proteinase) K 절단을 60℃에서 60분 동안 수행하였고, 담체 RNA의 첨가를 생략하였고, 20 ㎕의 제공된 용출 완충제를 사용하여 용출을 수행하였다.
혈장으로부터의 핵산 제제(약 17 ㎕의 총 부피) 1 ㎕를 전술된 바와 같이 10 ㎕ T790M 셀렉터 어세이 PCR 반응에서 직접적으로 사용하였다.
셀렉터의 부재 하에서 수행된 셀렉터 어세이 반응(상기 -셀렉터 참조)으로부터의 PCR 생성물의 용융 곡선 프로파일을 결정하기 위해, 셀렉터 및 레포터를 증폭 후 첨가하였고, 해리 곡선 분석을 전술된 바와 동일한 조건 하에서 수행하였다.
도 11a에 나타낸 혈장 핵산 반응의 증폭 데이터를 표준 곡선 그래프 상에 작도하였다. 표준 곡선은 셀렉터의 존재 또는 부재 하에서 증가하는 양의 H1975 게놈 DNA를 사용하여 셀렉터™ 어세이를 수행함으로써 수득되었다. 반응을 혈장 핵산과 동일한 플레이트 상에서 수행하였다.
실시예 9. 폐암 환자의 혈장으로부터 유래된 mRNA에 대한 셀렉터 어세이
폐암 환자(18280)의 핵산 샘플로부터 준비된 cDNA를 전술된 바와 같이 셀렉터의 존재 또는 부재 하에서 셀렉터 어세이 수행에서 사용하였다(실시예 8 참조). cDNA를 사용하는 반응을 이중으로 수행하였다. 반응들 중 하나는 셀렉터의 존재 하에서 증폭을 보였다. 50 pg H1975(셀렉터의 존재 하에서 약 7 카피의 T790M)의 증폭은 동일한 그래프 상에 표시되어 있다. 증폭된 생성물의 용융 곡선 프로파일은 돌연변이체에 상응하고, 서열분석은 증폭된 PCR 생성물 내의 T790M 돌연변이의 존재를 확인시켜 주었다.
방법:
수퍼십트(Superscipt) III 제1 가닥 합성 시스템(라이프 테크놀로지스 카달로그 번호 18080-051)을 사용하여 임상 폐암 샘플의 DNAse I-처리된 핵산으로부터 cDNA를 제조하였다. 상기 키트에 의해 제공된 올리고(dT)를 사용하였고 합성을 제조자의 설명서에 따라 수행하였다.
결과:
본 발명자들은 폐암 혈장 샘플로부터의 cDNA 제제에서 T790M 돌연변이체의 존재를 검출하였다. 약 8개 RNA 카피의 T790M이 3 ㎖ 혈장에서 검출되었다.
실시예 10. 바이오셉트 CEE™ 마이크로채널로부터 회수된 세포의 셀렉터 어세이
전혈에서 H1975를 사용한 스파이크 및 회수 실험의 증폭 데이터가 제시되어 있다. 도 13a를 참조한다. 상기 데이터는 증가하는 양의 H1975 게놈 DNA 대조군을 사용한 반응으로부터 수득된 표준 곡선 그래프로 작도되었다(상부 패널). 셀렉터의 존재 하에서의 반응은 스파이킹된(spiked) H1975 세포(증가하는 수의 스파이크 A, 스파이크 B 및 스파이크 C)의 정량을 가능하게 하는 반면, 셀렉터의 부재 하에서의 반응은 마이크로채널 용출물에서 발견된 배경 세포(WBC)의 정량을 가능하게 한다.
도 13a로부터의 증폭 생성물을 용융 곡선 분석으로 분석하였다. 도 13b를 참조한다. -셀렉터 PCR 반응의 용융 곡선 분석을 위해, 셀렉터 및 레포터를 증폭 후 첨가하였다. 돌연변이체 및 야생형 용융 곡선 피크의 위치가 표시되어 있다. 샘플을 생거 서열분석 반응에서 사용하여 돌연변이체 또는 야생형 서열의 존재를 확인하였다. 셀렉터 결합의 위치는 서열 아래에 표시되어 있다.
방법:
증가하는 수의 H1975 세포를 CEE-Sure™ 튜브 내의 전혈 내로 스파이킹하였다. 버피 코트를 제조하였고, EpCAM을 포함하는 암세포의 표면 상의 마커를 특이적으로 인식하는 바이오티닐화된 항체의 칵테일과 함께 항온처리하였다. 그 다음, 버피 코트를 스트렙타비딘 코팅된 마이크로채널(CEE™ 마이크로채널, 바이오셉트 인코포레이티드)에 통과시켰다. 포획된 H1975 세포를 사이토케라틴 염색으로 가시화하고 계수한 후, 상기 채널로부터 용출하였다. 단백질분해효소를 사용한 절단 및 효소의 불활성화 후, (실시예 9에 기재된 바와 같이) 1 ㎕를 셀렉터 어세이에서 사용하였다.
결과:
바이오셉트 CEE™ 마이크로채널을 사용하여 전혈로부터 스파이킹된 H1975 세포를 회수하였다. 스파이크 A, 스파이크 B 및 스파이크 C는 (용출 전 및 용출 후 상기 마이크로채널의 CK+ 염색에 의해 판단되었을 때) 마이크로채널 용출물 ㎕ 당 각각 0개, 3개 및 16개 세포를 함유하였다. 용출 및 단백질분해효소 절단 후, 게놈 DNA 물질을 셀렉터의 존재 또는 부재 하에서 셀렉터 어세이에서 사용하였다. 표준 곡선에 기초하였을 때, 스파이크 A, 스파이크 B 및 스파이크 C에서 검출된 H1975 세포의 수는 마이크로채널 용출물 ㎕ 당 각각 0, 3 및 36이다. 따라서, 셀렉터™ 어세이 결과는 마이크로채널 결과와 매우 일치한다.
실시예 11. 바이오셉트 CEE™ 마이크로채널로부터 회수되고 WGA의 사용을 통해 증폭된 세포의 셀렉터 어세이
실시예 9에서 분석된 동일한 스파이크 및 회수 반응물은 증폭된 전체 게놈이었고 셀렉터의 존재 하에서 셀렉터 어세이 반응에서 사용되었다. 각각 0개, 3개 및 16개 세포/마이크로채널 용출물을 함유하는 스파이크 A, 스파이크 B 및 스파이크 C로부터의 WGA 반응의 증폭 데이터 및 용융 곡선 분석은 도 14a에 제시되어 있다. 셀렉터 반응을 이중으로 수행하였고, 두 반응에 대한 결과가 제시되어 있다.
증폭을 보인 WGA 물질을 사용하여 수행한 셀렉터 어세이 반응(스파이크 B 및 스파이크 C)을 서열분석하여 돌연변이의 존재를 확인하였다. T790M 특이적 돌연변이(CAT)의 위치가 표시되어 있다. 도 14b를 참조한다. 셀렉터 결합의 영역은 서열 아래에 상자로 표시되어 있다.
결과:
전술된 스파이크 및 회수 실험으로부터의 게놈 DNA 물질은 증폭된 전체 게놈(WGA)이었고 T790M 돌연변이의 존재에 대해 셀렉터 어세이에서 시험되었다. WGA 반응을 위해 사용된 각각 6개의 H1975 세포 또는 32개의 H1975 세포와 함께 스파이크 B 및 스파이크 C 샘플을 주형으로서 사용하여 증폭을 검출하였다(방법 참조). 예측된 바와 같이, 스파이크 A(0개의 H1975 세포)는 증폭을 보이지 않았다. 용융 곡선 분석 및 서열분석 결과는 스파이크 B 및 스파이크 C 샘플에서 WGA 물질 내의 T790M 돌연변이의 존재를 확인시켜 주었다. 따라서, 셀렉터 어세이는 마이크로채널로부터 용출된 세포로부터의 WGA 물질과도 함께 성공적으로 이용되었고, 6개만큼 적은 세포 등가물이 WGA 증폭되었고 셀렉터 어세이에 의해 검출되었다.
방법:
레플리(Repli)-g 미니 키트(퀴아젠)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 상기 채널로부터 용출된 H1975 물질의 전체 게놈 증폭을 수행하였다. 상기 마이크로채널로부터 용출된 2 ㎕의 H1975 물질을 WGA 반응에 사용하였다(스파이크 A: 0개 세포/㎕, 스파이크 B: 3개 세포/㎕, 스파이크 C: 16개 세포/㎕). 증폭된 DNA를 셀렉터 어세이에 첨가하기 전에 10 mM 트라이스-HCl(pH 8.0) 및 0.1 mM EDTA로 40 ng/㎕까지 희석하였다. 1 mM EGTA를 반응에 첨가하였다는 점을 제외하고 셀렉터™ 어세이를 실시예 9에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다.
실시예 12. 중첩 정방향 프라이머를 사용한 셀렉터 어세이
셀렉터의 존재 또는 부재 하에서 야생형 주형을 사용하여 셀렉터와 중첩되는 정방향 프라이머로 셀렉터 어세이를 수행하였다. 도 15a를 참조한다. 셀렉터 및 야생형 주형의 존재 하에서 50 pg H1975의 증폭도 시험하였다. 셀렉터 어세이 반응의 실시간 PCR 및 용융 곡선 분석이 제시되어 있다. -셀렉터 PCR 반응의 용융 곡선 분석을 위해, 셀렉터 및 레포터를 증폭 후 첨가하였다.
결과:
셀렉터와 중첩되는 정방향 프라이머를 셀렉터 어세이에서 사용하였다. 상이한 양의 야생형 주형을 시험함으로써, 셀렉터에 의한 증폭에 대해 효율적으로 차단되지만 동일한 반응에 존재할 때 50 pg H1975 돌연변이체 게놈 DNA의 효율적인 증폭을 여전히 허용하는 야생형 주형의 양을 측정하였다. 이용된 조건 하에서, 약 800 카피의 야생형 주형(셀렉터의 부재 하에서 수행된 표준 곡선에 기초한 계산; 데이터는 제시되지 않음)이 증폭에 대해 차단되고 동일한 혼합물에 존재할 때 약 7개의 돌연변이체 카피(50 pg H1975)의 증폭을 허용한다는 것을 확인하였다(도 15a 참조). 셀렉터의 부재 하에서의 야생형 주형의 셀렉터™ 어세이 반응(도 15b 참조, 패널 A) 및 셀렉터의 존재 하에서의 야생형 주형과 50 pg H1975 돌연변이체의 혼합물의 셀렉터™ 어세이 반응(도 15b 참조, 패널 B)을 서열분석하여 증폭된 주형의 본질을 확인하였다.
방법:
정방향 프라이머 FP14ovl(C*G*TGCARCTCA*T*C*A; R=A/G; *는 포스포로티오에이트를 표시함)가 셀렉터 어세이를 위해 사용되었다는 점을 제외하고 셀렉터 어세이 반응 및 서열분석을 실시예 9에 대해 기재된 바와 동일하게 수행하였다. 야생형 주형을 실시예 10에 기재된 바와 같이 발생시켰고, 10 mM 트라이스-HCl(pH 8.0) 및 0.1 mM EDTA 중의 1000배 희석물의 셀렉터 어세이 데이터가 제시되어 있다.
실시예 13. 정확성이 낮은 효소는 증폭 동안 서열 오류를 도입하고 성능을 감소시킨다.
본 실시예에서, 이전 실시예에서 사용된 고충실도/복구 효소 카파 HiFi 핫스타트 DNA 중합효소 대신에 앰플리택 골드 DNA 중합효소를 사용하였다. 효소의 변화 이외에, 변성 온도가 95℃로 약간 감소하였다는 점 및 증폭 완충제에서 3 mM Mg++를 사용하였다는 점을 제외하고 반응 조건은 실시예 6의 반응 조건과 동등하였다. 상기 두 변화는 앰플리택 효소의 요건을 수용하기 위해 적용되었다. 도 16에서, 화살표는 앰플리택 골드의 낮은 정확성과 관련된, 서열 내에 도입된 G>A 오류를 보여준다. T790M 돌연변이에서 A로 변경된 G 뉴클레오티드(WT로서 표시됨)도 표시되어 있다. 셀렉터 결합의 영역은 서열 아래에 상자로 표시되어 있다. 카파 HiFi 효소를 사용하여 이 동일한 어세이를 수행할 때, 유의한 증폭은 일어나지 않고 임의의 유의한 도입 오류의 도입에 대한 증거도 없다(실시예 7 참조).
본 실시예는 2개의 핵심 요인을 예증한다. 먼저, 셀렉터 어세이는 3' 핵산말단분해효소 복구 활성을 갖는 고충실도 효소, 예컨대, 카파 HiFi 효소를 사용하여 수행하였을 때 보다 우수한 성능을 제공하였다. 셀렉터 어세이가 드문 사건을 검출하는 데에 사용되기 때문에, 상기 효소에 의해 도입된 임의의 오류는 어세이 성능을 손상시킬 수 있다. 따라서, 핵산분해효소 보호된 프라이머, 차단제 및 프로브와 함께 고충실도 효소를 사용할 수 있다. 둘째, 본 실시예에서 돌연변이가 증폭되게 하면서 야생형 신호를 억제하기 위한 셀렉터의 사용 및 이의 능력은 임의의 중합효소에 의해 유도된 증폭 반응에 대한 민감성 모델을 제공한다. 따라서, 본 실시예는 핵산분해효소 내성 프라이머들의 조합물, 및 3' 핵산말단분해효소 복구 활성을 보유하는 고충실도 효소 또는 효소들의 조합물이 임의의 중합효소 의존적 증폭 반응의 성능을 개선할 것이고 서열 정확성을 보다 높은 정도로 유지할 것이라는 직접적 증거를 제공한다. 이들 방법들은 에멀젼 PCR 및 고체상 PCR을 포함하는 임의의 PCR 반응에서 이용될 수 있을 뿐만 아니라 차세대 서열분석 및 플랫폼에 적용될 수 있다.
셀렉터 어세이는 정방향 프라이머에 의한 야생형 서열의 증폭을 고도로 억제한다. 동시에, 역방향 프라이머는 여전히 선형 증폭을 유도한다. 이 조합된 매우 낮은 수준의 증폭 기간 동안 도입 오류가 셀렉터의 풋-프린트(foot-print) 내에서 일어나는 경우, 셀렉터에 의한 차단은 감소될 것이고 기하급수적 증폭이 일어날 것이다. 이와 더불어, 앰플리택 골드를 사용할 때 하나 이상의 잘못된 도입 오류가 관용적으로 관찰된다. 따라서, 본 발명의 방법에서 고충실도 중합효소의 사용은 이러한 오류를 감소시킬 수 있거나 방지할 수 있다.
결과:
앰플리택 골드® DNA 중합효소 및 약 680 카피의 야생형 주형(실시예 7에 기재된 바와 같이 제조됨)을 사용하여 셀렉터의 존재 하에서 셀렉터 어세이를 수행하였다. 셀렉터의 존재 하에서 카파 HiFi 핫스타트 DNA 중합효소와 함께 셀렉터 어세이에서 사용될 때 동일한 양의 야생형 주형은 임의의 검출가능한 증폭 생성물을 (증폭의 55 주기 후) 제공하지 않았다. 그러나, 셀렉터의 존재 하에서 유사한 순환 조건(5 mM, 7 mM 또는 10 mM MgCl2을 사용함) 하에서 앰플리택 DNA 중합효소를 사용하였을 때 증폭 생성물이 모든 경우에서 관찰되었고, 용융 곡선 피크는 돌연변이체 생성물의 존재를 표시하였다(도 16 이외에 데이터는 제시되지 않음). 개별 웰들로부터의 돌연변이체 생성물의 서열분석은 셀렉터 결합 영역 내에 상이한 돌연변이들이 존재한다는 것을 보여준다(도 16). 여기에 나타낸 예는 G>A 돌연변이이다. 또 다른 빈번히 관찰된 돌연변이는 T790M 뉴클레오티드 G>A 변화이다. 이것은 셀렉터의 존재가 효소에 의해 도입된 돌연변이의 선택적 증폭을 유발할 수 있다는 것을 암시한다. 또한, 본 발명의 방법에서 고충실도 중합효소의 사용은 이러한 오류를 감소시킬 수 있거나 방지할 수 있다.
방법:
앰플리택 골드® DNA 중합효소를 사용하는 셀렉터 어세이 반응을 하기 성분들을 함유하는 10 ㎕ 부피로 수행하였다: 0.2 μM 정방향 프라이머(실시예 6에 기재된 바와 동일함), 2 μM 역방향 프라이머(도 1에 기재된 바와 동일함), 0.3 μM 셀렉터 6(실시예 6에 기재된 바와 동일함), 0.6 μM 레포터 4(실시예 6에 기재된 바와 동일함), 5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 3 U 앰플리택 골드®(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 4311814), 1 x PCR 골드 완충제(15 mM 트라이스-HCl pH 8.0, 50 mM KCl), 0.2 ㎕ ROX 기준 염료(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 12223-012). PCR 반응물을 384-웰 플레이트 상에 적재하였다. 하기 순환 조건을 이용하여 ABI 7900HT 기계에서 PCR 순환을 수행하였다: 5분 동안 95℃; 20초 동안 95℃, 30초 동안 61℃, 1분 동안 52℃ 및 15초 동안 69℃의 55회 주기 후; 해리 곡선 분석(1분 동안 95℃, 30초 동안 40℃, 그 다음 95℃까지 1% 상승). 52℃ 주기 단계 동안 6-FAM 및 LC-레드 640 형광을 모니터링함으로써 증폭 생성물의 검출을 수행하였다. 용융 곡선 분석을 위해, LC-레드 640 신호를 40℃에서 95℃로의 전이 동안 모니터링하였다. 생거 서열분석을 실시예 6에 대해 기재된 바와 동일하게 수행하였다.
실시예 14. 단순 FRET 레포터 시스템을 사용한 셀렉터 어세이
셀렉터 어세이 증폭 및 용융 곡선 분석이 수행되었고 FAM-표지된 차단제(차단제 8) 및 LC-레드 640-표지된 고착제(고착제 5)의 존재 하에서 수행된 반응에 대해 제시되어 있다. 실시예 6에 기재된 역방향 프라이머와 함께 차단제와 중첩되는 정방향 프라이머를 제시된 실험에서 사용하였다(세부사항은 방법 단락 참조). (약 7 카피의 T790M 돌연변이체를 함유하는) 50 pg H1975 게놈 DNA 또는 약 1100 카피의 야생형 EGFR DNA 주형(실시예 7에 기재된 바와 같이 제조됨)을 사용하여 셀렉터 어세이를 수행하였다. 증폭 생성물은 실시간 PCR 그래프에서 화살표로 표시되어 있다. (NTC: 주형 부재 대조군).
결과:
FAM-표지된 차단제(차단제 8), LC-레드 640-표지된 고착제(고착제 5), 차단제와 중첩되는 정방향 프라이머 및 이전 실시예에서 사용된 역방향 프라이머를 사용하여 셀렉터 어세이를 수행하였다. 50 pg H1975 게놈 DNA에서의 돌연변이체 증폭이 검출되었으나(약 7 카피의 T790M 돌연변이체), 약 1100 카피의 야생형 EGFR DNA 주형은 효율적으로 차단되었고 임의의 증폭을 보이지 않았다. 7 카피의 H1975와 대략 1100 카피의 야생형 EGFR의 조합은 돌연변이체 증폭을 다시 보여주었다.
방법:
셀렉터 어세이 반응을 하기 성분들을 함유하는 10 ㎕ 부피로 수행하였다: 0.5 μM 정방향 프라이머(5'-C*G*TGCARCTCA*T*C*A-3'; R=A/G; *는 포스포로티오에이트를 표시하고; 차단제와 중첩됨), 2 μM 역방향 프라이머(5'-T*G*TGTTCCCGGACAT*A*G*T-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시함), 0.4 μM 차단제 8(5'-2'OMe(U*C)*aucacgcagcu*c*a*(6-FAM)-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시하고; 소문자는 2'-플루오로 리보뉴클레오사이드를 표시함), 0.4 μM 고착제 5 (5'-LC-레드 640-C3-C3*T*GCCCTTCGGCTGCCTC*C*T*C3-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시하고; 소문자는 2'-플루오로 리보뉴클레오사이드를 표시하고; C3은 3-탄소 스페이서임), 3 mM MgCl2, 0.4 mM dNTP, 0.4 U 카파 HiFi 핫스타트 DNA 중합효소(카파 바이오시스템스, 카달로그 번호 KK2101), 1 x HiFi 완충제, 0.2 ㎕ ROX 기준 염료(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 12223-012). PCR 반응물을 384-웰 플레이트 상에 적재하였다. 하기 순환 조건을 이용하여 ABI 7900HT 기계에서 PCR 순환을 수행하였다: 5분 동안 95℃; 20초 동안 98℃, 30초 동안 61℃, 1분 동안 52℃ 및 15초 동안 69℃의 55회 주기 후; 해리 곡선 분석(1분 동안 95℃, 30초 동안 40℃, 그 다음 95℃까지 1% 상승). 52℃ 주기 단계 동안 LC-레드 640 형광을 모니터링함으로써 증폭 생성물의 검출을 수행하였다. 용융 곡선 분석을 위해, LC-레드 640 신호를 40℃에서 95℃로의 전이 동안 모니터링하였다.
실시예 15. 셀렉터 어세이를 사용한 KRAS G12C 돌연변이의 검출
야생형 게놈 DNA(대조군 혈액 17004; 약 14000 카피의 KRAS)와의 혼합물로 H2122 게놈 DNA(G12C 돌연변이에 대한 동형접합성)를 사용하여 증폭, 용융 곡선 분석 및 서열분석을 KRAS 셀렉터의 존재 또는 부재 하에서 수행하였다. 증폭 생성물은 실시간 PCR 그래프에서 화살표로 표시되어 있다(도 18 참조). KRAS G12C 돌연변이에 대해 특이적인 뉴클레오티드는 서열분석 결과에서 화살표로 표시되어 있다(야생형: C, G12C: A), 셀렉터 결합의 영역은 서열 아래에 상자로 표시되어 있다.
결과:
셀렉터의 존재 하에서 50 pg H2122 게놈 DNA(G12C 돌연변이에 대한 동형접합성; 약 14 카피)와 50 ng 야생형 게놈 DNA(대조군 혈액 17004; 약 14000 카피의 KRAS)의 혼합물을 사용하여 KRAS G12C 돌연변이에 대한 셀렉터 어세이 반응을 수행하였다. 본 발명자들은 돌연변이체 증폭을 검출할 수 있었고, 증폭 생성물의 용융 곡선 분석은 돌연변이체에 대해 특징적인 피크(약 52℃의 Tm)를 보여주었다. 이것은 G12C 돌연변이에 대해 특이적인 C>A 뉴클레오티드 변화를 보여준 서열분석에 의해 확인되었다(도 18, 상부 패널). 대조적으로, 셀렉터의 부재 하에서 동일한 양의 야생형 게놈 DNA는 돌연변이체와 비교되었을 때 약 12℃ 내지 64℃까지 이동된 용융 곡선 피크를 보여주었다. 서열분석은 증폭된 생성물에서 KRAS 야생형에 대해 특이적인 C 뉴클레오티드의 존재를 확인시켜 주었다(도 18, 하부 패널).
방법:
셀렉터 어세이 반응을 하기 성분들을 함유하는 10 ㎕ 부피로 수행하였다: 0.3 μM 정방향 프라이머(5'-A*T*ATAAACTTGTGGTAGT*T*G*G-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시함), 2 μM 역방향 프라이머(5'-G*C*ATATTAAAACAAGATTTAC*C*T*C-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시함), 0.3 μM 셀렉터 1(5'-2'OMe(A*G)*cugguggcg*u*a*(LC 레드 640)-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시하고; 소문자는 2'-플루오로 리보뉴클레오사이드를 표시함), 0.5 μM 레포터 2(5'-g*g*caa(6FAM)GAGTGCCuugacgauGGCAC*T*C*(댑실)-3'; *는 포스포로티오에이트를 표시하고; 소문자는 2'-플루오로 리보뉴클레오사이드를 표시함), 3 mM MgCl2, 0.4 mM dNTP, 0.4 U 카파 HiFi 핫스타트 DNA 중합효소(카파 바이오시스템스, 카달로그 번호 KK2101), 1 x HiFi 완충제, 0.2 ㎕ ROX 기준 염료(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 12223-012). PCR 반응물을 384-웰 플레이트 상에 적재하였고, 하기 순환 조건을 이용하여 ABI 7900HT 기계에서 PCR 순환을 수행하였다: 5분 동안 95℃; 20초 동안 98℃, 30초 동안 61℃, 1분 동안 52℃ 및 15초 동안 69℃의 55회 주기 후; 해리 곡선 분석(1분 동안 95℃, 30초 동안 40℃, 그 다음 95℃까지 1% 상승). 52℃ 주기 단계 동안 6-FAM 및 LC-레드 640 형광을 모니터링함으로써 증폭 생성물의 검출을 수행하였다. 용융 곡선 분석을 위해, LC-레드 640 신호를 40℃에서 95℃로의 전이 동안 모니터링하였다. 생거 서열분석을 위해, PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제 키트(퀴아젠)로 정제하였고, 서열분석 프라이머(CATAGCAGCTGTTTTCCCA GTCATCGACGTTGTACGTCCACAAAATGATTCTGAA)와 함께 빅다이® 터미네이터 v1.1 순환 서열결정 키트(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 4337449)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 서열분석 반응을 수행하였다. 센트리-셉™ 컬럼(라이프 테크놀로지스, 카달로그 번호 401762)을 사용하여 서열분석 반응물을 정제하고 3730 DNA 분석기 상에서 분석하였다.
퀴아앰프 DNA 혈액 미니 키트(퀴아젠, 카달로그 번호 51104)를 제조자에 의해 제공된 배양된 세포에 대한 프로토콜에 따라 사용하여 세포주(H1975, H2122)로부터 게놈 DNA를 준비하였다. 팩스진(PAXgene) 혈액 DNA 키트(프리어날리틱스, 카달로그 번호 761133)를 사용하여 대조군 혈액 샘플(ABR16965, 17004)로부터 게놈 DNA를 준비하였고, 혈액을 팩스진 혈액 DNA 튜브(프리어날리틱스, 카달로그 번호 761125) 내에 수집하였다.
실시예 16. 딥 벤트(엑소-) DNA 중합효소를 사용하는 PCR에서 프라이머 스위치 올리고뉴클레오티드 구축물의 사용에 의한 점 돌연변이 식별
결과:
단일 점 돌연변이에 의해 상이한 주형 서열들의 PCR 구별에 대한 프라이머-스위치 올리고뉴클레오티드 구축물의 효과를 평가하였다. T790M 돌연변이의 검출을 위한 프라이머-스위치 구축물을 시험하였다. 이것은 합성 야생형 및 돌연변이체 표적 서열들을 사용함으로써 수행되었다. 이들 연구를 위해 프라이머-스위치 구축물(도 19 참조)을 사용하였고 인터칼레이팅 SYTO® 9 염료를 사용하는 실시간 PCR 분석을 이용하여 개별 일치 및 불일치 표적으로 시험하였다(방법 단락 참조). 결과는 각각 23 및 27의 실시간 Cq를 제공하는, 야생형에 비해 약 4 델타 Cq의 돌연변이체 T790M 대립형질의 우세한 증폭을 보여주었다.
방법:
이들 연구를 위해, 2개의 단일 가닥 주형 서열들을 제조하였다. "야생형"으로 명명된 제1 서열(5'-TTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCGTGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGAT-3') 및 "T790M"으로 명명된 제2 서열(5'-TTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGCATGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGAT-3')을 제조하였다. 각각의 PCR 혼합물은 정방향 프라이머로서 스위치-차단제 프라이머(3'-ACTACTCGACGTGCCACCTCC-(5')-(S18)-(S18)-CTCATCACGCAGCTC-(C3)-3'; 소문자는 2'-플루오로 리보뉴클레오사이드를 표시하고; C3은 3-탄소 스페이서이고; S18은 스페이서 18(헥사에틸렌 글리콜)을 표시하고; (5')는 5'-CCTCCACCGTGCAGCTCATCA-3'의 역방향 합성을 표시함), 및 비변경된 역방향 프라이머(5'-CCGGACATAGTCCAGGAGGCAG-3')를 사용하였다. 0.2 mM dNTP, 1X 써모폴(Thermopol) 완충제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs); 20 mM 트라이스-HCl, 10 mM(NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% 트라이톤(Triton) X-100, pH 8.8 @ 25℃), 1 유닛의 딥 벤트(엑소+) 또는 딥 벤트(엑소-) DNA 중합효소(둘다 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 입수됨), 2 μM SYTO® 9(인터칼레이팅 염료; 라이프 테크놀로지스), 1.5 μM ROX(기준 염료; 아질런트(Agilent)), 및 105 카피의 야생형 또는 T790M 주형을 함유하는 25 ㎕ PCR 셋업에서 각각의 프라이머를 0.2 μM 농도로 사용하였다. 반응을 200 ㎕ 광학 튜브 내에서 삼중으로 준비하고 아질런트 MX3005P 실시간 열 순환기 상에서 수행하였다. 반응을 하기 열 순환 프로토콜로 수행하였다: 95℃ @ 10분; [95℃ @ 40초, 58℃ @ 30초, 72℃ @ 1분]의 40 주기; 및 72℃ @ 7분.
실시예 17. PCR에서 프라이머-스위치 올리고뉴클레오티드 구축물의 사용에 의한 점 돌연변이 식별 - 푸젼 ® 핫 스타트 II 고충실도 DNA 중합효소와 딥 벤트(엑소-) DNA 중합효소의 비교
결과:
본 연구는 실시예 16에서 사용된 동일한 프라이머-스위치 구축물 및 표적을 사용하였을 때 푸젼® 핫 스타트 II 고충실도 DNA 중합효소와 딥 벤트(엑소-) DNA 중합효소를 비교하였다. PCR 순환 조건은 실시예 16에서 사용된 조건과 약간 상이하였지만(방법 참조), 그 이외의 반응 조건은 동등하였다. 결과는 딥 벤트(엑소-) DNA 중합효소를 사용한 경우 야생형에 비해 돌연변이체의 증폭에 유리한(24.5 대 27.5) 약 델타 Cq=3을 제공하였지만, 푸젼 핫 스타트 II 중합효소는 약 델타 Cq=6만큼 야생형에 비해 돌연변이체 증폭에 유리하였다(22 대 28). 이 결과는 프라이머-스위치 구축물이 3'-핵산말단분해효소 활성을 보유하는 중합효소와 함께 효과적으로 작동할뿐만 아니라 3'-핵산말단분해효소 활성을 결여하는 중합효소와도 함께 효과적으로 작동한다는 것을 암시한다. 또한, 상기 결과는 3'-핵산말단분해효소 복구 활성을 갖는 효소가 바람직하다는 것을 암시한다.
방법:
방법 및 프라이머-스위치 구축은 하기 사항을 제외하고 실시예 16과 동일하였다. 푸젼® 핫 스타트 II 고충실도 DNA 중합효소 반응을 1X 푸젼® HF 완충제(뉴 잉글랜드 바이오랩스)에서 수행하였고, 1 유닛 푸젼® 핫 스타트 II 고충실도 DNA(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하였다. 추가로, 순환 조건은 다음과 같았다: 95℃ @ 3분; [95℃ @ 40초, 58℃ @ 30초, 72℃ @ 1분]의 40 주기; 및 72℃ @ 7분.
실시예 18. T790M 선택적 증폭을 위한 스위치-차단제 디자인
디자인:
스위치-차단제 방법들 중 하나를 이용하여 야생형과 비교된 T790M 대립형질의 선택적 증폭을 연구하기 위해 올리고뉴클레오티드를 디자인하고 합성하였다(도 20 참조). 어닐링 및 연장 온도 범위에 걸쳐 시스템의 시험을 가능하게 하기 위해 다수의 정방향 프라이머들을 제조하였다. 추가로, 5' 말단 BHQ1(블랙 홀 소광제 1) 소광제로부터 17개 뉴클레오티드만큼 떨어진 위치에 FAM 형광 표지를 배치함으로써 스위치-차단제를 "자체-보고" 스위치-차단제가 되도록 합성하였다. 이 배치는 혼성화 시 FAM 형광단과 BHQ1 소광제 사이의 최적 차별 분리를 달성하도록 선택되었다. 혼성화 시, 17개 뉴클레오티드에 의한 분리는 2개의 표지들을 이중체의 맞은 편 상에 배치하여 상기 2개의 표지들이 서로로부터 상당한 거리를 두고 존재하게 하는 데에 도움을 주는 대략 1.5 염기 회전과 동등하다. 혼성화 시, FAM 표지와 관련된 형광의 현저한 증가가 일어날 것이다. 정방향 프라이머 1: 5'-TGCCTCACCTCCACCGTGCA*G*C*T-3'. 정방향 프라이머 2: 5'-CCTCACCTCCACCGTGCA*G*C*T-3'. 정방향 프라이머 3: 5'-CTCACCTCCACCGTGCA*G*C*T-3'. 스위치 차단제: 5'-BHQ1*2'OMe(G*A*U)CACGCAGBBBBTGC(FAM)CCTTCGGCTGC-2'OMe(C*U*C)*C3-3'. 역방향 프라이머: 5'-TTGTGTTCCCGGACATAGTCCA*G*G*A-3'[*는 포스포로티오에이트를 표시함, B: 5-니트로인돌, C3: 3-탄소 스페이서].
상기 실시예들, 예컨대, 실시예 6 및 7에 기재된 조건을 이용한 이들 구축물의 평가, 및 어닐링 및 연장 온도의 범위에 걸친 시험은 이 스위치-차단제 T790M 구축물에 대한 최적화된 어세이 조건의 확립을 허용할 것이다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 예시하기 위한 것일 뿐이고, 이들에 비추어 볼 때 다양한 변경 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이고 본원의 사상 및 범위, 및 첨부된 특허청구범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.

Claims (1)

  1. 셀렉터 차단제에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결 또는 접합된 정방향 프라이머를 포함하는 프라이머-스위치로서, 상기 정방향 프라이머 및 셀렉터 차단제는 각각 하나 이상의 핵산 변이체의 존재 또는 부재 하에서 표적 영역 내의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 프라이머-스위치.
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