JP5424903B2 - 融解解析のためのプライマー - Google Patents
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Description
本出願は、融解解析のためのプライマーと題され、2007年3月8日に出願された米国仮特許出願番号60/905,721に基づく優先権を主張し、その全内容は参照として本明細書に援用される。
40%GC含量のM13配列の操作されたプラスミド鋳型を鋳型として用いた(25)。一つの位置でそれぞれA、C、G、またはTのいずれかをもつ以外は同一であるプラスミドを、研究のために使用した。“A”鋳型及び“C”鋳型の両方、並びに“A”鋳型及び“C”鋳型の等量を混合することによって形成された“A/C”ヘテロ型が調べられた。それぞれのプラスミドの濃度は、260 nmでの吸光度(A260)によって決定し、1.0のA260が50μg/mLと仮定した。用いられたM13プライマーは、フォワード
スナップバックプライマーのループ形成及び微分プロット上のスナップバック遺伝子型決定ピーク(低温度のピーク)の高さを上昇させるために、伸長ブロッカーを鋳型特異的なプライマーとスナップバックプライマーのプローブエレメントとの間に組み込んだ。フォワードプライマー中に“X”として示されるように、用いられたブロッカーは、Glen Researchから入手可能なdSpacer CE ホスホロアミダイト(cat. no. 10-1914-90)として組み込まれる脱塩基テトラヒドロフラン誘導体であった。10個の隣接するdSpacerユニットが、ポリメラーゼのブロックを確実にするために組み込まれた。用いられたプライマーは、フォワード
異なるプローブエレメント長を非対称性PCRを用いて調べた。用いたM13プライマーを表1に示し、ここにおいて大文字はプローブエレメント尾部を示し、小文字は鋳型特異的なプライマー領域を定義し、そして太字の塩基はスナップバックヘアピンが形成された後の鋳型上の可変位置を示す。
ゲノムDNAからのスナップバック遺伝子型決定の最初のいくつかの試みは、特によく機能したわけではなかった。非対称性PCRでは、増幅が阻害されたようであり、例えば60サイクル以上の、多くのサイクル後にのみ弱いシグナルが見られた。生じるメジャー鎖及びマイナー鎖をさらに考慮することにより、可能な説明及び解決が提供された。図7Aにおいて、非対称性PCR後に生産されたメジャー鎖及びマイナー鎖は共に、スナップバック構造で示される。メジャー鎖はその5'-端から伸長できないが、マイナー鎖はハイブリダイズしてポリメラーゼ基質を形成できる3'-端を実際に有する。伸長がこの3'-端から生じる可能性があり、このことがプライマーアニーリングを阻害し、そしてメジャー鎖形成を妨げる。この問題に対する一つの解決は、スナップバックプライマーの5'-端の最後の2塩基をミスマッチにし、それによりマイナー鎖からの伸長を不可能にすることである(図7B)。2塩基を例示的なミスマッチのために用いる一方、1塩基のミスマッチはいくつかの伸長を阻害するだろうし、所望する場合にはより多くの塩基をミスマッチへ付加することができると理解される。ミスマッチは、増幅の連続するラウンドへ繰り越されるだろう。
実施例4のような2塩基末端ミスマッチを有するスナップバックプライマーを使用して、異なるアンプリコン長を調べた。スナップバックプライマーからSNP部位までの距離を一定にし(二次構造のループが同じであるようにする)、一方でアンプリコンの長さを変化させた。非対称性PCRを実施例3のように行った。用いたM13プライマーを表3に示し、ここで大文字はプローブエレメントまたは尾部を表し、小文字は鋳型特異的なプライマー領域を定義し、小文字の斜体は標的に対してミスマッチである塩基を示し、そして太字の塩基はスナップバックヘアピンが形成された後の鋳型上の可変位置を示す。
ループ長を変えることの影響を、スナップバックプライマーと調べられる部分の間の距離を変えることによって調べた。実施例3のように非対称性PCRを行った。用いられたM13プライマーを表4に示し、ここで、大文字はプローブエレメントの尾部を表し、小文字は鋳型特異的なプライマー領域を定義し、そして太字の塩基はスナップバックヘアピンが形成された後の鋳型上の可変位置を示す。この事例では、プローブエレメントに隣接する2 bpの5'-ミスマッチを用いなかった。
一つのスナップバックプライマーを使用して、さまざまなプラスミド鋳型を増幅し、プローブエレメントの融解曲線の形状が増幅される配列に依存することを示す。四つの異なるM13プラスミドを標的として用い、ここでそれぞれのプラスミドは一つの位置のみA、C、G、またはTで異なる。本実施例では、ホモ型遺伝子型決定をシミュレートするために、わずか一つのマッチしたまたはミスマッチのプラスミドを用い、一方でヘテロ型をシミュレートするために、等しい割合で混合した二つのプラスミドを用いた。非対称性PCRは実施例3のように行った。用いたM13プライマーは1F tcattctcgttttctgaactg(SEQ ID NO: 5)及び1R22Tmis10
異なるプローブエレメントをもつスナップバックプライマーを使用して、同じ標的配列を増幅した。プローブエレメントは、同じ長さのアンプリコンをもち、プローブエレメントに沿った異なる位置に可変塩基を置くように設計された。プローブエレメントの長さは22塩基であり、2、8、14、または20の位置に置かれた可変塩基をもち、26〜44塩基のループ長及び120 bpのアンプリコンの大きさをもたらす。ループ長は最大18塩基の差異まで変化させたが、これは絶対Tmにのみ影響するはずであり、ヘテロ型からホモ型を区別する能力に影響しない。非対称性PCRは実施例3のように行われた。用いられたM13プライマーは表5に示され、ここで、大文字はプローブエレメントまたは尾部を表し、小文字は鋳型特異的なプライマー領域を定義し、小文字の斜体は標的に対してミスマッチである塩基を示し、そして太字の塩基はスナップバックヘアピンが形成された後の鋳型上の可変位置を示す。
スナップバックプライマー遺伝子型決定を、CFTR変異G542X、すなわちエキソン11におけるGからTへの一塩基変化、について行った。遺伝子型決定されたヒトゲノムDNA試料をCoriell Institute for Medical Research(Camden, NJ)から入手し、そしてPCRにおいて50 ng/μLで用いた。制限フォワードプライマーはtgtgcctttcaaattcagattg(SEQ ID NO: 36)(0.05μM)であり、そしてリバーススナップバックプライマーは
スナップバックプライマー遺伝子型決定を、F507del、F508del、及びF508Cを含むエキソン10中のCFTR変異ホットスポットで行った。遺伝子型決定したヒトゲノムDNA試料を、Coriell Institute for Medical Research(Camden, NJ)から入手し、PCRにおいて50 ng/μlで用いた。制限フォワードプライマーはacttctaatgatgattatggg(SEQ ID NO: 38)(0.05μM)であり、そしてスナップバックリバースプライマーは
スナップバック遺伝子型決定を、他の融解技術と同様に、温度軸に沿って多重化することができる(9)。例えば、二つ以上のプライマーセット(それぞれ一つのスナップバックプライマーをもつ)を使用して、例えばそれぞれのプローブエレメントにより全てのアレルを融解温度で分けることにより、複数部分を増幅し、そして遺伝子型決定する。あるいは、アンプリコン内の複数の部分を、定常領域間の鋳型をループさせることにより一つより多くの部分をそれぞれ調べることができる、二つのスナップバックプライマーを用いた増幅、または一つのスナップバックプライマーと一つの非標識プローブを用いた増幅で、遺伝子型決定することができる(13)。
さまざまなプローブエレメントをさまざまなフルオロフォアで“色づけ”できれば、さらなる多重化が可能だろう。このアプローチはiFRET(誘導性蛍光共鳴エネルギー移動)で示され、ここで、DNA二本鎖の存在下のdsDNA色素(SYBR Green I)の溶液は、二本鎖の鎖に共有結合したアクセプター色素へドナー蛍光を提供する(14)。
スナップバックプライマーでの非対称性増幅は、遺伝子型決定のためのヘアピン及びアンプリコンスキャニングのための二本鎖産物の両方を生産する。したがって、同じ融解曲線からの遺伝子型決定及びスキャニングの両方が、スナップバックプライマーにより可能である。そのような方法についてのスキーム図を図17に示す。スナップバック遺伝子型決定は、通常非対称性PCRで行われるので、アンプリコンシグナルは対照の増幅でのものほど強力ではなく、そしてヘテロ型スキャニングの正確性は現在のところ未知である。にもかかわらず、一つのプロセス中で変異をスクリーニングし、そして特異的配列変異を遺伝子型決定する可能性は、魅力的であり、そして全遺伝子解析における配列決定についての負荷の99%を潜在的に削減する可能性がある。プライマー間の配列における任意の配列の違いは、アンプリコン融解転移を歪め、形成されるヘテロ型二本鎖のために温度を低下させる。くわえて、スナップバックヘアピンで、プローブエレメントについての共通変異を限定的に同定することができる。ホモ型変異もプローブエレメントによって同定されるが、アンプリコン融解を変化させることはできない。最終的に、アンプリコン転移がヘテロ型変異を示すがスナップバック転移が正常である場合、プローブ化された領域の外の稀なまたは新しい変異が示唆され、そして同定のための配列決定が必要とされる可能性がある。
アレル特異的増幅とスナップバックプライマー遺伝子型決定とを組合せることによって、ハプロタイプ決定のための単純な方法を提供する。二つの遺伝子座、A及びB、それぞれが二つのアレル、A1、A2、及びB1、B2をもつものを考える。スナップバックプライマーのプライマーエレメントをA座とアニールするように設計し、そしてスナップバックプライマーのプローブエレメントをB座とアニールするように設計し、B座が二つのプライマーにより増幅されるように、第二のプライマーはB座に隣接するように設計する。スナップバックプライマーをA座のアレル1を伸長するためにのみ設計すれば(例えばA座の可変部位に3'末端を配置することによる)、プローブエレメントを融解することによって同定されるB座のタイプはA1アレル(と同一のハプロタイプ)と関連しなければならない。よって、プライマーエレメントがA1を伸長させ、プローブエレメントがB1とマッチし、そしてプローブ融解曲線がマッチすることを示す場合、A1B1ハプロタイプが存在する。プローブ融解曲線がミスマッチを示す場合、A1B2ハプロタイプが存在する。プライマーエレメントがA2を伸長させ、プローブエレメントがB1とマッチし、そしてプローブ融解曲線がマッチすることを示す場合、A2B1ハプロタイプが存在する。プローブ融解曲線がミスマッチを示す場合、A2B2ハプロタイプが存在する。
Claims (14)
- 標的核酸を増幅するために構成された第一のプライマー及び第二のプライマーと標的核酸とを混合して混合物を作る工程であって、ここで第一のプライマーは標的核酸の部分に特異的なプローブエレメント及び鋳型特異的なプライマー領域を含み、このプローブエレメントは鋳型特異的なプライマー領域の5’にある、前記工程、
標的核酸を増幅してアンプリコンを生成する工程、
プローブエレメントを前記部分とハイブリダイズさせてヘアピンを形成する工程、及び
前記混合物を加熱するにつれて、第一のプライマーに共有結合していないdsDNA結合色素からの蛍光を測定することによりプローブエレメントについての融解曲線を生成する工程、
を含む、核酸を解析する方法。 - 非対称性増幅のために、第一のプライマーが第二のプライマーより高い濃度で提供される、請求項1に記載の方法。
- 第一のプライマーがプローブエレメントの5’のミスマッチ領域をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第一のプライマーが、共有結合した色素またはクエンチャーを全く有さないオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 第一のプライマーが伸長ブロッカー(extension blocker)を有さない、請求項4に記載の方法。
- 第一のプライマー及び第二のプライマーが本質的に同じ濃度で提供され、そして第二のプライマーが標的核酸の第二の部分に特異的なプローブエレメント及び鋳型特異的なプライマー領域を含み、ここで第二のプライマーのプローブエレメントは鋳型特異的なプライマー領域の5’にある、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸を増幅した後、融解曲線を生成する前に、アンプリコンを希釈する工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- ヘアピンが20〜50塩基の間のループを有する、請求項1に記載の方法。
- プローブエレメントが10塩基未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記部分が既知の一塩基多型を有し、そしてこの一塩基多型はプローブエレメントの端から8塩基以上離れて位置する、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸が第二の部分をさらに含み、そして
第一のプライマーの鋳型特異的なプライマー領域が第二の部分の特定のアレルが存在した場合のみ標的核酸を増幅するように構成されている、
請求項1に記載の方法。 - 融解曲線の形状を解析する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 混合物を、標的核酸を増幅した後、融解曲線を生成する前に、プローブエレメントのヘアピン形成を促進するように調節する、請求項1に記載の方法。
- 増幅をプラトー段階に達する前に終わらせ、アンプリコン濃度を制限する、請求項1に記載の方法。
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