CN101918587B

CN101918587B - 用于熔解分析的引物

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Publication number: CN101918587B
Application number: CN2008800148410A
Authority: CN
Inventors: C·T·威特沃; L·周; M·A·普瑞茨
Original assignee: Biofax Diagnostics Co ltd; University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: Baiou law protection limited liability company; University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 2007-03-08
Filing date: 2008-03-07
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2028-03-07
Also published as: AU2008222649A1; US20160348157A1; EP2134861B1; AU2008222649A8; EP2134861A4; ATE554187T1; AU2008222649B2; EP2134861A2; JP5424903B2; CA2680121C; US8399189B2; ES2386487T3; DK2134861T3; CN101918587A; WO2008109823A3; US9771610B2; WO2008109823A2; US20100196890A1; CA2680121A1; JP2010520756A

Abstract

本发明提供了用于核酸分析的方法和试剂盒。在一个例证性的方法中，应用第一引物和第二引物扩增靶核酸，其中第一引物包含特异于靶核酸的一个位点的探针元件以及模板特异的引物区，并且所述的探针元件在模板特异引物区的5’端，从而使得探针元件杂交至所述位点以形成发夹，当混合物被加热时通过测量结合染料的dsDNA的荧光生成探针元件的熔解曲线，其中所述的染料非共价结合至第一引物，并分析熔解曲线的形状。试剂盒可以包括一个或多个第一和第二引物、结合dsDNA的染料、聚合酶以及dNTPs。

Description

用于熔解分析的引物

优先权

本申请要求2007年3月8日提交的题为“用于熔解分析的引物”的美国临时申请60/905,721的优先权，其全文在此通过引入的方式纳入本文。

背景技术

人类基因组计划已经成功地测序了人类DNA的大部分区域。鉴定与疾病相关的基因和序列变异的工作以飞快的速度持续着。连锁分析被用于建立表型与诸如简单序列重复或单核苷酸多态性(SNPs)的遗传标记之间的联系，以鉴定候选基因。序列变异包括导致错义、移码或剪切突变的SNPs、插入以及缺失，并可用于精确定位相应突变的基因和频谱。

然而，即使遗传信息为人所知，仍难以将这些知识应用在常规医疗实践中，很大程度是因为分析DNA的方法昂贵且复杂。当费用显著降低并且方法明显简化时，可以预期DNA分析适宜用在日常临床实践以有效检测疾病及更好地治疗。理想的DNA分析是快速、简单并且廉价的。

当疾病是由有限数量的突变导致，或少数序列改变构成大比例的病例时，直接基因分型是可行的。传统的方法包括经典的PCR产物限制性消化到封闭管荧光方法。DNA分析的封闭管方法可简单地施行。一旦PCR起始，不再需要加入或分离其它的试剂。然而，封闭管方法传统上是昂贵的，很大程度上归结于所使用的荧光探针的费用。尽管有很多精巧的设计，这些探针通常与多个荧光染料和/或功能团复合。例如，一个流行的方法应用荧光染料和淬灭剂，其每一个共价地连接至等位基因特异的探针(1)。分型一个SNP需要两个这样的

探针。不仅仅是这些探针昂贵，杂交以及核酸外切酶切割所需的时间同样限制了PCR施行的速度。

封闭管基因分型的另一个例子应用了

引物，其可从DxS Ltd(DxS有限公司)获得。最初在1 999年描述过，引物，或“自探测扩增子”在PCR中从包括包含探针元件的5’延伸物的引物、一对自补茎序列、一对荧光团/淬灭团以及阻止5’延伸物复制的封闭单体中形成(2)。如图1所示，在起始的茎环形式中，探针元件形成环，茎部分使荧光团和淬灭团紧密靠近。在PCR后，探针元件与延伸产物的一部分杂交，打开茎并将荧光团和淬灭团分开。随后形成图1所示的附加的二聚体形式，其中

引物上的荧光团被在PCR之前形成二聚物的独立互补探针上的淬灭团淬灭(3)。在PCR之后，成为扩增子的一部分的探针元件，从淬灭探针中分离并杂交至扩增子。在这两种情况中，探测是分子内的反应。

分子内反应相对于分子间反应有几个优点。首先，分子内反应迅速且不是限制步骤，即使与目前最快速的PCR方案一起也是如此(4)。探针元件通过分子内反应稳定，增加了探针熔解温度约5-15℃，使得可应用更短的探针在例如具有高序列变异的区域。在茎环形式中，单个的寡核苷酸既充当引物之一，又充当探针。然而，这些探针可能是复杂并且昂贵的。高成本是由生产某些探针的高度复杂性造成的。例如，每个

引物需要对寡核苷酸引物进行三个修饰(荧光团、淬灭团以及封闭体)。保留引物的优点但消除了其复杂性和花费的封闭管荧光基因分型系统是可取的。

还有另一种用于基因分型的方法，“回转单链构象多态性检测，或SSCP”已经被应用。SSCP应用将二级结构引入随后通过电泳分离以揭示单链构象多态性(“SSCP”)的PCR产物的特异序列引物(5)。在回转SSCP中，互补的8-11bp的引物尾端在延伸产物中的互补序列上环回，在单链扩增子上产生一个发夹，其随后通过凝胶分离检测。

如同上面所讨论的，回转引物(Snapback primer)可用于在延伸产物中引入二级环结构。然而，回转引物以及本发明所讨论的其它现有技术的方法依赖于扩增后的凝胶分离，或应用昂贵的荧光标记的引物。相反，本发明的方法应用dsDNA染料以及熔解分析来监测发夹的杂交。根据本发明的一个方面，在PCR之后，阐述性地而不限于非对称PCR，发夹的分子内熔解使得可以基因分型。分子内杂交展示在图2中。该方法简单，因为仅需要两个PCR引物，仅在至少一个引物的核苷酸上附加5’尾。不需要共价的荧光团、淬灭团或封闭体，极大地削减了合成和分析开发的费用。因此，在一个示范性的具体实施方式中，dsDNA染料是无束缚的并自由地结合以及基于熔解独自地从核酸释放。

一个阻止了更好的基因分型的方法的问题是大多数遗传疾病是复杂的这个事实。在相同或不同基因中的许多不同的序列变异可能促成疾病表型。最初希望大多数疾病由少数序列变异所导致已经被证明是不正确的。很多基因可以促成特定的表型，并且一个基因内的许多不同突变可以导致相同或相似的疾病模式。因而，为确定基因型及其产生的表型之间的联系，遗传检测通常要求平行分析很多编码和调节区域。有几种可用的筛选DNA异常的方法并作为“扫描”方法为人所知。虽然“基因分型”重点于检测特异序列突变，但突变扫描可以标签异常的存在，所述的异常随后可通过诸如基因分型或测序的方法鉴定。

测序是目前鉴定序列变异的黄金标准。即使费用在下降，当应用于特异遗传诊断或药物遗传学时，测序仍然是复杂的过程，不是快速、简单或廉价的。应用polonies PCR(6)或乳化PCR(7)的方法也是如此。标准测序要求七步：1)PCR扩增，2)清理PCR产物，3)循环测序试剂的添加，4)双脱氧末端终止的循环测序，5)终止产物的清理，6)通过毛细管电泳分离，以及7)数据分析。复杂度是自动的并存在于一些测序中心，但测序仍旧比本发明的方法更复杂。进一步地，当分析大基因或多个基因时，超过90％的测序产物正常返回。能够识别正常序列以及常规突变的简单方法将消除大部分的时间、费用以及测序努力。

本发明的回转引物可用于在同一反应中整合突变扫描以及基因分型。扫描可以通过同一反应中的高分辨率扩增子熔解(8)来实施，并应用相同的熔解曲线作为回转基因分型。用于回转基因分型的非对称PCR产生两种具有不同熔解转换的类型，即成发夹构型的多余单链以及双链PCR产物，优选地每种类型在不同温度熔解。示范性地，回转发夹在低温下熔解，全长扩增子在高温下熔解。发夹提供了常规突变的靶向分型，而全长扩增子允许扫描PCR产物内的任意序列突变。相似地，应用两个回转引物的对称PCR可用于在一个反应中扫描以及分型两个已知的多态性。在一个具有精确扩增熔点的已良好表征的基因中，据信回转基因分型一般可以消除至少90％以及可能高达99％的在复杂遗传疾病分析中的测序需求。

扫描以及基因分型与回转引物的组合是有吸引力的，因为其仅仅需要PCR试剂和dsDNA染料。不需要昂贵的修饰寡核苷酸、分离、纯化或添加试剂的步骤。封闭管分析消除了PCR污染的风险。此外，回转引物退火迅速并且与最快速的PCR方案兼容。

发明概述

因此，本发明描述了不同构型的回转引物。

本发明一个方面提供了用于核酸分析的方法，所述的方法包括以下步骤：混合靶核酸与第一引物和第二引物以形成混合物，所述引物被设计成用于扩增靶核酸，其中第一引物包含特异于靶核酸一个位点的探针元件和模板特异的引物区域，其中所述探针元件在模板特异引物区域的5’端，扩增靶核酸以产生扩增子，使得探针元件杂交至所述位点以形成发夹，当混合物被加热时通过测量结合dsDNA的染料的荧光生成探针元件的熔解曲线，其中所述染料非共价结合至第一引物，并分析熔解曲线的形态。本发明提供了这种方法的多种变化。

本发明的第二个方面提供了用于同时扫描并基因分型靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：混合靶核酸与第一引物和第二引物以形成混合物的步骤，该引物被设计成用于扩增靶核酸，其中第一引物包含特异于靶核酸一个位点的探针元件和模板特异的引物区域，其中所述探针元件在模板特异引物区域的5’端，扩增靶核酸以产生扩增子，当混合物被加热时通过测量结合dsDNA的染料的荧光生成扩增子的熔解曲线，通过探针元件分子内结合至靶核酸调节混合物以促成发夹形成，和当混合物被加热时通过测量结合dsDNA的染料的荧光生成探针元件的熔解曲线。

在本发明的第三个方面，提供了一种用于核酸分析的试剂盒，所述的试剂盒包含有第一引物和第二引物，所述引物被设计成用于扩增靶核酸，其中第一引物包含特异于靶核酸一个位点的探针元件和模板特异的引物区域，并且所述探针元件在模板特异引物区域的5’端，以及dsDNA结合染料。在一个示范性的实施例中，所述dsDNA结合染料是饱和染料。在另一个示范性的实施例中，试剂盒还包含热稳定的聚合酶和dNTPs。

在考虑以下例证实施本发明最佳模式的优选具体实施方式的详细描述后，本发明的附加特征对于本领域技术人员而言将会是显而易见的。

发明简述

图1显示了

引物作用的示意图。黑色环是封闭体，红色环是淬灭团，小绿色环是淬灭的荧光团，大绿色环是未淬灭的荧光团。

图2显示了回转引物的分子内杂交。

图3显示了应用饱和染料以及未标记寡核苷酸探针的SNP基因分型。

图4是应用回转引物的基因分型示意图。

图5A显示了对称PCR之后的应用回转引物的基因分型。基因型显示为C/C(蓝色)，A/A(黑色)以及A/C(红色)。

图5B显示了应用具有延伸封闭体的回转引物的基因分型。

图6A图解了具有不同长度探针元件的回转引物。

图6B是图6A探针元件的扩增产物的熔解导数图(derivative meltingplot)。

图6C-F显示了应用具有不同探针元件长度的回转引物的SNP分型的熔解导数图：图6C具有8碱基探针元件；图6D具有14碱基探针元件；图6E具有20碱基序列；图6F具有24碱基序列。

图6G显示了6到28个碱基对的不同发夹二聚体长度的预测及观测到的熔解温度。碱基错配不存在于回转引物的5’末端。预测的熔解温度(实心方块)通过标准的最邻近计算确定，包括两边的悬挂末端，但不考虑发夹环。在非对称PCR和熔解之后，观测到的Tms(实心圆圈)通过如归一化以及指数背景减法之后的负导数图上的最大峰高确定。发夹二聚体的GC％在8.3-32.1％变动。

图7A-B图解了应用回转引物的PCR抑制的可能机制，图7A显示了小链3’末端的可能延伸，图7B显示了两个碱基错配是如何阻止延伸的。

图7C显示了应用具有图7B中图解类型的双碱基错配的回转引物的一百个临床样品的标准化导数熔解图。基因型为纯合子野生型(黑色)、杂合子(浅灰色)以及纯合突变子(深灰色)。

图8A显示了具有阻止从发夹延伸的双碱基错配的回转引物中8、12、16、20碱基探针元件的熔解导数图。

图8B显示了以纯合子和匹配的杂合子模板非对称扩增后的12以及16碱基探针元件的熔解导数图。

图9A图解了不同长度的回转扩增子，其中扩增子的长度是：1＝120bp，2＝180bp，3＝221bp，4＝271bp以及5＝321bp。

图9B显示了图9A中扩增子的熔解导数图，黑色(120bp)，红色(180bp)，蓝色(221bp)，绿色(271bp)以及黄色(321bp)。

图10A图解了具有不同环大小的回转扩增子。环长度是：0R＝17碱基，1R＝34碱基，2R＝88碱基，3R＝135碱基，4R＝177碱基以及5R＝236碱基。

图10B显示了图10A扩增子的熔解导数图。没有应用指数背景减法，解释了导数曲线的下行。

图11A显示了其中回转引物用于扩增四种不同纯合子模板的熔解导数图，每种纯合子唯一不同的是在可变位点上具有一个不同的碱基。

图11B显示了其中回转引物用于扩增一个配对纯合子模板以及三个共享一个配对等位基因的不同杂合子模板时的熔解导数图。

图11C显示了其中回转引物用于扩增一个配对纯合子模板以及具有两个错配至探针元件的等位基因的三个不同杂合子模板时的熔解导数图。

图12A-B显示了当回转引物具有一个邻近22碱基探针元件末端的错配时的熔解导数图。图12A证明了位置2的一个错配，而图12B在位置20具有错配。

图12C-D显示了其中回转引物具有邻近22碱基探针元件中间的错配时的熔解导数图。图12C在位置8有错配，而图12D在位置14有错配。

图13显示了应用回转引物的囊性纤维变性G542X突变的熔解导数图。基因型显示为纯合野生型(蓝色)，杂合子(黑色)以及纯合突变子(红色)。

图14A-B显示了询问CFTR外显子10的F507-F508区域的回转引物探针元件的导数图(图14A)以及标准化熔解曲线(图14B)：野生型(黄色)，F507del het(黑色)，F508del het(蓝色)，F508C het(红色)以及F508del homo(绿色)。

图15显示了应用询问CFTR外显子10的双向回转引物的多位点基因分型的导数图：野生型(圆)，化合物F508del/Q493X杂合子(连接的小菱形)，I506V杂合子(小菱形)，F508C杂合子(小方块)，I507del杂合子(大方块)，F508del杂合子(连接的大菱形)以及F508del纯合子(连接的方块)。

图16显示了应用5’-LCRed640标记的回转引物(在72℃红跟踪熔解)的从LCGreen Plus至LCRed640的共振能量转移的导数图。相比较地，非粘附LCRed640标记的探针的熔解曲线以蓝色显示，在63℃具有熔解转换。

图17是应用回转引物的基因分型和扫描的示意图。

图18A-B显示了应用对称PCR以及一个回转引物的CFTR外显子4的同时突变扫描和基因分型。图18A显示了在以水稀释前全长扩增子的熔解曲线，而图18B显示了在以水10倍稀释后的导数曲线。在稀释后，在熔解前样品通过加热变性并冷却：野生型(黑色)以及R117H杂合子(红色)。

发明详述

(英杰生命技术有限公司(Invitrogen Corp)，加利福尼亚州的尔斯巴德)是一种广泛用于熔解分析的染料，原因是其在PCR过程显示出巨大的荧光改变(10，15)。

首先被用于熔解分析以区分在Tm上有2℃或更多差异的不同PCR产物(21)。随后，

被用于鉴别缺失(16)，二核苷酸重复序列基因型(17)，以及鉴别各种序列变异(18-21)。然而，基因型之间的Tm差异可以很小并可以挑战现有设备的分辨率。实际上，有人建议

“不应当用于常规基因分型应用”(22)。一般地应用双链特异DNA染料的熔解曲线基因分型可导致具有扩大熔解转换的升高的Tm(23)，以及基因型间Tm差异的压缩。这些因素降低了

用于基因型区别的可能性。

杂合子DNA由四种不同的在变性以及冷却时可产生两种同源二聚体以及两种异源二聚体产物的单链组成。理论上，所有具有不同Tms以及熔解曲线的四种产物应当是所有四种双链至单链转换的复合体。然而，双链特异DNA染料在熔解过程中可重新分布(24)，导致染料从低熔解异源二聚体释放并重新分布于高熔解同源二聚体。因为

在PCR兼容浓度中是不饱和的(10)，这种重新分布是似是而非的，并且与所观察到的异源二聚体转换的缺席相符合。

最近，

和(爱德霍技术有限公司(IdahoTechnology，Inc.)，犹他州的盐湖城)以及各种其它的饱和染料已被开发用于高分辨率应用，包括用于基因分型和扫描(参见共同未决美国专利申请10/531,996，10/827,890，11/485,851，11/931,174，在此将其全文以引入的方式纳入本文)。当仅有一个PCR产物被扩增，并且序列是纯合子时，仅有同源二聚体形成。应用饱和染料，不同同源二聚体基因型之间的Tm值差异未被缩小，基因型间的明确区分是可能的，甚至对于SNPs也是如此。这种饱和染料也可以用于鉴定和区分一个反应中存在的多个产物，例如多位点或多靶点扩增中生成的同源二聚体(纯合子)。相反，大多数情况下仅有一些产物可采用

观察到，这大概是由于染料再分布导致。

当一个或多个杂合子靶被扩增时，应用饱和染料可容易观察到异源二聚体产物。检测和鉴定异源二聚体的能力对检测杂合子基因型以及扫描未知突变特别有用。在很多情况下，在实时PCR中应用传统dsDNA染料(诸如

以及溴化乙锭)是不可能的，其中异源二聚体产物通常不可观测。

应用饱和染料，将所有单碱基杂合子从纯合子中区分出来是可能的。在杂合子的检测中，绝对熔解温度以及DNA浓度的影响不如在涉及纯合子基因型区分方法中的重要。异源二聚体影响熔解曲线的形态，特别是在“早期”，转换的低温部分。不同的熔解曲线可以是通过转换X轴为叠加“后期”转换高温部分而匹配的温度。然后异源二聚体的存在与否可以以更高的正确率推断出来。

未标记的寡核苷酸可与饱和染料相组合用于通过封闭管熔解分析的基因分型(11)。示范性的，互补于未标记探针的产物链通过非对称PCR过量产生，示例性地，互补引物为5-10倍的过量。未标记探针可在3’末端封闭以阻止延伸，但不需要其它的修饰。基因组DNA未标记探针基因分型的典型结果如图3所示。带有囊性纤维变性SNP G542X突变的片段在28聚体的未标记探针存在下扩增(11)。显示了应用匹配野生型(顶部)或突变型(底部)的探针的所有三种基因型(纯合野生型-黑色实线，杂合子-红线，以及纯合突变体-虚线)。应用未标记探针可以分型探针下的区域，如图3所示的，并且可以应用完整扩增子的熔解曲线扫描扩增子其它位置的突变，所述扩增子通常具有更高的熔解转换。

然而，封闭未标记探针的3’末端以阻止延伸通常是所希望的。封闭体是额外费用。此外，未标记探针基因分型需要三个寡核苷酸：两个引物以及额外的未标记探针。此外，当未标记探针相对较长(通常为25-35碱基)时能给出最佳信号(11)。最后，分子间杂交要求未标记探针可以被靶序列的二级结构所封闭，因为分子间杂交通常比二级结构的分子内杂交要慢。

本发明公开的回转引物解决了很多这样的问题。首先，仅需要两个寡核苷酸，示例性地，一个标准引物以及一个带有作为整合探针元件的短尾的引物。其次，不需要封闭3’末端，因为探针元件是引物5’末端的一部分，并且引物的延伸是期望的。最后，回转引物杂交是分子内的，因此杂交迅速并且几乎不涉及内部结构。当应用饱和染料时，饱和染料可在扩增中以足量浓度存在以检测扩增子熔解后的异源二聚体。因此，回转引物和饱和染料的组合提供了一种封闭管溶液核酸分析方法。然而，尽管本发明实施例应用饱和染料，但应当理解所述的回转引物可以与其它染料一起使用，特别是不需要高分辨率或染料在扩增之后加入不成为问题时。

示例性回转基因分型方案在图4中做了图解。回转引物显示于左侧，其具有不杂交至靶核酸20的尾8。标准引物12显示于右侧。示例性地，核酸通过非对称PCR扩增，从回转引物10延伸出比互补片段16更多的链14。然后冷却扩增产物，生成来自回转引物10的分子内发夹产物30与一些双链全长扩增子40的混合物。扩增混合物的导数熔解物(derivativemelt)产生代表发夹结构35熔解的低温峰，以及代表全长扩增子40熔解的高温峰。

尽管本发明的实施例采用PCR作为扩增方法，但应当理解任何整合了引物的扩增方法都是合适的。这些合适的方法包括聚合酶链式反应(PCR)；链置换扩增(SDA)基于核酸序列的扩增(NASBA)；级联滚环扩增(CRCA)；DNA的环介导等温扩增(LAMP)；等温以及嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)；基于靶的解旋酶依赖扩增(HAD)；转录介导的扩增(TMA)等等。因此，当应用术语“PCR”时，应当理解其包括其它替代扩增方法。

此外，尽管针对扩增后基因分型进行参考，但应当理解本发明所描述的引物可用于检测和/或定量。在这些方法中，回转引物既作为引物也作为探针，如同本领域所熟知的那样。

实施例1.在对称PCR之后采用回转引物基因分型

应用具有40％GC含量的M13序列的工程质粒模板作为模板(25)。不然，在一个位点上具有A、C、G或T的相同质粒可用于研究。研究了“A”模板和“C”模板，以及通过混合等量“A”和“C”模板形成的“A/C”杂合子。每种质粒的浓度通过260nm(A₂₆₀)处的吸光度测定，假设1.0的A₂₆₀是50μg/mL。采用的M13引物是：正向5′-AATCGTCATAAATATTCATTGAATCCCCtcattctcgttttctgaactg-3′(SEQID NO.1，在帽端具有尾并且以粗体显示回转发夹形成后模板上的可变位置)，反向5′-atgtttagactggatagcgt-3′(SEQ ID NO.2)，其形成一个约130bp的PCR产物。

PCR在10μl反应容积中实施，所述反应体积具有50mM Tris(pH8.3)，500μg/ml牛血清白蛋白，3mM MCl₂，200μM的各种脱氧核苷三磷酸，0.4U的Klen Taq聚合酶(AB肽)，0.5X的(爱德霍技术有限公司)，0.5μM的引物以及10⁶拷贝数的“A”质粒或相同浓度的“A”和“C”质粒1∶1的混合物。PCR在(罗氏)中循环35次，在95℃变性(保持0秒)，在50℃退火(保持0秒)，以2℃/s的速度上升至72℃的延伸温度并在72℃保持8秒。PCR之后，毛细管样品在94℃变性(保持0秒)并冷却至40℃。除非另外指出，所有温度间的转换速率设定为20℃/s。从LightCycler移出样品，放置入高分辨率熔解仪器HR-1^TM(爱德霍技术有限公司)，以0.3℃/s的速率从50℃升高至87℃熔解。通常，从熔解曲线中扣除指数背景，示例性地如描述于PCT/US2006/036605中的那样，本文将其全文在此以引用的方式纳入，曲线被归一化并通常以导数图展示。由此所得的导数熔解曲线见图5A。

图5A显示了A/C SNP所有基因型的导数熔解曲线。扩增子(78-82℃)和回转探针(66-73℃)的熔解转换都是明显的。首先就扩增子区域而言，C纯合子的峰比A纯合子具有更高的温度，如同所预期的那样。此外，由于异源二聚体的影响，AC杂合子显示出更低温度下的宽广转换(12)。回转引物中探针元件的熔解取决于基因型。配对完好的A模板在最高的温度(71℃)熔解，错配的C模板在68℃熔解，而杂合子显示两种温度的熔解峰。尽管信号强度低，通过观测回转引物探针元件的熔解来基因分型的能力还是显而易见的。

实施例2.应用对称PCR的具有延伸封闭体的回转引物基因分型

为增加回转引物环的形成以及导数图上回转基因分型峰(低温峰)的高度，在模板特异引物以及回转引物的探针元件之间整合入延伸封闭体。如正向引物中的“X”所显示的，应用的封闭体是可从革兰研究公司(GlenResearch)获得的作为dSpacer CE磷酰胺整合的脱碱基四氢呋喃(货号10-1914-90)。整合十个连续的dSpacer单元以确保聚合酶的封闭。应用的引物是：正向5′-AATCGTCATAAATATTCATTGAATCCCC(X)₁₀tcattctcgttttctgaactg-3′(SEQ ID NO.3，在帽端具有尾并且以粗体显示回转发夹形成后模板上的可变位置)，反向5′-atgtttagactggatagcgt-3′(SEQ ID NO.4)。

研究了实施例1中的“A”模板以及“A/C”杂合子。PCR以及熔解如实施例1所述那样施行。图5B显示了A与A/C基因型的导数熔解曲线图。扩增子(78-82℃)和回转探针(68-75℃)的熔解转换都是明显的。就扩增子区域而言，相比纯合子，AC杂合子具有在更低温度下的宽广转换。回转引物中探针元件的熔解取决于基因型。配对完好的A模板以一个转换在高温(73℃)熔解，而杂合子转换是双峰。相比于实施例1，探针元件信号强度相对增加。

应用对称PCR进行回转引物基因分型的一个优点是，可使用两个回转引物(每端各一个)以探查PCR产物内两个不同位点。每个尾互补于一个位点，并且探针元件可在长度和/或GC含量上变化以区分两个探针元件等位基因的Tm。另一个示范性探查远处位点(被诸如这样的距离所隔开，所述距离即一个探针元件将是不方便的)的途径是，仅使用一个具有单个探针元件的回转引物，但将所述探针元件分为两段或更多段，每一段互补于一个位点。模板DNA在位点和单体型间形成环是可能的(13)。备选地，可使用一个回转引物以及一个未标记探针(11)，示例性地应用非对称PCR。另外一个选择是，将数种回转引物混合在一起，每种都具有相同的模板特异引物区域及靶向不同位点的不同探针元件。

实施例3.探针元件长度在非对称PCR之后对回转引物信号的影响

应用非对称PCR研究了不同探针元件长度。使用的M13引物如表1所示，其中大写字体标明探针元件尾，小写字体限定了模板特异引物区域，并且粗体碱基标明了回转发夹形成后模板上的可变位点。

表1

除应用45个循环外，PCR以及熔解如实施例1施行，限制性正向引物浓度为0.05μM且回转反向引物浓度为0.5μM。尽管使用了10∶1的比例，但应当理解其它的引物比例也是合适的，如本领域技术人员所了解的，例如从2∶1至20∶1，或更高至100∶1。为确定探针元件长度对回转引物方法的影响，测试了6到28个碱基长度的探针区域(图6A)。得到熔解曲线如图6B所示。即使使用小到6碱基长度的探针区域，回转引物的熔解曲线仍是可见的。能看到小至6碱基对的二聚体熔解转换的能力让人惊讶。与具有相同序列的未标记探针相比(11)，熔解转换似乎在5-10℃或更大范围是稳定的。应用1F正向引物和1R26尾回转反向引物生成的扩增子的熔解，与应用具有与1R26尾探针元件相同序列的未标记探针的熔解相比较，证实了约10℃的稳定性，这是由于分子内的杂交的缘故。这种稳定性在具有导致更短发夹二聚体的更短探针元件的回转引物中甚至更大。例如，6bp回转二聚体的Tm比通过近邻分析所预测的要高40℃，8bp回转二聚体要高35℃。图6G所示的二聚体长度和Tm之间的线性关系提示熔解温度可通过二聚体长度来精确预测。

发夹二聚体的Tm也可以通过有意引入错配、碱基类似物或稳定基序至回转引物的探针元件来调整。例如，导致与模板错配的碱基可用来降低发夹二聚体的总体Tm。G:T错配(通过在探针元件中以T代替C来获得)具有特别的吸引力，因为它们能通过干扰稳定的C:G对来减少发夹二聚体Tm，但G:T二聚体足够稳定，其不能显著地降低来自饱和染料的荧光。错配也可以用来隐藏最好忽略的序列变异，诸如良性多态性(26)。如果需要更大的发夹二聚体稳定性，可将封闭的核酸整合入探针元件，或粘附小沟结合剂以增加熔解温度。

选择8、14、20以及24bp的探针区域用于SNP基因分型。杂合子通过以1∶1的比例混合合适的质粒形成。SNP分型的结果如图6C-F所示。可以采用所有的回转引物分型，包括那些具有短至8碱基长度探针元件的引物(图6C)。

实施例4.应用双碱基末端错配以增强探针元件信号：非对称PCR后探针元件长度的影响

基因组DNA回转分型的一些最初尝试进行得不是特别好。应用非对称PCR，扩增似乎被抑制了，仅多个循环之后出现低微信号，示例性地60或更多个循环。进一步考虑形成的大链和小链，提供了一种可能的解释和解决方案。在图7A中，非对称PCR后产生的大链和小链均以回转构象显示。尽管大链不能从其5’端延伸，但小链具有能杂交并形成聚合酶底物的3’末端。延伸可以从这一3’末端发生，抑制引物退火并阻止大链形成。这个问题的一个解决方案是错配回转引物5’末端的最后两个碱基使得不可能从小链延伸(图7B)。尽管将两个碱基用于示例性错配，但应当理解一个碱基错配可抑制部分延伸，并且如果需要，可加入更多的碱基错配。错配可以在连续几轮扩增中进行。

在回转引物探针元件5’末端整合2碱基错配导致强烈的探针熔解信号。如上面所讨论的，这样的错配阻止PCR抑制，否则所述PCR抑制可能发生在PCR期间小链3’末端延伸之后。应用非对称PCR研究了具有2-bp末端错配的不同探针元件长度。所应用的M13引物如表2所示，其中大写字体表示探针元件或尾部，小写字体限定了模板特异引物区域，小写字体斜体表明了错配至靶的碱基，粗体碱基标明了回转发夹形成后模板上的可变位点。

表2

PCR以及熔解如实施例3施行。研究了8、12、16以及20碱基长度的探针元件，每种均具有双碱基末端错配。图8A显示了使用完全配对的“A”模板在非对称PCR之后的导数熔解形态。所有探针元件峰都是大且容易鉴别的。令人惊奇地是，8碱基探针元件下的面积与更长探针元件的一样大。

基因分型的能力展示在图8B中，应用了“A”和“A/G”(杂合子)模板。“A”模板形成了与探针元件的完全配对，而“G”模板形成A/C错配，导致比完全配对的低6-8℃的熔解峰。

在384孔板上PCR扩增一百种已分型临床样品，并在384孔

(爱德霍技术有限公司)上熔解。具有16碱基探针元件以及双碱基5’末端错配的回转引物用于非对称PCR，生成169bp PCR产物以及具有99碱基环的发夹。在标准化以及消除发夹二聚体区域的背景之后，曲线展示在负导数图上并自动聚集。探针元件具有对突变等位基因的G:T错配。图7C显示，基因型容易被区分。图7C中所有样品的基因型与之前通过小扩增子高分辨率熔解所确定的相一致。

实施例5.扩增子长度对应用非对称PCR的在探针元件5’末端具有双碱基错配的回转引物信号的影响

将如实施例4的具有双碱基末端错配的回转引物用于研究不同的扩增子长度。回转引物至SNP位点之间的距离保持恒定(二级结构环保持不变)，但扩增子的长度是变化的。非对称PCR如实施例3施行。所应用的M13引物如表3所示，其中大写字体表示探针元件或尾部，小写字体限定了模板特异引物区域，小写字体斜体表明了错配至靶的碱基，粗体碱基标明了回转发夹形成后模板上的可变位点。

表3

实验设计图解于图9A中。在所有情况中，回转引物是相同的，因而在探针元件退火至扩增子时形成相同大小的环，引物在5’末端具有相同的2bp错配。然而，扩增子的长度在120bp至321bp变化。

结果如图9B所示。扩增子越长，则相比于扩增子信号探针元件信号就越小。亦即更短的扩增子通常导致相对更强的源自探针元件的信号。

实施例6.环长度对探针元件信号的影响

通过改变回转引物和待探查位点之间的距离研究不同环长度的影响。非对称PCR如实施例3施行。所应用的M13引物如表4所示，其中大写字体表示探针序列尾部，小写字体限定了模板特异引物区域，粗体碱基标明了回转发夹形成后模板上的可变位点。在这个例子中，不使用紧邻探针元件的2bp 5’错配。

表4

实验设计图解于图10A中。PCR之前引物的相对位置在顶端标明。PCR以及熔解如实施例3所述施行。非对称PCR之后延伸的回转引物的环形成如图10A底部所示。环大小在17-236bp间变化。

六种不同产物的导数熔解曲线如图10B所示。应当注意，全长扩增子的Tm与扩增子大小正相关。对于回转探针尾熔解，其中所有探针尾具有相同的大小，更小的环导致更高的熔解温度，表明分子内杂交的稳定性与环大小反相关，至少在17-236碱基之间如此。反向关系在17至150碱基间似乎是对数的，Tm与大小对数的对数成反比。空间位阻可能成为小于17碱基的环的问题，但由于最小环尺寸通常由引物大小所限定，因而其不可能涉及大部分的情况。形成更大环的回转引物的信号强度可能相对扩增子信号降低，如实施例5以及使用未标记探针所见(11)。例如，具有236bp(5R)环长度的熔解曲线是微弱的。对于此示例性扩增子，最好的信号在17至177碱基的环大小间获得，并可预计好的信号在具有少于200碱基环获得。由于探针元件的稳定性以及通常优选相对大的信号，预计20至50碱基间大小的环能很好地工作。

实施例7.应用单个回转引物分型所有可能的单碱基变异

单个回转引物被用于扩增不同质粒模板以证明探针元件熔解曲线的形状取决于被扩增的序列。应用四种不同M13质粒作为靶，其中每种质粒仅在一个位点上有A、C、G或T的差异。在这个实施例中，为模拟纯合子基因分型，仅使用了一个配对或错配质粒，然而模拟杂合子时使用了等比例混合的两种质粒。非对称PCR如实施例3施行。应用的M13引物是：1F tcattctcgttttctgaactg(SEQ ID NO：5)以及1R22Tmisl0tcATTCAATGAATATTTATGACGAatgtttagactggatagcgt(S EQ ID NO：31)，其中大写字母标明探针元件或尾，小写字体限定了模板特异引物区域，小写字母斜体表明了错配至靶的碱基，粗体碱基标明了回转发夹形成后模板上的可变位点。PCR产物为120bp长度。

应用在可变位置具有“A”的回转引物，研究了所有可能的配对、部分配对以及完全错配模板。使用纯合子模板，形成了一个配对的以及三个错配的二聚体(图11A)，均显示出单一熔解转换。在扩增子转换中，G以及C的PCR产物比A以及T的PCR产物稍稍更稳定。具有A:T配对的探针元件转换最稳定、随后是A:G错配、A:A错配以及最后是A:C错配。

图11B显示了一个配对模板以及所有三个部分配对杂合子。如图11A所示，配对模板在68℃附近显示出单个探针元件熔解峰。所有三个杂合子显示出一个等位基因配对、另一个错配的组合探针元件熔解峰，通常解析为两个不同的峰：一个68℃附近的峰以及另一个取决于特定错配的峰。

图11C显示了一个配对模板以及两个等位基因均错配的三个杂合子。配对的二聚体最稳定，而错配杂合子形成不那么稳定的具有探针元件的二聚体。每个杂合子在一个独特、宽广、明显的由两个不解析为不同峰的错配成分组成的单个转化中熔解。

实施例8.回转引物探针元件内错配位置的影响

应用具有不同探针元件的回转引物扩增同样的靶序列。探针元件设计为沿着探针元件的不同位点放置可变碱基，具有相同长度扩增子。探针元件的长度为22碱基，可变碱基放置在位点2、8、14或20，导致环长度为26至44碱基以及120bp的扩增子。尽管环长度变动最多达到了18个碱基的差异，这应当仅仅影响绝对Tm，而不影响区分纯合子与杂合子的能力。非对称PCR如实施例3施行。所应用的M13引物如表5所示，其中大写字体表示探针元件或尾部，小写字体限定了模板特异引物区域，小写字体斜体表明了错配至靶的碱基，粗体碱基标明了回转发夹形成后模板上的可变位点。

表5

分别扩增纯合“A”模板以及杂合“A/G”模板以测试在探针元件的不同位置检测杂合子的能力。当可变碱基放置在邻近22碱基探针元件末端的2位点或20位点，很难将杂合子从纯合子区分开(图12A-B)。相反，当可变碱基靠近中间的位点8或14时，杂合子很容易被鉴别(图12C-D)。这些结果提示在与本实施例相似的条件下，如果需要最佳区分，探针应当在靠近变异序列中心的位置。可能无法检测靠近探针元件任一个末端的序列变异。

实施例9.使用回转引物基因分型囊性纤维变性G542X突变

回转引物基因分型CFTR突变G542X，其在外显子11有G到T的单碱基突变。分型的人基因组DNA样品从Coriell Institute for MedicalResearch(Camden，NJ)获得，并以50ng/μl用于PCR。限制性正向引物是tgtgcctttcaaattcagattg(SEQ ID NO：36)(0.05μM)，反向回转引物是ctGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAcagcaaatgcttgctagacc (SEQ ID NO：37)(0.5μM)。探针元件的序列与野生型靶序列配对。扩增子为228bp。PCR如实施例3施行，除了在95℃起始变性20秒，退火温度为53℃，55个循环，熔解分析从55至88℃以0.2℃/s的速率完成。回转引物环为88碱基，探针元件为24碱基。

得到的回转引物基因分型如图13所示。具有较高温度扩增子熔解峰的导数熔解曲线在右侧，较低温度探针元件峰的在左侧。错配模板探针元件的熔解发生在约63℃，而配对模板熔解于约68℃。所有三种基因型均容易辨别。

实施例10.应用回转引物的囊性纤维变性外显子10序列变异(F508del、F507del以及F508C)的基因分型

回转引物基因分型在外显子10内的CFTR突变热点(hotspot)施行，包括F508del、F507del以及F508C。已分型的人基因组DNA样品从CoriellInstitute for Medical Research(Camden，NJ)获得，并以50ng/μl用于PCR。限制性正向引物是acttctaatgatgattatggg(SEQ ID NO：38)(0.05μM)，反向回转引物是tcAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGacatagtttcttacctcttc(SEQ ID NO：39)(0.5μM)。探针元件的序列与野生型序列配对。扩增子为231bp，回转引物环为58碱基。

得到的回转引物探针元件熔解曲线如图14A-B所示，其为导数(图14A)及标准化的熔解曲线图(图14B)两者。野生型模板来源的探针元件的熔解发生在约72℃，而错配模板在较低温度熔解，每种基因型具有一个特征明显的熔解曲线。所有基因型均容易辨别。

实施例11.应用双向回转引物的多位点基因分型

类似于其它熔解技术，回转基因分型可以沿着温度轴多重实施(9)。例如，可应用两套或多套引物(每套均具有一个回转引物)扩增及分型多个位点，示例性地，根据它们各自的探针元件在熔解温度分离等位基因。备选地，扩增子内的多个位点可通过应用两个回转引物、或一个回转引物与一个未标记探针来扩增分型，每种均可通过在恒定区域间环出模板来探查一个以上的位点(13)。

当应用两个回转引物扩增单个靶核酸时，示例性地，可应用对称PCR生成足够浓度的两种产物链。在本实施例中，应用对称PCR扩增CFTR基因，每种引物的浓度为0.5μM。引物包括双碱基5’末端错配以及分别产生CFTR外显子10的、具有69碱基和66碱基发夹环的249bp PCR产物的17碱基(回转1)或28碱基(回转2)探针元件。模板DNA浓度为5ng/μl。以10-15μl矿物油(西格玛公司(Sigma))覆盖96孔板内2μl的反应体积，离心平板(1500g离心3-5分钟)，在PTC-200themal cycler(生物拉德公司(Bio-Rad))上实施PCR。在95℃起始变性3分钟，随后是95℃15秒，55℃10秒以及72℃15秒，循环35次。

由于双链全长扩增子形成是取决于浓度的分子间反应，并且回转发夹环形成通常不依赖浓度的分子内反应，相对于同样未稀释的PCR产物，PCR产物的稀释有利于回转环形成。因此，在这一示范性的实施例中，在PCR之后，CFTR样品以水稀释(18μl 10倍稀释)、离心，在

中加热至95℃(在全长扩增子熔解温度之上)，从该仪器上取下来冷却至＜40℃以下(室温，其在本实施例发夹的熔解温度之下)，之后在

上以0.15℃/s的速率加热期间采集荧光数据。已发现稀释之后以及采集熔解荧光数据之前的加热和冷却，例证性地快速冷却(示范性地，至少为2℃/s，更为示范性地至少为5℃/s)，生成源自回转发夹的优良信号。对称PCR中，(i)未稀释，或(ii)稀释并在熔解期间采集荧光数据之前没有加热和冷却时，仅观察到微弱的发夹熔解转换。应当理解，其它方法也可用于形成回转分子内环，如调节pH。

回转1在46-60℃之间以熔解转换覆盖了F508del、F507del、F508C以及I506V变体。较长的回转2覆盖了Q493X变体并在66-72℃之间熔解。数据在标准化以及扣除背景后以负导数图展示于图15。野生型(圆)、组合F508del/Q493X杂合子(连接的小菱形)、I506V杂合子(小菱形)、F508C杂合子(小方块)、I507del(大方块)、F508del杂合子(连接的大菱形)以及F508del纯合子(连接的方块)均是可区分的。

尽管在本实施例使用十倍稀释，但应当理解可应用其它的稀释比，取决于需要的源自全长扩增子的最小信号的范围。如果仅需要基因分型，较高稀释比是合适的，而如果需要基因分型以及扫描，较低稀释比是合适的。备选地，样品可不稀释用于熔解扫描，然后稀释后再次熔解用于基因分型。进一步地，尽管本实施例中稀释PCR扩增产物，通过在平台期之前停止PCR扩增从而限制全长扩增子的量，得到较低的扩增子浓度，从而也可能获得相似的结果。

已经验证了对称PCR之后有利于在全长扩增子二聚体上形成回转环的其它方法。例如，变性之后的快速冷却有利于这一发夹形成。这可以通过在LightCycler上的毛细管内通过以设定的-20℃/s的速率冷却而获得，也可以在-10℃/s和-5℃/s观察到。或者，足以有利于发夹的快速冷却可通过在诸如MJ PTC-200的块温度循环器上冷却而获得，其中变性样品在60秒内冷却至＜35℃。通过将毛细管内的变性样品置于冰水中冷却非常有利于变性后的发夹形成，其中可在2秒内获得＜5℃的温度。如果样品被快速冷却，不必要在对称PCR之后稀释，其取决于发夹的以及所需的全长扩增子二聚体的量。

高pH，示例性地从8.5至11.0，也有利于在全长二聚体扩增子上形成发夹。或者在高pH实施PCR，或者在PCR之后增加pH，示例性地，通过添加NaOH或高pH缓冲液的稀释液。例如，PCR扩增之后在pH8.9至10.8的AMP(氨甲基丙醇)缓冲液中有利于发夹形成。备选地，可在pH8.5的10mM Tris缓冲液中进行PCR，并在PCR之后添加pH9至11之间的10mM AMP缓冲液以使得溶液更为碱性。稀释的非缓冲NaOH也可以直接加入，例如，可在以pH8.5的10mM Tris缓冲的10μl PCR反应产物中加入1-9μl 0.01M的NaOH。总之，扩增产物可通过一个或多个下述有利于发夹形成而不是分子间杂交的组合来调节：1)较低的产物浓度，示例性地，由限制PCR产物产生的量(循环次数少或低引物浓度)或者通过PCR后的稀释获得；2)变性后的快速冷却；以及3)通过在高pH下运行PCR或者通过在PCR结束后添加碱性溶液获得的高pH(示例性地，8.5-11.0)。

实施例12.回转引物作为多色基因分型的能量转移供体

如果不同的探针元件能够以不同的荧光团“着色”，甚至较大的多重测定(multiplexing)也是可以的。该进展已采用iFRET(诱导的荧光共振能量转移)所展示，其中有DNA二聚体存在的dsDNA染料溶液(SYBR GreenI)将荧光供体提供给共价结合到二聚体的一条链上的受体染料(14)。

为证实共振能量转移以及应用回转引物的多色测定(colormultiplexing)的可行性，将具有5’末端的共价结合染料LCRed640(罗氏诊断公司(Roche Diagnostic))的回转引物与具有相同序列的5’标记探针相比较。用于回转扩增的正向引物序列是1F(tcattctcgttttctgaactg(SEQ IDNO：5))，回转引物是Red640-GGATTCAATGAATATTTATGACGAatgtttagactggatagcgt(SEQ ID NO：15)。用于作为对照的标记探针反应的正向引物仍然是1F，反向引物是1R(atgtttagactggatagcgt(SEQ ID NO：40))，并且标记的探针是Red640-GGATTCAATGAATATTTATGACGA-P(S EQ IDNO：41)，其中“P”是3’磷酸。除了延伸温度是74℃外，PCR如实施例3中所描述的在0.5X LCGreen Plus存在下实施，50个循环，正向引物浓度为0.1μM，反向引物(回转的或正常的)浓度为0.5μM，标记探针(如果有)为0.5μM。熔解分析在

的F2(LCRed640)通道内以0.2℃/s的速率从50-87℃施行。

图16显示了LCRed640通道内的导数熔解图，其证实了LCGreen Plus与共价结合的LCRed640之间的共振能量转移。应用回转引物或标记探针时，LCRed640熔解转换是明显的，尽管相对于分子间二聚体分子内的环稳定了回转二聚体约9℃。通过以不同的被相同dsDNA染料(如LCGreen

Plus)所激发的荧光团来标记不同的回转引物，可以完成多色测定。应用颜色补偿技术，优选应用温度对通道间串扰的影响的方法(9)，破解复杂光谱信号为个别成分。

在图16中，标记探针对照反应展示了在63℃的熔解峰，它是结合LCGreen Plus与标记探针之间FRET的结果。由分子间结合稳定了约9℃的标记回转探针，具有约72℃的熔解温度。

实施例13.组合回转基因分型与扩增子扫描

应用回转引物的非对称PCR产生了用于基因分型的发夹以及用于扩增子扫描的双链产物。因此，源于相同熔解曲线的基因分型以及扫描均可应用回转引物。这种方法的图解如图17所示。因为回转基因分型通常以非对称PCR完成，扩增子信号不如对称扩增的强，并且当前也不清楚杂合子扫描的精确率。然而，在一个方法中筛选突变以及分型特异序列变异的潜力是吸引人的，并且可能消除整个基因分析中99％的测序负担。由于异源二聚体的形成，引物间在序列中的任何序列差异使扩增子熔解转换偏至较低温度。此外，应用回转发夹，探针元件下的普通变异可最终确定。纯合子变异也可通过探针元件鉴定，但可能不改变扩增子熔解。最后，如果扩增子转换表明有杂合子变异但回转转换是正常的，提示探针区域外有稀有变异或新变异，并且可能需要测序来鉴定。

作为非对称PCR的替代选择，扫描和基因分型可应用回转引物和非对称PCR在稀释或不稀释情况下分两步完成。如上所讨论的，对称PCR至平台期(plateau phase)有利于全长双链扩增子形成，而稀释有利于回转环形成。引物是tctcagggtattttatgagaaataaatgaa(SEQ ID NO：42)以及gtAAGGAGGAACGCTCTATCtcctcacaataataaagagaaggca(SEQ ID NO：43)，并扩增一个包含CFTR外显子4的211bp的PCR产物。发夹环为46碱基长度，具有18bp的发夹二聚体。PCR如实施例11施行，但应用2mM Mg⁺⁺以及0.25μM各种引物的5μl体积。温度循环包括95℃起始变性5分钟，随后是36个循环的95℃30s、62℃10s以及72℃30s。在任何添加或稀释之前，从60至95℃采集扫描用的熔解数据。图18A显示了数种野生型样品以及由G至A碱基变换导致的单个R117H杂合子的扫描熔解曲线。单个R117H杂合子清晰可见，说明这种未稀释的对称熔解曲线可用于扫描。图18B显示了相同扩增子产物以45μl水稀释(10倍稀释)后并如上所述在熔解数据采集前加热以及冷却的导数图。再次地，通过回转引物分型，R117H杂合子容易被区分，可用于特异性鉴定。当相同的杂合子在两种曲线上可见时，这证明了可以应用使用回转引物的相同PCR扩增来扫描和分型。

实施例14.应用回转引物的单体型分析

通过组合等位基因特异扩增与回转引物基因分型，提供了单体型分析的简单方法。考虑两个遗传位点A和B，每个都具有两个等位基因，A1、A2以及B1、B2。回转引物的引物单元设计为退火至A位点，回转引物的探针元件设计为退火至B位点，第二引物设计在B位点侧翼，使得B位点可以被两个引物所扩增。如果回转引物设计为仅延伸A位点的等位基因1(示例性地，通过在A位点的可变位置放置3’末端)，则通过熔解探针元件鉴别的B位点类型必须与A1等位基因相关(相同的单体型)。因此，如果引物单元延伸A1，探针元件配对B1，并且探针熔解曲线表明配对，则存在A1B1单体型。如果探针熔解曲线表明错配，则存在A1B2单体型。如果引物单元延伸A2，探针元件配对B1，并且探针熔解曲线表明配对，则存在A2B1单体型。如果探针熔解曲线表明错配，则存在A2B2单体型。

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尽管本发明已经参照优选具体实施方式做了详细描述，本发明范围以及精神内的变化和修改如后续的权利要求书中所描述及限定。

序列表

<110>犹他大学研究基金会(University of Utah Research Foundation)

爱达荷州技术股份有限公司(Idaho Technology，Inc.)

C.T.威特沃(Wittwer，Carl T)

L.周(Zhou，Luming)

M.A.普瑞茨(Poritz，Mark A)

<120>用于熔解分析的引物

<130>P01520-WO-00

<150>US 60/905,721

<151>2007-03-08

<160>43

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的质粒

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(28)

<223>回转引物上的探针结合位点

<220>

<221>primer_bind

<222>(29)..(49)

<400>1

aatcgtcata aatattcatt gaatcccctc attctcgttt tctgaactg 49

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的质粒

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>2

atgtttagac tggatagcgt 20

<210>3

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的质粒

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(28)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(38)

<223>10碱基四氢呋喃衍生物延伸封闭体

<220>

<221>primer_bind

<222>(39)..(55)

<400>3

aatcgtcata aatattcatt gaatccccnn nnnnnnnntc attctcgttt tctgaactg 59

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>4

atgtttagac tggatagcgt 20

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>5

tcattctcgt tttctgaact g 21

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(6)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(7)..(26)

<400>6

gaatatatgt ttagactgga tagcgt 26

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

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<222>(1)..(8)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(9)..(28)

<400>7

tgaatattat gtttagactg gatagcgt 28

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(10)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(11)..(30)

<400>8

atgaatattt atgtttagac tggatagcgt 30

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(12)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(13)..(32)

<400>9

aatgaatatt taatgtttag actggatagc gt 32

<210>10

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(14)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(15)..(34)

<400>10

caatgaatat ttatatgttt agactggata gcgt 34

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(16)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

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<222>(17)..(36)

<400>11

tcaatgaata tttatgatgt ttagactgga tagcgt 36

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(18)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(19)..(38)

<400>12

ttcaatgaat atttatgaat gtttagactg gatagcgt 38

<210>13

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(20)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(20)..(40)

<400>13

attcaatgaa tatttatgac atgtttagac tggatagcgt 40

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(22)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(23)..(42)

<400>14

gattcaatga atatttatga cgatgtttag actggatagc gt 42

<210>15

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>15

ggattcaatg aatatttatg acgaatgttt agactggata gcgt 44

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(26)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(27)..(46)

<400>16

gggattcaat gaatatttat gacgatatgt ttagactgga tagcgt 46

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(10)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(11)..(30)

<400>17

cctgaatatt atgtttagac tggatagcgt 30

<210>18

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(14)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(15)..(34)

<400>18

gtaatgaata tttaatgttt agactggata gcgt 34

<210>19

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(18)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(19)..(38)

<400>19

cgtcaatgaa tatttatgat gtttagactg gatagcgt 38

<210>20

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(22)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(23)..(42)

<400>20

tcattcaatg aatatttatg acatgtttag actggatagc gt 42

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>21

gcaatccgct ttgcttctga 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>22

gatatttgaa gtctttcggg 20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>23

gttggagttt gcttccggtc 20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>24

atgacctctt atcaaaagga 20

<210>25

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>25

tcgattcaat gaatatttat gacgatgttt agactggata gcgt 44

<210>26

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(41)

<400>26

ggattcaatg aatatttatg acgacgtcca atactgcgga a 41

<210>27

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(45)

<400>27

ggattcaatg aatatttatg acgaaaaata gcgagaggct tttgc 45

<210>28

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>28

ggattcaatg aatatttatg acgataagag caacactatc ataa 44

<210>29

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>29

ggattcaatg aatatttatg acgaaatgca gatacataac gcca 44

<210>30

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>30

ggattcaatg aatatttatg acgaacaaca ttattacagg taga 44

<210>31

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>31

tcattcaatg aatatttatg acgaatgttt agactggata gcgt 44

<210>32

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>32

acaatattta tgacgattcc gcagatgttt agactggata gcgt 44

<210>33

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>33

gctcaatgaa tatttatgac gattatgttt agactggata gcgt 44

<210>34

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>34

ctggggattc aatgaatatt tatgatgttt agactggata gcgt 44

<210>35

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(24)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(25)..(44)

<400>35

agtttgaggg ggattcaatg aataatgttt agactggata gcgt 44

<210>36

<211>22

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(22)

<400>36

tgtgcctttc aaattcagat tg 22

<210>37

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有智人CFTR基因的几条序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(26)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(27)..(46)

<400>37

ctgaaagaca atatagttct tggagacagc aaatgcttgc tagacc 46

<210>38

<211>21

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<400>38

acttctaatg atgattatgg g 21

<210>39

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有智人CFTR基因的几条序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>两碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(30)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(31)..(50)

<400>39

tcaatatcat ctttggtgtt tcctatgatg acatagtttc ttacctcttc 50

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的引物

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>40

atgtttagac tggatagcgt 20

<210>41

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工质粒的探针

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(24)

<223>探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>荧光团结合

<400>41

ggattcaatg aatatttatg acga 24

<210>42

<211>30

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(30)

<400>42

tctcagggta ttttatgaga aataaatgaa 30

<210>43

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有智人CFTR基因的几条序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>双碱基错配

<220>

<221>misc_binding

<222>(3)..(20)

<223>回转引物上的探针结合区域

<220>

<221>primer_bind

<222>(21)..(45)

<400>43

gtaaggagga acgctctatc tcctcacaat aataaagaga aggca 45

Claims

1.核酸分析方法，包括以下步骤：

将靶核酸与第一引物和第二引物混合以形成混合物，所述引物设计用于扩增靶核酸，其中所述第一引物包含特异于靶核酸的一个位点的探针元件和模板特异引物区域，其中所述探针元件在所述模板特异引物区域的5末端，

扩增靶核酸以产生扩增子，

允许探针元件杂交至所述位点以形成发夹，以及

通过测定加热混合物时源自结合dsDNA的染料的荧光，生成探针元件的熔解曲线，其中所述染料非共价结合至第一引物。

2.权利要求1的方法，其中所述第一引物以大于第二引物的浓度提供，用于非对称扩增。

3.权利要求1的方法，其中所述扩增步骤是通过PCR扩增。

4.权利要求1的方法，其中所述第一引物还包含探针元件5端的错配区域。

5.权利要求4的方法，其中所述错配区域是两个碱基。

6.权利要求1的方法，其中所述第一引物是不具有任何共价结合染料或淬灭团的寡核苷酸。

7.权利要求6的方法，其中所述第一引物不含有延伸封闭体。

8.权利要求1的方法，其中所述染料存在于扩增期间的混合物中。

9.权利要求8的方法，其中所述染料是饱和染料。

10.权利要求9的方法，其中所述染料以足以区分熔解曲线中的杂合子的浓度存在。

11.权利要求1的方法，其中所述第一和第二引物以基本上相同的浓度提供。

12.权利要求11的方法，其中所述第二引物包含特异于靶核酸第二位点的探针元件和模板特异引物区域，其中所述第二引物的探针元件在模板特异引物区域的5端。

13.权利要求12的方法，其中所述第一引物探针元件在不同于第二引物探针元件的温度熔解。

14.权利要求12的方法，进一步包含在生成熔解曲线前稀释扩增子的步骤。

15.权利要求13的方法，进一步包含在生成熔解曲线前，加热稀释的扩增子至少至扩增子的变性温度并冷却被加热稀释的扩增子至发夹变性温度以下的温度的步骤。

16.权利要求15的方法，其中所述冷却是快速冷却。

17.权利要求11的方法，其中所述第一引物包含在探针元件与模板特异引物区域之间的延伸封闭体。

18.权利要求1的方法，其中所述发夹具有少于200个碱基的环。

19.权利要求1的方法，其中所述发夹具有20至50个碱基的环。

20.权利要求1的方法，其中所述探针元件少于20个碱基。

21.权利要求20的方法，其中所述探针元件少于10个碱基。

22.权利要求1的方法，其中所述混合物还包含第三引物，所述第三引物包含特异于靶核酸第三位点的探针元件和模板特异引物区域，其中所述第三引物的模板特异引物区域与第一引物的模板特异引物区域相同，但第三引物的探针元件所特异的位点不同于第一引物所特异的位点。

23.权利要求1的方法，其中所述位点具有已知的单核苷酸多态性，并且所述单核苷酸多态性位于距探针元件末端不少于8个碱基的位置。

24.权利要求1的方法，其中所述混合物进一步包含设计为杂交至靶核酸不同位点的未标记探针。

25.权利要求1的方法，其中：

所述第二引物包含特异于靶核酸第二位点的探针元件、模板特异引物区域以及可以与dsDNA结合染料共振能量转移的共价结合染料，其中所述第二引物的探针元件在模板特异引物区域的5端，并且

dsDNA结合染料的荧光在第一波长测量，并且生成步骤进一步包含在第二波长测量源自共价结合染料的荧光。

26.权利要求1的方法，其中：

所述靶核酸进一步包含第二位点，并且

第一引物的模板特异引物区域被设计为仅在第二位点的特定等位基因存在时扩增所述靶核酸。

27.权利要求1的方法，进一步包含分析所述熔解曲线形态的步骤。

28.权利要求1的方法，其中所述混合物在生成熔解曲线之前被调节为有利于探针元件发夹形成。

29.权利要求28的方法，其中所述混合物通过稀释、变性后的快速冷却或增加pH值来调节。

30.权利要求1的方法，其中所述扩增在到达平台期之前终止，以限制扩增子浓度。

31.用于核酸分析的试剂盒，包含

第一引物和第二引物，所述引物设计用于扩增靶核酸，其中所述第一引物包含特异于靶核酸一个位点的探针元件和模板特异引物区域，并且探针元件在模板特异引物区域的5’端，以及

dsDNA结合染料，其中所述染料非共价结合至所述第一引物。

32.权利要求31的试剂盒，其中所述dsDNA结合染料是饱和染料。

33.权利要求31的试剂盒，其中所述第一引物以大于第二引物的浓度提供。

34.权利要求31的试剂盒，其中所述第一引物进一步包含探针元件5端的错配。

35.权利要求31的试剂盒，其中所述第一引物和第二引物均不具有任何共价结合染料或淬灭团。

36.权利要求31的试剂盒，进一步包含热稳定聚合酶和dNTPs。

37.一种同时扫描和基因分型靶核酸的方法，包括以下步骤：

将靶核酸与第一引物和第二引物混合以形成混合物，所述引物设计用于扩增靶核酸，其中所述第一引物包含特异于靶核酸的一个位点的探针元件和模板特异引物区域，其中所述探针元件在模板特异引物区域的5末端，

扩增靶核酸以产生扩增子，

通过测定加热混合物时源自dsDNA结合染料的荧光，生成扩增子的熔解曲线，

调节混合物以有利于通过探针元件分子内结合至靶核酸的发夹形成，并且

通过测定加热混合物时源自dsDNA结合染料的荧光，生成探针元件的熔解曲线。

38.权利要求37的方法，其中所述调节是稀释扩增子。

39.权利要求38的方法，进一步包括以下步骤：

在生成探针元件的熔解曲线之前，加热稀释的扩增子至少至扩增子的变性温度并冷却加热的稀释扩增子至探针变性温度之下的温度。

40.权利要求37的方法，其中所述调节是之后快速冷却的加热。

41.权利要求37的方法，其中所述调节是增加pH值。