CN110257492A - 一组fret杂交扩增引物和检测探针组 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组FRET杂交扩增引物和检测探针组。包括正向引物、反向引物、荧光基团和荧光检测探针，所述的正向引物包括顺序相连的与模板互补的正向序列、自体杂交反向序列1和荧光探针序列的反向结合序列，所述的荧光检测探针包括顺序相连的荧光探针序列和其末端的荧光供体基团或荧光受体基团，所述的荧光基团上连有自体杂交序列2，所述的自体杂交反向序列1和自体杂交序列2都能与正、反向引物延伸得到的单链扩增产物自体杂交，并且杂交区域相邻，所述的荧光基团为荧光受体基团或荧光供体基团。本发明在使用扩增引物上引物的自身杂交区域与扩增产物直接杂交取代独立的FRET检测探针，其杂交效率明显提高，从而提高了检测灵敏度。

Description

一组FRET杂交扩增引物和检测探针组
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一组FRET杂交扩增引物和检测探针组。
背景技术：
当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象称为荧光共振能量转移(FRET)现象。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生FRET；随着距离延长，FRET呈显著减弱。
FRET杂交探针可用于对待测序列进行检测(Matthews,JA AnalyticalBiochemistry 169(1988)1-25)，其特征为同时使用与待测序列同一链互补相邻位点互补的两个单链杂交探针对，两个探针用不同荧光成分标记，当特定波长激发时，第一种成分(供体)将吸收的能量转移到第二种成分(受体)上，通过检测第二种成分的荧光发射量对待测序列的量进行检测。当退火到靶序列时，杂交探针之间必须非常接近，通常第一个探针标记的3`端和第二个探针的5`端间隙为1-5个碱基，约10-100埃。
除进行实时PCR外，FRET杂交探针还可用于熔解曲线分析，当杂交探针结合到靶序列上时，受体基团通过FRET原理发射出荧光，在解链温度时，杂交探针从靶序列上脱离，受体基团的荧光信号降低，通过求导观察荧光信号降低的最大值来判读熔解温度(Tm)值，通过Tm值来判断杂交序列是否是目标序列。
大部分利用探针的核酸检测技术采用扩增产物和检测探针相互独立的方法，如Taqman探针、分子信标探针、FRET探针等，检测探针和扩增产物各自独立，在一定反应条件下根据分子随机碰撞和碱基配对原则发生杂交从而产生信号，其杂交效率受到产物浓度和探针浓度的双重影响。
目前FRET杂交探针针对每个靶标需要使用至少2条检测探针进行检测，因此检测效率受到扩增产物、检测探针浓度及杂交效率的多重影响，灵敏度受到限制。此外，FRET杂交探针设计时由于熔解曲线分析时Tm值会受到扩增区域核苷酸序列各种突变的影响，造成熔解曲线分析时Tm值的变异，影响结果判读，同时在一个通道上进行多个目标检测时需要多条携带供体荧光基团和受体荧光基团探针，造成荧光背景升高，增加了误杂交几率并增加成本。
发明内容：
本发明针对每个待检测区域，在扩增引物上加入可与扩增产物形成自身杂交的区域，当扩增完成后，在低温条件下扩增产物自身杂交形成新的哑铃型二级结构，使荧光供体基团与受体基团在空间上接近，发生FRET现象，然后通过熔解曲线分析判断检测结果。
本发明的一组FRET杂交扩增引物和检测探针组，其特征在于，包括正向引物、反向引物、荧光基团和荧光检测探针，所述的正向引物包括顺序相连的与模板互补的正向序列、自体杂交反向序列1和荧光探针序列的反向结合序列，所述的荧光检测探针包括顺序相连的荧光探针序列和其末端的荧光供体基团或荧光受体基团，所述的荧光基团上连有自体杂交序列2，所述的自体杂交反向序列1和自体杂交序列2都能与正、反向引物延伸得到的单链扩增产物自体杂交，并且杂交区域相邻，所述的荧光基团为荧光受体基团或荧光供体基团。
优选，所述的反向引物的5’端与自体杂交序列2相连。
本发明的另外一个目的是提供一组FRET杂交扩增引物和检测探针组，其特征在于，包括正向引物、反向引物和荧光检测探针，所述的正向引物包括顺序相连的与模板互补的正向序列、自体杂交序列和荧光供体基团或荧光受体基团，所述的荧光检测探针包括顺序相连的荧光探针序列和其末端的荧光受体基团或荧光供体基团，所述的自体杂交序列和荧光探针序列都能与正、反向引物延伸得到的单链扩增产物自体杂交，并且杂交区域相邻。
与常规的FRET探针相比，本发明在使用扩增引物上引物的自身杂交区域与扩增产物直接杂交取代独立的FRET检测探针，其杂交效率明显提高，从而提高了检测灵敏度。通过不同设计，熔解曲线分析的Tm值既可以取决于扩增产物自身杂交的部分以检测SNP位点，也可以取决于与扩增序列无关的人工标签序列，从而避免扩增区域突变对Tm值的影响。
附图说明：
图1是本发明的FRET杂交扩增引物和检测探针组的扩增原理图；
图2是本发明的FRET杂交扩增引物和检测探针组的扩增原理图；
图3是熔解曲线图；
图4是熔解曲线图；
图5是熔解曲线图；
图6是熔解曲线图。
具体实施方式：
实施例1：
使用一条引物携带荧光供体基团，另一条独立的检测探针携带荧光受体基团进行自身杂交FRET反应(具体原理如图2所示)。
1、SEQ1：A(FAM)AAAACAAGGCACTCTttgtggtagttggagctggtga
KRAS G13D正向引物，其中小写字母部分是正向序列，CAAGGCACTCT为自体杂交序列，FAM为荧光供体基团。
2、SEQ2：cctctattgttggatcatattcgtc
KRAS G13D反向引物
3、SEQ3：CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCGT-MGB
KRAS G13D荧光受体探针(杂交探针)
4、SEQ4：Ttttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtgacgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgtttt(如SEQ ID NO.1所示)
KRAS G13D扩增序列质粒(模板)
反应体系：
反应条件：
实验结果如图3所示，从图3可以看出，阳性孔有Tm＝71度的阳性峰，阴性孔没有阳性峰，与实验设计一致。
实施例2：
使用一条引物携带可结合独立荧光探针的人工序列，另一条独立的检测探针携带荧光受体基团进行自身杂交FRET反应
1、SEQ5：CCGGTCAAGGTTGAGTTATGAAGGACCCAAGGCACTCTttgtggtagttggagctggtga
KRAS G13D正向引物，下划线部分序列为与待检测序列无关的人工标签，CCCAAGGCACTCT为自体杂交序列反向序列，ttgtggtagttggagctggtga为正向引物序列
2、SEQ6：A(FAM)AAAAAGGTCCTTCATCGCTCAGCCTTCACCGG
与SEQ5的人工标签结合的荧光供体探针
反应体系：
正向引物 SEQ5 20pmol
反向引物 SEQ2 2pmol
荧光供体探针 SEQ6 5pmol
荧光受体探针 SEQ3 5pmol
模板 SEQ4 10<sup>6</sup>拷贝(阳性)或0拷贝(阴性)
PCR反应液 2X PCR反应缓冲液 12.5ul
ddH2O 补充总体积至25ul
反应条件：
实验结果图4所示，从图4可以看出阳性孔有与目标温度一致的45度的Tm峰，阴性孔没有熔解峰。
实施例3：
使用一条引物携带可结合独立荧光探针的人工序列，另一条引物携带荧光受体基团进行自身杂交FRET反应(具体原理图如图1所示)
1、SEQ7：GGTCCTTCATAACTCAACCTTGACCGGGTCGTCAAGGCttgtggtagttggagctggtga
KRAS G13D正向引物，下划线部分序列为与待检测序列无关的人工标签
2、SEQ8：BHQ1-GCTAATTCAGAcctctattgttggatcatattcgtc
KRAS G13D反向引物，5’端修饰荧光受体基团
反应体系：
正向引物 SEQ7 2pmol
反向引物 SEQ8 20pmol
荧光供体探针 SEQ6 5pmol
模板 SEQ4 10<sup>6</sup>拷贝(阳性)或0拷贝(阴性)
PCR反应液 2X PCR反应缓冲液 12.5ul
ddH2O 补充总体积至25ul
反应条件：
实验结果图5，可见阳性孔有与目标温度一致的45度的Tm峰，阴性孔没有熔解峰。
实施例4：
使用一条引物携带荧光供体基团，另一条独立的检测探针携带荧光受体基团进行自身杂交FRET反应检测SNP(具体原理图如图2)
1、SEQ9：A(FAM)AAAACCCTGAGGTGCGGGCCCAGTCCGCCAGCCTTG
CYP4F2正向引物下划线部位为自身杂交序列
2、SEQ10：TGCTCCCTTCTCTCCCACAG
CYP4F2反向引物
3、SEQ11：AACCCAGCTGTGTGGCCGGA-BHQ2
携带荧光受体基团探针(检测探针)
4、SEQ12：CCCAGTCCGCCAGCCTTGGAGAGACAGACAGTTGTGTGTGTCTTTGAG GGAGGTGATGTTGGATACTCCTGATCAAAACCCTGCCCCCTCCTCTAGGAGCCTTGGAATGGACAAAAACAGAGAGAGGGGCCCCGCA CCTCAGGGTCCGGCCACACAGCTGGGTTGTGATGGGTTCCGAAAACACTGATGAGGCAGATAATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGCA
CYP4F2野生型扩增序列质粒
5、SEQ13：CCCAGTCCGCCAGCCTTGGAGAGACAGACAGTTGTGTGTGTCTTTGAGGGAGGTGATGTTGGATACTCCTGATCAAAACCCTGCCCCCTCCTCTAGGAGCCTTGGAATGGACAAAAACAGAGAGAGGGGCCCCGCACCTCAGGGTCCGGCCACATAGCTGGGTTGTGATGGGTTCCGAAAACACTGATGAGGCAGATAATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGCA
CYP4F2突变型扩增序列质粒
反应体系：
反应条件：
实验结果图6，可见CYP4F2野生型质粒单独10000拷贝孔有69度熔解曲线峰，突变型质粒单独10000拷贝有63度熔解曲线峰，野生突变各5000拷贝孔有62度和69度两个熔解曲线峰，与实验设计一致。

Claims (3)

1.一组FRET杂交扩增引物和检测探针组，其特征在于，包括正向引物、反向引物、荧光基团和荧光检测探针，所述的正向引物包括顺序相连的与模板互补的正向序列、自体杂交反向序列1和荧光探针序列的反向结合序列，所述的荧光检测探针包括顺序相连的荧光探针序列和其末端的荧光供体基团或荧光受体基团，所述的荧光基团上连有自体杂交序列2，所述的自体杂交反向序列1和自体杂交序列2都能与正、反向引物延伸得到的单链扩增产物自体杂交，并且杂交区域相邻，所述的荧光基团为荧光受体基团或荧光供体基团。
2.根据权利要求1所述的FRET杂交扩增引物和检测探针组，其特征在于，所述的反向引物的5’端与自体杂交序列2相连。
3.一组FRET杂交扩增引物和检测探针组，其特征在于，包括正向引物、反向引物和荧光检测探针，所述的正向引物包括顺序相连的与模板互补的正向序列、自体杂交序列和荧光供体基团或荧光受体基团，所述的荧光检测探针包括顺序相连的荧光探针序列和其末端的荧光受体基团或荧光供体基团，所述的自体杂交序列和荧光探针序列都能与正、反向引物延伸得到的单链扩增产物自体杂交，并且杂交区域相邻。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20090142752A1 (en) * 2006-10-04 2009-06-04 Third Wave Technologies, Inc. Snap-Back Primers And Detectable Hairpin Structures
CN101918587A (zh) * 2007-03-08 2010-12-15 爱达荷州技术股份有限公司 用于熔解分析的引物
CN102321765A (zh) * 2011-09-08 2012-01-18 厦门基科生物科技有限公司 一种实时荧光pcr方法及用途

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