KR101761862B1 - 표적 핵산에 대한 검출 정확도를 높이기 위한 프로브 세트 및 상기 프로브 세트를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법 - Google Patents

표적 핵산에 대한 검출 정확도를 높이기 위한 프로브 세트 및 상기 프로브 세트를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 핵산에 대한 검출 정확도를 높이기 위한 프로브 세트, 상기한 프로브 세트를 설계하는 방법, 상기 프로브 세트를 이용하여 융해 곡선을 분석(melting curve analysis)을 통해 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 프로브 세트는 매우 높은 정확도로 표적 핵산의 존재 유무를 검출할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명에서 제공하는 프로브 세트는 리포터로 다양한 파장대의 형광 물질을 사용할 수 있어, 하나의 핵산 서열 내 다양한 부위의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 여러 핵산 서열 내 각각의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있다.

Description

표적 핵산에 대한 검출 정확도를 높이기 위한 프로브 세트 및 상기 프로브 세트를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법{Probe set for improving accuracy of detectection to target nucleic acid and the method for detecting target nucleic acid using the same}
본 발명은 표적 핵산에 대한 검출 정확도를 높이기 위한 프로브 세트, 상기한 프로브 세트를 설계하는 방법, 상기 프로브 세트를 이용하여 융해 곡선을 분석(melting curve analysis)을 통해 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
1983년 Kary Mullis에 의해 개발된 핵산증폭 기술인 PCR 기술은, 20세기 가장 큰 기술적, 경제적 가치를 지닌 생명공학 기술 중의 하나로 평가되고 있으며 분자생물학 전체에 일대 변혁을 일으켜 주었다. 극히 적은 양의 핵산 시료를 간편하게 대량으로 증폭할 수 있다는 장점 때문에 유전자 클로닝(cloning), 염기서열 분석(sequencing), 유전병 진단, 유전자 지문 분석 및 전염병 진단 등 생명공학 전 분야에서 기본 핵심 기술로 응용되어왔다(Bartlett, Stirling, MethodsMolBiol. 3(6):226, 2003).
또한, 핵산 증폭기술은 1990년대 이후 핵산의 정량 증폭 기술로 발전하여 급속히 시장이 증가하고 있으며, 기존의 PCR 기술이 표적핵산의 증폭과정 전의 최초 농도를 예측할 수 없다는 점을 극복하고 초기 농도를 실시간으로 정확히 진단할 수 있는 기술이 많이 활용되고 있다. 대표적으로 비특이적 형광물질인 SYBR green과 염기서열 특이적인 TaqMan probe 등을 사용한 정량중합효소연쇄반응(qPCR)인 리얼타임 PCR 기술이 널리 사용되고 있고 많은 연구 성과들이 보고되었다(이창묵, BioWave, 9(8), 2007). 이와 같은 리얼타임 PCR 기법은 최근 유전자 분석 분야에서 가장 강력한 기법으로 인정되어 핵산 분석 분야에서 널리 이용되고 있으며, 최근 세계적으로 유행했던 신종플루 (H1N1) 바이러스 감염 확진에 사용되면서 그 가치를 입증한 바 있다.
대표적인 DNA-결합 염료인 SYBR Green은 이중 가닥 DNA 사이에 삽입되어 형광을 나타낸다. 그러나 SYBR Green은 DNA 가닥 사이에 비-특이적으로 삽입될 가능성이 높기 때문에, 특이적 타겟 검출에 적합하지 않으며, SYBR Green 기술을 실시간 멀티플렉스 검출에 응용하는 경우, 융해 곡선 분석(melting curve analysis)을 통하여 증폭산물을 동정하여야 하므로, 시간적 및 효율적인 분석면에서 적합하지 않은 것으로 간주된다.
또한, 종래의 실시간 멀티플렉스 PCR 방법의 프라이머 또는 프로브는 비-특이적 혼성화를 발생시킬 가능성이 높아(R.N. Gunson, etal ., JournalofClinicalVirology, 43:372, 2008), 표지 프라이머-기반 실시간 멀티플렉스 PCR의 경우, 표지 프라이머의 다이머(dimer) 형성은 위양성 시그널을 발생시킬 수 있기 때문에 주요 문제점으로 여겨지며, 표적핵산이 있음에도 PCR 증폭이 되지 않거나, 프로브 문제에 의해 나타나는 위음성 시그널을 구분하기 어려운 문제점이 있다.
기존에 내부 컨트롤을 이용하여 위음성 시그널을 구분하는 방법이 연구가 되었으나(Burggraf S. etal., ClinChem.,50(5):819, 2004), 염기 변이를 이용한 내부 컨트롤을 제작하기 위해 특이성과 적당한 융해 온도(Tm)을 만들기 위해서는 DNA 프로브의 길이가 길어져야 하는 문제가 있다. 상기 논문에서는 길이를 길게 하기 위해 binary probe 법을 사용하여 PCR을 수행하였으나, 이는 프로브 디자인과 제작에 어려움을 동반하며, binary probe기법은 일반 형광-소광자 방법보다 다양한 형광을 사용하는데 어려움이 있어 다중 검출(multiplex detection)을 함에 있어 커다란 제한사항으로 작용한다.
한편, PNA는 DNA보다 열 및 생물학적 안정성과 표적 핵산에 대한 인식능력 및 결합능력이 뛰어나서 표적 핵산을 검출하는 실시간 PCR 기술의 프로브로 사용할 수 있다. 그러나 실시간 PCR 방법은 시료 내 표적 핵산을 검출함에 있어 형광물질을 사용하기 때문에, 두 가지 이상 표적 핵산을 검출하기 위해서는 두 개의 서로 다른 파장의 형광물질을 가진 프로브가 필요한 문제가 있으며, 다중 검출(multiplex detection)을 함에 있어 커다란 제한사항으로 작용한다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 일 목적은 표적 핵산에 대한 검출 정확도를 높일 수 있는 프로브 세트와 그 설계 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 프로브 세트를 이용하여 융해 곡선 분석(melting curve analysis)을 이용해 높은 정확도로 표적 핵산을 검출하고 정량화할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명자들은 일 말단에 리포터(reporter)가 결합된 프로브의 융해 온도(melting temperature, Tm)와, 일 말단에 소광자(quencher)가 결합된 프로브의 융해 온도를 상이하게 설계하여, 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 시 온도의 변화에 따른 형광 세기를 측정함으로써 높은 정확도로 표적 핵산을 검출할 수 있음을 확인하여, 본 발명에 이르게 되었다.
구체적으로, 본 발명의 일 구현 예에 따르면 리포터(reporter)가 결합된 표적 프로브; 및 소광자(quencher)가 결합된 헬퍼 프로브를 포함하며, 상기 표적 프로브와 헬퍼 프로브의 융해 온도(melting temperature, Tm)는 서로 상이한 것을 특징으로 하는, 프로브 세트를 제공한다.
본 발명에서 상기 표적 프로브는 핵산 시료 중 검출 대상이 되는 표적 핵산의 제1 특이 영역에 혼성화될 수 있고, 상기 헬퍼 프로브는 핵산 시료 중 표적 핵산의 제2 특이 영역에 혼성화될 수 있다.
본 발명에서 상기 표적 프로브의 융해 온도를 헬퍼 프로브의 융해 온도보다 낮게 설정함으로써, 융해 곡선 분석 시 표적 프로브의 융해 온도 미만의 온도에서 표적 프로브와 헬퍼 프로브를 각각 표적 핵산의 제1 특이 영역 및 제2 특이 영역에 혼성화시키면 헬퍼 프로브에 결합된 소광자가 표적 프로브에 결합된 리포터를 소광시키나, 온도를 표적 프로브의 융해 온도 이상 헬퍼 프로브의 융해 온도 미만의 온도로 증가시키면 표적 프로브만이 표적 핵산의 제1 특이 영역으로부터 해리되면서 형광 신호가 급격히 증가하게 된다.
본 발명에서는 상기와 같이 표적 프로브의 융해 온도가 헬퍼 프로브의 융해 온도보다 낮게 하기 위해서는 표적 프로브의 염기 서열의 길이를 헬퍼 프로브의 염기 서열 길이보다 상대적으로 짧도록 설계함으로써 구현할 수 있다.
이와 같이 본 발명에서는 표적 프로브의 염기 서열 길이를 헬퍼 프로브의 염기 서열의 길이보다 상대적으로 짧게 설계함으로써 융해 온도의 차이로 인하여 표적 핵산, 특히 제1 특이 영역을 검출할 수 있지만, 더 나아가서는 표적 프로브와 검출 대상이 되는 표적 핵산의 제1 특이 영역의 상보성을 99 ~ 100% 정도로 높일 수 있어, 표적 핵산에 대한 검출 정확도를 매우 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 표적 프로브와 헬퍼 프로브의 융해 온도의 차이를 특별히 제한하지는 않으나, 적어도 1℃ 이상의 온도 차이가 존재하여야만 융해 곡선 분석 시 온도의 점차적 증가에 따라 표적 프로브만이 제1 특이 영역으로부터 우선적으로 해리되며 형광 신호를 방출함에 따라 표적 핵산의 검출 정확도를 높일 수 있고, 바람직하게는 상기 융해 온도의 차이는 1 ~ 50℃, 또는 5 ~ 30℃ 또는 10 ~ 20℃일 수 있다.
또한, 상기 표적 프로브 및 헬퍼 프로브의 융해 온도는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 표적 프로브의 융해 온도는 50 ~ 60℃일 수 있고, 헬퍼 프로브의 융해 온도는 60 ~ 80℃일 수 있다.
본 발명에서 상기 리포터의 표적 프로브 내 결합 위치는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 표적 프로브의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 소광자의 헬퍼 프로브 내 결합 위치는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 소광자는 헬퍼 프로브의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 리포터가 표적 프로브의 5' 말단에 결합되는 경우 소광자는 상기 리포터를 소광시킬 수 있도록 헬퍼 프로브의 3' 말단에 결합될 수 있고, 리포터가 표적 프로브의 3' 말단에 결합되는 경우 소광자는 헬퍼 브로브의 5' 말단에 결합될 수 있다.
본 발명에서 상기 "표적 핵산"이란 시료 내에서 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 단일염기다형성 또는 유전자형 분석에 사용되는 유전자를 의미한다. 이는 돌연변이를 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, genomic DNA 와 mitchondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, ribosomal RNA, non-cording RNA, tRNA, viral RNA등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 혼성화, 어닐링(annealing) 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명에서 상기 "표적 핵산의 제1 특이 영역"은 표적 핵산 중에서도 특히 검출 대상이 되는 핵산 영역으로, 핵산 시료 중 상기 표적 프로브가 특이적으로 결합하는 영역에 해당한다. 표적 핵산 증폭 산물의 표지 부위 말단(3' 또는 5')에 대해 반대 방향(3'→5'방향 또는 5'→3'방향)으로 전체 증폭 산물의 80% 범위 내에서 우선적으로 결정되고, 표적 프로브가 특이적으로 결합해야 하는 서열변이 위치가 유일하게 존재하는 곳이 전체 증폭 산물의 나머지 20% 범위 내인 경우에는 이러한 20% 범위 내에서 결정된다.
본 발명에서 상기 "표적 핵산의 제2 특이 영역"은 표적 핵산의 제1 특이 영역에 인접하여 위치하고, 바람직하게는 표적 핵산의 일 말단으로부터 1 ~ 10bp, 보다 바람직하게는 1 ~ 5bp, 더욱 바람직하게는 1 ~ 2bp가 이격된 부위에 위치한다.
본 발명에서 상기 "프로브"는 DNA 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명에서 상기 프로브를 설계할 때, 3' 말단에는 인산화(phosphorylation)를 함으로써 연장(elongation)을 방지할 수 있다.
본 발명에서 상기 "표적 프로브"는 표적 핵산 중 특히 제1 특이 영역에 혼성화할 수 있는 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 "헬퍼 프로브"는 표적 핵산의 제2 특이 영역에 혼성화하여 표적 핵산의 양성 증폭산물의 검출 신호를 선택적으로 감소시키는 표지된 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 특히 온도와 같은 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있다. 단, 본 발명에서 상기 헬퍼 프로브는 핵산 시료 중 표적 핵산의 제2 특이 영역에 정확하게 상보적으로 결합하거나 일부 부정합을 허용하면서 상보적으로 결합할 수 있으나, 상기 표적 프로브는 표적 핵산의 제1 특이 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명에서 상기 "리포터(reporter)"는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적 핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미하여, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서는 상기한 리포터로 다양한 파장대의 형광 물질을 사용할 수 있어, 하나의 핵산 서열 내 다양한 부위의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 여러 핵산 서열 내 각각의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "소광자(quencher)"는 리포터가 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 소광자는 종류에 따라 형광세기를 감소하는 범위가 다르므로 이를 고려하여 사용 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로브 세트의 구성을 개략적으로 도시한 것으로, 표적 프로브는 헬퍼 프로브에 비하여 상대적으로 서열 길이가 짧으며, 융해 온도(Tm)는 상기한 헬퍼 프로브에 비하여 상대적으로 낮다. 또한, 상기 표적 프로브는 표적 핵산의 제1 특이 영역에 혼성화되고, 상기 표적 프로브가 혼성화된 제1 특이 영역의 말단으로부터 1bp 이격된 위치에서 시작되는 제2 특이 영역에는 헬퍼 프로브가 혼성화된다. 이때, 상기 표적 프로브의 3' 말단에 형광 물질인 리포터가 결합되어 있으나, 헬퍼 프로브의 5' 말단에는 소광자가 결합되어 있어, 소광자의 소광 작용에 의해 두 프로브가 표적 핵산에 혼성화되어 있을 때에는 상기 리포터의 형광 신호가 검출되지 않는다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 표적 핵산의 제1 특이 영역에 상보적인 서열을 포함하는 표적 프로브와, 표적 핵산의 제2 특이 영역에 상보적인 서열을 포함하는 헬퍼 프로브를 설계하는 단계를 포함하며, 상기 표적 프로브의 융해 온도와 헬퍼 프로브의 융해 온도를 상이하게 설계하는 것을 특징으로 하는, 프로브 세트의 설계방법을 제공한다.
보다 상세하게, 상기 설계하는 단계는 핵산 시료 중 표적 핵산의 염기 서열을 분석하는 단계; 상기 표적 핵산 중 검출 대상이 되는 제1 특이 영역을 결정하는 단계; 상기 제1 특이 영역의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 1 ~ 10bp가 이격된 위치의 제2 특이 영역을 결정하는 단계; 상기 표적 핵산의 제1 특이 영역에 혼성화될 수 있는 표적 프로브의 염기 서열을 결정하는 단계; 및 상기 표적 핵산의 제2 특이 영역에 혼성화될 수 있는 헬퍼 프로브의 염기 서열을 결정하는 단계는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 상기 표적 프로브의 융해 온도를 헬퍼 프로브의 융해 온도보다 낮도록 설계함으로써, 융해 곡선 분석 시 표적 프로브의 융해 온도 미만의 온도에서 표적 프로브와 헬퍼 프로브를 각각 표적 핵산의 제1 특이 영역 및 제2 특이 영역에 혼성화시킬 때 헬퍼 프로브에 결합된 소광자가 표적 프로브에 결합된 리포터를 소광시키다가, 온도를 표적 프로브의 융해 온도 이상 헬퍼 프로브의 융해 온도 미만의 온도로 증가시키면 표적 프로브만이 표적 핵산의 제1 특이 영역으로부터 해리되면서 형광 신호가 급격히 증가된다.
본 발명에서는 상기와 같이 표적 프로브의 융해 온도를 헬퍼 프로브의 융해 온도보다 낮게 하기 위해서는 표적 프로브의 염기 서열의 길이를 헬퍼 프로브의 염기 서열 길이보다 상대적으로 짧게 설계함으로써 구현할 수 있다.
이와 같이 본 발명에서는 표적 프로브의 염기 서열의 길이를 헬퍼 프로브의 염기 서열의 길이보다 상대적으로 짧게 설계함으로써 융해 온도의 차이로 인하여 표적 핵산, 특히 제1 특이 영역을 검출할 수 있지만, 더 나아가서는 표적 프로브와 검출 대상이 되는 표적 핵산의 제1 특이 영역의 상보성을 99 ~ 100% 정도로 높일 수 있어, 표적 핵산에 대한 검출 정확도를 매우 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 표적 프로브와 헬퍼 프로브의 융해 온도의 차이를 특별히 제한하지는 않으나, 적어도 1℃ 이상의 온도 차이가 존재하여야만 융해 곡선 분석 시 온도의 점차적 증가에 따라 표적 프로브만이 제1 특이 영역으로부터 우선적으로 해리되며 형광 신호를 방출함에 따라 표적 핵산의 검출 정확도를 높일 수 있고, 바람직하게는 상기 융해 온도의 차이는 1 ~ 50℃, 또는 5 ~ 30℃, 또는 10 ~ 20℃일 수 있다.
또한, 상기 표적 프로브 및 헬퍼 프로브의 융해 온도는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 표적 프로브의 융해 온도는 50 ~ 60℃일 수 있고, 헬퍼 프로브의 융해 온도는 60 ~ 80℃일 수 있다.
본 발명에서는 상기 표적 프로브에 리포터를 결합시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 이때 그 결합 위치를 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 표적 프로브의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 헬퍼 프로브에 소광자를 결합시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 이때 그 결합 위치를 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 헬퍼 프로브의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 리포터가 표적 프로브의 5' 말단에 결합되는 경우 소광자는 상기 리포터를 소광시키기 위하여 헬퍼 프로브의 3' 말단에 결합될 수 있고, 리포터가 표적 프로브의 3' 말단에 결합되는 경우 소광자는 헬퍼 브로브의 5' 말단에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 프로브 세트 중 표적 프로브를 표적 핵산의 제1 특이 영역에 혼성화시키고, 헬퍼 프로브는 표적 핵산의 제2 특이 영역에 혼성화시키는 단계; 및 온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법을 제공한다.
우선, 본 발명에서는 검출 대상이 되는 표적 핵산을 포함하는 핵산 시료를 준비하는 단계를 수행할 수 있다. 여기서 상기 핵산 시료는 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물 시료로부터 얻어진 것일 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기와 같이 핵산 시료가 준비되면 이를 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)에 의해 증폭하는 단계를 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 필요에 따라 PCR 증폭하는 단계에 후속적으로 얻어진 핵산 시료의 PCR 증폭물을 희석하는 단계를 수행할 수 있다. 여기서 상기 희석하는 공정은 PCR 증폭물에 증류수 또는 PCR 반응 버퍼를 첨가하여 수행할 수 있고, 그 첨가량은 특별히 제한하지는 않으나 PCR 증폭물의 2 ~ 10배 부피의 양으로 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기와 같이 얻어진 PCR 증폭물 또는 그 희석물에 본 발명에 따른 프로브 세트를 첨가한 뒤 온도를 90 ~ 100℃, 바람직하게는 93 ~ 97℃, 보다 바람직하게는 94 ~ 96℃로 높이고 5 ~ 60초, 바람직하게는 20 ~ 40초, 보다 바람직하게는 25 ~ 35초 동안 유지시켜 핵산 시료가 DNA인 경우 이중 가닥을 변성(denature) 및 분리시키고, 표적 핵산과 프로브의 결합 역시 해리시키는 단계를 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 증폭 시 역방향 프라이머(Reverse primer)를 과량 첨가하여 단일 가닥의 핵산 서열을 유도할 수 있다.
이 후, 본 발명에서는 온도를 표적 프로브의 융해 온도 미만으로 낮추고 5 ~ 30분, 바람직하게는 5 ~ 20분, 보다 바람직하게는 5 ~ 15분 동안 유지시켜 표적 프로브는 표적 핵산의 제1 특이 영역에 혼성화시키고, 헬퍼 프로브는 표적 핵산의 제2 특이 영역에 혼성화시키는 단계를 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기와 같이 혼성화시킨 뒤에는 표적 프로브의 융해 온도 이상 헬퍼 프로브의 융해 온도 미만의 온도까지 온도를 점차 상승시키면서 형광 강도를 측정하여 표적 핵산의 존재 유무를 검출하는 단계를 수행할 수 있다.
단, 본 발명에서는 상기와 같이 온도의 변화에 따라 형광 강도를 측정하여 온도의 변화에 따른 형광 강도의 변화를 그래프로 도출함으로써 표적 핵산을 검출할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 얻어진 그래프로부터 미분 곡선을 얻은 뒤 피크의 존재 유무를 통해 표적 핵산을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 발명자들은 상기 핵산 시료 내에 포함된 표적 핵산의 농도가 증가할수록 미분 곡선에 존재하는 피크의 세기가 커지는 것을 발견하였다. 이에, 본 발명에서는 표적 핵산을 다양한 농도로 포함하는 복수 개의 검정 시료를 준비하여 이들 시료 각각에 대하여 온도의 변화에 따른 형광 강도의 변화의 미분 곡선 그래프를 도출한 뒤, 상기 표적 핵산의 농도에 따른 미분 곡선 내 피크 값의 변화를 표준 곡선 그래프(standard curve)로 도출하는 단계를 수행할 수 있다.
이 후, 본 발명에서는 검출하고자 하는 핵산 시료로부터 온도의 변화에 따른 형광 강도 변화의 미분 곡선 내 피크 값이 측정되면, 그 값을 상기한 표준 곡선 그래프에 대입하여 핵산 시료 내 표적 핵산의 농도를 검출하는 단계를 수행할 수 있다.
이처럼 본 발명은 핵산 시료 내 표적 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 표적 핵산의 농도 또한 검출할 수 있다.
도 2는 본 발명의 검출 방법의 각 공정을 개략적으로 도시한 것으로 이하에서는 이를 참조하여 설명한다.
우선 검출 대상인 표적 핵산을 포함하는 핵산 서열에 제1 특이 영역에 혼성화될 수 있는 표적 프로브와 제2 영역에 혼성화될 수 있는 헬퍼 프로브를 첨가한 뒤, 온도를 95℃의 고온으로 높여 표적 핵산의 이중 나선 결합과, 프로브 및 표적 핵산의 결합을 모두 해리시킨다(a). 이후, 표적 프로브 및 헬퍼 프로브의 융해 온도(Tm) 미만의 온도인 45℃로 온도를 낮춘 뒤 대략 3분 가량 유지하며 표적 핵산 중 제1 특이 영역에 대한 표적 프로브의 혼성화와, 제2 특이 영역에 대한 헬퍼 프로브의 혼성화를 유도시키면 표적 프로브의 리포터를 헬퍼 프로브의 소광자가 소광시킨다(b). 그리고 온도를 표적 프로브의 융해 온도 이상, 헬퍼 프로브의 융해 온도 미만인 62℃로 높이면, 표적 프로브가 제1 특이 영역으로부터 해리되면서 상기 표적 프로브의 리포터가 소광자로부터 멀어져 형광 신호가 방출된다(c). 따라서, 본 발명에서는 표적 핵산을 포함하는 핵산 서열과 프로브의 혼합물의 온도를 변화시키면서 형광 강도의 변화를 측정하여 이를 그래프로 나타내고, 온도 변화에 따라 형광 세기가 급격히 증가하는 부분이 존재하는 경우 표적 핵산의 존재를 확인할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 그래프의 세로축을 음수화 및 미분하여 미분 곡선을 얻음으로써 피크의 존재 유무를 통해 표적 핵산의 존재를 보다 정확하게 확인할 수 있다(d).
단, 본 발명에서 상기 (b) 및 (c)의 과정에서 유지 온도는 일 실시예를 기재한 것이고, 이에 제한되지 않으며 혼성화 유도 시 표적 프로브의 융해 온도 미만의 온도이면 무방하고, 표적 프로브 해리 시에는 표적 프로브의 융해 온도 이상, 헬퍼 프로브의 융해 온도 미만의 온도이면 어느 온도이든 제한되지 않는다.
본 발명은 매우 높은 정확도로 신속하게 표적 핵산의 존재 유무를 검출할 수 있으며, 더 나아가서는 표적 핵산을 정량할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 프로브 세트는 리포터로 다양한 파장대의 형광 물질을 사용할 수 있어, 하나의 핵산 서열 내 다양한 부위의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 여러 핵산 서열 내 각각의 표적 핵산을 동시에 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로브 세트의 구조를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 다른 표적 핵산의 검출 방법의 각 공정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1 및 실시예 2에서 사용되는 참조기 및 부세 각각에서의 프라이머 및 프로브의 서열과 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1에서 온도 변화에 따른 형광 세기 변화의 미분 곡선을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2에서 온도 변화에 따른 형광 세기 변화의 미분 곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 3 및 실시예 4에서 사용되는 참조기 및 부세 각각에서의 프라이머 및 프로브의 서열과 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 3에서 온도 변화에 따른 형광 세기 변화의 미분 곡선을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 4에서 온도 변화에 따른 형광 세기 변화의 미분 곡선을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
참조기와 부세는 한국, 중국 및 일본 등에서 많이 소비되는 생선이다. 나라와 지역에 따라 두 가지 생선은 가격차이가 크게 난다. 그런데 두 종은 육안으로 보았을 때 크게 차이가 나지 않아, 이를 이용한 사기가 만연하다. 두 종은 DNA 서열의 차이를 이용하여서는 구분이 가능하므로, 이하에서는 본 발명의 방법을 이용하여 두 종을 구분하고자 한다. 이하의 실험에서 참조기로는 군산수산시장, 서울노량진시장, 부산공동어시장에서 국내산 참조기로 구입하였고, 부세로는 농림수산식품검역검사본부, 인천종합어시장에서 중국산 부세를 구입하였다. 이와 같이 구입한 참조기와 부세 샘플로부터 독일 퀴아젠사 (QIAGEN)의 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen, Cat. 69506)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출 부위로는 참조기와 부세의 몸통조직을 사용하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 다양한 조직을 사용할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.
[실시예 1]
참조기(Larimichthys polyactis) 및 부세(Larimichthys crocea)의 특이적 판별을 위해서 선행문헌과 GenBank 유전자 서열을 참조하였고, 그 결과 하기 도 3과 같이 정방향 프라이머(5'-ACAGAATATCTGACCAACA-3'), 역방향 프라이머(5'-GGATTGCGCTGTTATCCCTA-3'), 참조기의 표적 프로브(5'-FAM-ACGAACCCAGTTACC-P-3'), 부세의 표적 프로브(5'-HEX-ACGAACCGAGTTACT-P-3') 및 헬퍼 프로브(5'-ATCCGGCAACGCCGATC-BHQ-3')를 제작하였다. 상기 참조기와 부세 각각의 표적 프로브의 융해 온도는 54℃이고, 헬퍼 프로브의 융해 온도는 66℃로 예측되었다. 여기서 상기 프라이머는 Cosmogenetech(Korea)에서 제작하였고, 프로브는 Biobasic(Canada)에서 제작하였으며, 융해 온도의 예측은 Exiqon oligo Tm prediction(https://www.exiqon.com/ls/pages/exiqontmpredictiontool.aspx)를 통해 수행하였다.
우선, 하기 표 1에 나타낸 조성 및 하기 표 2에 나타낸 조건으로 리얼타임 PCR을 수행하였다. 이때 상기한 리얼타임 PCR 과정 중 2차 어닐링 공정에서부터 온도를 변화시키며 형광 강도를 측정하고, 측정된 형광 강도의 값을 음수화 및 미분하여 미분 곡선의 결과를 도 4에 그래프로 나타내었다. 단, 대조군(NTC)으로는 DNA 주형을 사용하지 않고, 초순수로 대체하였다.
PCR 혼합물(총 20㎕)
Premix(RR390, TAKARA, Japan) 10㎕
정방향 프라이머 1pmole
역방향 프라이머 50pmole
표적 프로브(참조기 또는 부세) 5pmole
헬퍼 프로브 5pmole
DNA 주형(참조기, 부세 또는 이들의 혼합물) 15ng
초순수(W2006, Biosesang, Korea) 잔부
PCR 프로토콜
단계 온도 시간 사이클 횟수
사전-변성 95℃ 20초 1회
변성 95℃ 3초 50회
어닐링/연장 54℃ 30초 1회
변성 95℃ 30초 1회
어닐링 30℃ 10분 1회
형광 신호 측정 30℃~60℃, 1℃씩 온도 상승 온도 상승 후 5초 후 형광 측정 1회
상기 실험에서 참조기의 표적 프로브는 FAM(최대 흡수파장: 535nm, 최대 방출 파장: 556nm)으로, 부세의 표적 프로브는 HEX(최대 흡수파장: 535nm, 최대 방출 파장: 556nm)으로, 각기 다른 방출 파장을 갖는 형광 물질로 표지되어 온도 변화에 따른 형광 세기의 변화 결과를 시각적으로 구분하여 확인할 수 있도록 하였다.
이에 따라 도 4에서 보는 바와 같이, 참조기의 표적 프로브를 사용한 경우 참조기 DNA 시료에서만 대략 54℃에서 피크(파란색)가 관찰되었고, 부세의 DNA 시료에서는 온도 변화에도 불구하고 피크가 관찰되지 않았다. 반면, 부세의 표적 프로브를 사용한 경우 부세의 DNA 시료에서만 대략 54℃에서 피크(초록색)가 관찰되었고, 참조기의 DNA 시료에서는 온도 변화에도 불구하고 피크가 관찰되지 않았다. 또한, 참조기의 표적 프로브 및 부세의 표적 프로브 모두 참조기와 부세의 혼합 DNA 시료에서 대략 54℃ 부근에서 피크가 관찰되었지만, 그 피크 세기가 참조기 또는 부세 단독 DNA 시료를 사용한 경우에 비하여 절반 정도로 감소한 것을 볼 때, 상기 참조기 표적 프로브는 혼합 시료 중 절반 정도의 양을 차지하는 참조기 DNA 시료에 대하여만, 부세 표적 프로브는 부세 DNA 시료에 대하여만 혼성화한 것임을 알 수 있다.
[실시예 2]
상기 실시예 1과 동일한 과정으로 리얼타임 PCR을 수행하되, 표적 프로브로는 참조기의 표적 프로브 25pmole과 부세의 표적 프로브 25pmole의 혼합물을 사용하였다. 리얼타임 PCR 과정 중 2차 어닐링 공정에서부터 온도를 변화시키며 형광 강도를 측정하고, 측정된 형광 강도의 값을 음수화 및 미분하여 미분 곡선의 결과를 도 5에 그래프로 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 참조기의 표적 프로브와 부세의 표적 프로브의혼합 표적 프로브를 사용하더라도, 상기 참조기의 표적 프로브는 참조기 DNA 시료에 대하여만 대략 54℃에서 형광 피크(파란색)를 나타내었고, 부세의 표적 프로브는 부세 DNA 시료에 대하여만 대략 54℃에서 형광 피크(초록색)를 나타내었다. 더욱이, 참조기 및 부세의 혼합 DNA 시료에 대하여는 참조기의 표적 프로브는 참조기 DNA 시료에 대하여, 부세의 표적 프로브는 부세 DNA 시료에 대하여 각각 형광 피크를 나타내었다.
상기 실험에서 검출 대상으로 한 참조기의 표적 핵산 중 제1 특이 영역과 부세의 표적 핵산 중 제1 특이 영역은 2개의 염기 서열만이 상이하다. 하지만, 본 발명의 검출 방법을 사용하는 경우, 매우 높은 정확도로 이들을 판별할 수 있음을 확인할 수 있었고, 피크 세기를 통하여 정량 분석 또한 가능함을 알 수 있었다. 더 나아가서는 리포터로 다양한 파장대의 형광 물질을 사용할 수 있어, 여러 종류의 검출 대상의 존재 유무를 동시에 확인할 수 있었다.
[실시예 3]
상기 실시예 1과 동일한 과정으로 리얼타임 PCR을 수행하되, 프라이머 및 프로브로는 하기 도 6과 같이 정방향 프라이머(5'-ACAGAATATCTGACCAACA-3'), 역방향 프라이머(5'-CAACATCGAGGTCGTA-3'), 참조기의 표적 프로브(5'-FAM-ACGAACCCAGTTACC-P-3'), 부세의 표적 프로브(5'-HEX-ACGAACCGAGTTACT-P-3') 및 헬퍼 프로브(5'-CTAGGGATAACAGCGCAATCCTCTTTTAGAGTCCATATCGACAAGAGGG-BHQ-3')를 제작하여 사용하였다. 상기 참조기와 부세 각각의 표적 프로브의 융해 온도는 52℃이고, 헬퍼 프로브의 융해 온도는 75℃로 예측되었다. 여기서 상기 프라이머는 Cosmogenetech(Korea)에서 제작하였고, 프로브는 Biobasic(Canada)에서 제작하였으며, 융해 온도의 예측은 Exiqon oligo Tm prediction(https://www.exiqon.com/ls/pages/exiqontmpredictiontool.aspx)를 통해 수행하였다.
이러한 리얼타임 PCR 과정 중 2차 어닐링 공정에서부터 온도를 변화시키며 형광 강도를 측정하고, 측정된 형광 강도의 값을 음수화 및 미분하여 미분 곡선의 결과를 도 7에 그래프로 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 참조기의 표적 프로브를 사용한 경우 참조기 DNA 시료에서만 대략 43℃에서 피크가 관찰되었고, 부세의 DNA 시료에서는 온도 변화에도 불구하고 피크가 관찰되지 않았다. 반면, 부세의 표적 프로브를 사용한 경우 부세의 DNA 시료에서만 대략 45℃에서 피크가 관찰되었고, 참조기의 DNA 시료에서는 온도 변화에도 불구하고 피크가 관찰되지 않았다. 또한, 참조기의 표적 프로브 및 부세의 표적 프로브 모두 참조기와 부세의 혼합 DNA 시료에서는 대략 43℃ 및 45℃ 부근에서 피크가 관찰되었으나, 참조기 또는 부세 단독 DNA 시료를 사용한 경우에 비하여 그 세기가 절반 정도로 감소한 것을 볼 때, 상기 참조기 표적 프로브는 혼합 시료 중 참조기 DNA 시료에 대하여만, 부세 표적 프로브는 부세 DNA 시료에 대하여만 혼성화한 것임을 알 수 있다.
[실시예 4]
상기 실시예 3과 동일한 과정으로 리얼타임 PCR을 수행하되, 표적 프로브로는 참조기의 표적 프로브 25pmole과 부세의 표적 프로브 25pmole의 혼합물을 사용하였다. 리얼타임 PCR 과정 중 2차 어닐링 공정에서부터 온도를 변화시키며 형광 강도를 측정하고, 측정된 형광 강도의 값을 음수화 및 미분하여 미분 곡선의 결과를 도 8에 그래프로 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 참조기의 표적 프로브와 부세의 표적 프로브의혼합 표적 프로브를 사용하더라도, 상기 참조기의 표적 프로브는 참조기 DNA 시료에 대하여만 대략 43℃ 부근에서 형광 피크를 나타내었고, 부세의 표적 프로브는 부세 DNA 시료에 대하여만 대략 45℃에서 형광 피크를 나타내었다. 더욱이, 참조기 및 부세의 혼합 DNA 시료에 대하여는 참조기의 표적 프로브는 참조기 DNA 시료에 대하여, 부세의 표적 프로브는 부세 DNA 시료에 대하여 각각 형광 피크를 나타내었고, 시료 량이 감소됨에 따라 피크 세기도 작아진 것을 볼 수 있었다.
상기 실험에서 검출 대상으로 한 참조기의 표적 핵산 중 제1 특이 영역과 부세의 표적 핵산 중 제1 특이 영역은 2개의 염기 서열만이 상이하다. 하지만, 본 발명의 검출 방법을 사용하는 경우, 매우 높은 정확도로 이들을 판별할 수 있음을 확인할 수 있었고, 피크 세기를 통하여 정량 분석 또한 가능함을 알 수 있었다. 더 나아가서는 리포터로 다양한 파장대의 형광 물질을 사용할 수 있어, 여러 종류의 검출 대상의 존재 유무를 동시에 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (35)

  1. 리포터(reporter)가 결합된 표적 프로브 2개와 소광자(quencher)가 결합된 헬퍼 프로브 1개를 포함하는 검출 정확도가 증가된 서열 감별용 프로브 세트로서,
    상기 표적 프로브 1은 표적 핵산의 제1 특이 영역에 상보적인 서열을 포함하고,
    상기 표적 프로브 2는 표적 핵산의 제1 특이 영역의 상보적인 서열과 염기가 1 내지 3 bp 상이한 서열을 포함하며,
    상기 헬퍼 프로브는 표적 핵산의 제2 특이 영역에 상보적인 서열을 포함하며,
    상기 표적 프로브 1과 2의 융해 온도(melting temperature, Tm)는 동일하며,
    상기 표적 프로브 1과 2의 융해 온도는 헬퍼 프로브의 융해 온도보다 5 내지 30℃ 낮은 것인, 프로브 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 표적 프로브와 헬퍼 프로브의 융해 온도의 차이는 10 ~ 20℃인 프로브 세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 표적 프로브의 융해 온도는 50 ~ 60℃인 프로브 세트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 헬퍼 프로브의 융해 온도는 60 ~ 80℃인 프로브 세트.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 표적 프로브의 서열 길이는 헬퍼 프로브의 서열 길이보다 짧은 프로브 세트.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 프로브 세트.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 소광자는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, 및 IRDye QC-1 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 프로브 세트.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 리포터는 표적 프로브의 3' 말단에 결합되고, 상기 소광자는 헬퍼 프로브의 5' 말단에 결합되는 프로브 세트.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 리포터는 표적 프로브의 5' 말단에 결합되고, 상기 소광자는 헬퍼 프로브의 3' 말단에 결합되는 프로브 세트.
  13. 표적 핵산의 제1 특이 영역에 상보적인 서열을 포함하는 표적 프로브 1;
    표적 핵산의 제1 특이 영역의 상보적인 서열과 염기가 1 내지 3 bp 상이한 표적 프로브 2; 및,
    표적 핵산의 제2 특이 영역에 상보적인 서열을 포함하는 헬퍼 프로브 1개를 설계하는 단계를 포함하고,
    상기 표적 프로브 1과 2의 융해 온도(melting temperature, Tm)는 동일하며,
    상기 표적 프로브 1과 2의 융해 온도는 헬퍼 프로브의 융해 온도보다 5 내지 30℃ 낮게 설계하는 것을 특징으로 하는, 검출 정확도가 증가된 서열 감별용 프로브 세트의 설계방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 설계하는 단계는,
    핵산 시료 중 표적 핵산의 염기 서열을 분석하는 단계;
    상기 표적 핵산 중 검출 대상이 되는 제1 특이 영역을 결정하는 단계;
    상기 제1 특이 영역의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 1 ~ 10bp가 이격된 위치의 제2 특이 영역을 결정하는 단계;
    상기 표적 핵산의 제1 특이 영역에 혼성화될 수 있는 표적 프로브의 염기 서열을 결정하는 단계; 및
    상기 표적 핵산의 제2 특이 영역에 혼성화될 수 있는 헬퍼 프로브의 염기 서열을 결정하는 단계를 포함하는 프로브 세트의 설계방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제13항에 있어서,
    상기 표적 프로브의 융해 온도는 50 ~ 60℃인 프로브 세트의 설계방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 헬퍼 프로브의 융해 온도는 60 ~ 80℃인 프로브 세트의 설계방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 표적 프로브의 서열 길이는 헬퍼 프로브의 서열 길이보다 짧게 설계되는 프로브 세트의 설계방법.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 표적 프로브에 리포터를 결합시키는 단계를 추가로 더 포함하는 프로브 세트의 설계방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 리포터는 표적 프로브의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합되는 프로브 세트의 설계방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 리포터는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상인 프로브 세트의 설계방법.
  23. 제13항에 있어서,
    상기 헬퍼 프로브에 소광자를 결합시키는 단계를 추가로 더 포함하는 프로브 세트의 설계방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 소광자는 헬퍼 프로브의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합되는 프로브 세트의 설계방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 소광자는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, 및 IRDye QC-1 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 프로브 세트의 설계방법.
  26. 검출 대상이 되는 표적 핵산을 포함하는 핵산 시료를 준비하는 단계;
    제1항의 프로브 세트 중 표적 프로브를 표적 핵산의 제1 특이 영역에 혼성화시키고, 헬퍼 프로브는 표적 핵산의 제2 특이 영역에 혼성화시키는 단계; 및
    온도를 변화시키면서 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는, 검출 정확도가 증가된 표적 핵산의 검출 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 핵산 시료를 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)에 의해 증폭하는 단계를 더 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭된 핵산 시료의 PCR 증폭물을 희석하는 단계를 더 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭된 핵산 시료의 PCR 증폭물에 프로브 세트를 첨가한 뒤 온도를 90 ~ 100℃로 높이고 5 ~ 60초 동안 유지하여 변성(denature)시키는 단계를 더 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  30. 제26항에 있어서,
    상기 혼성화시키는 단계는 표적 프로브의 융해 온도 미만의 온도를 5 ~ 30분 동안 유지시키며 수행되는, 표적 핵산의 검출 방법.
  31. 제26항에 있어서,
    상기 형광 강도를 측정하는 단계는 표적 프로브의 융해 온도 이상, 헬퍼 프로브의 융해 온도 미만의 온도까지 온도를 상승시키며 수행되는, 표적 핵산의 검출 방법.
  32. 제26항에 있어서,
    상기 형광 강도를 측정하는 단계에 후속적으로 온도의 변화에 따른 형광 강도의 변화를 그래프로 도출하는 단계를 더 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 그래프는 온도 변화에 따른 형광 강도의 변화 곡선의 미분 곡선인, 표적 핵산의 검출 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 미분 곡선 내에 피크(peak) 존재 유무에 따라 표적 핵산의 존재 유무를 검출하는 단계를 더 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    표적 핵산을 다양한 농도로 포함하는 복수 개의 검정 시료에 대하여 온도의 변화에 따른 형광 강도의 변화의 미분 곡선 그래프를 도출하는 단계;
    상기 표적 핵산의 농도에 따른 미분 곡선 내 피크 값의 변화를 표준 곡선 그래프(standard curve)로 도출하는 단계; 및
    상기 핵산 시료를 이용하여 도출된 미분 곡선 내 피크 값을 표준 곡선 그래프에 대입하여 핵산 시료 내 표적 핵산의 농도를 검출하는 단계를 더 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
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