KR20160047302A

KR20160047302A - 리포터 및 소광자가 포함된 내부 정량 컨트롤 프로브를 이용한 새로운 정량 분석 방법

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Publication number: KR20160047302A
Application number: KR1020140143574A
Authority: KR
Inventors: 김성기; 김경일; 조군호; 최재진; 오인성; 김수남; 윤지혜; 박준호; 이소현
Original assignee: 주식회사 파나진
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2016-05-02

Abstract

본 발명은 리포터 및 소광자가 포함된 내부 정량 컨트롤 (Standard quantification control, SQC) 프로브를 이용한 표적핵산의 정량 분석 방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 내부 정량 컨트롤의 형광 값에 대비한 정량 분석 방법이다. 본 발명에 따른 내부 정량 컨트롤(Standard quantification control, SQC)을 이용한 표적핵산 정량 검출방법은, 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자 증폭의 억제가 가능하고, 검출하고자 하는 극미량의 표적 유전자의 선택적 증폭과 선택적 검출을 통해 시료 속에 포함된 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 다양한 변이, 또는 특정 유전자 서열을 효과적으로 검출할 수 있으며, 다중의 검출 프로브와 다중의 증폭 억제 프로브를 사용하여 실시간 증폭곡선과 융해곡선의 동시 분석이 가능하다. 이에 따라, 본 발명은 동시 다중적으로 표적핵산 검출 및 정량뿐 아니라 융해곡선분석을 통한 유전형판별이 가능하다.

Description

리포터 및 소광자가 포함된 내부 정량 컨트롤 프로브를 이용한 새로운 정량 분석 방법 {NEW QUANTIFICATION ANALYSIS METHOD USING STANDARD QUANTIFICATION CONTROL(SQC) PROBES COMPRISING REPOTER AND QUENCHER}

본 발명은 리포터 및 소광자가 포함된 내부 정량 컨트롤 프로브를 이용하여 표적핵산을 정량하는 방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 실시간 중합효소 반응 및 융해 곡선(melting curve) 분석 방법을 이용하여 표적핵산을 정량적으로 검출하는 것으로서, 표적핵산이 증폭되는 반응 튜브에 내부 정량 컨트롤 프로브를 첨가하고, 동일한 반응기 내에서 내부 정량 컨트롤 프로브의 형광 값 및 표적핵산의 양의 상관관계를 분석하여, 다중 표적핵산을 정량하는 방법에 관한 것이다.

유전자(gene)는 전사(transcription)와 번역(translation)을 통해 생명체의 형질을 발현하며, 또한 그 형질을 자손에게 전달하는 매우 중요한 물질로서, A(아데닌)·C(시토신)·G(구아닌)·T(티민)을 기본단위로 하는 염기의 배열로 이루어져 있다. 유전자의 염기 배열은 생명체의 형질을 결정하며, 이러한 유전자의 염기 배열 및 염기 다형성 분석은 많은 생물학적 정보를 연구하는데 매우 중요하다. 예를 들면, 염기 다형성 분석을 통하여 유전관련 질환 진단 및 유전 형질에 따른 맞춤의약의 처방을 가능하게 하고 감염균의 진단 및 약제 내성균을 판별할 수 있으며, 그 밖에도 생물체의 종 판별 및 법의학 등 수많은 분야에서 광범위하게 응용이 가능하다.

특히 1983년 이후 국내 사망원인 1위인 암 질환의 경우, 종양 유전자(Oncogenes)의 변이(mutations), 종양 억제 유전자(tumour suppressor genes)의 변이, 탈조절(deregulations)과 염색체의 이상(chromosomal abnormalities)등의 유전자 이상이 암의 발병과 약물의 예후 판단에 직접적으로 관여한다는 사실이 새롭게 밝혀지면서 이에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있다 (Fearson ER et al., Cell., 1990, 61:759; K.W Kinzler et al., Cell., 1996, 87:159; Manuel Serrano et al., Cell., 1997, 88:593; Amado RG et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26:1626; Raponi M et al., Curr. Opin. Pharmacol., 2008, 8:413; Siena S et al., J. Natl. Cancer Inst., 2009, 101:1308).

이와 같은 이유로 임상적 의미가 있는 돌연변이의 검출은 매우 중요하기 때문에, 분석하고자 하는 목적 또는 유전자의 종류에 따라 진단을 위한 다양한 검출 방법들이 계속해서 보고되고 있다(Taylor CF, Taylor GR. Methods Mol. Med., 92:9, 2004). 특히 체세포 돌연변이의 경우(somatic mutation), 돌연변이 유전자는 종양의 종류에 따라 다량의 야생형 유전자 속에 메가 베이스당 0.1~100 베이스 정도의 매우 낮은 빈도로 존재한다. 또한 분석 샘플에 존재하는 돌연변이 암세포의 수는 정상세포대비 현저히 적기 때문에 이것의 검출은 매우 어려우며 고도의 검출 기술을 필요로 한다 (Chung et al., Clin Endocrinol., 65:660, 2006; Trovisco et al., J Pathol., 202:247, 2004).

극미량의 돌연변이 검출 위한 대표적 방법으로는, 소량의 돌연변이 유전자를 선택적으로 증가시키기 위해 돌연변이에 특이적인 프라이머를 이용하여 돌연변이를 특이적으로 증폭하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법(Rhodes et al., Diagn mol pathol., 6:49, 1997), 스콜피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR, DxS' scorpions and ARMS) 방법(Mark et al., Journal of Thoracic Oncology, 4:1466, 2009), 대립형질 특이적(allele specific) 프라이머 기술과 MGB(minor groove binder)-프로브를 이용하여 야생형 유전자의 증폭을 억제하고 돌연변이 유전자만을 선택적으로 증폭 후, 택만(Taqman) 프로브를 이용하여 돌연변이가 일어난 위치를 포함하지 않고 증폭산물을 검출하는 CAST PCR 방법 (Didelot A et al., Exp Mol Pathol., 92:275, 2012), 임계적 변성온도(critical denaturation temperature, Tc)를 이용하여 돌연변이의 민감도를 증가시킬 수 있는 콜드-PCR(Cold-PCR) 방법(Zuo et al., Modern Pathol., 22:1023, 2009) 등 실시간 PCR 기술에 기반을 둔 다양한 분석법이 있다. 이러한 기술은 쉽고 빠르게 다양한 진단에 적용이 가능하며, 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석을 위해 좋은 기술이 되고 있다 (Bernard et al., Clinical Chemistry, 48:1178, 2002).

하지만 위의 방법들은 돌연변이만을 선택적으로 증폭시키는 프라이머를 설계해야 하며, 임계적 변성 온도를 정교히 맞춰줘야 하는 등의 실험 디자인이 어렵고, 대립형질 특이적 프라이머를 이용한 방법의 경우 미스프라이밍(mispriming)이 되면 위양성(false positive) 결과를 야기할 수 있다. 또한, 현재 가장 대중적으로 이용되고 있는 택만(Taqman) 및 스콜피언(scorpions) 프로브 법은 프로브의 융해곡선 분석을 이용한 동시 다중 분석이 불가능하기 때문에, 한 튜브에서 검출 가능한 유전자 수는 실시간 PCR 장비의 검출 가능한 형광 개수에 의존하는 문제점이 있다.

최근에 실시간 PCR 기술을 통해 체세포 돌연변이 검출을 위한 다양한 분자진단 기술들이 개발되고 있으며, 특히 높은 민감도와 특이도를 가지고 짧은 시간에 동시 다중 정량을 할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

피엔에이(Peptide nucleic acid, PNA)는 N-(2-아미노에틸)글리신 아미드를 기본 골격으로 하는 핵산 유사체로서 1991년 닐슨에 의해 보고되었다 (Nielsen PE et al., Science, 254(5037):1497, 1991). PNA 골격은 전기적으로 중성으로 상보적 염기서열을 갖는 표적 핵산에 대해서 DNA 프로브보다 높은 특이도와 선택성을 가지며, 백본(backbone)의 알파(α), 감마(γ) 위치 혹은 링커 부위에 특정 작용기를 도입하여 세포 투과 및 표적핵산과의 융해온도 조절과 같은 자유로운 물성 조절이 가능한 특성을 가지고 있다 (Englund EA et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 46:1414, 2007; Stefano Sforza et al., Eur. J. Org. Chem., 16:2905, 2000; Roberto Corradini et al., Curr. Top. Med. Chem., 11:1535. 2011). 또한 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 분해되지 않는 장점이 있어, 프로브를 이용한 분자 진단 방법에 매우 유용하다 (Egholm et al., Nature, 365:556, 1993; Nielsen et al., Bioconjugate Chem., 5:3, 1994; Demidov, et al., Biochem. Pharmacol., 48:1310, 1994). 이와 같은 PNA의 장점을 이용하여 1993년 PCR 클램핑(camping) 기술이 개발되었다 (Henrik Orum et al., Nucleic Acids Res., 21:5332, 1993). 이 기술은 PNA 프로브를 증폭을 원하지 않는 유전자와 결합시켜 PCR 증폭을 억제하는 기술로서, 야생형 유전자에 상보적인 PNA 프로브를 이용하면 PCR반응 중 야생형 유전자의 증폭을 선택적으로 억제하여 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있다.

현재 PNA clamping 기술을 응용한 다양한 기법들이 보고되어 있다. 이하 PNA clamping 기법을 이용하여 유전자를 선택적으로 증폭하기 위한 방법들의 특징을 간략히 서술하였다.

PNA-LNA clamp(미국 공개특허 제2013-0005589호; Yoshiaki Nagai et al. Cancer Res., 65(16):7276, 2005) 방법은 표적 부위에 대해서 야생형 유전자의 배열을 가지는 PNA 클램핑(clamping) 프로브와 변이 유전자의 배열을 가지는 검출용 LNA 택만(taqman) 프로브가 경쟁적으로 하이브리디제이션(hybridization)하도록 양자의 배열을 설계해 선택적인 증폭과 선택적 검출을 하는 방법이다. 하지만, 이 방법은 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성을 가진 DNA 폴리머레이즈가, 형광자와 소광자로 라벨링된 돌연변이 프로브를 분해하여 형광을 검출하는 택만 프로브 방법을 사용하였고, 따라서 프로브의 융해온도(Tm, melting temperature) 값을 분석할 수 없으며 한 개의 형광으로 다중 표적 검출이 불가능하다.

PNA 하이브 프로브(hyb probe)(PNA as both PCR clamp and sensor probe; 미국공개특허 제2008-0176226호)는 기존 로슈사의(roche) 하이브 프로브 시스템에서 공여자(donor) 프로브 부분을 PNA 프로브로 바꿈으로써 PNA프로브를 통하여 클램핑과 검출을 동시에 하도록 설계된 기술이다. 그러나, 앵커(anchor) 프로브를 포함하여야 하는 제한점을 여전히 가지고 있기 때문에 프로브의 설계가 어려우며, 길이가 긴 앵커 프로브의 사용은 인접한 위치의 변이에 대한 동시 다중 검출을 불가능하게 할 뿐 아니라, 클램핑과 검출을 동시에 하는 1종의 PNA 프로브를 사용하기 때문에 PNA 프로브의 융해곡선 분석을 통한 동일한 코돈 내의 다중 돌연변이 유전형 판별시 PNA 프로브와 각 돌연변이 유전형 간의 융해온도 차이가 크지 않아 분석이 어려운 문제점이 있다.

PNA 클램핑 & 인터컬레이터 검출(PNA Clamping & intercalator detection) 방법은 야생형 유전자를 PNA 프로브 이용해 클램핑하고, 돌연변이형 유전자만 선택적으로 증폭 후 인터컬레이터(intercalator)를 이용하여 증폭산물을 검출하는 방법으로서(Makito Miyake et al., Biochem Biophys Res Commun., 362:865, 2007), 동시 다중 검출이 불가능하며 야생형 유전자가 완전히 클램핑되지 않을 경우 위양성 결과를 초래하는 등 결과 분석이 어렵다.

PNA & 표지되지 않은 DNA 프로브(PNA & unlabeled DNA probe)를 이용한 방법(Ji Eun Oh et al., J Mol Diagn., 12:418, 2010)은 PNA 프로브를 이용하여 야생형 유전자를 클램핑 후 인터컬레이터를 이용하여 표지되지 않은 DNA 프로브와 돌연변이 유전자의 융해곡선을 분석하는 방법으로 특이적인 실시간 증폭곡선 분석이 불가능하고, 민감도가 낮으며, 동시 다중 검출이 불가능한 문제점이 있다.

위의 문제점을 해결하기 위하여, 클램핑 프로브(clamping probe)와 동시에 형광자 및 소광자를 포함하는 검출 프로브(detection probe)의 혼합체를 이용하여, 원하는 유전자를 선택적으로 높은 민감도로 검출 가능함을 확인하였고, 인접한 돌연변이 검출이 용이함을 확인하였다. 또한, 야생형 유전자와 표적핵산 유전자의 융해온도 차이를 크게 함으로써, 증폭 곡선(amplification curve) 및 융해곡선(melting curve) 분석을 이용하여 동시에 다중 표적핵산 검출 및 유전형 판별이 가능하고, 높은 민감도로 검출이 가능해졌다.

그러나, 상기 기술에 따라 다양한 질환과 관련이 있는 돌연변이나 유전자의 검출은 가능해졌으나, 상기 기술은 일반적인 실시간 PCR(real time PCR) 의 Ct 값만으로 돌연변이를 검출하는 과정이 아니라, 융해곡선 분석법으로 돌연변이를 확인하는 방법이므로, 일반적인 중합효소 연쇄반응법의 정량 분석 방법을 사용하기 어려운 점이 있다. 또한 일반적인 실시간 PCR(real time PCR) 법에서 사용되고 있는 정량 분석 방법은 동일한 반응 튜브에서 이루어지는 것이 아니라, 다른 반응 튜브에서 반응되는 표준 곡선(standard curve)를 통해 상대적으로 정량하는 방법이므로, 상기 기술에서는 정확한 정량 값을 확인하기 어려운 단점이 있다. 따라서, 임상적인 유용성 확인 및 약물반응에 대한 모니터링 등에 광범위하게, 상기 기술을 이용하기 위해서는 정확한 정량을 하기 위한 새로운 정량 분석 방법이 필요하다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 노력한 결과, 정량 표준 곡선(standard curve)을 분석하기 위한, 리포터 및 소광자가 포함된 내부 정량 컨트롤 (Standard quantification control, SQC) 프로브를 융해곡선(melting curve) 분석 방법에 이용하여, 검출하고자 하는 표적핵산의 정량 분석이 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

일 실시예에서는, 표적핵산을 실시간으로 검출하기 위해, 클램핑 프로브(clamping probe)와 리포터 및 소광자가 포함된 검출 프로브(detection probe)의 혼합체를 이용하여, 원하는 유전자를 선택적으로 높은 민감도로 검출 가능함을 확인하였고, 검출 돌연변이의 정량을 위하여 내부 정량 컨트롤 프로브를 사용하여 상대적인 정량이 가능한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 정량 분석 방법은 분자진단, 산전진단, 조기진단, 암진단 유전관련 진단, 유전 형질 진단, 감염균의 진단, 약제내성균의 판별, 법의학, 생물체의 종 판별 등 다양한 분자진단 기술에 이용할 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 표적핵산을 정량적으로 검출 하기 위한, 하나 이상의 내부 정량 컨트롤 (Standard quantification control, SQC) 프로브를 포함하는 동시다중적 표적핵산 검출 방법 및 상기 방법을 이용한 분자진단 키트를 제공한다.

본 발명의 내부 정량 컨트롤 (Standard quantification control, SQC)은 리포터(reporter)와 소광자(quenching)가 결합된 하나 이상의 프로브가 포함된다.

본 발명에 따른 내부 정량 컨트롤(Standard quantification control, SQC) 프로브를 이용하여, 원하는 표적핵산의 정량 분석이 가능하다. 또한, 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자 증폭의 억제가 가능하고, 극미량의 표적핵산 유전자의 선택적 증폭과 선택적 검출을 통해 시료 속에 포함된 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있다. 아울러, 다중의 검출 프로브와 다중의 증폭 억제 프로브를 사용하여 실시간 증폭곡선과 융해곡선의 동시 분석이 가능해 동시 다중적으로 표적핵산 검출 및 정량뿐 아니라 융해곡선분석을 통한 유전형 판별이 가능하다. 또한, 고민감도로 타겟 검출이 가능하므로, 극소량의 타겟 검출이 필요한 조기진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 내부 정량 컨트롤과 대비하여 원하는 표적핵산에 대해 상대 정량 분석한 그래프 모식도이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 리포터 및 소광자가 포함된 내부 정량 컨트롤 (Standard quantification control, SQC) 를 이용하여, 검출하고자 하는 표적핵산의 정량을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 실시간 중합효소 반응 및 융해 곡선(melting curve) 분석 방법을 이용하여 표적핵산을 정량적으로 검출하는 것으로서, 표적핵산이 증폭되는 반응 튜브에 표준 곡선(standard curve)을 분석하기 위한 내부 정량 컨트롤 프로브를 첨가하고, 동일한 반응기 내에서 내부 정량 컨트롤 프로브의 형광 값 및 표적핵산의 양의 상관관계를 분석하여, 다중 표적핵산을 정량하는 방법이다.

본 발명의 '내부 정량 컨트롤(Standard quantification control, SQC)'은 다양한 염기서열을 포함하고, 검출하고자 하는 표적핵산의 증폭에는 영향을 미치지 않으며, 농도를 정확하게 알고 있는 컨트롤 지표이다. 또한, 본 발명의 내부 정량 컨트롤은 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)가 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 내부 정량 컨트롤(Standard quantification control, SQC)은 모든 핵산 및 핵산 유사체로서, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 바람직하게 PNA 프로브를 사용하였으며, PNA 프로브는 인공합성 DNA로 안정적인 형광 신호를 나타낸다.

본 발명의 '표적 핵산'은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 돌연변이 유전자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. genomic DNA 와 mitchondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, ribosomal RNA, non-cording RNA, tRNA, viral RNA등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 혼성화, 어닐링(annealing) 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

상기 '리포터(reporter)'는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미하여, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 '소광자(quencher)'는 리포터가 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 소광자는 종류에 따라 형광세기를 감소하는 범위가 다르므로 이를 고려하여 사용할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 표적 핵산의 정량 분석 방법은, 하나 이상의 검출 프로브(detection probe), 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe) 및 내부 정량 컨트롤 (Standard quantification control, SQC) 프로브를 포함하는 프로브 혼합체를 이용할 수 있다.

본 발명의 '검출 프로브(detection probe)'는 검출하고자 하는 표적 핵산 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 프로브를 의미하고, '클램핑 프로브(clamping probe)'는 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 반응간 중합효소의 신장반응을 억제할 수 있는 프로브를 의미한다.

본 발명에 있어서 검출 프로브 또는 클램핑 프로브는 표적핵산에 상보적으로 결합하는 모든 핵산 및 핵산 유사체로 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택될 수 있다. PCR을 위한 중합효소에 일반적으로 뉴클레아제(nuclease) 활성이 있어 프로브의 손상이 생길 가능성도 있으므로 뉴클레아제에 안정한 PNA와 같은 합성핵산을 사용하는 것을 장려한다. 또한, 검출 프로브는 목적 표적핵산 유전자를 선택적으로 검출시키는 역할을 하므로, 당업계에 알려진 핵산 검출을 위한 프로브의 사용이 가능하다. 본 발명에서는 바람직하게 PNA 프로브를 사용하였으며, PNA 프로브는 인공합성 DNA로 타겟 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합이 가능하고, 뉴클레아제에 대해 안정하기 때문에 프로브를 기반으로 한 융해곡선 분석이 가능하다. 또한, DNA와 결합 후 중합효소(polymerase)의 진행을 방해하는 성질을 가지고 있으므로, 본 발명에서는 야생형 유전자와 완전한 혼성화를 이루도록 제조한 PNA 프로브는 PNA 클램핑 프로브로 사용하였으며, 동시 다중으로 표적핵산 검출을 위해 PNA 검출 프로브는 표적핵산 유전자와 완전한 혼성화를 이루도록 제조하였다.

본 발명의 상기 검출 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)가 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다.

본 발명은 내부 정량 컨트롤(Standard quantification control, SQC) 프로브를 이용하여, 원하는 표적핵산의 정량 분석이 가능하다.

일 실시예에서는, 본 발명은 야생형 유전자 혹은 원하지 않는 유전자와 상보적으로 결합하여 중합효소의 신장반응을 억제하는 하나 또는 하나 이상의 클램핑 프로브(clamping probe)를 이용하여 검출하고자 하는 표적핵산 유전자를 선택적으로 증폭시키고, 표적핵산을 특이적으로 검출하기 위한 하나 또는 하나 이상의 검출 프로브(detection probe)를 이용해 다중 표적핵산의 유무 또는 농도를 검출할 수 있으며, 프로브 혼합체를 이용한 표적핵산의 검출은 실시간 증폭곡선 및 융해곡선의 동시분석이 가능하다. 뿐만 아니라, 내부 정량 컨트롤(Standard quantification control, SQC) 프로브를 이용하여, 원하는 표적핵산의 정량 분석 또한 가능하다.

또한, 본 발명은 내부 정량 컨트롤(Standard quantification control, SQC) 프로브를 포함하는 분자진단 키트에 관한 것이다. 일 실시예에서 분자진단 키트는 클램핑 프로브, 검출 프로브 및 내부 정량 컨트롤(Standard quantification control, SQC) 프로브로 구성된 프로브 혼합체를 포함할 수 있다. 상기 키트는 다양한 표적핵산을 동시에 검출할 수 있으며, 표적핵산의 정량 또는 유전형을 분석하는데 이용할 수 있다.

Claims

하나 이상의 내부 정량 컨트롤 (Standard quantification control, SQC) 프로브를 이용한 정량 분석 방법.
제1항에 있어서, 내부 정량 컨트롤 프로브는 핵산유사체로, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid) 및 DNA로 이루어진 군에서 각각 선택되는 것을 특징으로 하는 정량 분석 방법.
제1항에 있어서, 상기 내부 정량 컨트롤 프로브는 중 한가닥은 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 것을 특징으로 하는 정량 분석 방법.
제3항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 하는 정량 분석 방법.
제3항에 있어서, 상기 소광자(quencher)는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 정량 분석 방법.
제 1 항에 있어서, 검출 프로브(detection probe) 및 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe)를 추가로 포함하는 정량 분석 방법.
검출 프로브(detection probe), 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe) 및 내부 정량 컨트롤 (Standard quantification control, SQC) 프로브를 포함하는, 표적 핵산의 실시간 검출 및 정량 분석을 위한 프로브 혼합체.