KR20160036906A - 프로브 혼합체의 반응성을 높일 수 있는 프라이머 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클램핑 프로브 및 검출 프로브 혼합체와 다양한 프라이머를 이용하여 표적핵산을 민감하게 검출할 수 있는 방법으로, 다양한 프라이머를 이용하여 PCR 효율의 특이성의 향상 및 검출 민감도를 높이는 방법에 관한 것이다.
표적핵산을 실시간으로 검출하기 위한 검출 프로브(detection probe) 및 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe) 혼합체와 혼용하여 사용 가능한 프라이머들을 이용하여 기존의 방법보다 우수한 표적핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다양한 프라이머 및 프로브 혼합체를 통한 표적핵산 검출방법을 이용하면 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자 증폭의 억제가 가능하고 검출하고자 하는 극미량의 표적 유전자의 선택적 증폭과 선택적 검출을 통해 시료 속에 포함된 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 다양한 변이, 또는 특정 유전자 서열을 효과적으로 검출할 수 있다. 특히, 다중의 검출 프로브와 다중의 증폭 억제 프로브와 특이성이 우수한 프라이머를 사용하여 실시간 증폭곡선과 융해곡선의 동시 분석이 가능해 동시 다중적으로 표적핵산 검출 및 정량뿐 아니라 융해곡선분석을 통한 유전형판별이 가능하다.
본 발명에 따르는 프라이머 및 프로브 혼합체는 원하지 않는 유전자가 과량 혼합되어 있는 시료에서 원하는 표적핵산만을 높은 민감도로 (0.01%) 검출이 가능하여, 조기진단 및 극미량의 돌연변이 검출이 가능하다.

Description

프로브 혼합체의 반응성을 높일 수 있는 프라이머 및 그의 용도{PRIMER FOR ENHANCING REACTIVITY OF PROBE MIXTURES, AND USE THEREOF}

본 발명은 클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 표적핵산 검출방법에 적용 가능한 프라이머에 관한 것이다. 구체적으로는, 표적핵산을 실시간으로 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브(detection probe) 및 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe)를 포함하는 프로브 혼합체와 검출 민감도를 향상시키며 특이성이 우수한 프라이머의 응용에 관한 것이다.

임상적 의미가 있는 돌연변이의 검출은 매우 중요하기 때문에, 분석하고자 하는 목적 또는 유전자의 종류에 따라 진단을 위한 다양한 검출 방법들이 계속해서 보고되고 있다(Taylor CF, Taylor GR. Methods Mol. Med., 92:9, 2004). 특히 체세포 돌연변이의 경우(somatic mutation), 돌연변이 유전자는 종양의 종류에 따라 다량의 야생형 유전자 속에 메가 베이스당 0.1~100 베이스 정도의 매우 낮은 빈도로 존재한다. 또한 분석 샘플에 존재하는 돌연변이 암세포의 수는 정상세포대비 현저히 적기 때문에 이것의 검출은 매우 어려우며 고도의 검출 기술을 필요로 한다 (Chung et al., Clin Endocrinol., 65:660, 2006; Trovisco et al., J Pathol., 202:247, 2004).

극미량의 돌연변이 검출 위한 대표적 방법으로는, 소량의 돌연변이 유전자를 선택적으로 증가시키기 위해 돌연변이에 특이적인 프라이머를 이용하여 돌연변이를 특이적으로 증폭하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법(Rhodes et al., Diagn mol pathol., 6:49, 1997), 스콜피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR, DxS' scorpions and ARMS) 방법(Mark et al., Journal of Thoracic Oncology, 4:1466, 2009), 대립형질 특이적(allele specific) 프라이머 기술과 MGB(minor groove binder)-프로브를 이용하여 야생형 유전자의 증폭을 억제하고 돌연변이 유전자만을 선택적으로 증폭 후, 택만(Taqman) 프로브를 이용하여 돌연변이가 일어난 위치를 포함하지 않고 증폭산물을 검출하는 CAST PCR 방법 (Didelot A et al., Exp Mol Pathol., 92:275, 2012), 임계적 변성온도(critical denaturation temperature, Tc)를 이용하여 돌연변이의 민감도를 증가시킬 수 있는 콜드-PCR(Cold-PCR) 방법(Zuo et al., Modern Pathol., 22:1023, 2009) 등 실시간 PCR 기술에 기반을 둔 다양한 분석법이 있다. 이러한 기술은 쉽고 빠르게 다양한 진단에 적용이 가능하며, 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석을 위해 좋은 기술이 되고 있다 (Bernard et al., Clinical Chemistry, 48:1178, 2002).

하지만 위의 방법들은 돌연변이만을 선택적으로 증폭시키는 프라이머를 설계해야 하며, 임계적 변성 온도를 정교히 맞춰줘야 하는 등의 실험 디자인이 어렵고, 대립형질 특이적 프라이머를 이용한 방법의 경우 미스프라이밍(mispriming)이 되면 위양성(false positive) 결과를 야기할 수 있다. 또한, 현재 가장 대중적으로 이용되고 있는 택만(Taqman) 및 스콜피언(scorpions) 프로브 법은 프로브의 융해곡선 분석을 이용한 동시 다중 분석이 불가능하기 때문에, 한 튜브에서 검출 가능한 유전자 수는 실시간 PCR 장비의 검출 가능한 형광 개수에 의존하는 문제점이 있다.

최근에 실시간 PCR 기술을 통해 체세포 돌연변이 검출을 위한 다양한 분자진단 기술들이 개발되고 있으며, 특히 높은 민감도와 특이도를 가지고 짧은 시간에 동시 다중 정량을 할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.

피엔에이(Peptide nucleic acid, PNA)는 N-(2-아미노에틸)글리신 아미드를 기본 골격으로 하는 핵산 유사체로서 1991년 닐슨에 의해 보고되었다 (Nielsen PE et al., Science, 254(5037):1497, 1991). PNA 골격은 전기적으로 중성으로 상보적 염기서열을 갖는 표적 핵산에 대해서 DNA 프로브보다 높은 특이도와 선택성을 가지며, 백본(backbone)의 알파(α), 감마(γ) 위치 혹은 링커 부위에 특정 작용기를 도입하여 세포 투과 및 표적핵산과의 융해온도 조절과 같은 자유로운 물성 조절이 가능한 특성을 가지고 있다 (Englund EA et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 46:1414, 2007; Stefano Sforza et al., Eur. J. Org. Chem., 16:2905, 2000; Roberto Corradini et al., Curr. Top. Med. Chem., 11:1535. 2011). 또한 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 분해되지 않는 장점이 있어, 프로브를 이용한 분자 진단 방법에 매우 유용하다 (Egholm et al., Nature, 365:556, 1993; Nielsen et al., Bioconjugate Chem., 5:3, 1994; Demidov, et al., Biochem. Pharmacol., 48:1310, 1994). 이와 같은 PNA의 장점을 이용하여 1993년 PCR 클램핑(camping) 기술이 개발되었다 (Henrik Orum et al., Nucleic Acids Res., 21:5332, 1993). 이 기술은 PNA 프로브를 증폭을 원하지 않는 유전자와 결합시켜 PCR 증폭을 억제하는 기술로서, 야생형 유전자에 상보적인 PNA 프로브를 이용하면 PCR반응 중 야생형 유전자의 증폭을 선택적으로 억제하여 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있다. 또한 PNA 클램핑 기술을 응용한 다양한 기법들이 보고되고 있다.

PNA-LNA 클램프(미국 공개특허 제2013-0005589호; Yoshiaki Nagai et al. Cancer Res., 65(16):7276, 2005) 방법은 표적 부위에 대해서 야생형 유전자의 배열을 가지는 PNA 클램핑(clamping) 프로브와 변이 유전자의 배열을 가지는 검출용 LNA 택만(taqman) 프로브가 경쟁적으로 하이브리디제이션(hybridization)하도록 양자의 배열을 설계해 선택적인 증폭과 선택적 검출을 하는 방법이다. 하지만, 이 방법은 5'→3' 엑소뉴클레이즈 활성을 가진 DNA 폴리머레이즈가 형광자와 소광자가 라벨링된 돌연변이 프로브를 분해하여 형광자가 분리되는 방법을 이용하므로, 프로브의 융해온도(Tm, melting temperature) 값을 분석할 수 없으며 한 개의 형광으로 다중 표적 검출이 불가능하다.

PNA 하이브 프로브(hyb probe)(PNA as both PCR clamp and sensor probe; 미국공개특허 제2008-0176226호)는 기존 로슈사의(roche) 하이브 프로브 시스템에서 공여자(donor) 프로브 부분을 PNA 프로브로 바꿈으로써, PNA프로브를 통하여 클램핑과 검출을 동시에 하도록 설계된 기술이다. 그러나, 앵커(anchor) 프로브를 포함하여야 하는 제한점을 여전히 가지고 있기 때문에 프로브의 설계가 어려우며, 길이가 긴 앵커 프로브의 사용은 인접한 위치의 변이에 대한 동시 다중 검출을 불가능하게 할 뿐 아니라, 클램핑과 검출을 동시에 하는 1종의 PNA 프로브를 사용하기 때문에 PNA 프로브의 융해곡선 분석을 통한 동일한 코돈 내의 다중 돌연변이 유전형 판별시 PNA 프로브와 각 돌연변이 유전형 간의 융해온도 차이가 크지 않아 분석이 어려운 문제점이 있다.

PNA 클램핑 & 인터컬레이터 검출(PNA Clamping & intercalator detection) 방법은 야생형 유전자를 PNA 프로브 이용해 클램핑하고, 돌연변이형 유전자만 선택적으로 증폭 후 인터컬레이터(intercalator)를 이용하여 증폭산물을 검출하는 방법으로서(Makito Miyake et al., Biochem Biophys Res Commun., 362:865, 2007), 동시 다중 검출이 불가능하며 야생형 유전자가 완전히 클램핑되지 않을 경우 위양성 결과를 초래하는 등 결과 분석이 어렵다.

PNA & 표지되지 않은 DNA 프로브(PNA & unlabeled DNA probe)를 이용한 방법(Ji Eun Oh et al., J Mol Diagn., 12:418, 2010)은 PNA 프로브를 이용하여 야생형 유전자를 클램핑 후 인터컬레이터를 이용하여 표지되지 않은 DNA 프로브와 돌연변이 유전자의 융해곡선을 분석하는 방법으로 특이적인 실시간 증폭곡선 분석이 불가능하고, 민감도가 낮으며, 동시 다중 검출이 불가능한 문제점이 있다.

중합효소 연쇄반응(PCR) 기술은 생물학 및 의학의 다양한 연구 분야에 널리 이용되고 있다. 특히 실시간 PCR(Real-time PCR)은 실시간으로 증폭산물을 측정하고 정량적 분석이 가능하며 편리하다는 장점이 있다. 또한, 실시간 PCR(Real-time PCR) 방법 중 택만(TaqMan) 프로브법은 프로브의 말단에 리포터 분자를 표지하고, 다른 쪽 말단에는 소광자(quencher)를 표지하여, PCR 진행시 리포터 분자가 소광자(quencher) 분자와 떨어지면서 발산되는 고유의 형광을 검출하는 방식으로 다양한 분야에서 사용 중이다. 하지만 택만(TaqMan) 프로브의 비특이적 결합에 의한 위양성(false positives) 결과의 발생 가능성이 제기되고 있다.

프라이머로 사용하는 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 가닥을 정확하게 동정하는 혼성화의 특징을 갖고 있으나, 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 하이브리드(hybrid)는 긴 핵산의 하이브리드보다 매우 불안정하여 낮은 융해 온도를 갖게 된다. 이러한 하이브리드의 불안정성은 올리고뉴클레오타이드 디자인에 고려되어야 한다. 올리고머는 짧을수록 다양한 상보적인 가닥의 검출을 가능하게 하지만, 완전하게 상보적인 서열에 혼성화의 결합력이 약한 문제점을 갖고 있다.. 따라서, 올리고뉴클레오타이드를 다양한 조건에서도 안정하도록 사용할 수 있는 방법이 요구되고, 올리고뉴클레오타이드 혼성화 특이성이 높일 수 있는 방법이 필요하다. 이에 본 발명에서는 PNA 클램핑 기술 및 PNA 검출 기술에 프라이머로 적용 가능하며 안정성을 높일 수 있는 올리고머 시스템을 확인하였다. PNA 클램핑 기술 및 PNA 검출 기술의 특이성을 높이기 위해서는 프라이머가 자신의 타깃 서열에만 어닐링하는 특이성이 중요하다. 일반적으로 프라이머의 구성 및 어닐링 온도 조절을 통해 PCR반응의 특이성 조절이 가능하며, 프라이머 길이, GC 구성 비율 및 PCR 생성물의 길이와 같은 조건 등을 고려하여 PCR 반응의 특이성의 개선 및 백그라운드 문제를 해결할 수 있다.

본 발명에서는 SNPs를 검출하기 위하여 각각의 타깃 SNP 를 포함하는 시료 DNA 단편을 많은 카피로 생성하는 안정적인 프라이머 시스템을 확보하고자 하였다. 특히 임상 시료의 DNA는 미량이므로, 프로브 혼합체와 잘 반응할 수 있는 프라이머의 적용 및 증폭은 시그널-to-노이즈 비율을 개선하여 검출의 신뢰성을 증가시킨다. 특히 PCR 증폭 과정을 포함하는 방법 및 기술들은, 사용되는 프라이머의 비특이적인 결합으로 발생 가능한 위양성, 재현성이 낮아지는 문제 및 높은 백그라운드 문제점을 해결하고자 하였다. 본 발명에서 클램핑 및 검출 프로브 혼합체를 이용하여 0.01%의 극미량의 점 돌연변이의 검출이 가능한 시스템을 확인하였다. 프로브 혼합체 시스템에 적용 가능한 올리고머를 확인하고자 하였다.

본 발명의 프로브 혼합체 시스템과 프라이머 시스템은 분자진단, 산전진단, 조기진단, 암 진단, 유전관련 진단, 유전 형질 진단, 감염균의 진단, 약제 내성균의 판별, 법의학, 생물체의 종 판별 등 다양한 분자진단 기술에 이용할 수 있다.

표적핵산을 실시간으로 검출하기 위해, 클램핑 프로브(clamping probe)와 동시에 형광자 및 소광자가 포함된 형광 검출 프로브(detection probe)의 혼합체에 적용 가능한 다양한 프라이머 시스템을 확인하고, 이를 이용하여 원하는 유전자를 선택적으로 높은 민감도로 검출 가능함을 확인하였으며, 야생형 유전자와 표적핵산 유전자의 융해온도 차이를 크게 하여, 증폭 곡선(amplification curve) 및 융해곡선(melting curve) 분석을 통해 동시에 다중 표적핵산 검출 및 정량뿐 아니라 유전형 판별이 가능한 것을 확인하고 발명을 완성하였다.

본 발명은 표적핵산을 실시간으로 검출하기 위한, 하나 이상의 검출 프로브(detection probe) 및 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe)를 포함하는 프로브 혼합체와 적용 가능한 프라이머를 이용하여 검출 민감도를 향상시키며, 특이성을 높일 수 있는 표적핵산 검출방법 및 상기 방법을 이용한 분자 진단 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 프로브 혼합체를 이용한 표적핵산 검출방법과 프라이머의 다양성은 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자 증폭 억제가 가능하여, 극미량의 표적핵산 유전자의 선택적 증폭 및 검출을 통해 시료 속에 포함된 단일 염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있다. 또한 다중의 검출 프로브와 증폭 억제 프로브를 사용하여 실시간 증폭곡선과 융해곡선의 동시 분석이 가능해, 동시 다중적으로 표적핵산 검출 및 정량뿐 아니라 융해 곡선 분석을 통한 유전형 판별이 가능하다. 또한, 고민감도로 타겟 검출이 가능한 프라이머의 디자인을 용이하게 함으로써, 극소량의 타겟 검출이 필요한 조기진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 검출 프로브, 클램핑 프로브 및 프라이머 혼합체의 모식도이다.
도 2는 서열번호 1번 및 2번 프로브 혼합체와 서열번호 5번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 2 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였습니다. 또한, 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우 돌연변이형의 검출 민감도가 0.1%까지 확인되나, 클램핑 프로브를 사용하는 경우에 비해 민감도가 낮았으며, 야생형(wild) 증폭이 억제되지 않아 돌연변이형 PCR 반응산물과 검출 프로브간 미스매치로 결합하여 형성되는 야생형의 멜팅 피크(melting peak)가 확인되었다.
도 3는 서열번호 1번 및 2번 프로브 혼합체와 서열번호 6번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 3 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였다. 또한, 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우 돌연변이형의 검출 민감도가 1%까지 확인되나, 클램핑 프로브를 사용하는 경우에 비해 민감도가 낮았으며, 야생형(wild)의 증폭이 억제되지 않아 돌연변이형 PCR 반응산물과 검출 프로브간 미스매치로 결합하여 형성되는 야생형의 멜팅 피크(melting peak)가 확인되었다.
도 4는 서열번호 1번 및 2번 프로브 혼합체와 서열번호 7번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 4 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였으나, 야생형(wild)의 억제가 불가능하였다. 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우 야생형(wild)의 억제가 불가능하여 특이성이 없음을 확인하였다.
도 5는 서열번호 1번 및 2번 프로브 혼합체와 서열번호 8번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 5 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였고, 야생형(wild)의 억제가 불가능하였으나, 서열번호 7에 비해 야생형(wild)의 억제 가능성을 확인하였다. 또한 클램핑 프로브를 첨가하지 않는 경우 야생형(wild)의 억제가 불가능하여 특이성이 없었으나, 서열번호 5, 6 및 7에 비해서는 사용량이나 디자인 방법에 따라 특이성을 높일 수 있는 가능성을 확인하였다.
도 6은 서열번호 1번 및 3번 프로브 혼합체와 서열번호 5번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 6 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였으며, 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우 야생형(wild)의 억제가 불가능하여 특이성이 없음을 확인하였다.
도 7은 서열번호 1번 및 3번 프로브 혼합체와 서열번호 6번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 7 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였으며, 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우 야생형(wild)의 억제가 불가능하여 특이성이 없음을 확인하였다.
도 8은 서열번호 1번 및 3번 프로브 혼합체와 서열번호 7번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 8 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였으나, 야생형(wild)의 억제가 불가능하였다. 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우 야생형(wild)의 억제가 불가능하여 특이성이 없음을 확인하였다.
도 9는 서열번호 1번 및 3번 프로브 혼합체와 서열번호 8번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 9 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였다. 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우 야생형(wild)의 억제가 불가능하였으나, 서열번호 5, 6 및 7에 비해 특이성을 구분할 수 있는 가능성을 확인하였다.
도 10은 서열번호 1번 및 3번 프로브 혼합체와 서열번호 9번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 10 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였으나, 야생형의 억제가 불가능하였다. 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우 야생형(wild)의 억제가 불가능하였으나, 서열번호 5, 6 및 7에 비해 특이성을 구분할 수 있는 가능성을 확인하였다.
도 11은 서열번호 1번 및 3번 프로브 혼합체와 서열번호 10번 프라이머 시스템을 적용한 PCR 반응을 나타낸 그래프로서, 도 11 의 A 및 B 는, 서열번호 1번 클램핑 프로브의 유무에 따른 그래프이다. 클램핑 프로브가 첨가된 경우 0.01% 돌연변이 형의 검출이 가능한 민감도를 확인하였다. 또한, 클램핑 프로브를 사용하지 않는 경우에도 야생형(wild)의 억제가 가능하여 서열번호 5, 6, 7, 8 및 9에 비해 특이성을 구분할 수 있는 가능성을 확인하였다. 하지만 다른 서열번호 프라이머와는 다른 Tm값을 형성하였으며, 이는 디자인된 프라이머에 사용된 이노신(inosine)의 위치와 검출 프로브 서열이 중복되어 발생되는 문제점으로 확인되었다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 야생형 또는 원하지 않은 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브 및 리포터(reporter)와 소광자(quenching)가 결합된 검출 프로브를 이용하여 동시 다중적인 표적 핵산을 검출하는 방법에 사용 가능한 프라이머에 관한 것이다.

본 발명의 '클램핑 프로브(clamping probe)'는 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 반응간 중합효소의 신장반응을 억제할 수 있는 프로브를 의미한다.

본 발명의 '검출 프로브(detection probe)'는 검출하고자 하는 표적 핵산 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 프로브를 의미한다.

본 발명의 '표적 핵산'은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 돌연변이 유전자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. genomic DNA 와 mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, ribosomal RNA, non-cording RNA, tRNA, viral RNA등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 혼성화, 어닐링(annealing) 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.

본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 특히 온도와 같은 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 '돌연변이'는 야생형 유전자 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것도 포함된다. 또한 자연에서 발생 할 수 있는 체세포 돌연변이(somatic mutation)와 생식세포 돌연변이(germline mutation)가 포함되나, 인위적으로 염기서열의 변이를 유도한 인공 돌연변이 등도 제한 없이 포함된다. 의미있는 체세포 돌연변이(somatic mutation)로는 KRAS, BRAF, EGFR, JAK2, HER2, BCL-ABL, NRAS, HRAS, IDH1, IDH2, C-KIT, TP53, EGFR, PIK3CA등 각종 암 관련 유전자들을 예로 들 수 있다. 본 발명에서는 체세포 유전자 K-ras(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)의 특정 돌연변이를 이용한 실시예를 통해 본 발명이 작동함을 확인하고 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서 검출 프로브 또는 클램핑 프로브는 표적 핵산에 상보적으로 결합하는 모든 핵산 및 핵산 유사체로 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택될 수 있다. PCR을 위한 중합효소에 일반적으로 뉴클레아제(nuclease) 활성이 있어 프로브의 손상이 생길 가능성도 있으므로 뉴클레아제에 안정한 PNA와 같은 합성 핵산을 사용하는 것을 장려한다.

본 발명에서 사용한 PNA 프로브는 인공합성 DNA로 타겟 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합이 가능하고, 뉴클레아제에 대해 안정하기 때문에 프로브를 기반으로 한 융해곡선 분석이 가능하다. 또한, DNA와 결합 후 중합효소(polymerase) 의 진행을 방해하는 성질을 가지고 있으므로, 본 발명에서는 야생형 유전자와 완전한 혼성화를 이루도록 제조한 PNA 프로브는 PNA 클램핑 프로브로 사용하였으며, 동시 다중으로 표적핵산 검출을 위해 PNA 검출 프로브는 표적핵산 유전자와 완전한 혼성화를 이루도록 제조하였다.

본 발명에 있어서, 클램핑 프로브 및 검출 프로브는 프로브의 N 말단, C 말단 또는 프로브(합성핵산) 골격의 알파, 베타, 감마 또는 링커(Linker) 위치에 천연 아미노산의 및 합성 아미노산의 곁사슬 등 특정 작용기를 결합시켜, 입체구조적 변화를 줄 수 있다. 상기 아미노산은 전하를 가지고 있지 않거나, 음전하 또는 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니며, 당업계에 공지된 프로브 입체구조 변화 및 전하 부여 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 융해온도 차이를 확인하기 위해, 음전하를 가지는 L-글루탐산 (L-glutamic acid) 또는 D-글루탐산 (D-glutamic acid), 전하를 가지고 있지 않은 L-알라닌(L-alanine) 또는 D-알라닌(D-alanine), 양전하를 가지는 L-라이신(L-lysine) 또는 D-라이신(D-lysine)의 곁사슬을 PNA의 감마 위치에 도입할 수 있으며, L-라이신(L-lysine), L-글루탐산 (L-glutamic acid)을 PNA의 링커 위치에 도입할 수 있다.

상기와 같이 구조를 변형시킨 PNA 프로브는 단일 염기 서열 변이에 대한 특이도를 증가시켜 야생형 유전자와 표적핵산 유전자의 융해온도 차이를 20℃ 이상 차이가 나도록 하기 때문에, 실시간 증폭곡선의 비특이결합에 대한 개선과 융해곡선 분석 시 나타날 수 있는 문제점을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 상기 검출 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)가 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅 (intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다.

상기 '리포터(reporter)'는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미하여, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 '소광자(quencher)'는 리포터가 발생시킨 빛을 흡수하여 형광 세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 소광자는 종류에 따라 형광세기를 감소하는 범위가 다르므로 이를 고려하여 사용할 수 있다.

본 발명에서는 표적핵산을 실시간으로 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브(detection probe) 및 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe)를 포함하는 프로브 혼합체를 이용하여 동시 다중적 표적핵산을 검출하였다.

본 발명의 프로브 혼합체를 이용한 동시 다중 표적핵산 검출방법은 야생형 유전자 혹은 원하지 않는 유전자와 상보적으로 결합하여 중합효소의 신장반응을 억제하는 하나 또는 하나 이상의 클램핑 프로브(clamping probe)를 이용하여 검출하고자 하는 표적핵산 유전자를 선택적으로 증폭시키고, 표적핵산을 특이적으로 검출하기 위한 하나 또는 하나 이상의 검출 프로브(detection probe)를 이용해 다중 표적핵산의 유무 또는 농도를 검출하는 것을 특징으로 하며, 프로브 혼합체를 이용한 표적핵산의 검출은 실시간 증폭곡선 및 융해곡선의 동시분석이 가능하다.

본 발명의 클램핑 프로브 및 검출 프로브는 동일가닥상에서 타겟 DNA와 혼성화하거나, 또는 클램핑 프로브 및 검출 프로브가 서로 다른 상보적인 가닥에 혼성화하여, 야생형 유전자의 블로킹(blocking) 및 표적핵산 유전자의 검출을 동시에 진행하는 방법이다. 즉, 클램핑 프로브가 야생형 유전자와 완전한 혼성화(perfect match)를 이루면 야생형 유전자의 증폭을 억제시킬 수 있기 때문에, 극미량의 표적핵산 유전자의 선택적 증폭 및 검출이 가능하며, 또한, 하나 이상의 검출 프로브를 사용하여 동시 다중적으로 표적핵산 검출이 가능하다.

프로브 혼합체를 이용한 타겟 DNA의 증폭과정에 있어서 어닐링(annealing) 단계에서는 클램핑 프로브와 검출 프로브가 한쪽의 동일가닥 또는 각각 서로 다른 상보적인 가닥에 어닐링하게 되고, 리포터와 소광자를 가지고 있는 검출 프로브는 검출하고자 하는 표적핵산 유전자에 특이적으로 결합하여 증폭곡선 신호(형광)를 나타내게 된다. 이후의 신장(extension) 단계에서 클램핑 프로브는 여전히 야생형 유전자 혹은 원하지 않는 유전자와 혼성화되어 있어 야생형 유전자 혹은 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하고, 검출 프로브는 표적핵산과의 신장단계의 온도보다 낮은 융해 온도로 제작되었기 때문에 표적핵산과 분리되어 증폭이 진행된다. 이러한 증폭 과정을 통해 실시간으로 증폭곡선을 분석할 수 있으며, 상기의 증폭과정을 통해 생성된 증폭산물을 이용하여 융해곡선 분석이 가능하다. 융해곡선 분석 단계에서 검출 프로브는 낮은 온도에서 표적핵산 유전자와 혼성화되어 형광신호를 나타내지만, 온도가 올라감에 따라 표적핵산과 분리되어 형광이 소광된다.

이 과정은 다양한 프라이머의 어닐링 온도 및 디자인된 서열에 따라 프로브 혼합체의 검출 민감도 및 특이성을 결정한다.

본 발명의 '프라이머'는 검출하고자 하는 표적(target)에 따라 다양한 형태로 디자인이 가능하다. 구체적으로, 검출하고자 하는 염기서열과 대립특이적으로 프라이머를 디자인하는 방법; 대립특이적인 프라이머를 변형하여 이노신을 적용하는 방법; 및 검출하고자 하는 염기서열의 위치를 변형하여 프라이머가 타겟과 결합하는 온도를 조절하는 방법 등으로 디자인할 수 있다. 대립특이적인 프라이머는 검출하고자 하는 염기서열의 증폭률을 향상시킬 수 있으며, 대립특이적인 프라이머의 변형을 통한 이노신의 적용 방법은 증폭 민감도를 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 프라이머가 타겟과의 결합하는 온도 반응 및 특이성을 조절할 수 있다. 또한 프라이머의 위치 조절을 통해 염기서열의 G/C비율, 결합 반응 온도 제어 등이 가능하다.

예로서, KRAS G13V(G>T) 표적의 검출을 위한 프라이머를 표 1과 같이 디자인하여 프로브 혼합체 시스템의 작동 유무를 검증하였다. 또한 프로브 혼합체 시스템에서 클램핑 프로브가 제외된 경우의 프라이머 시스템을 검증함으로써 정확한 프라이머의 증폭 반응을 확인하고자 하였다. 각각의 프라이머 서열과 프로브 혼합체의 결과는 도 2 내지 도 11에서 표시하였다.

일반적으로, 복수의 표적핵산을 동시적으로 검출하기 위해 종래의 실시간 PCR을 이용한 증폭곡선 분석 방법은 시료 내 표적핵산을 검출함에 있어서 형광물질을 사용하기 때문에 두 가지 이상 표적핵산을 검출하기 위해서는 타겟 수만큼의 형광물질을 가진 프로브가 필요한 문제가 있어 다중 검출이 제한적이지만, 본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 프로브 및 프라이머 혼합체를 이용하여 증폭곡선 및 융해곡선 분석을 동시에 수행할 수 있으므로, 하나의 형광물질을 이용하여 다중 타켓의 검출이 가능한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 프로프 및 프라이머 혼합체를 이용한 동시 다중적 검출방법은 증폭곡선 및 융해곡선의 동시 분석에 한정된 것이 아닌, 증폭곡선과 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적으로 분석할 수 있으며, 필요에 따라 증폭곡선 분석 또는 융해곡선 분석만 수행하여 표적핵산을 검출할 수 있다. 특히, 정량분석이 필요 없는 경우에는 증폭곡선 분석을 생략하고, 융해곡선 분석만 수행하여도 표적핵산의 유무 또는 유전자형을 구별할 수 있다.

본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 구체적으로, (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 프로브 및 프라이머 혼합체를 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 증폭과정 이후 온도를 변화시키면서 증폭산물과 검출 프로브간의 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적 또는 동시에 분석하는 단계;를 포함한다.

여기서, 상기 (b) 단계의 융해 곡선을 얻는 단계 전에, 실시간 증폭곡선을 얻는 단계와는 별도로 5 내지 20의 PCR 사이클을 추가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 프로브 및 프라이머 혼합체를 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 프로브 및 프라이머 혼합체를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 증폭곡선 또는 융해곡선을 수득하는 단계는 실시간 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하였으며, 증폭곡선의 분석은 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다. 시료 내에 표적핵산이 존재하거나 시료에 포함된 표적핵산의 양이 많으면, 스레스홀드(threshold)에 도달하는 사이클(cycle) 수가 적어지게 되어 Ct 값이 적게 측정되므로 표적핵산의 유무를 확인할 수 있으며, 초기 표적핵산의 양도 측정할 수 있다.

또한, 융해곡선(melting curve) 분석은 일반적으로 실시간 PCR의 과정이 끝난 후에 마지막으로 진행되는 과정으로, 샘플의 온도를 30℃ 정도로 떨어트린 후에 95℃ 까지 초당 0.5 내지 1℃ 씩 증가시키면서 형광의 시그널 크기를 측정하며, 온도가 올라감에 따라 검출 프로브와 표적핵산(검출 프로브와 상보적으로 결합 가능한 표적핵산의 한쪽 가닥)이 분리되면 형광이 소광되어 형광시그널이 갑자기 떨어지게 되므로, 멜팅 피크(melting peak)를 통해 표적핵산의 유무를 확인할 수 있다.

본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 10ng 이하의 핵산 샘플시료에 0.01% 내지 100% 비율로 포함된 표적핵산을 검출할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 '시료'는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

시료의 표적핵산은 DNA 또는 RNA이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook et al,, Molecular Cloning, 2001에 개시되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 표적핵산 동시 다중 검출을 위한 표적핵산은 대표적인 체세포 돌연변이 유전자인 K-ras(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 유전자를 이용하여 실험을 수행하였으며, KRAS의 야생형(Wild) 헬라(HeLa) 세포주의 유전자를 분리하여 야생형 유전자에 각 돌연변이 유전자를 100%, 10%, 1%, 0.1%, 0.01% 함유되도록 샘플을 제작하였다 (표 4).

본 발명의 방법으로 야생형 및 K-ras 돌연변이의 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 분석한 결과, 야생형에 포함되어 있는 0.01%의 K-ras 돌연변이 유전자 를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 간접적인 정량도 가능한 것을 확인하였다.

또한, 도 6 내지 도 11의 증폭곡선을 분석한 결과, 프로브 혼합체의 시스템에 다양하게 적용가능한 프라이머 시스템을 확인하였으며, 기존의 사용중인 일반적인 프라이머 디자인 방법 이외에, 대립특이적인 프라이머는 프로브 혼합체에 단독으로 사용하는 것은 불가하였으며, 대립특이적인 프라이머를 변형하여 이노신(Inosine)을 적용한 프라이머를 사용하는 경우 프로브 혼합체와 디자인되어 사용 가능함을 확인하였다.

즉, 본 발명의 표적핵산 검출방법은 클램핑 프로브 및 검출 프로브 혼합체에 다양한 형태의 프라이머를 적용하고, 프로브 혼합체와 어닐링 온도 조절을 통해 단일염기변이에 대한 특이도 증가 및 생체시료에 포함된 극미량의 다양한 표적핵산을 검출하였으며, 유전형의 판별 및 정량이 가능한 것을 확인하였다. 본 발명은 동시 다중적 표적핵산의 검출방법을 이용하고, 클램핑 프로브 및 검출 프로브로 구성된 프로브 혼합체에 적용 가능한 프라이머에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 클램핑 프로브, 검출 프로브 및 대립특이적이고, 이노신이 포함된 프라이머로 구성된 프로브 및 프라이머 혼합체를 포함하는 표적핵산 동시 다중 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 시료에 1 내지 100%의 비율로 포함된 다양한 표적핵산을 동시에 검출할 수 있으며, 표적핵산의 정량 또는 유전형을 분석하는데 이용할 수 있다.

본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다.

또한, 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적양은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 앞서 언급된 구성성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작된다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[클램핑 및 검출 프로브와 검출 프로브 혼합체 시스템의 DNA 올리고머 분석]

돌연변이 검출에 사용된 PNA 프로브 및 타겟 DNA 올리고머 합성예시

1-1 : PNA 프로브 제작

본 발명의 입체구조 변화 및 전하부여를 통한 구조적 변화를 준 검출 프로브(detection probe) 및 클램핑 프로브(clamping probe)로 구성된 PNA 프로브 혼합체와, 클램핑 프로브가 포함되지 않은 PNA 프로브 혼합체를 포함하는 다양한 구성의 DNA 올리고머를 이용하여 돌연변이 검출방법의 구현 및 성능을 비교하기 위해, 표 1과 같이 PNA 프로브를 합성하였다. K-ras 돌연변이 유전형 검출을 위한 검출 프로브는 변형되지 않는 프로브 및 PNA 프로브 골격의 감마 위치에 음전하를 가지는 D-글루탐산의 곁사슬을 결합한 프로브를 사용하였다. 또한, 야생형 클램핑 프로브는 야생형 유전자와 검출 프로브가 경쟁적으로 결합할 수 있도록 동일 방향에서 제작하였다.

본 발명에서 사용한 PNA 프로브의 서열

서열번호	PNA 이름	PNA 프로브 서열
		N-말단	PNA 서열 (N→C)	C-말단
1	클램핑 프로브		ATCTGGTGGCGTAGGCA
2	검출 프로브	OEK(BHQ3)	AG4TG3TGTCGTAG	CY5
3	검출 프로브	OEK(Dabcyl)	AG4TG3TGTCGTAG	ROX

(표 1의 PNA 서열 중에서 숫자 표식은 PNA 서열 일부를 D-글루타민으로 변형시킨 것임. 표 2 참조)

PNA 서열 변형

형태	염기	표식
D-글루탐산 (D-glutamic acid)	A	1
	T	2
	G	3
	C	4

PNA 프로브는 한국등록특허 제464,261호에 기재된 방법에 따라 PNA 올리고 머를 벤조티아졸설포닐(Bts : Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다 (Lee et al., Org. Lett., 9:3291, 2007). 이 방법 이외에도 알려진 9-플루오레닐메톨시카르보닐 (Fmoc: 9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl) 합성법을 사용하여 PNA를 합성할 수 있으며(Kim L. et al., J. Org. Chem., 59:5767, 1994; Stephen A. et al., Tetrahedron, 51:6179, 1995), 리포터 물질 및 소광 물질은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 PNA 프로브에 표지하였다.

1-2 : DNA 올리고머 제작

상기 표 1에서 제작한 PNA 프로브와 PCR 반응에 사용하는 다양한 올리고머의 성능 확인을 위해서 프라이머로 사용하는 DNA 올리고머는 표 3과 같이 ㈜바이오니아(한국)에 합성을 의뢰하여 사용하였다. 특히 SNP 구별능의 우수성을 확인하기 위하여, 대립형질 특이적(Allele specific) 프라이머와 이노신(Inosine)을 도입한 프라이머를 합성하여 DNA 올리고머에 따른 PNA 프로브와의 결합능을 비교 분석하였다.

PNA 프로브 특성 분석을 위한 DNA 올리고머 서열

서열번호	이름	서열(5'→3')
4	Forward primer	AGGTACTGGTGGAGTATTTG
5	Reverse A primer	GCAGTTCCGTGAGAACGGATGC
6	Reverse B primer	TAGCAGTTCCGTGAGAACGGATGC
7	Reverse C primer	TAGCAGTTCCGTGAGAACGGATGCT
8	Reverse D primer	TAGCAGTTCCGTGAGAIIIGATGCT

표 1의 클램핑 PNA 프로브와 검출 PNA 프로브는, 표 3의 서열번호 4, 5, 6, 7 및 8 의 프라이머를 이용하여 동일한 가닥에서 경쟁적인 반응을 이루도록 제작하였다.

PNA 프로브 혼합체와 DNA 올리고머에 따른 반응 분석

2-1 표적핵산의 준비

체세포 돌연변이의 검출효율 확인을 위한 표적핵산은 K-ras(V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 유전자를 이용하여 실험을 수행하였다. 한국 세포주 은행으로부터 K-ras 야생형 세포주로 헬라 세포(HeLa cell)를 분양받았으며, G13V와 동일한 염기서열의 DNA는 바이오니아에서 약 300bp의 유전자 합성을 진행하였다.

분양받은 세포주는 RPMI1640(Hyclone, Thermo scientific, USA)에 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA)과 1×페니실린-스트렙토마이신(Welgene, Korea)이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 Labopass™ 티슈 미니 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 키트에서 제공한 매뉴얼에 의거하여 DNA를 추출하여 표적핵산을 확보하였다. 상기에서 확보된 야생형 유전자에 G13V의 돌연변이 유전자를 100%, 10%, 1%, 0.1%, 0.01% 함유되도록 샘플을 제작하였다(표 4).

반응에 사용되는 표적핵산의 양

	야생형 gDNA	돌연변이 gDNA
돌연변이 100%	0 ng	25 ng
돌연변이 10%	25 ng	2.5ng
돌연변이 1%	25 ng	0.25 ng
돌연변이 0.1%	25 ng	0.025ng
돌연변이 0.01%	25 ng	0.0025ng
돌연변이 0%	25 ng	0 ng

2-2 PNA 프로브 혼합체와 다양한 프라이머의 반응분석

실시예 1-1에서 제조한 PNA 프로브 혼합체와 실시예 1-2에서 제조한 프라이머의 종류에 따른 돌연변이의 검출 민감도 및 특이성 확인을 위해, 상기 표 1의 서열번호 1 의 PNA 프로브(clamping probe) 1.2μM과 서열번호 2 의 PNA 프로브(Detection probe) 4μM의 혼합체에, 표 3의 DNA 올리고머 서열번호 4 의 1.2μM 과 각각의 서열번호 5, 6, 7 및 8 번을 각각 4μM로 혼합하고, PCR 증폭용액(엔지노믹스, 한국)과 각각의 준비된 표적핵산을 첨가하였으며, 실시간 유전자 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-time PCR System, 바이오라드, 미국)를 이용하여 반응을 수행하였다. PCR 사이클은 크게 클램핑 반응, 검출 반응 및 융해 반응의 세 단계로 나누어 진행하였으며, 95℃에서 15분 동안 반응 후, 95℃ 30초, 70℃ 20초, 63℃ 30초, 72℃ 30초 반응 과정을 형광 측정 없이 15cycle 반복 후, 95℃ 에서 10초, 53℃ 20초, 72℃ 20초 반응 과정을 40 cycle 수행하였으며, 형광은 53℃에서 측정하였다. 이 후 95℃에서 15분 동안 유지 후, 35℃까지 낮춘 뒤에 5분 동안 혼성화시킨 후, 35℃부터 75℃까지 0.5℃씩 상승시키며 형광을 측정하여 융해곡선 분석을 수행하였다.

그 결과, 표 3의 서열번호 5 내지 8의 올리고머(일반적인 프라이머, 대립특이적인 프라이머, 이노신을 사용한 프라이머)간의 검출성능을 비교하였을 때 프라이머 종류에 따라 Cq값이 다음 표 5와 같이 형성됨을 확인하였다. 또한 융해곡선 그래프가 도 2 내지 도 5와 같이 형성됨을 확인하였다.

서열번호 5 및 6 올리고머의 경우 PCR 반응에서 100% ~ 0.01%까지 Cq값을 확인하였으며, PNA 프로브 혼합체와 작동이 성공적으로 야생형(wild)의 억제능을 확인하였다(도 2 및 도 3).

서열번호 7 올리고머의 경우 PCR 반응에서 100~0.01%까지의 Cq값은 확인되었으나, PNA 프로브 혼합체와의 작동이 원활하지 않아 야생형(wild)의 억제능이 낮아 야생형 표적(Wild target)에서도 증폭이 발생하는 결과를 확인하였다. 이는 프라이머가 구분하고자 하는 특정 염기 치환 부위까지 인식하여 신장반응을 함에 따라 PNA 검출 프로브가 염기치환 부위를 프라이머 부위로 인식하는 원인으로 보인다(도 4).

서열번호 8의 경우 100% 표적(target)에서 가장 우수한 Cq값을 확인하였으나, PNA 프로브 혼합체와의 반응에서 야생형(wild)이 억제되지 않아 증폭문제가 발생하는 경우가 확인되었다. 하지만 서열번호 7에 비해 PNA 프로브 혼합체와 반응의 우수성을 확인하였다(도 5).

이에, 실시예 2에서는 PNA 프로브 혼합체와 반응성이 우수한 프라이머가 서열번호 5와 6의 올리고머로 확인되었으며, 서열번호 7에 비해서는 서열번호 8의 올리고머가 좀더 우수한 반응성을 확인하였다.

또한 PNA 프로브 혼합체 시스템에서 클램핑 프로브의 제외함에 따른 프라이머 간의 반응성을 확인하였으며, 그 결과, 클램핑 프로브의 제외 유무에 따른 Cq값을 확인하였다[표 5]. 클램핑 프로브가 제외되는 경우 서열번호 5, 6, 7 및 8 모두 표적(target) %에 따른 구별능을 확인할 수 없었으나, 서열번호 8의 경우 야생형 표적(Wild target)의 구별능이 나머지 올리고머에 비해 차이가 있음을 확인하였다. 야생형 및 K-ras 돌연변이 G13V 융해곡선을 분석한 결과, 야생형에 포함되어 있는 K-ras 돌연변이 유전자 G13V가 프라이머의 종류 및 서열에 따라 0.01%까지 작동하는 것을 확인하였다.

	100%	10%	1%	0.1%	0.01%	야생형 A	야생형 B	야생형 C
서열번호 5 - 클램핑 프로브 첨가	17.09	20.53	22.8	24.88	26.5	N/A	N/A	N/A
서열번호 5 - 클램핑 프로브 미첨가	13.84	15.26	15.01	19.28	14.25	N/A	N/A	N/A
서열번호 6 - 클램핑 프로브 첨가	17.63	20.93	23.52	25.39	26.68	N/A	N/A	N/A
서열번호 6 - 클램핑 프로브 미첨가	14.42	15.71	15.66	16	14.7	N/A	N/A	N/A
서열번호 7 - 클램핑 프로브 첨가	17.99	20.91	23.62	23.89	25.66	26.68	27.04	27.66
서열번호 7 - 클램핑 프로브 미첨가	14.62	17.01	18.96	20.61	21.44	21.91	22.27	22.66
서열번호 8 - 클램핑 프로브 첨가	15.6	18.8	21.42	23.07	23.97	N/A	34.94	32.84
서열번호 8 - 클램핑 프로브 미첨가	13.94	16.82	19.43	20.91	22.66	34.37	31.96	34

이에, 본 발명에서는 서열번호 8과 유사한 방법으로 디자인한 몇몇의 올리고머를 이용하여 PNA 혼합체와 반응성이 우수한 올리고머를 찾고자 하였다.

PNA 프로브 혼합체와 변형된 DNA 올리고머에 따른 반응 분석

PNA 프로브 특성 분석을 위한 변형된 DNA 올리고머 서열

서열번호	이름	서열(5'→3')
9	Reverse E primer	TAGCAGTTCCGTGAGIIIIGATGCT
10	Reverse F primer	TAGCAGTTCCGTGAGAAIIIATGCT

실시예 2에서 서열번호 8 프라이머와 PNA 프로브 혼합체의 반응 가능성을 확인하여 서열번호 9, 10을 새롭게 합성을 진행하였다. 또한, 표 5의 K-ras 유전자의 억제와 검출을 동시 다중으로 구현하기 위한 프라이머를 ㈜바이오니아(한국)에서 합성 의뢰하여 사용하였다(표 6).

표적핵산의 제작 및 확보는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하여, 야생형 유전자에 각 돌연변이 유전자를 1%, 0.1%, 0.01%, 0% 함유되도록 샘플을 제작하였다.

서열번호 8과 유사한 형태의 올리고머에 따른 PNA probe 혼합체와의 반응성의 확인을 위해, 표 6의 서열번호 9 및 10 프라이머를 각각 서열번호 1 및 3 클램핑 프로브와 검출 프로브 혼합체를 사용하여 올리고머에 따른 반응성을 확인하였다.

실시예 2 에서 사용한 서열번호 5 내지 8 및 새롭게 제작한 서열번호 9 및 10 의 프라이머를 이용하고, 프로브 혼합체의 검출 프로브를 표 1의 서열번호 3으로 변경하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 올리고머 서열번호에 따른 표적별 검출 민감도를 다음과 같이 확인하였다[표 7]. 또한, 융해곡선 그래프가 도 6 내지 11 과 같이 형성됨을 확인하였다.

서열번호 5 및 6의 올리고머의 경우 프로브 혼합체와 반응하여 0.01%까지의 검출 민감도가 가능함을 확인하였으며(도 6 및 도 7), 서열번호 7은 야생형 유전자와 돌연변이 유전자형의 구분이 불가함을 확인하였다(도 8). 또한 서열번호 8 내지 10의 이노신(inosine)을 적용한 프라이머 경우 PNA 프로브 혼합체와 반응하여 표적(target)에 따라 유사한 Cq값을 확인하였으나, 야생형(wild) 억제능에서는 프라이머에 따른 차이를 확인하였다(도 9 내지 도 11).

그리고 서열번호 5 내지 9의 프라이머의 경우 클램핑 프로브가 제외되는 경우 야생형 유전형과 돌연변이 유전형의 구분이 어려움을 확인하였다. 야생형 및 K-ras 돌연변이 G13V 융해곡선을 분석한 결과, 야생형에 포함되어 있는 K-ras 돌연변이 유전자 G13V가 프라이머의 종류 및 서열에 따라 0.01%까지 작동하는 것을 확인하였다.

또한 서열번호 10의 올리고머는 클램핑 프로브가 첨가되지 않고, PNA 검출 프로브만으로도 야생형 유전자와 돌연변이 유전자형을 구분하였으나, 다른 올리고머와는 다르게 융해 곡선값이 다르게 형성됨을 확인하였다. 이는 올리고머의 염기서열부위에 사용한 이노신과 검출 프로브가 겹쳐짐으로 인해 융해곡선 값이 달라지는 것으로 확인하였다. 본 발명은 본 실시예를 통해 이노신(inosine)을 적용한 올리고머 및 다양한 프라이머 또한 PNA 프로브 혼합체 시스템에 적용하여 고민감도 검출의 성능 구현이 가능함을 확인하였다.

	100%	10%	1%	0.10%	0.01%	야생형 A	야생형 B	야생형 C
서열번호 5 - 클램핑 프로브 첨가	17.44	20.65	22.9	24.6	27.3	N/A	N/A	N/A
서열번호5 - 클램핑 프로브 미첨가	14.1	15.39	15.64	15.34	15.8	15.62	15.63	15.99
서열번호 6 - 클램핑 프로브 첨가	18.51	21.39	23.7	25.43	26.38	N/A	N/A	N/A
서열번호6 - 클램핑 프로브 미첨가	14.72	16.03	16.01	15.44	15.94	15.72	16	16.57
서열번호 7 - 클램핑 프로브 첨가	18	21.52	23.63	24.79	25.74	26.74	26.92	27.56
서열번호7 - 클램핑 프로브 미첨가	14.95	17.89	19.99	21.48	21.81	22.21	22.1	22.57
서열번호 8 - 클램핑 프로브 첨가	15.85	19.06	21.58	23.06	22.47	N/A	N/A	N/A
서열번호8 - 클램핑 프로브 미첨가	14	17.18	20.03	22.47	22.84	32.73	N/A	32.65
서열번호 9 - 클램핑 프로브 첨가	15.8	18.68	21.67	23.2	24.96	N/A	N/A	32.29
서열번호9 - 클램핑 프로브 미첨가	14.01	17.21	19.16	22.11	23.09	32.78	32.91	N/A
서열번호 10 - 클램핑 프로브 첨가	15.16	18.88	20.93	22.98	24.78	N/A	N/A	N/A
서열번호10 - 클램핑 프로브 미첨가	15	18.36	20.96	23.34	24.47	N/A	N/A	N/A

Claims (23)

1. 표적핵산을 실시간으로 검출하기 위한, 하기를 포함하는 프로브 및 프라이머 혼합체:
   (a) 하나 이상의 검출 프로브(detection probe);
   (b) 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe); 및
   (c) 대립특이적이고, 이노신이 포함된 프라이머.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 프로브 및 클램핑 프로브는 핵산 유사체로서, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택되는 것을 특징으로 하는, 프로브 및 프라이머 혼합체.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 프로브 및 클램핑 프로브는 구조적 변형을 위해 아미노산 또는 아미노산의 곁사슬이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 프로브 및 프라이머 혼합체.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 것을 특징으로 하는 프로브 및 프라이머 혼합체.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지 닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 물질임을 특징으로 하는 프로브 및 프라이머 혼합체.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 소광자(quencher)는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 프로브 및 프라이머 혼합체.
   
7. 표적핵산을 실시간으로 검출하기 위한 프로브 및 프라이머 혼합체를 이용한 동시 다중적 표적핵산 검출방법으로서, 상기 프로브 및 프라이머 혼합체는 하기를 포함하는 방법:
   (a) 하나 이상의 검출 프로브(detection probe);
   (b) 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe); 및
   (c) 대립특이적이고, 이노신이 포함된 프라이머.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 검출 프로브 및 클램핑 프로브는 핵산 유사체로서, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택되는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
   
9. 제 7 항에 있어서, 상기 검출 프로브 및 클램핑 프로브는 구조적 변형을 위해 아미노산 또는 아미노산의 곁사슬이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 아미노산의 곁사슬은 프로브 골격의 알파, 베타, 또는 감마 위치에 결합 되는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
11. 제 9 항에 있어서, 상기 검출 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 리포터(reporter)는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광물질임을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
13. 제 11 항에 있어서, 상기 소광자(quencher)는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
14. 제 9 항에 있어서, 야생형 유전자와 상보적으로 결합하여 중합효소의 신장반응을 억제하는 클램핑 프로브를 이용하여 표적핵산 유전자를 선택적으로 증폭시키고, 표적핵산을 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브를 이용해 동시 다중적으로 표적핵산 유무 또는 농도를 검출하는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
15. 제 9 항에 있어서, 상기 검출 프로브 및 클램핑 프로브는 표적으로 하는 핵산 사슬의 동일 가닥에 결합하여 야생형 유전자의 억제 및 표적핵산 유전자의 검출이 동시에 이루어지는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
16. 제 9 항에 있어서, 상기 검출 프로브 및 클램핑 프로브는 표적으로 하는 핵산 사슬의 서로 다른 가닥에 결합하여 야생형 유전자의 억제 및 표적핵산 유전자의 검출이 동시에 이루어지는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
17. 제 9 항에 있어서, 프로브 및 프라이머 혼합체를 이용한 표적핵산의 검출은 실시간 증폭곡선 및 융해곡선의 동시분석이 가능한 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
18. 제 9 항에 있어서, (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 프로브 및 프라이머 혼합체를 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 증폭과정 이후 온도를 변화시키면서 증폭산물과 검출 프로브간의 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적 또는 동시에 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
19. 제 18 항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
20. 제 18 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 융해 곡선을 얻는 단계 전에, 실시간 증폭곡선을 얻는 단계와는 별도로 5 내지 20의 PCR 사이클을 추가하는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
21. 제 9 항에 있어서, (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 프로브 및 프라이머 혼합체를 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법.
    
22. 제 9 항에 있어서, (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 프로브 및 프라이머 혼합체를 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 동시 다중적 표적핵산 검출 방법.
    
23. 제 9 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하고, 클램핑 프로브, 검출 프로브 및 대립특이적이고, 이노신이 포함된 프라이머로 구성된 프로브 및 프라이머 혼합체를 포함하는 표적핵산 동시 다중 검출용 키트.
    

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