KR20220078362A

KR20220078362A - 두족류(Cephalopod) 검출용 조성물

Info

Publication number: KR20220078362A
Application number: KR1020200167837A
Authority: KR
Inventors: 강현우; 이익재; 최지현; 김소영; 백송이; 김봉석
Original assignee: 주식회사 바이오티엔에스
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2022-06-10
Also published as: KR102494431B1

Abstract

본 명세서에서는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는 조성물을 포함하는 키트 및 이를 통한 검출 방법을 제공한다.

Description

두족류(Cephalopod) 검출용 조성물{COMPOSITION FOR DETECTING CEPHALOPOD}

본 발명은 두족류 검출용 조성물, 이에 따른 키트 및 검출 방법에 관한 것이다.

두족류(Cephalopod)는 연체동물의 총칭으로, 형태학적으로 몸통이 머리의 위에 붙어 있고, 머리의 밑에 바로 다리가 존재하는 특징을 가지며, 문어, 오징어, 낙지, 앵무조개 및 주꾸미 등을 포함한다.

국내에 유통되고 있는 두족류는 국내산 두족류 및 수입산 두족류로 분류될 수 있으며, 원산지 및 종에 따라 가격의 차이가 발생한다. 이에, 외형이 유사하여 일반 소비자가 구별하기 힘든 다른 종의 두족류를 속여서 판매하거나, 두족류를 식재로로 이용함에 있어, 고의적으로 고가의 재료를 유사한 저가의 재료로 대체하여 판매하는 문제가 발생되어 왔다.

나아가, 수입산 두족류는 보관기간 및 취급 방법에 따라, 곰팡이와 같은 오염 및 변성이 유발되어, 식용이 불가할 수 있다. 이에, 종에 대한 라벨의 진위 여부는 소비자 권리법에서 중요하다.

그러나, 이러한 두족류는 일반적으로 형태학적 특징으로 종을 구분하는데, 형태학적 특징이 매우 유사하기 때문에, 육안으로 종을 구분하기 어려우며, 전문가의 눈으로만 확인할 수 있는 몇 가지 상세한 특성으로만 구분될 수 있다. 나아가, 이러한, 형태학적 식별 방법은 두족류가 특정 가공과정을 거쳐 식품 내에 포함된, 전혀 이의 포함 유무 및 종류를 알 수 없다. 따라서, 정확하게 두족류를 식별할 수 있는 방법에 대한 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 본 발명의 발명자들은 PNA를 주목하였다. 보다 구체적으로, PNA는 Peptide nucleic acids의 약자로 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로 인공적으로 합성하며 기본 골격이 polyamide로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)가 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 restriction enzyme으로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.

더욱이, DNA-DNA 결합력 보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 염기변이(nucleotide miss match)에도 10 내지 15℃가량 융해온도가 차이가 나며, 이러한 결합력의 차이를 이용하여 단일염기서열변이(SNP, Single Nucletide Polymorphism) 및 삽입/결실에 의한 염기변화를 검출할 수 있게 된다. PNA 프로브와 타겟 DNA의 융해 온도(Tm) 값은 PNA 프로브 염기서열과 이에 상보적으로 혼성화하는 타겟 DNA의 염기서열의 차이에 따라 변하므로, 이를 이용한 어플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 택맨 프로브(TaqMan probe)의 가수분해 방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화 방법(hybridization method)을 이용하여 분석하며, 이와 비슷한 역할을 하는 프로브로는 비콘 프로브(molecular beacon probe) 또는 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.

최근 PNA 프로브 혼성화 방법의 분석방법으로 형광 융해 곡선 분석(FMCA; Fluorescence Melting Curve Analysis)을 이용하며, FMCA는 PCR 증폭반응이 끝나고 난 후, 생성된 산물과 PNA 프로브 간의 결합력의 차이를 융해온도(Tm)로 구분하여 분석하는 방법이다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 PNA 프로브는 디자인이 매우 간편하며, 9 내지 15 mer의 염기서열을 이용하여 제작하므로, 원하는 Tm 값을 가지는 프로브를 디지인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm 값을 조절하거나 같은 길이의 PNA 프로브라도 프로브를 변형시켜 Tm 값을 조절할 수 있다.

또한, PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm 값이 높기 때문에 DNA보다 ?F은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능한 장점이 있다. 기존의 HRM(High resolution melting)방법은 Tm 값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면 PNA 프로브는 프로브 염기서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 다수의 염기변이 분석이 가능하다.

이에, 본 발명의 발명자들은 전술한 PNA를 통하여, 두족류의 종류를 보다 정확하고 신속하게 판별할 수 있다는 것을 인지할 수 있었다.

결국, 본 발명의 발명자들은 국내 선호도가 높고 주로 유통되는 주꾸미 및 낙지에서 공통적으로 포함되어 있는 특정 서열을 확인하였으며, 이를 기반으로 전술한 두족류를 판별할 수 있는 프라이머 및 PNA 프로브를 개발하였다.

이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 두족류 개체를 정확하고 신속하게 판별할 수 있는 프라이머 및 PNA 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는, 두족류 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 특징에 따르면, 두족류는, 주꾸미 속(Amphioctopus genus), 낙지 속(Octopus genus) 및 주머니낙지(Cistopus taiwanicus) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 주꾸미 속은 모래주꾸미(Amphioctopus aegina), Amphioctopus neglectus 및 Amphioctopus fangsio 중 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 낙지 속은, Octopus minor일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 특징에 따르면, PNA 프로브는, 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 포함할 수 있다. 이때, 리포터는, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TxR(Texas Red), 시아닌(Cyanine) 계열 염료, Quasar705, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine) 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 중 적어도 하나일 수 있으며, 소광자는, 답실(dimethylaminoazobenzenesulfonic acid, Dabcyl), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher), Qxl 퀀처(Qxl quencher), 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ), 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ), IRDye QC-1, 딥 다크 퀀처(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 이클립스 퀀처(ECLIPSE Quencher) 및 탐라 퀀처(TAMRA quencher) 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

나아가, 전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따른 전술한 두족류 검출용 조성물을 포함하는, 두족류 검출용 키트를 제공한다.

더 나아가, 전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은, 시료로부터 DNA를 분리하는 단계, 분리된 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 DNA 단편을 생성하는 단계, DNA 단편에 서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계, 혼성화된 DNA 단편에 온도를 증가시키면서 온도별 융해 곡선을 획득하는 단계 및 획득된 융해 곡선의 융해 피크를 통하여 시료의 유형을 결정하는 단계를 포함하는, 두족류의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 특징에 따르면, 융해 곡선은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)에 의하여 형광세기를 측정하며 온도 대비 형광 값을 분석하여 수득될 수 있으며, 이때의 형광세기는 45℃내지 85℃로 온도를 증가시키면서 측정될 수 있다.

본 발명의 다른 특징에 따르면, 융해피크는, 56℃ 내지 73℃에서 관찰될 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 시료의 유형을 결정하는 단계는, 융해피크가 56℃ 내지 73℃에서 관찰되는 경우, 시료를 두족류인 것으로 결정할 수 있으며, 나아가, 융해피크가 57℃ 내지 67℃에서 관찰되지 않는 경우, 시료를 두족류가 아닌 것으로 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 시료의 유형을 결정하는 단계는, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 60℃내지 66℃에서 관찰되는 경우, 시료를 Amphioctopus fangsio인 것으로 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 시료의 유형을 결정하는 단계는, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 61℃내지 67에서 관찰되는 경우, 시료를 Amphioctopus neglectu인 것으로 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 시료의 유형을 결정하는 단계는, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 67℃내지 73℃에서 관찰되는 경우, 시료를 모래주꾸미인 것으로 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 시료의 유형을 결정하는 단계는, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 65℃내지 71℃에서 관찰되는 경우, 시료를 Octopus minor인 것으로 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 시료의 유형을 결정하는 단계는, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 59℃내지 64℃에서 관찰되는 경우, 시료를 Cistopus taiwanicus인 것으로 결정할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 발명은, 형태학적으로 구별하기 힘든 두족류 중 주꾸미 속(Amphioctopus genus), 낙지 속(Octopus genus) 및 주머니낙지(Cistopus taiwanicus)에 속하는 개체만 특이적으로 선별할 수 있으며, 분쇄 및 조리 공정을 거쳐 식품 내 함유되어 있어 육안으로 개체의 식별이 불가능한 상태에서도, 본 발명을 이용하여, 개체의 함유 여부를 정판별할 수 있다.

즉, 본 발명은 두족류 중 특정 개체만을 정확하고 신속하게 검출 및 판별할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에 대한 순서도이다.
도 2 및 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에서 이용되는 PCR 방법에 대한 예시도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 조성물 및 이를 포함하는 키트를 통한 Amphioctopus fangsio, Amphioctopus neglectus, 모래주꾸미, Octopus minor 및 Cistopus taiwanicus의 측정 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 조성물 및 이를 포함하는 키트를 통한 꽃게의 측정 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산(nucleic acid, NA)"은, 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)로 유전정보를 전달하는 유전물질인 DNA 및 RNA를 포함할 수 있으며, 핵산, DNA 및 RNA는 상호호환되어 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화"는, 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "변이"는, 표적 핵산 또는 DNA에 대한 염기서열에 변이가 일어난 것을 의미할 수 있으며, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "PNA(peptide nucleic acid)"는, 핵산 염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연걸된 유사 DNA를 의미한다. PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "PNA 프로브(PNA probe)"는, PNA 기반의 프로브를 이용해 표적 염기서열(뉴클레오티드)을 검출하는 마커이다. PNA 프로브는 골격에 전하가 없기 때문에 음전하를 가진 상보적인 DNA 올리고머와 결합에 있어서 반발력이 적어, DNA 프로브보다 빠르고 강하게 표적 염기서열과 결합할 수 있으며, 효소들에 의한 손상이 없어 높은 안정성을 보인다.

두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 이에 따른 검출 방법

이하에서는, 도 1 내지 4를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출방법에 대하여 설명하도록 한다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에 대한 순서도가 도시된다. 이때, 설명의 편의를 위하여 도 2 내지 4를 참조하여 설명하도록 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법은, 시료로부터 DNA를 분리하는 단계(S110), 분리된 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 DNA 단편을 생성하는 단계(S120), DNA 단편에 서열번호 3 내지 7의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계(S130), 혼성화된 DNA 단편에 온도를 증가시키면서 온도별 융해 곡선을 획득하는 단계(S140) 및 융해 곡선의 서열번호 3 내지 6의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 피크를 통하여 시료의 유형을 결정하는 단계(S150)를 포함할 수 있다.

먼저, 시료로부터 DNA를 분리하는 단계(S110)에서, 시료는 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원으로 핵산을 포함하고 있는 생물학적 시료(bio-sample)를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있으며, 조직일 경우, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 기관일 경우, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에 의하여 분석될 수 있는 생물학적 시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함할 수 있으며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료를 포함할 수 있다. 또한, 생물학적 시료는 체액 시료를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

시료로부터 DNA를 분리하는 단계(S110)는 전술한 생물학적 시료에 포함되어 있는 핵산을 정제하기 위하여, 물리적 및/또는 화학적이 수행될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료는 핵산을 포함한 다양한 단백질 성분 및 불순물을 포함하고 있음에 따라, 계면활성제가 포함된 세포 파쇄액을 사용하여 생물학적 시료를 용해한 뒤, 원심 분리 및 필터와 같은 물리적인 방법을 통하여 핵산이 수득되도록 정제될 수 있다.

그 다음, 전술한 시료로부터 DNA를 분리하는 단계(S110) 이후, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR, rtPCR 또는 quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)가 이용되어, 분리된 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 DNA 단편을 생성하는 단계(S120), DNA 단편에 서열번호 3 내지 6의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계(S130) 및 혼성화된 DNA 단편에 온도를 증가시키면서 온도별 융해 곡선을 획득하는 단계(S140)가 수행될 수 있다.

이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물은 특정 염기서열을 통하여 제작된, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머와 서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA 프로브를 포함한다.

보다 구체적으로, 전술한 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머와 서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA 프로브는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열을 통하여 도출된 두족류의 공통서열(Consensus Sequence)로부터 제작되었으며, 이의 염기서열은 하기의 [표 1]에 나타내었다.

구분	서열번호	5' -> 3‘(sequence)	비고
프라이머	서열번호1	GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
프라이머	서열번호2	TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
PNA 프로브	서열번호3	TGATCTGTCTTTATTACA	FAM, Dabcyl
	서열번호4	CCTTGCCGGAGCA	HEX, Dabcy
	서열번호5	GACTACCACTATTTGTATGA	TxR, Dabcyl
	서열번호6	ACCAGGTTCACTACTCA	Cy5, Dabcyl
	서열번호7	CCTTGCCGGAGCA	Quasar705, Dabcyl

나아가, 서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성되었고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 통하여 확인되었다. 또한, 표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차 구조는 포함하지 않았다.

더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트는, 전술한 조성물 이외의 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체 또한 포함할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트에 포함되어 있는 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물 및 이외의 다양한 시약의 사용 용량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.

이러한, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트는 rtPCR 방법과 함께 S120 단계, S130 단계 및 S140 단계에 적용되어, 왕게 속 및 대게를 보다 정확하게 검출(판별)할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에서는 PNA를 이용한 rtPCR을 통하여 시료가 분석될 수 있다.

보다 구체적으로, 도 2를 참조하면, 종래의 PCR 방법에 대한 예시도가 도시된다. 종래의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 표적 DNA에 결합능력을 가진 프라이머(primer)라는 작은 합성 DNA와 DNA를 합성하는 DNA 중합효소(DNA Polymerase)를 이용하여 표적하는 특정 유전자의 양을 증폭하는 방법을 의미할 수 있으며, 반응 1 회(cycle) 당 2배의 유전자 증폭이 이루어진다.

그러나, 이러한 종래의 PCR 방법은 표적 핵산에 부합되는 올리고머 프라이머(oligomer primer)를 디자인(제작)하여 증폭을 진행함에도 불구하고, 비특이적 밴드(non-specific band)가 항상 존재한다. 보다 구체적으로, 종래의 PCR 방법은 표적 DNA에 100 % 상보적인 프라이머 및 DNA 사이의 어닐링(annealing)을 기초로 이루어진다. 그러나, 프라이머 및 DNA 간 100% 상보적이지 않더라도 즉, 1 내지 3 bp 정도의 비상보적인 서열이 존재하여도 어닐링이 이루어질 수 있다. 이에, 표적하고자 하는 유전자 이외의 밴드가 발현될 수 있음에 따라, 종래의 PCR 방법은 진단의 정확성이 떨어진다. 나아가, 종래의 PCR 방법은 전기영동을 통한 유전자 길이 측정으로 증폭된 표적 핵산을 확인해야하는 번거로움을 가지고 있다.

또한, 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 이용하여 수행한다 하여도, 기계상에서 보여주는 Ct값으로는 증폭된 유전자가 표적하고자 하는 유전자인지에 대한 진위(유전자의 존재 여부 또는 염기변이의 존재 여부)를 판별하기 힘들다. 따라서, 종래의 PCR 및 rtPCR을 통한 Ct값 기준의 진단 및 개체 판별의 분석 방법은 개체의 판별 및 진단에 대한 오류가 초래될 수 있다.

한편, 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에서 이용될 수 있는 PNA를 이용한 rtPCR에 대한 예시도가 도시된다. PNA를 이용한 rtPCR에서 rtPCR 방법은 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥 DNA 사슬에 결합(interchelating)한 뒤, PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써, DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해 곡선의 패턴, 특히, DNA가 융해(변성)되는 온도 즉, 융해온도(melting temperature, Tm)를 통하여, 표적 DNA 유무 및 이의 염기변이 유무를 검출할 수 있다.

이때, 형광 물질로서, PNA를 이용한 프로브가 사용될 수 있다. 인공 핵산(artificial nucleotide)인 PNA는 표적 DNA 혹은 RNA와의 상보적 결합력이 탁월함에 따라, 핵산 분해효소 및 단백질 분해효소 등에 대한 생물학적 안정성이 뛰어나며, 화학적 안정성 및 수용해도(Water Solubility)가 다른 인공 합성된 올리고머(oligomer)보다 뛰어나다.

더욱이, PNA를 이용한 프로브(PNA probe)는 Taq DNA 중합효소의 5' 엑소뉴클레아제(5' exonuclease)의 활성과 상관없이 표적하고자하는 상보적인 유전자의 염기서열이 존재할 경우, 혼성되어(hybridization) 형광 신호를 나타낼 수 있다. 특히, PNA 프로브는 TaqMan 프로브와 같이 핵산 증폭 과정뿐만 아니라, 증폭이 종결된 후 추가적인 융해 단계(Melting analysis)에서도 형광 신호를 나타낼 수 있음에 따라, 다양한 단계에서 표적 유전자를 검출할 수 있다. 이에, 미량의 표적 유전자의 존재 여부를 확인할 경우, 추가적인 증폭 단계만으로 대부분의 Ct 값을 이용하는 종래의 PCR 방법의 단점을 해결할 수 있다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에서 이용될 수 있는 PNA를 이용한 rtPCR 방법은, 특정 염기 변이 즉, 1bp의 단일 돌연변이(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)또한 측정할 수 있다.

보다 구체적으로, 도 4를 참조하면, PNA 프로브는 표적 핵산 즉, DNA와 혼성화된 후, 형광 신호를 발생시킬 수 있으며, 온도가 높아짐에 따라 프로브의 적정 융해온도에서 표적 DNA로부터 빠르게 융해되어 형광신호를 소광시킨다. 그러나, PNA-DNA 결합은 DNA-DNA와는 달리 1bp만 상보적이지 않아도 그 융해온도 값이 급격하게 떨어지는 경향을 갖는다. 이러한 융해온도 값의 급격한 감소는 특정 온도에서의 PNA-DNA 사이의 어닐링(annealing)을 불가능하게 만든다. 나아가, 융해온도 값의 감소 정도는 상보적이지 않은 염기서열의 종류와 그 위치, 그 개수에 따라서 달라지게 된다. 이에, 이러한 융해온도 값의 감소 정도를 이용하여 종 판별을 정확하게 하기 위해 rtPCR 기술의 응용분야인 FMCA이 적용될 수 있다.

이때, FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)은 형광물질을 이용하여 증폭 곡선의 검출을 통해 증폭 산물을 확인하는 방법을 의미한다. 융해 곡선 분석에서는 PCR 후에 PCR 반응액의 온도를 서서히 올려, 형광물질의 형광 시그널을 모니터링한다. 처음에는 PCR 증폭 산물이 이중 가닥(double strand)를 형성해 형광 시그널을 나타내지만, 어느 일정한 온도에 이르면 단일가닥으로 분리되어 형광 신호가 급격하게 저하한다.

결국, 표적하고자 하는 DNA와 염기서열이 100 % 일치하지 않을 경우, 낮은 융해온도를 나타낼 수 있으며, 나아가, 표적하고자 하는 DNA가 존재하지 않을 경우 융해온도가 나타나지 않을 수 있다. 이때 나타나는 온도가 융해온도(Tm값)이며, 각각의 증폭 산물은 고유한 융해온도 값을 가지고 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에서 사용되는 표적 DNA 및 이에 상보적인 PNA는 각각 고유의 Tm 값을 가질 수 있다.

나아가, PNA 프로브을 가짐으로써, 형광 신호를 나타내어 가시화될 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법에서 사용되는 PNA 프로브는 리포터 물질(reporter molecule) 및 소광물질(quencher molecule, Q)를 포함할 수 있다. PNA 프로브는 양 끝에 각각 리포터 물질인 형광원(fluorophore, F)과 소광물질(quencher, Q)이 라벨링(labeling)되어 있다. 이러한 PNA 프로브는 상보적인 염기서열 즉, 표적 DNA이 없는 경우, 내적인 염기서열간의 인력으로 인하여 꼬임 구조를 형성한다. 이에, 상보적인 DNA 염기서열이 없는 경우, 형광과 소광 물질간의 거리가 가까워져 형광신호가 나타나지 않으며, 상보적인 DNA 염기서열이 존재하는 경우, 그 구조가 일자 구조를 향상한다. 결국, 표적 DNA가 있는 경우, 형광원과 소광 물질간의 거리가 멀어져 형광 신호가 발현될 수 있다.

이때, 형광원으로써 리포터는, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TxR(Texas Red), 시아닌(Cyanine) 계열 염료, Quasar705, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine) 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 소광자는, 답실(dimethylaminoazobenzenesulfonic acid, Dabcyl), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher), Qxl 퀀처(Qxl quencher), 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ), 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ), IRDye QC-1, 딥 다크 퀀처(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 이클립스 퀀처(ECLIPSE Quencher) 및 탐라 퀀처(TAMRA quencher) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류의 검출 방법은 전술한 PNA를 이용한 rtPCR방법에 의하여 종래의 PCR 또는 rtPCR 방법보다 개체를 정확하게 판별할 수 있는, 융해 곡선을 획득할 수 있다.

결국, 다시 도 1을 참조하면, 융해 곡선의 융해 피크를 통하여 시료의 유형을 결정하는 단계(S150)에서는, 서열번호 3 내지 7의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해곡선에서 융해피크가 56℃ 내지 73℃에서 관찰되는 경우, 시료를 두족류인 것으로 결정될 수 있다.

이상의 과정을 통하여, 본 발명의 일 실시예에 따른, 두족류의 검출 방법은, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물 및 rtPCR을 이용하여, 종래의 방법보다 정확하게 시료 내 포함되어 있는 개체의 표적 DNA를 검출할 수 있으며, 이에, 개체가 포함되어 있는 속 즉, 종류를 판별할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 이에 따른 검출 방법의 검증

이하에서는, 도 5 및 6을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 이에 따른 검출 방법을 검증하도록 한다.

먼저, 검증을 위한 실험 과정은, 전술한 도 1에 기반하여 수행되었으며, rtPCR 즉, PCR 반응은 CFX96™Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 통하여 수행되었다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트는 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물(올리고머 믹스), PCR 버퍼를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트에서 조성물(올리고머 믹스)은 2pmol인 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머(순방향)가 1㎕, 20pmol인 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머(역방향)가 2㎕ 및 5pmol인 서열번호 3 내지 7의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브가 각각 0.5㎕씩 포함되어 있을 수 있으나, 이들 각각에 대한 농도 및 용량은 이에 제한되는 것은 아니며, 시료의 종류에 따라, 당업자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있다. 나아가, 키트에서 PCR 버퍼는 2X의 농도로, nTaq-HOT(0.2 unit/㎕), nTaq-HOT buffer(4mM MgCl₂ 함유), dNTP 혼합물(A, T, G, C 각각 0.4mM) 및 안정제(Stabilizer)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 이에 따른 검출 방법의 검증을 위한 반응물의 조성은 하기의 [표 2]에 나타내었다.

조성	용량
2X PCR buffer	10㎕
올리고머 믹스 (PNA 프로브, 프라이머)	7㎕
주형(Template, DNA)	1㎕
증류수	up to 20㎕

나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트의 마스터 믹스(master mix)를 만든 후, 이를 1㎕ 첨가하여, rtPCR 반응을 수행하였으며, rtPCR 반응에 대한 조건은 하기의 [표 3]에 나타내었다.

단계	온도(℃)	반응시간 및 사이클
Predenaturation	95	10 min
유전자 증폭	95	30 sec	45 cycles
	55	30 sec
	76	60 sec
변성(Denaturation)	95	30 sec
프로브 결합 (Probe binding)	75	30 sec
	55	30 sec
융해(Melting)	45 to 85	Increment 1.0℃5 sec(FAM)

이에, 도 5를 참조하면, 전술한 과정을 통하여 측정된 각각의 두족류에 대한 측정 결과가 도시된다.

먼저, 도 5의 (a)를 참조하면, Amphioctopus fangsio 시료의 경우, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 곡선이 나타날 수 있으며, 이때의 융해 온도(융해 피크)는 63℃인 것으로 나타난다.

그 다음, 도 5의 (b)를 참조하면, Amphioctopus neglectus 시료의 경우, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 곡선이 나타날 수 있으며, 이때의 융해 온도(융해 피크)는 64℃인 것으로 나타난다.

그 다음, 도 5의 (c)를 참조하면, 모래주꾸미 시료의 경우, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 곡선이 나타날 수 있으며, 이때의 융해 온도(융해 피크)는 70℃인 것으로 나타난다.

그 다음, 도 5의 (d)를 참조하면, Octopus minor 시료의 경우, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 곡선이 나타날 수 있으며, 이때의 융해 온도(융해 피크)는 68℃인 것으로 나타난다.

그 다음, 도 5의 (e)를 참조하면, Cistopus taiwanicus 시료의 경우, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해 곡선이 나타날 수 있으며, 이때의 융해 온도(융해 피크)는 62℃인 것으로 나타난다.

이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 이에 따른 검출 방법은 Amphioctopus fangsio, Amphioctopus neglectus, 모래주꾸미, Octopus minor 및 Cistopus taiwanicus 각각에 대한 고유의 값을 가짐에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 이에 따른 검출 방법을 통하여, 전술한 개체의 종류를 검출 및 판별할 수 있다. 이때, 각 표적 샘플별로 얻어진 PNA 프로브의 융해온도 값은 장비의 차이로 인한 오차범위를 ± 3 ℃로 설정한 뒤, 이의 범위 내에 포함되는 결과값을 갖는 시료를 전술한 결과와 동일한 종임을 확인할 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 이에 따른 검출 방법은 전술한 개체(Amphioctopus fangsio, Amphioctopus neglectus, 모래주꾸미, Octopus minor 및 Cistopus taiwanicus)에 대해서만 특이적으로 결과 값을 나타낼 수 있다.

보다 구체적으로, 도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 두족류 조성물 및 이를 포함하는 키트를 통한 꽃게의 측정 결과가 도시된다. 그 결과, 서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해곡선이 전혀 나타나지 않았다. 즉, 발명의 일 실시예에 따른 두족류 검출용 조성물을 포함하는 키트 및 이에 따른 검출 방법은 두족류 이외의 다른 종에서는 반응하지 않아, 간섭 없이 두족류(Amphioctopus fangsio, Amphioctopus neglectus, 모래주꾸미, Octopus minor 및 Cistopus taiwanicus)에 대해서만 특이적으로 검출할 수 있다. 이에, 오차없이 정확하게 표적하고자 하는 DNA를 포함하는 개체 즉, Amphioctopus fangsio, Amphioctopus neglectus, 모래주꾸미, Octopus minor 및 Cistopus taiwanicus를 포함하는 두족류를 검출 및 판별할 수 있다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> TNS Co., Ltd <120> COMPOSITION FOR DETECTING CEPHALOPOD <130> 20PD6038KR <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 tgatctgtct ttattaca 18 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 4 ccttgccgga gca 13 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 5 gactaccact atttgtatga 20 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 6 accaggttca ctactca 17 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 7 ccttgccgga gca 13

Claims

서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 및
서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 포함하는, 두족류 검출용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 두족류는,
주꾸미 속(Amphioctopus genus), 낙지 속(Octopus genus) 및 주머니낙지(Cistopus taiwanicus) 중 적어도 하나를 포함하는, 두족류 검출용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 주꾸미 속은,
모래주꾸미(Amphioctopus aegina), Amphioctopus neglectus 및 Amphioctopus fangsio 중 적어도 하나를 포함하는, 두족류 검출용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 낙지 속은,
Octopus minor인, 두족류 검출용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 PNA 프로브는,
리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 포함하는, 두족류 검출용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 리포터는,
FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TxR(Texas Red), 시아닌(Cyanine) 계열 염료, Quasar705, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine) 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 중 적어도 하나인, 두족류 검출용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 소광자는,
답실(dimethylaminoazobenzenesulfonic acid, Dabcyl), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher), Qxl 퀀처(Qxl quencher), 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ), 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ), IRDye QC-1, 딥 다크 퀀처(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 이클립스 퀀처(ECLIPSE Quencher) 및 탐라 퀀처(TAMRA quencher) 중 적어도 하나인, 두족류 검출용 조성물.
상기 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 두족류 검출용 키트.
시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
분리된 상기 DNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 DNA 단편을 생성하는 단계;
상기 DNA 단편에 서열번호 3 내지 7의 염기서열 중 적어도 하나로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
혼성화된 상기 DNA 단편에 온도를 증가시키면서 온도별 융해 곡선을 획득하는 단계; 및
획득된 상기 융해 곡선의 융해 피크를 통하여 상기 시료의 유형을 결정하는 단계를 포함하는, 두족류의 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 두족류는,
주꾸미 속(Amphioctopus genus), 낙지 속(Octopus genus) 및 주머니낙지(Cistopus taiwanicus) 중 적어도 하나를 포함하는, 두족류의 검출 방법.
제 10항에 있어서,
상기 주꾸미 속은,
모래주꾸미(Amphioctopus aegina), Amphioctopus neglectus 및 Amphioctopus fangsio 중 적어도 하나를 포함하는, 두족류의 검출 방법.
제 10항에 있어서,
상기 낙지 속은,
Octopus minor인, 두족류의 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 융해 곡선은
FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)에 의하여 형광세기를 측정하며 온도 대비 형광 값을 분석하여 수득된, 두족류의 검출 방법.
제 13항에 있어서,
상기 형광세기는,
45℃ 내지 85℃로 온도를 증가시키면서 측정되는, 두족류의 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 시료의 유형을 결정하는 단계는,
상기 융해피크가 56℃ 내지 73℃에서 관찰되는 경우,
상기 시료를 두족류인 것으로 결정하는, 두족류의 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 시료의 유형을 결정하는 단계는,
상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 60℃ 내지 66℃에서 관찰되는 경우,
상기 시료를 Amphioctopus fangsio인 것으로 결정하는, 두족류의 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 시료의 유형을 결정하는 단계는,
상기 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 61℃ 내지 67℃에서 관찰되는 경우,
상기 시료를 Amphioctopus neglectus인 것으로 결정하는, 두족류의 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 시료의 유형을 결정하는 단계는,
상기 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 67℃ 내지 73℃에서 관찰되는 경우,
상기 시료를 모래주꾸미인 것으로 결정하는, 두족류의 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 시료의 유형을 결정하는 단계는,
상기 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 65℃ 내지 71℃에서 관찰되는 경우,
상기 시료를 Octopus minor인 것으로 결정하는, 두족류의 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 시료의 유형을 결정하는 단계는,
상기 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브에 의한 융해피크가 59℃ 내지 64℃에서 관찰되는 경우,
상기 시료를 Cistopus taiwanicus인 것으로 결정하는, 두족류의 검출 방법.