KR20190086333A

KR20190086333A - 두족류 분석용 프라이머 세트 및 이를 이용한 정성 및 정량적 분석 방법

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Publication number: KR20190086333A
Application number: KR1020180025365A
Authority: KR
Inventors: 김현우; 김은비
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2019-07-22
Also published as: KR102017236B1

Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 두족류 분석 또는 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물, 상기 두족류 분석용 조성물을 포함하는 두족류 분석용 키트, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 두족류 분석 방법 및 두족류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법에 관한 것이다. 기존의 형태학적 분석과는 달리 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용하면 두족류 플랑크톤을 따로 분리하지 않더라도 혼재된 샘플에서 높은 특이성으로 두족류를 분류할 수 있다. 또한 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용할 경우, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 두족류에 대한 정성적·정량적 분석을 경제적이고 신속하게 대량으로 분석할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 두족류, 두족류의 산란장 및 성육장 조사 및 해양 생태계 조사, 먹이 생물 분석, 생태계 교란 및 외래 유입종에 대한 분석 등과 가공식품의 원재료 분석에도 사용이 가능하며 대규모 수산생물의 유통의 원산지 및 동정에도 이용이 가능하다. 또한 기존의 두족류 분석용 유전자 라이브러리를 이용할 수 있을 뿐 아니라, 새로운 두족류 분석용 유전자 라이브러리를 구축함으로 좀 더 정확한 두족류의 종 동정에 이용할 수 있다.

Description

두족류 분석용 프라이머 세트 및 이를 이용한 정성 및 정량적 분석 방법{The primer set for analysis of cephalopods and methods for their qualitativeand quantitative analysis}

본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 두족류 분석 또는 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물, 상기 두족류 분석용 조성물을 포함하는 두족류 분석용 키트, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 두족류 분석 방법 및 두족류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법에 관한 것이다.

우리나라는 삼면이 바다로 둘러싸여 있으며 다양한 형태의 저류지와 하천이 발달되어 총 1,186종의 자생어류가 서식하고 있다(국립생물자원관, 2011). 이중, 두족류는 어류의 주된 먹이 중 하나로써 해양의 다양한 서식처에 광범위하게 분포하며 오징어나 문어, 낙지와 같은 상업적으로 유용한 다수의 종들을 포함하고 있다. 특히, 유엔 식량농업기구(FAO) 에서 조사한 세계 주요국의 수산물 섭취량 보고서(2016) 에 따르면 한국 소비자들은 연간 1 인당 58.4 kg 의 수산물을 섭취한다고 보고되었으며 이는 노르웨이 (53.3 kg) 나 일본 (50.2 kg) 보다 더 높은 수준인 것으로 나타났다. 게다가 2025년에는 한국 소비자들의 수산물 섭취가 약 10 % 가량 더 증가할 것으로 예상된다고 보고된 바 있다. 우리나라에서 여러 수산물 중 가장 선호도가 높은 것은 고등어로 나타났으며 오징어나 문어 등의 두족류 또한 선호도가 3번째로 높은 것으로 나타났다.

상기 두족류와 같은 상업종의 자원 관리를 위해서는 산란장의 환경 조건이나 알의 부화율 이외에도 유생 분포를 파악하는 것이 중요하다. 또한 유생 분포 연구에 대한 전반적인 이해는 종에 대한 생물 생태학적 특성을 이해하는데 도움이 될 뿐만 아니라, 자원의 변화를 예측함으로써 어황에 대한 기본 자료를 제공할 수 있다. 그러나 한국 주변 해역에 서식하는 두족류의 유생 분포 특성에 대한 연구는 샘플링과 그에 따른 형태학적 동정의 어려움으로 인해 많이 부족한 실정이다.

과거 형태학적인 분류 특징을 이용한 종 분석이 주로 이루어져 왔으나 최근에는 DNA 마커를 이용한 종 검정이 본격화되고 있다. 분자학적 기법의 발달로 그 중에서도 Sanger sequencing을 이용한 분석법이 많이 시행되고 있으나, 이 분석법은 특정 두족류 분류군에 한정되어 모든 두족류 분류군에 대한 분석이 어렵다는 단점이 있다.

두족류를 분류하기 위해서 과거 형태에 기초한 종 동정, 특히 어란이나 자어의 경우 종 동정의 핵심이 불명확하여 어려움이 많았다. 그러나, 최근 NGS (Next generation sequencing)와 같은 분자동정기법이 개발됨에 따라 그러한 어려움이 상당 해소되었다.

생물학의 발전에 따라 생물 분류 체계에도 변화가 뒤따랐으며, DNA 염기서열을 중심으로 한 분자 형질을 이용하여 생물의 계통을 연구하는 분야를 분자계통학(molecular systematics)라고 하며 이는 전체 생물의 분류체계와 동정법에 큰 변화를 가져왔다. 그 중 DNA 기반 종 분석은 노동 또는 시간 소비가 적게 듦으로써 형태분석법과 비교하여 볼 때 유용하고 유망한 도구이다. 두족류의 경우 mitochondrial genome 염기서열의 데이터 베이스화가 잘 되어있으며, 그 중 Ribosomal DNA 유전자 영역을 종 분석에 많이 사용한다.

종래에는 기본적으로 모든 시퀀서(sequencer)는 Sanger의 dideoxyribonucleotide analog를 이용한 방식이었는데, 최근 새로운 기법의 시퀀싱 기술이 급속도로 보급되었으며, 그 중 Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능한 차세대 또는 제2세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, 2nd Generation Sequencer)가 개발되었다. 차세대 염기서열 분석법인 NGS(Next Generation sequencing)는 모든 유전자의 집합체인 유전체를 무수히 많은 조각으로 나눠 읽은 후 얻어진 염기 서열 조각을 조립하여 전체 유전체의 서열을 얻는 분석 방법이다. 해당 기술이 상용화 된 이후 관련 기술이 비약적으로 발전함에 따라 단기간 내에 많은 양의 유전체 정보를 얻게 되었고 이를 다양한 연구 분야에 활용할 수 있게 되었다. 특히 유전체 분석 비용과 시간이 점차 감소함에 따라 다양한 생명체의 유전체 분석 수요가 빠르게 증가하고 있다.

특히, 2014년 10월 '나고야 의정서'가 발표됨에 따라 자국 생물자원의 중요성 및 가치가 대두되고 있으며, 이에 따라 해양생명자원의 확보 및 보전에 대한 국가차원의 체계적인 통합관리가 필요하다. 또한, 우리나라의 '해양생태계보전 및 관리에 관한 법률(2007)'에 따르면 원시성을 유지하고 있거나 해양생물 종 다양성이 풍부한 지역 등을 해양보호구역으로 지정하여 조사, 관찰 및 관리하는 기본계획 등을 규정한 바 있다. 수산자원 생물의 관리를 위해서는 우리나라 연근해 전역에 대한 두족류 종 조성 및 어종별 산란장 및 산란기 추정에 대한 조사가 필요하다. 또한 해양보호구역과 같은 정책 수립의 일환으로, 산란 및 성육장 파악이 필요하며 이를 위해 과학적인 종 조성 파악이 시급한 실정이다.

따라서 NGS를 이용하여 상업종인 두족류를 분류 및 분석하기 위하여 DNA meta barcoding에 사용되는 많은 universal primer를 활용할 수 있지만, 분류학적으로 다앙한 생물이 혼재된 샘플에서 두족류 플랑크톤을 검출하기에는 몇 가지 문제점이 있다. 먼저 두족류는 플랑크톤 샘플 내에서 양이 매우 적기 때문에 상대적으로 양이 많은 다른 종들에 의해 검출되기 어려우며, 대부분의 범용 프라이머는 시퀀스가 잘 보존된 COI 영역을 타겟으로 하기 때문에 cross-reactivity에 의한 non-target species의 검출이 있을 수 있다. 따라서 플랑크톤 샘플에서 두족류를 높은 특이성으로 검출하기 위한 두족류-특이(cephalopod-specific, CPD-specific) 범용 프라이머 세트에 대한 필요성이 대두되고 있다.

이에 본 발명자들은 차세대 시퀀서(NGS)를 이용하여 분류학적으로 다양한 해양 생물이 혼재되어 있는 동물 플랑크톤 샘플에서 두족류만을 분류하기 위해 연구한 결과, Illumina Miseq sequencer로 분석이 가능한 최적화된 길이(465-471bp)의 신규한 두족류 분류용 범용 프라이머 세트를 디자인하였고 이를 이용하여 증폭된 DNA 서열을 Illumina Miseq sequencer로 분석한 결과, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 두족류를 경제적이고 신속하며 대량으로 분류(classification)하며 정성적 분석뿐 아니라 정량적 분석이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 두족류 분석 또는 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물, 상기 두족류 분석용 조성물을 포함하는 두족류 분석용 키트, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 두족류 분석 방법 및 두족류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 두족류 분석용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 두족류 분석용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 샘플의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 단계; 를 포함하는 두족류 분석 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 두족류 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 샘플의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 단계; 를 포함하는, 두족류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법을 제공한다.

기존의 형태학적 분석과는 달리 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용하면 두족류 플랑크톤을 따로 분리하지 않더라도 혼재된 샘플에서 높은 특이성으로 두족류를 분류할 수 있다. 또한 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용할 경우, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 두족류에 대한 정성적·정량적 분석을 경제적이고 신속하게 대량으로 분석할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 두족류, 두족류의 산란장 및 성육장 조사 및 해양 생태계 조사, 먹이 생물 분석, 생태계 교란 및 외래 유입종에 대한 분석 등과 가공식품의 원재료 분석에도 사용이 가능하며 대규모 수산생물의 유통의 원산지 및 동정에도 이용이 가능하다. 또한 기존의 두족류 분석용 유전자 라이브러리를 이용할 수 있을 뿐 아니라, 새로운 두족류 분석용 유전자 라이브러리를 구축함으로 좀 더 정확한 두족류의 종 동정에 이용할 수 있다.

도 1은 분석을 위한 샘플을 추출한 한국 해역의 258개의 정점을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 범용 프라이머 세트를 이용하여 해양 생물이 혼재된 샘플에서 두족류만을 특이적으로 검출할 수 있는지 여부를 확인한 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 2016년 월별 난자치어 샘플에서 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 확인한 두족류 조성을 그래프로 나타낸 도이다.
도 4는 CPD 범용 프라이머 세트를 이용한 한국 해역 내 두족류를 계통학적으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 두족류 우점종 3종에 대한 월별 표준 단상형(haplotype)을 분석하기 위한 단상형간 비율의 분석한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 두족류 분석용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 두족류 미토콘드리아 DNA의 사이토크롬(cytochrome) b와 ND6 영역을 타겟으로 하여, 두족류나 갑각류 등 분류학적으로 다양한 해양 생물이 혼재되어 있는 동물플랑크톤 샘플에서 미량으로 존재하는 두족류만을 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 증폭된 PCR 산물이 차세대 시퀀서(NGS)를 이용하여 두족류를 분류하기 위해 최적 크기의 비교 서열을 얻을 수 있도록 서열을 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 300bp 내지 600bp의 PCR 산물을 증폭할 수 있고, 더욱 바람직하게는 465 내지 471 bp의 PCR 산물을 증폭하여 NGS에 최적화 될 수 있다. 300bp 내지 600bp의 유전자를 증폭하는 경우, 기존의 증폭 방법 대비 더 긴 서열의 분석이 가능하여 종 분석의 정확도가 증가될 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 샘플 중에 존재하는 다양한 종의 두족류의 유전자를 공통적으로 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 1 내지 100종의 두족류의 유전자를 증폭할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 70종의 두족류의 유전자를 증폭할 수 있다. 본 발명에 있어 증폭 대상 두족류는 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 하기 표 1에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

[표 1]

본 발명의 프라이머 세트는 차세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, NGS) 분석용도에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 Cephalopoda(두족강)를 제외한 어떠한 다른 분류군의 서열도 증폭하지 않는다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 데이터베이스 부족으로 인한 unidentified를 제외하고, 전체 서열의 87 % 이상이 종(species) 수준, 0.8 %가 속(genus) 수준으로 식별되면서 종 확인을 위한 충분한 종 내 variation을 포함하여 두족류를 진단 가능한 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 표준 단상형(haplotype)을 분석할 수 있으며, 두족류의 종류, 두족류의 비율, 및 두족류의 표준 단상형(haplotype) 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분석이 가능하다.

상기 "분석"은 "정량적 분석" 및 "정성적 분석"으로 나눌 수 있으며, 상기 "정량적 분석"은 혼합된 샘플상에서 특정 분류군이 어떤 비율을 차지하는지를 알아내는 것을 말한다. "정성적 분석"은 혼합된 샘플상에서 어떠한 생물종이 있는지 확인할 수 있음을 뜻한다.

또한 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 두족류 분석용 조성물을 포함하는 두족류 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한 본 발명은 (a) 시료의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 단계; 를 포함하는 두족류 분석 방법을 제공한다.

상기 (b) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplexPCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time QuantitativePolymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용할 수 있다.

상기 (b)단계의 증폭은 PCR을 이용하여 15 내지 30회를 반복할 수 있으며, 바람직하게는 총 28회 반복하여 수행할 수 있다. 초기 변성은 94℃에서 30초; 변성은 94℃에서 30초, 51℃에서 30초, 72 ℃에서 30초씩 28회 반복 수행하였고, 최종 연장은 72℃에서 5분간 수행 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 (c) 단계에서 증폭 산물에 대한 서열의 분석은 차세대 시퀀서(NGS)를 이용할 수 있고, 상기 NGS의 분석 장비는 사용하는 화학 반응 및 염기서열 검출 원리 등 세부 기술에 따라 고유의 특성 및 장단점에 따라 다양한 플랫폼이 출시되었고, 그 예로, Illumina MiSeq sequencer, Illumina의 HiSeq sequencer, Roche 454 GS FLX+ sequencer, Thermo Fisher사의 Ion Torrent PGM sequencer 또는 Illumina Genome Analyser IIx sequencer 등이 있다.

본 발명의 목적 상, Illumina MiSeq sequencer을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서 상기 "Illumina Miseq sequencer"는 기존의 Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능한 차세대 또는 제2세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, 2nd Generation Sequencer) 기법을 이용하는 것 중 하나이다. 상기 NGS는 DNA 서열에 대한 증폭을 하고 그 후 형광 표식 등을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기를 읽어내는 것으로, 본 발명의 Illumina Miseq sequencer는 고체상 증폭(solid-phase amplification)을 사용한다. 본 발명의 Illumina Miseq sequencer는 대용량 시퀀서인 HiSeq의 기법 (chemistry)을 그대로 유지하면서 장비의 가격이 낮고 다양한 응용성을 가지고 있어 경제적이다. 기존의 454 sequencer를 이용했을 때 하나의 cyt.b-ND6 서열을 읽는데 드는 비용이 1센트 정도이라면 본 발명에서 적용하는 Illumina Miseq sequencer는 2 x 300bp 에서 0.02 센트로 약 50배 정도의 가격 경쟁력을 가지게 된다.

상기 프라이머 세트를 이용하여 두족류 분석을 위한 두족류 DNA 유전자 풀(pool), 즉 유전자 라이브러리를 생성할 수 있다. 본 발명에서 ‘유전자 풀’은, 다수의 유전자로 구성된 유전자 집단을 말하며, 유전자 라이브러리와 상호교환하여 사용할 수 있다. 이때, 검색 대상인 유전자에서 변이 유전자의 존재 비율은 묻지 않는다. 예를 들어, 100%가 야생형 유전자일수 있고, 50%가 야생형 유전자이고 나머지 50%가 변이 유전자일 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 1 내지 100종의 두족류의 유전자를 공통적으로 증폭함으로써, 두족류 분석을 위한 두족류 DNA 유전자 라이브러리를 효과적으로 형성하고 이를 이후 차세대 시퀀서를 이용한 분석 등에 사용할 수 있도록 할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. CPD 범용 프라이머 세트의 제작 및 두족류 종 분석 가부 확인

1.1 샘플의 채집 및 DNA 추출

2016년 한국 해역의 258개의 정점에서 봉고 네트 (333 ㎛)를 이용하여 채집된 총 739개의 동물플랑크톤 샘플을 사용하였으며, 샘플을 채집한 정점을 도 1에 나타내었다. 알코올로 고정된 상기 채집된 샘플을 흐르는 물에 충분히 탈수 시켜준 후 전체 습중량의 1/2 무게에 대한 6배의 1X Lysis buffer를 넣어 균질화한 뒤 샘플의 genomic DNA를 추출하였다.

1.2 CPD 범용 프라이머 세트의 설계

두족류를 분석하기 위하여 프라이머 세트를 디자인하였다. 비교하는 서열이 길면 길수록 더 많은 종, 혹은 개체군의 비교가 가능하기 때문에 Illumina Miseq sequencer를 이용한 최대의 길이를 확보하는 것이 중요하다. 따라서 Miseq 분석 시스템의 최대 판독 서열은 600 bp (300 + 300)인 바, 약 300~600 bp로 증폭하는 프라이머 세트에 대하여 두족류만을 특이적으로 분류 및 검출할 수 있는 영역을 찾았다. 구체적으로, 두족류 특이적 범용 프라이머를 디자인하기 위해 시퀀스 데이터를 이용하여, 두족류를 특이적으로 검출할 수 있는 두족류의 분류학적 위치 및 종을 분류하기에 충분한 매우 가변적인 미토콘드리아 DNA의 cytochrome b와 ND6 영역을 증폭하도록 CPD 범용 프라이머 세트를 설계하였다. 설계된 프라이머 세트를 서열번호 1 및 2로 나타내었다.

1.3 CPD 범용 프라이머 세트를 이용한 두족류의 진단

그리고 상기 실시예 1.2에서 설계한 프라이머 세트를 사용하면 타겟인 두족류의 종을 보다 높은 분류학적 수준으로 진단할 수 있는지를 확인하기 위하여, 기존의 프라이머 세트인 16Sar, 16Sbr(Simon et al., 1994)과 본 발명의 프라이머 세트인 CPD 범용 프라이머 세트 간 샘플 내 두족류의 진단 수준을 측정하는 실험을 수행하였다. 상기 두쌍의 프라이머 세트의 종 간 유전적 거리를 계산하였으며, 이를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

표 2에서 나타난 바와 같이, 16Sar 및 16Sbr 프라이머 세트는 분석할 수 있는 두족류의 목(order), 과(family), 속(genus)의 평균 수준이 각각 0.084±0.012, 0.081±0.012, 0.083±0.011로 나타났으며, 본원 발명의 프라이머 세트 지역은 차례대로 0.131±0.015, 0.127±0.015, 0.116±0.014로 나타나는 것을 확인하였다. 평균 유전적 거리 값을 측정한 결과, 본원 발명의 프라이머 세트의 종 간 변이가 기존의 16S rRNA 영역보다 높은 것을 확인하였다. 따라서, cytocrome b 영역을 타겟으로 증폭하는 본원 발명의 프라이머 세트가 두족류 내의 종 간 식별을 우수한 수준으로 가능케 하는 것을 확인하였다.

실시예 2. CPD 범용 프라이머 세트의 특이성 평가

상기 실시예 1.2에서 디자인한 프라이머 세트의 두족류에 대한 특이성과 효율성을 평가하기 위해 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 3분, 94 ℃에서 30 초, 51℃ 에서 30초, 72 ℃에서 30초로 하는 사이클로 28회를 반복하였고, 마지막으로 72 ℃에서 5분을 두었다. Template는 두족류 플랑크톤 개체와 2016 년 한국 해역에서 채집된 난자치어 샘플의 각 genomic DNA 200ng을 사용하였다. CPD 범용 프라이머 세트 1 ㎕, 2 ㎕의 dNTPs(10 mM), 0.2 ㎕ 의 Ex Taq Hot Start Version(Takara Bio Inc. Japan), 2 ㎕의 10X Ex Taq buffer(TakaraBio Inc. Japan), 1 ㎕의 DMSO를 혼합하여 3차 증류수로 최종 볼륨을 20 ㎕에 맞춰 PCR을 수행하였다. 이후 PCR product를 AccuPrep Gel PurificationKit (Bioneer. Korea)를 이용하여 정제한 후, 시퀀스를 얻어 염기서열 분석을 진행하였으며, 4개의 두족류 플랑크톤 개체와 4개의 혼합된 동물플랑크톤 샘플에 대하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 PCR product를 1.5% 아가로스 겔에 두고 전기영동을 수행하였고, 이를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용하면 4개의 두족류 플랑크톤 개체와 4개의 혼합된 동물플랑크톤 샘플에서 모두 길이가 일정한 하나의 특이적인 amplicon이 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 시퀀싱을 분석한 결과 레인 1번과 2번은 살오징어(Todarodes pacificus), 3번과 4번은 좀귀오징어(Sepiola birostrata)로 나타났으며, 5번 내지 6번 레인의 동물플랑크톤 샘플에서는 좀귀오징어가 69%, 살오징어가 24%, 매오징어(Watasenia scintillans)가 1%를 차지하는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용하면 해양 생물이 혼재된 샘플에서 두족류만을 특이적으로 검출할 수 있으며, 또한 샘플을 구성하는 두족류의 종의 분석이 가능하여 혼재된 샘플 내에서 두족류만의 정성 및 정량적 분석이 가능함을 확인하였다.

실시예 3. 대용량 염기서열 분석 ( NGS )을 통한 한국 해역에 서식하는 두족류의 종 다양성 확인

3.1 CPD 범용 프라이머 세트를 이용한 한국 해역 내 두족류의 종 월별 종 다양성의 진단

본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용하여 한국 해역에 서식하는 두족류의 종 다양성을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 1차 PCR 조건은 94 ℃에서 3분, 94 ℃에서 30 초, 51℃ 에서 30초, 72 ℃에서 30초로 하는 사이클로 28회를 반복하였고, 마지막으로 72 ℃에서 5분을 두었다. 또한 PCR은 2016 년에 채집된 난자치어 샘플의 genomic DNA 200 ng과 각 1 ㎕, CPD 범용 프라이머 세트 1 ㎕, 2 ㎕의 dNTPs(10 mM), 0.2 ㎕ 의 Ex Taq Hot Start Version(Takara Bio Inc. Japan), 2 ㎕의 10X Ex Taq buffer(TakaraBio Inc. Japan), 1 ㎕의 DMSO를 혼합하여 3차 증류수로 최종 볼륨을 20 ㎕에 맞춰서 수행하였다. 이후 PCR product를 AccuPrep Gel PurificationKit (Bioneer. Korea)를 이용하여 정제하고, 2차 PCR에 사용하였다. 2차 PCR 온도조건을 annealing 온도 55℃를 제외하고 1차 PCR과 조건을 동일하게 하여 PCR을 수행하였으며, 15회 반복하여 증폭하였다. 이후, 증폭하여 수득한 PCR product는 1.5% 아가로스 겔 전기영동 후 겔을 잘라 AccuPrep　 Gel PurificationKit (Bioneer, Korea) 로 정제하였다. MiSeq 플랫폼 (lllumina. USA)을 사용하여 염기서열 분석하기 위해 Nextera XT index Kit(lllumina, USA)를 사용하여 라이브러리를 제작하였으며 lllumina MiSeq (2 X 300 bp pair-ends)를 사용하여 염기서열 분석을 수행하였다. BLASTn 검색은 NCBI nt 데이터베이스를 이용하였고, 99 % 이상의 염기서열 동일성을 갖는 OTU의 경우 종(species)으로 지정하고, 90 %에서 98 % 사이의 염기서열들은 속 (genus)으로 지정하였다. 90 % 미만의 염기서열 동일성을 갖는 OTU는 "미확인(unidentified)"으로 지정하였다. 상기 염기서열 분석 수행한 결과를 표 3 및 도 3에 나타내었다.

[표 3]

표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이, NGS를 이용하여 시퀀싱을 수행한 결과, 월별 난자치어 샘플에서 6개의 과 수준, 10개의 속 수준, 6개의 종 수준으로 두족류를 분석할 수 있었다. 전체적으로 매오징어의 비율이 전체의 65 %로 높게 나타났으며, 16 %의 좀귀오징어, 9 %의 살오징어 순으로 비율이 나타나 국내 해역에 상기와 같은 비율로 두족류가 존재하고 있음을 확인하였다. 작은 꼴뚜기(Loliolus uyii)는 8월에만 나타났으며, 8월이 종 다양성을 나타내는 Shannon-Wiener index 지수가 1.271로 가장 높아 다양한 두족류 종이 서식하는 달임을 확인하였다. 상기와 같은 결과로, 분류학적으로 다앙한 생물이 혼재된 샘플에서 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용하면 cross-reactivity없이 한국 해역에 서식하는 두족류의 종 다양성 분석이 가능함을 확인하였다.

3.2 CPD 범용 프라이머 세트를 이용한 한국 해역 내 두족류의 계통학적 분석

상기 실시예 3.1에서 분석한 종 다양성을 기초로 한국 해역 내 존재하는 두족류의 데이터베이스 구축을 위하여 두족류를 계통학적으로 분석하였다. 월별로 분석한 샘플의 전체 contig의 10 % 이상을 차지하는 genotype을 표준 OTU로 선정하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였으며, 이를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용하면 총 50개의 표준 OTU를 각 분류군에 따라 두족류를 총 7개 과와 상기 과의 하위 속 및 종으로 구분하여 분석할 수 있음을 확인하였다.

3.3 CPD 범용 프라이머 세트를 이용한 한국 해역 내 두족류 우점종 3종에 대한 단상형( haplotype ) 진단

한국 해역 내 주요 두족류 우점종 3종에 대하여 월 별로 어떤 haplotype이 표준 haplotype인지 확인하기 위하여 본 발명의 CPD 프라이머 세트를 이용하여 그 비율을 분석하였다. 표준 haplotype은 우점종 3종에 대해 월별로 분석한 샘플의 전체 contig의 10 % 이상을 차지하는 genotype을 표준 haplotype으로 선정하였으며, 그 월별 비율을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 살오징어 (Todarodes pacificus)의 경우 11월에는 하나의 표준 haplotype만을 가지는 것으로 나타났고, 또한 11월의 genotype들은 다른 달과는 뚜렷이 구분되면서 11월의 population이 다른 달의 population과는 확연하게 차이가 나는 것을 확인하였다. 또한 매오징어 (Watasenia scintillans)의 경우 표준 haplotype이 5종으로 가장 다양한 표준 haplotype이 나타나는 것을 확인하였다. 좀귀오징어 (Sepiola birostrata)의 경우, 표준 haplotype 2가 6월에 70%정도 차지하였으며, 11월에는 표준 haplotype 3이 특이적으로 많이 차지하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기와 같은 결과를 바탕으로 본원 발명의 CPD 범용 프라이머 세트를 이용하면 두족류에 있어 특정 기간의 두족류에서 표준 haplotype까지 분석할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

상기 실험으로부터 본원 발명의 CPD 범용 프라이머 세트는 두족류의 목, 과, 속, 종 수준까지 분석이 가능하며, 다수의 종이 혼재되어 있는 샘플로부터 두족류만을 특이적으로 검출함과 동시에 샘플 내에 포함된 양까지 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 CPD 범용 프라이머 세트는 두족류의 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물로 이용할 수 있으며, 동시에 두족류에 관하여 유전적 다양성의 연구에 활용될 수 있음을 확인하였다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> The primer set for analysis of Cephalopoda and methods for their qualitative and quantitative analysis <130> 1-49P <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of cephalopod-specific universal primer set <400> 1 gayatytgnc cycadgg 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of cephalopod-specific universal primer set <400> 2 atttgytayt aytgtgangg 20

Claims

서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 두족류 분석용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 두족류의 미토콘드리아 DNA의 사이토크롬 비(cytochrome b) 및 ND6(NADH dehydrogenase subunit6)영역을 증폭하는 것을 특징으로 하는, 두족류 분석용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 300 내지 600bp의 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는, 두족류 분석용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 1 내지 100종 두족류의 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 두족류 분석용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 하기 표 1에서 선택된 1종 이상의 두족류 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 두족류 분석용 조성물.
[표 1]
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 차세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, NGS) 분석용인 것을 특징으로 하는, 두족류 분석용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분석은 샘플 내 두족류의 종류, 두족류의 비율, 및 두족류의 표준 단상형(haplotype) 분석으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 두족류 분석용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 두족류 분석용 키트.
(a) 샘플의 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 단계; 를 포함하는 두족류 분석 방법.
제9항에 있어서, 상기 (c)단계의 분석은 차세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, NGS)를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 두족류 분석 방법.
서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 두족류 분석을 위한 유전자 라이브러리 제작용 조성물.
(a) 샘플의 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 단계; 를 포함하는, 두족류 분석용 유전자 라이브러리 제작 방법.