KR101737314B1 - 큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 - Google Patents

큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 큰징거미새우 노다바이러스(Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus, MrNV)의 특정 핵산을 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)을 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 큰징거미새우 노다바이러스를 검출하거나 새우의 상기 바이러스의 감염 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 간단신속정확하게 검출함으로써, 새우 양식에 가장 큰 위협으로 인식되고 있는 상기 바이러스의 감염 및 확산을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.

Description

큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법{Genetic Marker for Dectecting Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus, and Method for Detecting Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus Using the Same}
본 발명은 흰꼬리병(white tail disease)의 원인바이러스중 하나인 큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 큰징거미새우(Macrobrachium rosenbergii)에 감염하는 큰징거미새우 노다바이러스(Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus, MrNV)의 특정 핵산을 증폭시킨 다음, 증폭산물을 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)을 혼성화시키고, 혼성화된 산물의 온도 조절을 통해 온도별 융해곡선을 얻고, 상기 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 큰징거미새우 노다바이러스를 검출하거나 새우의 상기 바이러스의 감염 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
새우류는 전 세계 수산물 교역 물량의 17%를 차지하며, 새우 생산량의 75%를 양식에 의존하고 있다 (FAO, 2009). 세계적으로 새우 양식 산업이 크게 성장하였음에도 불구하고, 질병 발생에 의한 손실 또한 계속적으로 증가하여 실제로 1994년부터 새우류의 바이러스성 질병에 의한 손실이 매년 30억 달러 ($US) 이상으로 집계되고 있다.
특히 최근 들어 아시아를 비롯한 전 세계적으로 신종질병 및 바이러스성 질병으로 인한 피해가 커짐에 따라 새우양식 생산량이 크게 감소하는 등 심각한 문제가 발생하고 있어 (Walker and Mohan, 2009; Tran et al., 2013), 각국의 양식 산업 및 수서 생태계 보호를 위한 검역 및 방역의 역할이 날로 증가하고 있다.
새우류의 OIE 지정 질병 및 수산생물질병관리법 지정 질병 중 향후 국내 유입 또는 발병 시 예상되는 파급 영향이 크고 최근 국제적으로 관심이 높은 전염병인 흰꼬리병 (White Tail Disease, WTD)이 있다.
큰징거미새우인 마크로브라키움 로젠베르기(Macrobrachium rosenbergii)는 경제성이 우수한 양식 갑각류이다. 마크로브라키움 로젠베르기에 발병하는 흰꼬리병은 1995년 과들루프 섬에서 처음 확인되고, 이후 마르티니크 섬(프랑스 서인도제도)에서 추가적으로 확인되었으며, 이후 대만과 중국에서도 확인되고, 최근에는 인도에서 발병이 확인되었다. 이처럼 흰꼬리병이 급속히 확산됨에 따라 양식 중인 마크로브라키움 로젠베르기가 높은 폐사율을 나타내고 그 결과, 심각한 경제적 손실이 야기되었다.
흰꼬리병은 국내 미발생 전염병으로서 제2종 수산생물전염병으로 지정되어 방역조치가 필요적인 법정전염병으로 분류되고 있어서, 국내유입 차단을 위해 중점적으로 모니터링이 필요한 질병이다.
흰꼬리병을 발병시키는 병원체로 큰징거미새우 노다바이러스(M. rosenbergii Noda Virus, MrNV)와 엑스트라 스몰 바이러스(Extra Samll Virus, XSV)로 일컫는 작은 바이러스 유사 입자와 연관되어 있음이 보고되었다.
흰꼬리병의 심각성으로 인해 흰꼬리병을 유발시키는 바이러스의 신뢰할 수 있는 검출 방법이 필요한 실정이나, 흰꼬리병은 현재 새우 꼬리의 흰색 계열의 착색에 의해 진단되고 있어 진단의 신뢰도가 떨어지는 문제점이 있다.
현재 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 진단하기 위한 방법 중 분자진단을 사용한 진단 방법 및 키트 등이 개발되어 있으며 일반적인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법을 수행한 다음, 상기 반응의 증폭산물을 전기영동법으로 확인하거나, 형광 프로브 또는 SYBR Green을 이용하여 Real-time PCR법 등으로 확인하는 방법이 주로 사용되고 있다.
특히, 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 진단하기 위해서는 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE) 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code)의 기준에 따른 일반적인 종래 PCR(conventional PCR)법을 수행하여 PCR 증폭산물을 전기영동으로 확인한 다음, 증폭산물을 클로닝하고 다시 정제된 플라스미드 DNA의 염기서열을 Sanger sequencing 등의 방법을 통하여 확인하는 작업을 거치고 있어, 절차가 복잡하고 질병진단을 위한 분석에 많은 시간이 소모되는 단점이 있다.
또한, OIE 기준에 따라서 PCR 증폭산물의 전기영동 확인 시 객관적인 분석이 불가능하거나(gray zone), 희미한 PCR 증폭산물을 클로닝 벡터를 이용하여 클로닝한 후 시퀀싱을 통하여 상기 증폭산물의 염기서열을 재확인하는 등의 검증 단계를 거친다. 이러한 검증 단계는 비특이적 산물(non-specific PCR band)의 서열을 확인하여 검증하는 방식으로 분석 절차가 많고 많은 시간을 소모하는 등의 문제점을 가지고 있다. 특히, 종래 PCR법에 의해 증폭산물이 양성으로 확인되면(시퀀싱 판정 이전), 수산생물전염병의 감염이 우려되는 경우에 해당되어 방역조치를 취하게 됨에 따라, 이후 시퀀싱에 따라 위양성으로 판정되는 경우 검사기관의 신뢰성 하락 및 어업인의 피해 발생 사례도 있으므로, 신속,정확하게 법정 전염병을 진단하는 방법의 개선이 절실하다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 판별 및/또는 검출용 유전자 마커를 발굴하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 증폭 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 간단·신속·정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 검출용 유전자 마커, 및 PNA 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 검출용 프라이머 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시킨 다음, 생성된 유전자 마커 서열단편에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키고, 상기 PNA 프로브의 혼성화에 따른 Tm값을 얻어 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 감염 여부를 확인하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 유전자 마커를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 염기서열을 주형(template)으로 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;
(c) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 검출하는 단계
를 포함하는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 유전자 마커를 선정하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산 및 프라이머를 이용하여 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 간단·신속·정확하게 검출함으로써, 새우 양식에 가장 큰 위협으로 인식되고 있는 상기 바이러스의 감염 및 확산을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 종래 사용되던 MeltingArray 방법과 본원발명에 따른 MeltingArray 방법의 각 단계별 기술적 특징을 나타내는 개념도이다.
도 2는 종래 사용되던 MeltingArray 방법에 비해 본원발명에 따른 MeltingArray 방법에 의해 발휘되는 효과를 비교한 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 유전자 마커, 프라이머 및 펩티드핵산을 포함하고 있는 공통서열(Consensus Sequence)을 나타낸 것이다.
도 4는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 OIE 기준에 따른 검출용 PCR법으로 도출된 증폭산물의 전기영동 결과이다.
도 5는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 프라이머 및 펩티드핵산을 이용한 바이러스 검출 방법에 따른 증폭곡선과 융해곡선 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 OIE 기준에 따른 검출용 PCR법에 따른 바이러스 검출 결과와 본원발명의 프라이머 및 펩티드핵산을 이용한 바이러스 검출 결과의 민감도를 비교한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자들은 세계동물보건기구(World Organization for Animal Health, OIE)의 수생동물위생규약(Aquatic Animal Health Code) 기준에 따른 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 특정 유전자 마커에 대한 PCR 산물의 특이/비특이적 증폭여부를 시퀀싱 단계 없이 또는 시퀀싱 단계 전에 검출하고, 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 새우)를 검출하는 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 특이적 염기서열을 가지는 마커 및 상기 마커에 대응되는 바이러스 검출용 프라이머 및 펩티드핵산 프로브(peptide nucleic acid probe, PNA probe)를 이용하여 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 간단·신속·정확하게 검출할 수 있게 되었다.
더욱 상세하게 설명하면, (1) 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 검출할 수 있는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 특이적인 검출용 PNA 프로브(서열번호 3) 및 프라이머(서열번호 2)를 포함하는 올리고머 혼합물(oligomer mixture); 및 (2) 상기 프라이머를 이용하여 생성된 PCR 증폭산물을 주형으로 단일가닥 DNA를 생성하고 상기 단일가닥에 상기 PNA 프로브를 혼성화시키기 위한 SSG 버퍼(single strand generation buffer);를 포함하는 조성물 또는 키트(MeltingArray 포함)를 이용하여 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)을 검출할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 검출용 유전자 마커에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 검출용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)이란 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로, 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었으며, 자연계에서는 발견되지 않아 화학적인 방법으로 인공 합성될 수 있다.
PNA는 LNA(Locked nucleic acid) 또는 MNA(Mopholino nucleic acid)와 같이 유전자 인식물질의 하나로, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는 장점이 있다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.
PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, PNA는 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다
또한, DNA-DNA 결합력보다 PNA-DNA 결합력이 매우 우수하여 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide miss match)에도 10~15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(Single-nucleotide polymorphism) 및 In/Del의 뉴클레오티드(nucleotide)의 변화를 검출(detection)할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 PNA 염기서열의 길이는 특별히 제한되지는 않지만, 바이러스 종류에 따른 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP))이 포함되도록 12~18mer 길이로 제작할 수 있다. 이 때, PNA 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 PNA 프로브를 디자인할 수도 있고, 같은 길이의 PNA 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm값을 조절하는 것도 가능하다. 또한, PNA 프로브는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 염기변이 또는 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM(High Resolution Melt) 방법에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 염기변이 또는 SNP가 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 PNA 프로브의 서열과 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.
본 발명에서와 같이, PNA 프로브가 12개의 염기서열을 포함하는 경우에는, 가운데 염기서열 중 하나 이상의 위치에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 가지는 것이 바람직하다. 또한, PNA 프로브는 염기서열의 가운데 부분에 바이러스의 염기변이 또는 SNP 부위에 상응하는 서열을 포함하여 구조적인 변형을 가질 수 있고, 이를 통해 완전한 혼성화를 이루는 표적 핵산(perfect match)과의 융해온도(Tm) 차이를 더욱 크게 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 프라이머, 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
상기 키트를 이용하면, PNA 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 검출이 가능하다.
본 발명자들은 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)에 대하여 OIE 기준에 따른 검출용 PCR 산물에 상응하는 유전자 염기서열을 비교 분석하여, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 검출용 프라이머를 이용하여 합성된 단일가닥의 PCR 증폭산물에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시켜 얻은 융해곡선으로부터 융해온도(Tm)를 확인하여 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출하고 상기 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
(b) 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 유전자 염기서열을 주형(template)으로 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;
(c) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 검출하는 단계;를 포함하는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 단일가닥의 유전자 마커 서열단편은 단일가닥 형성용 버퍼(single strand generation buffer, SSG buffer)를 추가로 첨가하여 생성시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단일가닥 형성용 버퍼는 DNA 중합효소, dNTPs(deoxynucleotides) 및 안정제(Stabilizer)를 함유할 수 있고, 여기서, DNA 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서는 종래 프라이머 쌍을 이용하여 상기 유전자 마커 염기서열을 증폭하고, TaqMan 프로브를 추가로 포함시켜 증폭곡선을 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)방법으로 수행할 수 있다.
본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 새우 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는, 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열(염기변이 또는 SNP 포함)을 의미하며, 생리·생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 변성(염기변이 또는 SNP 포함) 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.
본 발명의 '염기변이'는 표적 핵산의 염기서열에 변이가 일어난 것으로, 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 PNA 프로브는 표적 핵산의 SNP 또는 표적 핵산의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것을 융해곡선 분석을 통해 분석할 수 있다.
본 발명의 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)의 형광 물질이 결합할 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, Cy3 및 Cy5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl(FAM-labeled)을 사용할 수 있다.
PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.
PNA 프로브를 이용한 특정 염기서열(예컨대, 염기변이 또는 SNP) 분석을 위해서는 우선 특정 염기서열을 인식하는 염기(들)가 포함된 프로브와 PCR을 위한 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍: OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따름) 및 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 유전자 마커 염기서열을 주형(template)으로 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 프라이머만 있으면 충분하다. 상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 0.5℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.
본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상(표적)의 특정 염기서열(염기변이 또는 SNP 포함)에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨다. 계속해서, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다. Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값 보다 낮으면, 미스매치, 즉 표적 DNA에 변이가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥(double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열(염기변이, SNP 포함)의 유무로 바이러스 유형의 검출 및/또는 판별이 가능하다.
도 1은 종래 사용되던 MeltingArray 방법과 본원발명에 따른 MeltingArray 방법의 각 단계별 기술적 특징을 나타내는 개념도이고, 도 2는 종래 사용되던 MeltingArray 방법에 비해 본원발명에 따른 MeltingArray 방법에 의해 발휘되는 효과를 비교한 모식도이다. 상기 도에서 나타낸 바와 같이, PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호를 발생시킬 수 있으며, 온도가 높아짐에 따라 프로브의 적정 융해온도(Tm)에서 표적 핵산으로부터 빠르게 융해되어 형광신호를 소광시킨다. 본 발명은 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여, 표적 핵산의 존재 유무 및 염기차이 유무를 검출할 수 있는 것이다. 본 발명에 따른 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적 핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이며, 표적 핵산이 존재하지 않을 경우 융해온도 (Tm) 값을 보이지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 큰징거미새우 노다바이러스 ( MrNV ) 검출용 유전자 마커 , 및 상기 바이러스에 특이적인 프라이머 및 PNA 프로브 제작
큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 특이적 유전자 마커를 도출하기 위하여 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 하기 표 1과 같은 37종의 바이러스 염기서열을 분석하였고, 분석결과를 바탕으로 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 특이적 유전자 마커를 포함하는 공통서열(Consensus Sequence)를 확보하고자 하였다. 이 때, 공통서열에 사용된 IUB code Name을 하기 표 2에 정리하였다.
NCBI No.
1 gi|34366030|gb|AY222840.1|:379-801
2 gi|158427670|gb|EU150128.1|:376-798
3 gi|158427666|gb|EU150126.1|:377-799
4 gi|395146442|gb|JQ965674.1|:346-768
5 gi|383472044|gb|JQ418298.1|:379-798
6 gi|383472040|gb|JQ418296.1|:342-761
7 gi|326307737|gb|HQ637179.1|:342-761
8 gi|305379306|gb|HM565741.1|:300-722
9 gi|158427668|gb|EU150127.1|:375-797
10 gi|284080610|gb|GU300102.1|:342-761
11 gi|158427672|gb|EU150129.1|:375-797
12 gi|262093910|gb|FJ751225.1|:379-801
13 gi|109139127|gb|DQ521575.1|:342-764
14 gi|595763587|gb|KJ000009.1|:351-771
15 gi|395146438|gb|JQ965672.1|:346-766
16 gi|395146436|gb|JQ965671.1|:346-766
17 gi|113951966|gb|AY231437.2|:379-799
18 gi|363498778|gb|JN571287.1|:1-423
19 gi|395146440|gb|JQ965673.1|:346-766
20 gi|395146444|gb|JQ965675.1|:346-766
21 gi|373159016|gb|JN619370.1|:379-801
22 gi|319739706|gb|HQ287005.1|:1-339
23 gi|209980078|gb|FJ360617.1|:1-302
24 gi|209980080|gb|FJ360618.1|:1-302
25 gi|210161188|gb|FJ379530.1|:342-682
26 gi|76262753|gb|DQ189990.1|:1-282
27 gi|329132407|gb|GU476556.1|:3-289
28 gi|329132421|gb|GU476567.1|:3-289
29 gi|329132406|gb|GU476558.1|:363-649
30 gi|329132418|gb|GU476564.1|:10-254
31 gi|329132419|gb|GU476565.1|:8-251
32 gi|329132411|gb|GU476560.1|:9-252
33 gi|329132420|gb|GU476566.1|:19-249
34 gi|329132409|gb|GU476557.1|:20-250
35 gi|329132410|gb|GU476559.1|:18-255
36 gi|363498780|gb|JN571288.1|:1-205
37 gi|77799233|emb|AM114036.1|:243-384
Mixed Base Code Name
A+G R
C+T Y
A+C M
G+T K
G+C S
A+T W
A+T+C H
G+A+T D
G+T+C B
G+A+C V
A+G+C+T N
큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 공통서열(Consensus Sequence) 분석 결과, 5'-TCACGCCTGACA-3'(서열번호 1)로 표시되는 염기서열을 확보하고, 상기 염기서열을 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 유전자 마커로 선정하였다.
또한, 상기 유전자 마커의 단일가닥 DNA 생성용 프라이머로 서열번호 2로 표시되는 프라이머 및 상기 유전자 마커의 혼성화용 프로브로 서열번호 3으로 표시되는 PNA 프로브를 제작하였다.
도 3는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 염기서열 일부와 이로부터 도출된 유전자 마커, 프라이머, PNA 프로브를 포함하는 염기서열도이고 PNA 프로브가 혼성화되는 유전자 마커 부위는 특히 파란색으로 표시하였다.
구분 서열번호 서열(5'->3') 변형
유전자 마커 서열번호 1 TCACGCCTGACA -
프라이머 서열번호 2 AGCTGTGAAACTTCCACTGG -
PNA 프로브 서열번호 3 TGTCAGGCGTGA TexasRed, Dabsyl
상기 표 3에 나타난 바와 같은 염기서열과 리포터 및 소광자로 PNA 프로브를 제작하였다. PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다. 표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.
실시예 2: 큰징거미새우 노다바이러스 ( MrNV ) 검출용 MeltingArray 키트의 최적화
실시예 1에서 제작된 PNA 프로브 및 프라이머를 이용하여, 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 핵산 샘플에 대하여 증폭곡선 및 용해곡선을 도출하였고, 이를 분석하여 PCR 산물의 검증을 수행함으로써 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출을 최적화하고자 하였다. 이때, OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따른 바이러스 검출용 프라이머 세트(종래 프라이머 쌍, 표 4)를 이용하였다.
구분 서열번호 서열(5'->3')
검출용 프라이머(F) 서열번호 4 GCGTTATAGATGGCACAAGG
검출용 프라이머(R) 서열번호 5 AGCTGTGAAACTTCCACTGG
MeltingArray 반응은 CFX96 Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, PCR 산물을 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 SSG 버퍼(single strand generation buffer) 및 프로브의 결합하는 가닥의 상보적인 방향인 단일 프라이머를 이용하였다. 상기 SSG 버퍼의 조성은 2X의 사용 농도로 nTaq-HOT(0.2 unit/㎕), nTaq-HOT buffer(4mM MgCl2 함유), dNTP 혼합물(A, T, G, C 각각 0.4mM) 및 안정제(Stabilizer)를 포함한다.
MeltingArray 반응을 위한 반응물의 조성은 표 5에 나타내었다. MeltingArray 키트의 master mix을 만든 후 상기 PCR 산물을 1~3㎕ 첨가하여 분석을 수행하였다.
조성 용량
2X SSG 버퍼 10㎕
Oligomer mix (PNA 프로브, 프라이머) 1.5㎕
주형(Template, PCR 산물) 1~3㎕
증류수 up to 20㎕
표 6은 반응물의 혼성화 반응 조건을 나타낸 것으로, PCR 산물로부터 단일가닥 DNA을 형성하는 단계, 변성 단계, 및 PNA 프로브를 혼성화하고, 상기 혼성화된 산물의 온도를 높이는 과정을 나타낸 것이다.
단계 온도(℃) 반응시간 및 사이클
단일 가닥 형성
(Single Strand Generation)		 95 10 min
95 30 sec
15-20 cycle
55 1 min
76 1 min
변성(Denaturation) 95 1 min
프로브 결합
(Probe binding)		 75 30 sec
55 30 sec
융해(Melting) 45 to 90 Increment 1.0℃, 5 sec (TexasRed)
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, PNA 프로브를 이용한 융해곡선 분석으로 63~69℃의 Tm값에서 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 큰징거미새우 노다바이러스 ( MrNV ) 검출용 MeltingArray 키트의 민감도 확인
OIE(Office of International Epizootics, 세계동물보건기구) 기준에 따른 바이러스 검출용 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물을 각각 1, 0.5, 025. 0.125 ㎕씩 2% 아가로오스 겔에 로딩하여 전기영동하고, 이를 MeltingArray 키트로 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 아가로스 겔에 전기영동 했을 때 band 확인이 가능한 0.25㎕까지 PNA 프로브를 이용한 융해곡선으로 명확한 융해피크를 나타내어 본원발명에 따른 MeltingArray 키트의 민감도를 확인할 수 있었고, 아가로오스 겔에 band를 확인 할 수 있을 정도의 PCR 산물 농도이면 본원 발명에 따른 MeltngArray 키트로 검출 할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Republic of Korea(National Fisheries Research and Development Institute) <120> Genetic Marker for Dectecting Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus, and Method for Detecting Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus Using the Same <130> P16-B235 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genetic Marker for MrNV <400> 1 tcacgcctga ca 12 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 agctgtgaaa cttccactgg 20 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 tgtcaggcgt ga 12 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional Primer(Forward) <400> 4 gcgttataga tggcacaagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional Primer(Reverse) <400> 5 agctgtgaaa cttccactgg 20

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자 마커에 상보적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 PNA 프로브.
  3. 제2항에 있어서, 리포터 및 소광자 중에서 어느 하나 이상이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 PNA 프로브.
  4. 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 제2항의 PNA 프로브를 포함하는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 조성물.
  5. 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 제2항의 PNA 프로브를 포함하는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출용 키트.
  6. 다음 단계를 포함하는 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV) 검출 방법:
    (a) 검체 시료로부터 표적 핵산을 추출하는 단계;
    (b) 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)의 유전자 염기서열을 주형(template)으로 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 단일가닥의 유전자 마커 서열단편을 생성시키는 단계;
    (c) 상기 단일가닥으로 생성된 유전자 마커 서열단편에 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 PNA 프로브를 혼성화시키는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 PNA 프로브로 혼성화된 산물의 온도를 높이면서 온도별 융해곡선을 얻는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 융해곡선의 분석을 통해 융해온도로부터 큰징거미새우 노다바이러스(MrNV)를 검출하는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 단일가닥의 유전자 마커 서열단편은 단일가닥 형성용 버퍼(single strand generation buffer, SSG buffer)를 추가로 첨가하여 생성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단일가닥 형성용 버퍼는 DNA 중합효소, dNTPs(deoxynucleotides) 및 안정제(Stabilizer)를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020160132023A 2016-10-12 2016-10-12 큰징거미새우 노다바이러스 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 KR101737314B1 (ko)

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