KR102286597B1 - 타겟과 표지된 프로브의 결합 효율 개선 및 미결합 프로브와 결합 프로브의 효율적인 분리 방법 - Google Patents

타겟과 표지된 프로브의 결합 효율 개선 및 미결합 프로브와 결합 프로브의 효율적인 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표지 프로브를 이용한 분자진단에 있어서, 표지 프로브와 타겟의 결합 효율을 극대화하면서, 타겟과 비특이적인 결합이 없게 하고, 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 전기영동방법을 통하여 간단하게 높은 효율로 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 타겟과 결합한 표지 프로브를 효율적으로 분리할 수 있는 방법은 타겟과 결합된 표지 프로브를 분리하기 위하여 별도의 세척과정을 거치지 않음으로써 시그널이 약화되는 것을 방지할 수 있으며, 표지 프로브와 타겟의 결합을 극대화할 수 있고 동시에 빠르게 진행하면서, 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 분리하는 과정을 종래보다 간단하고, 효율적으로 수행할 수 있다.

Description

타겟과 표지된 프로브의 결합 효율 개선 및 미결합 프로브와 결합 프로브의 효율적인 분리 방법{Method for effectively separating probes attaching target marker}
본 발명은 표지 프로브를 이용한 분자진단에 있어서, 표지 프로브와 타겟의 결합 효율을 극대화하면서, 타겟과 비특이적인 결합이 없게 하고, 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 전기영동방법을 통하여 간단하게 높은 효율로 분리하는 방법에 관한 것이다.
분자진단은 질병의 직접적인 원인을 진단하는 방식으로 정밀진단, 확진에 사용되며, 사용 범위가 계속 넓어지고 있다.
분자진단을 위해서는 타겟과 결합할 수 있는 표지 프로브를 이용한 검출이 사용된다. 분자진단에 사용되는 표지자의 검출방법으로서는 형광 측정방법, 화학발광 측정방법, 전기화학 측정방법 등 다양하게 적용되고 있다.
표지 프로브를 이용한 특이적 검출을 위해서는 표지 프로브와 타겟의 결합이 매우 효율적이어야 하며, 위양성 결과를 제거하기 위해서 특이도 또한 매우 높아야 한다. 또한 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 효율적으로 분리하는 과정이 필요하다. 추가적으로 진단 결과의 빠른 확인을 위해 상기의 과정이 매우 짧은 시간에 수행되어야 한다.
타겟과 표지 프로브를 결합시키며, 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 구분하는 방식으로 대표적인 방법은 타겟과 상보적인 염기서열을 가지는 Dual labeled 프로브(Taqman 프로브) 방식이나, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상을 이용하는 hybridization 프로브 방식이다. 이들 방식은 형광 표지자와 해당 표지자의 signal을 억제하는 quencher를 이용한다. Real-time PCR 등에 사용되며, 용액 상태에서 결합이 이루어져서 매우 빠르고 효율적으로 결합할 수 있다. 또한 하나의 반응 장소에서 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 구분하는 방식으로 자동화의 편리성을 가지고 있으나, 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브가 가지는 background signal로 인해 적은 양의 타겟을 대상으로 검사할 때는 타겟의 증폭 과정을 수행하지 않으면 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 구분하지 못하는 단점이 있고, 이로 인해 타겟의 증폭 과정을 수행하기 위한 효소가 별도로 필요하며, 반응을 위한 시간 또한 상당히 필요하게 되어 빠른 결과 확인이 어려운 단점을 가지고 있다.
타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 분리하는 방식으로 또 다른 방식은 microarray, line프로브 assay나 suspension array와 같은 방식으로, 고체 지지체에 부착된 프로브를 이용하여 타겟을 고정하고, 고정된 타겟을 대상으로 표지 프로브를 결합시키고, 타겟과 결합되지 않은 표지 프로브는 별도의 세척 과정을 거쳐서 제거하여 구분할 수 있다. 하지만, 타겟을 고정하는 용도의 추가적인 프로브가 필요하며, 고체 지지체를 사용함으로 인해 steric hindrance 등으로 인하여 결합 효율이 떨어지고, 결합 시간이 길게 소요되며, 물리적인 세척 과정을 거침으로 인해 특이 결합의 경우에도 signal이 소실될 수 있는 단점을 가지고 있다.
대한민국등록특허공보 10-1777168 대한민국공개특허공보 10-2013-0011348
본 발명의 목적은 종래기술의 문제점이었던 증폭과정을 수행하기 위해 소요되는 시간을 절약하고, 세척과정을 수행함으로써 발생하는 타겟과 결합한 프로브의 손실을 방지할 수 있도록 타겟과 결합한 표지 프로브를 효율적으로 분리할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서 제공하는 타겟과 결합한 표지 프로브를 효율적으로 분리할 수 있는 방법은 타겟과 결합된 표지 프로브를 분리하기 위하여 별도의 세척과정을 거치지 않음으로써 시그널이 약화되는 것을 방지할 수 있으며, 표지 프로브와 타겟의 결합을 극대화할 수 있고 동시에 빠르게 진행하면서, 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 분리하는 과정을 기존보다 간단하고, 효율적으로 빠르게 수행하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 표지 프로브와 타겟의 결합을 극대화하고, 빠르게 수행하기 위해서 real time PCR과 같이 용액 상에서 표지 프로브와 타겟이 결합하는 방식을 제공하였다. 또한 타겟이 되는 핵산과 다른 전하를 가지는 표지 프로브를 제공하여 기존에 사용되는 고체 지지체 기반의 방식과 달리 용액상에서 전하의 차이를 이용하여 효율적이고, 빠르게 타겟과 결합한 표지 프로브와 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브를 분리하는 방법을 제공하였다.
본 발명에서 제공하는 타겟과 결합된 표지 프로브의 효율적인 분리방법은 다음의 단계를 포함하여 이루어지는데, 상기 단계는 1)검체에서 분리된 타겟 핵산을 가열하는 단계, 2) 상기 타겟 핵산과 형광물질이 결합된 표지 프로브를 혼합하는 단계, 3) 전기영동을 가하여 상기 타겟과 결합된 표지 프로브를 분리하는 단계, 및 4) 분리된 타겟과 결합된 표지 프로브의 형광을 측정하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 제공되는 표지 프로브는 타겟인 핵산과 결합하고, 분리되는 반응 용액의 pH 조건하에서 타겟과 다른 전하를 띠는 것을 특징으로 한다. 예를 들면 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid)와 같이 일반적인 반응 용액 조건에서 양전하를 띠는 표지자이면 만족하고, 특별히 상기 PNA, LNA에 국한되지는 않는다.
상기 단계에서 검체에서 분리된 타겟 핵산을 가열하는 단계는 본발명에서 제공하는 표지 프로브와 특이적으로 결합되는 핵산을 가열하여 이중가닥 핵산을 단일가닥 핵산으로 denaturing하는 단계로서, 가열온도는 타겟 핵산마다 차이는 있으나 주로 90 내지 100℃이고, 가열시간은 0.5 내지 20분이다.
상기 단계에서 타겟 핵산과 표지 프로브를 결합하는 단계는 상기 단계에서 단일가닥으로 형성된 핵산에 표지 프로브를 혼합하는 단계로서, 표지 프로브는 타겟 핵산과 특이적으로 결합하게 된다.
상기 단계에서 전기영동을 가하여 상기 타겟과 결합된 표지 프로브를 분리하는 단계는 상기 타겟 핵산과 표지 프로브가 혼합된 혼합물에 전기영동을 가함으로써 타겟 핵산과 결합된 표지 프로브는 음전하를 띄게 되고 타겟 핵산과 결합되지 않은 표지 프로브는 양전하를 유지하게 되어 전기영동을 가함으로써 전기력에 의해서 타겟 핵산과 결합된 표지 프로브와 결합되지 않은 표지 프로브가 자연적으로 분리되게 하는 단계이다.
마지막으로 분리된 타겟과 결합된 표지 프로브의 형광을 측정하는 단계는 상기 단계를 거쳐서 자연스럽게 분리된 타겟과 결합된 표지 프로브의 형광을 측정하는 단계이다.
본 발명에서 제공되는 표지 프로브는 타겟인 핵산과 pH 9.0 이하의 반응 용액에서 real time PCR의 반응 조건인 1분 이내에 타겟과 높은 효율로 결합한다. 이를 통해 기존에 분자진단에 주로 사용되었던 고체 지지체 기반의 방식에 비해 표지자가 타겟 핵산에 결합하기 위해 소요되는 시간을 대폭 줄일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 표지 프로브는 타겟인 핵산과 결합하게 되면 결합된 표지 프로브-타겟 핵산의 전하가 전체적으로는 음전하를 띠게 되어 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브와 다른 전하를 띠게 되고 용액 상태에서 전기영동을 통해 짧은 시간에 물리적인 세척 과정이 없이 자연스럽게 분리가 가능하게 된다.
본 발명에서 제공하는 표지 프로브의 분리방법은 제공되는 표지 프로브가 타겟인 핵산과 결합하는 효율을 극대화하고, 분리 효율을 극대화함으로써 간단한 과정을 통해 background signal을 최소화하여 증폭단계가 없이 짧은 시간 동안에 효율적인 분자진단을 수행할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 표지 프로브가 타겟 핵산과 결합되어 결합되지 않은 표지 프로브와 다른 전하를 가지게 되는 방식에 대한 설명도이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 타겟 핵산과 결합한 표지 프로브를 전하의 차이를 이용하여 전기영동 방식을 통하여 결합하지 않은 표지 프로브와 분리하고, 시그날을 검출하는 방법에 대한 설명도이다.
도 3a는 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하여 타겟 핵산인 GJB2_V371 유전자와 본 발명에서 제공하는 primer가 특이적으로 결합하여 증폭된다는 것을 나타낸다.
도 3b는 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하여 타겟 핵산인 CDH23_P240L 유전자와 본 발명에서 제공하는 primer가 특이적으로 결합하여 증폭된다는 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 방법을 적용하였을 때에 타겟 핵산인 GJB2_V371 유전자 특이 primer가 타겟 핵산이 아닌 sheared salmon sperm DNA를 대상으로 하였을 때에는 낮은 수준의 비특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
도 5a는 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하여 타겟 핵산인 GJB2_V371 유전자와 결합한 표지 프로브를 형광측정한 결과이다.
도 5b는 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하여 타겟 핵산인 CDH23_P240L 유전자와 결합한 표지 프로브를 형광측정한 결과이다.
도 6a는 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하여 1/10 내지 1/1000으로 희석한 타겟 핵산인 GJB2_V371 유전자와 표지 프로브의 결합을 형광측정한 결과이다.
도 6b는 본 발명에서 제공하는 방법을 이용하여 1/10 내지 1/1000으로 희석한 타겟 핵산인 CDH23_P240L 유전자와 표지 프로브의 결합을 형광측정한 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 타겟 핵산인 GJB2_V371 유전자와 결합한 표지 프로브를 전기영동을 가하여 분리한 결과이다.
도 7c 및 도 7d는 타겟 핵산인 CDH23_P240L 유전자와 결합한 표지 프로브를 전기영동을 가하여 분리한 결과이다.
이하 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 용액 상에서 표지 프로브가 타겟과 결합하고, 타겟과 결합된 표지 프로브를 결합하지 않은 표지 프로브와 전하의 차이를 이용해 분리하는 방식에 대한 개념도이다. 도 1에 도시된 바와 같이 타겟 핵산은 가열을 통해 이중나선에서 단일 가닥으로 분리될 수 있으며, 다량으로 존재하는 표지 프로브와 결합할 수 있다. 타겟과 결합된 표지 프로브는 결합하지 않은 표지 프로브와 전체적인 전하가 달라져서 전기영동을 통해 타겟 핵산들과 같은 방향으로 이동이 가능하며 이를 통해 타겟과 결합하지 않은 표지 프로브와 효율적으로 분리될 수 있다. 분리된 타겟과 결합된 표지 프로브는 형광 광학계를 통해 검출이 가능하다.
도 2는 타겟의 존재 유무 및 양에 따라 타겟 핵산과 결합된 표지 프로브를 전기영동법을 이용하여 결합하지 않은 표지 프로브와 분리하는 과정을 설명하는 도면이다. 결합 반응을 통해 생성된 타겟과 결합한 표지 프로브와 결합하지 않은 표지 프로브의 혼합물은 전기영동을 통해 수용액 상태에서 분리가 가능하다. 이를 표지자에 결합된 형광물질을 검출 가능한 gel doc system의 형광 광학계를 이용하여 측정 가능하다.
본 발명에서 사용되는 상기 표지자에 결합되는 형광물질은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, BHQ2, MGB, ZEN, TEXASRED, ROX 및 비오틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 타겟 핵산과 결합하는 표지 프로브에는 형광물질과 더불어 형광 효율을 향상시킬 수 있도록 소광물질도 결합될 수 있다.
상기 소광물질로서는 Dabcyl, TAMRA, Black hole quencher 등을 사용할 수 있다.
실시예 1 : 인체 유전자 중 유전성 난청 관련 유전자 검출을 위한 표지자 설계
본 발명자들은 유전성 난청 관련 유전자 중 GJB2_V37I와 CDH23_P240L에 특이적인 표지 프로브와 해당 부분의 유전자를 증폭할 primer를 설계하였다.
GJB2_V37I 관련 표지 프로브와 primer는 아래의 표 1 및 표 2와 같다.
이름 염기서열(5’->3’) 길이 GC% Tm
(PNA bio)		 비고
PNA-test1 Dabcyl-ccacaacgag gatc-O-K-(FAM) 14 57.1 73.7 GJB2_V37I, complementary
PNA-test1-1 ccacaacgag gatc-O-K-(FAM) 14 57.1 73.7 GJB2_V37I, complementary
이름 염기서열(5’->3’) 길이 GC% Tm(IDT) 비고
Test1-for ggggtgtgaa caaacactcc a 21 52.4 57.7 GJB2_V37I
Test1-rev atctccccac acctcctttg c 21 57.1 59.5 GJB2_V37I, complementary
CDH23_P240L 관련 표지 프로브와 primer는 아래의 표3 및 표4와 같다.
이름 염기서열(5’->3’) 길이 GC% Tm
(PNA bio)		 비고
PNA-test2 Dabcyl- aacctgcctt acagc -O-K-(FAM) 15 53.5 72.6 CDH23_P240L
PNA-test2-1 aacctgcctt acagc -O-K-(FAM) 15 53.5 72.6 CDH23_P240L
이름 염기서열(5’->3’) 길이 GC% Tm(IDT) 비고
Test2-for acttggccat catcatcaca gat 23 43.5 56.5 CDH23_P240L
Test2-rev ccctaacagg agctcagaag gaa 23 52.2 58.1 CDH23_P240L_complementary, intron에 위치
상기 표에서 Dabcyl은 상기 표지 프로브가 타겟 핵산과 결합시에 형광세기를 증가시키기 위한 ?쳐이고, O는 O-링커이고 K는 K-링커를 의미한다.
실시예 2 : 각 primer/표지 프로브 세트별 성능 확인
상기 실시예 1에서 설계된 모든 primer 및 표지 프로브들을 합성하였다. Primer는 독일의 metabion사에서 합성하였으며, 표지 프로브는 panagene사에서 합성하였다.
먼저 각 primer가 표적 핵산을 특이적으로 증폭 검출하는지 여부를 확인하기 위해 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 실시간 PCR 반응을 위한 주형으로는 인체 유래 세포의 DNA 추출액을 희석하여 사용하였다. DNA 추출액은 Qiagen사의 QIAamp DNA mini kit를 사용하여 얻어진 것이다. 각 반응 혼합물(20 ul)은 상기와 같이 준비된 DNA 주형 2ul, 정방향 프라이머 10 pmole, 역방향 프라이머 10 pmole, SyBr Green I(1X) 2 ul, 2X PCR Premix 10 ul, Magnesium Chloride (10 mM) 4 ul를 포함하였다. 실시간 PCR은 applied Biosystems 사의 ABI7500 실시간 PCR 기기를 사용하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 음성대조군의 경우 10 ng/ul의 sheared salmon sperm DNA를 사용하였다.
항목 volume(ul)
2X PCR premix 10
10 pmol/ul for 1
10 pmol/ul rev 1
SyBr green I (1X) 2
MgCl2 (10mM) 4
target DNA 2
합계 20
온도(℃) 시간 반복
95 10분
95 30초 40회
62 45초 형광측정
그 결과, 본 발명의 각 primer set들은 목적하는 유전성 난청 관련 유전자 중 GJB2_V37I와 CDH23_P240L 유전자를 특이적으로 증폭시켜서 검출할 수 있음을 확인하였다(도 3 및 표 7, 표 8).
도 3은 첫번째로 GJB2_V371을 증폭한 real time PCR data로 인체 유래 세포의 DNA 추출액에 대해서는 특이적인 반응을 보여 23의 Ct 값을 보였으며, sheared salmon sperm DNA를 대상으로는 낮은 시그날의 비특이 반응을 보였다(도 3a). 두번째로 CDH23_P240L을 증폭한 real time PCR data는 인체 유래 세포의 DNA 추출액에 대해서는 특이적인 반응을 보여 23의 Ct 값을 보였으며, sheared salmon sperm DNA를 대상으로는 증폭 시그날이 전혀 형성되지 않았다(도 3b).
legend target Ct
C 인체 유래 세포 DNA 추출액 23
D Sheared salmon sperm DNA 35
E 인체 유래 세포 DNA 추출액 23
F Sheared salmon sperm DNA 36
legend target Ct
C 인체 유래 세포 DNA 추출액 23
D Sheared salmon sperm DNA -
E 인체 유래 세포 DNA 추출액 23
F Sheared salmon sperm DNA -
도 4는 GJB2_V371 real time PCR의 sheared salmon sperm DNA 를 대상으로 한 산물이 비특이 반응임을 확인하기 위한 melting temperature analysis의 결과이다. 특이적인 산물은 82.79 °C의 Tm을 나타냈고, 비특이 산물은 일관성이 결여된 75.83, 48.60°C의 Tm을 나타냈다 (도 4, 표 10). 이러한 비특이 반응은 프라이머의 self-dimer 형성 등에 의해서 발생하는 것으로 intercalating dye인 SyBr Green I을 사용할 때 발생하며, 표지 프로브를 사용하여 제거할 수 있다. 아래의 표 9는 상기 반응을 검사하기 위한 melting temperature analysis의 조건을 나타낸다.
온도 시간
95 5분
75 1분
55 1분
45 30초
45~95 30초, 30초, ramping rate 1%, 연속 측정
legend target Tm
C 인체 유래 세포 DNA 추출액 82.79
D Sheared salmon sperm DNA 75.83
E 인체 유래 세포 DNA 추출액 82.79
F Sheared salmon sperm DNA 48.60
추가적으로 각 primer/표지 프로브가 표적 핵산을 특이적으로 증폭 검출하는지 여부를 확인하기 위해 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 실시간 PCR 반응을 위한 주형으로는 인체 유래 세포의 DNA 추출액을 희석하여 사용하였다. DNA 추출액은 Qiagen사의 QIAamp DNA mini kit를 사용하여 얻어진 것이다. 각 반응 혼합물(20 ul)은 상기와 같이 준비된 DNA 주형 2ul, 정방향 프라이머 10 pmole, 역방향 프라이머 2 pmole, Dual labeled 표지 프로브 5 pmole, 2X PCR Premix 10 ul, Magnesium Chloride (10 mM) 4 ul를 포함하였다(표 11). 실시간 PCR은 applied Biosystems 사의 ABI7500 실시간 PCR 기기를 사용하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 음성대조군의 경우 10 ng/ul의 sheared salmon sperm DNA를 사용하였다.
항목 volume(ul)
2X PCR premix 10
10 pmol/ul for 1
2 pmol/ul rev 1
5 pmol/ul Dual labeled 표지 프로브 1
MgCl2 (10mM) 4
target DNA 2
DW 1
합계 20
온도(℃) 시간 비고
95 10분
95 30초 40회
62 45초 형광측정
그 결과, 본 발명의 각 primer 및 표지 프로브세트들은 목적하는 유전성 난청 관련 유전자 중 GJB2_V37I와 CDH23_P240L 유전자를 특이적으로 증폭시켜서 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 5 및 표 13, 표 14).
아래의 표 13은 GJB2_V37I 유전자를 특이적으로 증폭한 결과이고, 표 14는 CDH23_P240L 유전자를 특이적으로 증폭한 결과이다.
도 5는 첫번째로 GJB2_V371을 증폭한 real time PCR data로 인체 유래 세포의 DNA 추출액에 대해서는 특이적인 반응을 보여 26의 Ct 값을 보였으며, sheared salmon sperm DNA를 대상으로는 증폭 시그날이 전혀 형성되지 않았다(도 5a). 두번째로 CDH23_P240L을 증폭한 real time PCR data는 인체 유래 세포의 DNA 추출액에 대해서는 특이적인 반응을 보여 27의 Ct 값을 보였으며, sheared salmon sperm DNA를 대상으로는 증폭 시그날이 전혀 형성되지 않았다(도 5b).
legend target Ct
E 인체 유래 세포 DNA 추출액 26
F Sheared salmon sperm DNA -
G 인체 유래 세포 DNA 추출액 26
H Sheared salmon sperm DNA -
legend target Ct
E 인체 유래 세포 DNA 추출액 27
F Sheared salmon sperm DNA -
G 인체 유래 세포 DNA 추출액 27
H Sheared salmon sperm DNA -
실시예 3 : 타겟 양에 따른 표적 핵산의 증폭 결과 확인
각 primer/Dual labeled 표지 프로브를 이용하여 표적 핵산의 양에 따른 증폭 결과를 확인하기 위해 실시간 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응을 위한 주형으로는 인체 유래 세포의 DNA 추출액을 희석하여 사용하였다. DNA 추출액은 Qiagen사의 QIAamp DNA mini kit를 사용하여 얻어진 것이며, 이를 각각 1/10, 1/100, 1/1000로 10ng/ul의 sheared salmon sperm DNA를 이용하여 희석하여 사용하였다. 각 반응 혼합물(20 ul)은 상기와 같이 준비된 DNA 주형 2ul, 정방향 프라이머 10 pmole, 역방향 프라이머 2 pmole, Dual labeled 표지 프로브 5 pmole, 2X PCR Premix 10 ul, Magnesium Chloride (10 mM) 4 ul를 포함하였다(표 15). 실시간 PCR은 applied Biosystems 사의 ABI7500 실시간 PCR 기기를 사용하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 음성대조군의 경우 10 ng/ul의 sheared salmon sperm DNA를 사용하였다.
항목 volume(ul)
2X PCR premix 10
10 pmol/ul for 1
2 pmol/ul rev 1
5 pmol/ul dual labeled 표지 프로브 1
MgCl2 (10mM) 4
target DNA 2
DW 1
합계 20
온도(℃) 시간 비고
95 10분
95 30초 40회
62 45초 형광측정
그 결과, 본 발명의 각 primer/표지 프로브세트들은 목적하는 유전성 난청 관련 유전자 중 GJB2_V37I와 CDH23_P240L 유전자를 정량적으로 증폭시켜서 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 6 및 표 17, 표 18).
아래의 표 17은 GJB2_V37I 유전자를 검출한 결과이고, 표 18는 CDH23_P240L 유전자를 검출한 결과이다.
도 6은 첫번째로 GJB2_V371을 증폭한 real time PCR data로 인체 유래 세포의 DNA 추출액에 대해서는 특이적인 반응을 보여 1/1000 희석액까지 증폭 시그날을 형성하였으며, sheared salmon sperm DNA를 대상으로는 증폭 시그날이 전혀 형성되지 않았다(도 6a). 두번째로 CDH23_P240L을 증폭한 real time PCR data는 인체 유래 세포의 DNA 추출액에 대해서는 특이적인 반응을 보여 1/100 희석액까지 증폭 시그날을 형성하였으며, sheared salmon sperm DNA를 대상으로는 증폭 시그날이 전혀 형성되지 않았다(도 6b).
legend target Ct
E 인체 유래 세포 DNA 추출액 1/10희석액 30
F 인체 유래 세포 DNA 추출액 1/100희석액 33
G 인체 유래 세포 DNA 추출액 1/1000 희석액 37
H Sheared salmon sperm DNA -
legend target Ct
A 인체 유래 세포 DNA 추출액 1/10희석액 32
B 인체 유래 세포 DNA 추출액 1/100희석액 35
C 인체 유래 세포 DNA 추출액 1/1000 희석액 -
D Sheared salmon sperm DNA -
실시예 4 : 전기영동을 통한 타겟과 결합한 표지 프로브와 결합하지 않은 표지 프로브 분리 성능 확인
각 primer를 이용하여 프로브와 반응할 수 있는 표적 핵산을 증폭하기 위해 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응을 위한 주형으로는 인체 유래 세포의 DNA 추출액을 희석하여 사용하였다. DNA 추출액은 Qiagen사의 QIAamp DNA mini kit를 사용하여 얻어진 것이며, 이를 각각 1/10, 1/100, 1/1000로 10 ng/ul의 sheared salmon sperm DNA를 이용하여 희석하여 사용하였다. 각 반응 혼합물(20 ul)은 상기와 같이 준비된 DNA 주형 2ul, 정방향 프라이머 10 pmole, 역방향 프라이머 2 pmole, 2X PCR Premix 10 ul, Magnesium Chloride (10 mM) 4 ul를 포함하였다(표 19). PCR은 applied Biosystems 사의 ABI9700 PCR 기기를 사용하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 음성대조군의 경우 10 ng/ul의 sheared salmon sperm DNA를 사용하였다.
항목 volume(ul)
2X PCR premix 10
10 pmol/ul for 1
2 pmol/ul rev 1
MgCl2 (10mM) 4
target DNA 2
DW 2
합계 20
아래의 표 20은 상기 과정에서 적용된 온도 및 시간을 나타낸다.
온도(℃) 시간 비고
95 10분
95 30초 40회
62 45초 형광측정
75 1분
또한 증폭된 PCR 산물에 각 유전자에 특이적인 표지 프로브를 5 pmole씩 첨가하고, 아래 조건과 같이 결합 반응을 수행하였다.
온도(℃) 시간
95 5분
75 1분
55 1분
45 30초
상기에서 결합 반응이 완료된 반응물은 0.5X TBE buffer를 이용해 EtBr이 포함되지 않은 2 % 아가로즈 젤상에서 5ul를 로딩하여 전기영동하였고, gel documentation system을 이용하여 형광 시그날을 확인하였다. 추가적으로 1 X EtBr solution에 아가로즈 젤을 10분간 담궈 핵산을 염색하고 동일하게 gel documentation system을 이용하여 형광 시그날을 확인하였다(도 7). 도 7의 a는 GJB2_V371 유전자의 전기영동 젤을 EtBr염색 없이 촬영한 사진이며, b는 GJB2_V371 유전자의 전기영동 젤을 EtBr염색한 후 촬영한 사진이다. 도 7의 c는 CDH23_P240L 유전자의 전기영동 젤을 EtBr염색 없이 촬영한 사진이며, d는 CDH23_P240L 유전자의 전기영동 젤을 EtBr염색한 후 촬영한 사진이다.
도 7에서 a와 b는 GJB2_V371 유전자의 전기영동 결과이며 레인 1은 1/10, 레인 2는 1/100, 레인 3은 1/1000, 레인 4는 음성대조군, M은 100bp ladder 사이즈마커이다. 1/10 희석액부터 1/1000 희석액까지 특이 반응 산물이 형성됨을 확인하였고, a에서 특이 반응 산물에 특이적으로 결합하는 표지 프로브에 의해서 특이 반응 산물을 형광을 통해 검출 가능함과 정량성을 확인하였으며, 특이 반응 산물에 결합하지 않은 표지 프로브는 전하의 차이에 의해서 분리됨을 확인하였다. b에서는 해당 밴드가 특이적인 반응 산물의 크기와 동일함을 사이즈마커와 위치 비교하여 확인하였다.
도 7에서 c와 d는 CDH23_P240L 유전자의 전기영동 결과이며 레인 1은 1/10, 레인 2는 1/100, 레인 3은 1/1000, 레인 4는 음성대조군, M은 100bp ladder 사이즈마커이다. 1/10 희석액부터 1/1000 희석액까지 특이 반응 산물이 형성됨을 확인하였고, c에서 특이 반응 산물에 특이적으로 결합하는 표지 프로브에 의해서 특이 반응 산물을 형광을 통해 검출 가능함과 정량성을 확인하였으며, 특이 반응 산물에 결합하지 않은 표지 프로브는 전하의 차이에 의해서 분리됨을 확인하였다. d에서는 해당 밴드가 특이적인 반응 산물의 크기와 동일함을 사이즈마커와 위치 비교하여 확인하였다.
본 발명은 산업상 이용가능하다.

Claims (4)

  1. 타겟 핵산과 결합된 표지 프로브를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 타겟 핵산을 가열하여 핵산의 이중가닥을 단일가닥으로 분리하는 단계; 상기 단계에서 생성된 타겟 핵산과 형광물질이 결합된 표지 프로브를 혼합하여 타겟 핵산과 표지 프로브를 결합시키는 단계; 전기영동을 가하여 타겟 핵산과 결합된 표지 프로브를 분리하는 단계; 및 상기 단계에서 분리된 표지 프로브의 형광을 측정하는 단계로 이루어지며,
    상기 표지 프로브를 혼합하는 단계에서 타겟 핵산과 결합된 표지 프로브는 음전하를 띄게 되고, 타겟 핵산과 결합되지 않는 표지 프로브는 양전하를 띄게 되는 것을 특징으로 하는 표지 프로브를 검출하는 방법

  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 표지 프로브는 PNA 또는 LNA인 것을 특징으로 하는 표지 프로브를 검출하는 방법
  4. 제1항에 있어서, 상기 형광물질은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, BHQ2, MGB, ZEN, TEXASRED, ROX 및 비오틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표지 프로브를 검출하는 방법
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